JP2023130476A - 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 - Google Patents
培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023130476A JP2023130476A JP2023114436A JP2023114436A JP2023130476A JP 2023130476 A JP2023130476 A JP 2023130476A JP 2023114436 A JP2023114436 A JP 2023114436A JP 2023114436 A JP2023114436 A JP 2023114436A JP 2023130476 A JP2023130476 A JP 2023130476A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- medium
- culture
- manufactured
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 151
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 111
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title abstract description 81
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title abstract description 68
- 238000007667 floating Methods 0.000 abstract description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 44
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 19
- 238000012136 culture method Methods 0.000 abstract description 18
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 765
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 350
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 285
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 230
- 235000010492 gellan gum Nutrition 0.000 description 230
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 description 230
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 157
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 128
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 115
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 115
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 111
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 72
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 72
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 70
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 50
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 49
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 49
- 229920000591 gum Polymers 0.000 description 45
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 44
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 44
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 43
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 43
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 43
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 42
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 41
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 41
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 41
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 41
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 40
- -1 dimethylaminoethyl Chemical group 0.000 description 40
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 40
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 39
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 35
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 35
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 33
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 33
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 32
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 30
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 30
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 30
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 30
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 29
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 29
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 29
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 27
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 27
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 27
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 26
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 26
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 26
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 26
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 24
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 24
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 24
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 24
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 24
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 24
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 24
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 24
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 23
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 23
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 23
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 23
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 22
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 22
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 19
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 19
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 19
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 19
- 230000006870 function Effects 0.000 description 19
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 19
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 19
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 19
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 19
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 19
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 19
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 18
- VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].COC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 17
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 17
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 17
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229920000161 Locust bean gum Polymers 0.000 description 16
- 235000004298 Tamarindus indica Nutrition 0.000 description 16
- 240000004584 Tamarindus indica Species 0.000 description 16
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 16
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 16
- 235000010420 locust bean gum Nutrition 0.000 description 16
- 239000000711 locust bean gum Substances 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 13
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 13
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 13
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 12
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 11
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 11
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 11
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 11
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 11
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 11
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 11
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 11
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 11
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 11
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 10
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 10
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 10
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 10
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 10
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 10
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 10
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 10
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 10
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 10
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 10
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 10
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 10
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 9
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 9
- ZNOZWUKQPJXOIG-XSBHQQIPSA-L [(2r,3s,4r,5r,6s)-6-[[(1r,3s,4r,5r,8s)-3,4-dihydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]oxy]-4-[[(1r,3r,4r,5r,8s)-8-[(2s,3r,4r,5r,6r)-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-sulfonatooxyoxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-3-yl]oxy]-5-hydroxy-2-( Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H]2OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H]4OC[C@H]3O[C@H](O)[C@@H]4O)[C@@H]1O)OS([O-])(=O)=O)[C@@H]2O ZNOZWUKQPJXOIG-XSBHQQIPSA-L 0.000 description 9
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 9
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 9
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 9
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 9
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 8
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 8
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 8
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 8
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 7
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 7
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 7
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 7
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 7
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 7
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 6
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 6
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 6
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 6
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 6
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 6
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 6
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 6
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 6
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 6
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 6
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000000306 component Substances 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 6
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 6
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 235000010491 tara gum Nutrition 0.000 description 6
- 239000000213 tara gum Substances 0.000 description 6
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 5
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 5
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 5
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 5
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 5
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 5
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 5
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 5
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 5
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 5
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 5
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 5
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 5
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 5
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 5
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 5
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 5
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 4
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 4
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000006375 Desmocollins Human genes 0.000 description 4
- 108010019063 Desmocollins Proteins 0.000 description 4
- 102000011799 Desmoglein Human genes 0.000 description 4
- 108050002238 Desmoglein Proteins 0.000 description 4
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 4
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 description 4
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 4
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 4
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 4
- 102000016551 L-selectin Human genes 0.000 description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 4
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 4
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 4
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 4
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 4
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 4
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 4
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 108010057670 laminin 1 Proteins 0.000 description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 4
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 4
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 4
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 4
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 4
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 3
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 3
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 3
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 3
- XDSSPSLGNGIIHP-VKHMYHEASA-N Se-methyl-L-selenocysteine Chemical compound C[Se]C[C@H]([NH3+])C([O-])=O XDSSPSLGNGIIHP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 3
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 3
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 3
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 3
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 3
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 3
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 3
- 125000003976 glyceryl group Chemical group [H]C([*])([H])C(O[H])([H])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 3
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 3
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 3
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 3
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 3
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 3
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 3
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 3
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 3
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N troglitazone Natural products C([C@@]1(OC=2C(C)=C(C(=C(C)C=2CC1)O)C)C)OC(C=C1)=CC=C1C[C@H]1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N 0.000 description 3
- GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N troglitazone Chemical compound C1CC=2C(C)=C(O)C(C)=C(C)C=2OC1(C)COC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001641 troglitazone Drugs 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 239000005971 1-naphthylacetic acid Substances 0.000 description 2
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-methoxy-2-methylbenzenesulfonamide Chemical compound COC1=CC(S(N)(=O)=O)=C(C)C=C1N IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- SOGAXMICEFXMKE-UHFFFAOYSA-N Butylmethacrylate Chemical compound CCCCOC(=O)C(C)=C SOGAXMICEFXMKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 2
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 244000124209 Crocus sativus Species 0.000 description 2
- 235000015655 Crocus sativus Nutrition 0.000 description 2
- 108010081668 Cytochrome P-450 CYP3A Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 2
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 229920000855 Fucoidan Polymers 0.000 description 2
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000874160 Homo sapiens Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 2
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 2
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 description 2
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 2
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GKWTZACONBQTNK-IVIZKJKWSA-N N-benzyl-7H-purin-6-amine (1R,2R,5R,8R,9S,10R,12S)-12-hydroxy-11-methyl-6-methylidene-16-oxo-15-oxapentacyclo[9.3.2.15,8.01,10.02,8]heptadecane-9-carboxylic acid (1R,2R,5R,8R,9S,10R,12S)-12-hydroxy-11-methyl-6-methylidene-16-oxo-15-oxapentacyclo[9.3.2.15,8.01,10.02,8]heptadec-13-ene-9-carboxylic acid Chemical compound C(Nc1ncnc2nc[nH]c12)c1ccccc1.CC12[C@H]3[C@H](C(O)=O)[C@@]45C[C@@H](CC[C@H]4[C@@]3(CC[C@@H]1O)OC2=O)C(=C)C5.CC12[C@H]3[C@H](C(O)=O)[C@@]45C[C@@H](CC[C@H]4[C@]3(OC1=O)C=C[C@@H]2O)C(=C)C5 GKWTZACONBQTNK-IVIZKJKWSA-N 0.000 description 2
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000123069 Ocyurus chrysurus Species 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 2
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 2
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000804 Pregnane X Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010001511 Pregnane X Receptor Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- HDSBZMRLPLPFLQ-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol alginate Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(C(O)=O)C1OC1C(O)C(O)C(C)C(C(=O)OCC(C)O)O1 HDSBZMRLPLPFLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 2
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 2
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000001785 acacia senegal l. willd gum Substances 0.000 description 2
- 229940081735 acetylcellulose Drugs 0.000 description 2
- 229920001284 acidic polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000004805 acidic polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 210000002199 attachment cell Anatomy 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000003851 corona treatment Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- RVIXKDRPFPUUOO-UHFFFAOYSA-N dimethylselenide Chemical compound C[Se]C RVIXKDRPFPUUOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000045360 human SDHB Human genes 0.000 description 2
- 108010046591 human laminin-511 Proteins 0.000 description 2
- 102000007573 human laminin-511 Human genes 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 2
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 2
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 2
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 2
- 229940074383 interleukin-11 Drugs 0.000 description 2
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 2
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 2
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 2
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 2
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 2
- 229940118526 interleukin-9 Drugs 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- LCLHHZYHLXDRQG-ZNKJPWOQSA-N pectic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)O[C@H](C(O)=O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)C(O)=O)O)[C@@H](C(O)=O)O1 LCLHHZYHLXDRQG-ZNKJPWOQSA-N 0.000 description 2
- 229920003175 pectinic acid Polymers 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 2
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 2
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 2
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 2
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 2
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010409 propane-1,2-diol alginate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000770 propane-1,2-diol alginate Substances 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 235000013974 saffron Nutrition 0.000 description 2
- 239000004248 saffron Substances 0.000 description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 2
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 2
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 2
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 2
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 2
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 229960005256 sulbactam Drugs 0.000 description 2
- FKENQMMABCRJMK-RITPCOANSA-N sulbactam Chemical compound O=S1(=O)C(C)(C)[C@H](C(O)=O)N2C(=O)C[C@H]21 FKENQMMABCRJMK-RITPCOANSA-N 0.000 description 2
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 2
- DNXHEGUUPJUMQT-UHFFFAOYSA-N (+)-estrone Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 DNXHEGUUPJUMQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N (16alpha,17betaOH)-Estra-1,3,5(10)-triene-3,16,17-triol Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(C(O)C4)O)C4C3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GGJFWMOVUFBSIN-AIRLBKTGSA-N (2S)-2-amino-4-[[(2S,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl-methylselaniumyl]butanoate Chemical compound C[Se+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1O)n1cnc2c(N)ncnc12 GGJFWMOVUFBSIN-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 1
- DBSABEYSGXPBTA-RXSVEWSESA-N (2r)-2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-2h-furan-5-one;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O DBSABEYSGXPBTA-RXSVEWSESA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-KLVWXMOXSA-N (2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5-tetrahydroxy-6-oxohexanoic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-KLVWXMOXSA-N 0.000 description 1
- IKGZFJCMJFERPR-CNEXKXPGSA-N (2s,5r,6e)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-(2-oxopropylidene)-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound S1C(C)(C)[C@H](C(O)=O)N2C(=O)C(=C/C(=O)C)\[C@H]21 IKGZFJCMJFERPR-CNEXKXPGSA-N 0.000 description 1
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- XIYOPDCBBDCGOE-IWVLMIASSA-N (4s,4ar,5s,5ar,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methylidene-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C=C1C2=CC=CC(O)=C2C(O)=C2[C@@H]1[C@H](O)[C@H]1[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]1(O)C2=O XIYOPDCBBDCGOE-IWVLMIASSA-N 0.000 description 1
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 1
- FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N (4s,4as,5ar,12ar)-4,7-bis(dimethylamino)-1,10,11,12a-tetrahydroxy-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1C2=C(N(C)C)C=CC(O)=C2C(O)=C2[C@@H]1C[C@H]1[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]1(O)C2=O FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N 0.000 description 1
- GUXHBMASAHGULD-SEYHBJAFSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-7-chloro-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1([C@H]2O)=C(Cl)C=CC(O)=C1C(O)=C1[C@@H]2C[C@H]2[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]2(O)C1=O GUXHBMASAHGULD-SEYHBJAFSA-N 0.000 description 1
- OCLRGULJISNUQS-OXQOHEQNSA-N (6r,7r)-3-(acetyloxymethyl)-7-[[3-(2-chlorophenyl)-5-methyl-1,2-oxazole-4-carbonyl]amino]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1Cl OCLRGULJISNUQS-OXQOHEQNSA-N 0.000 description 1
- 125000006594 (C1-C3) alkylsulfony group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006274 (C1-C3)alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 description 1
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- QKDHBVNJCZBTMR-LLVKDONJSA-N (R)-temafloxacin Chemical compound C1CN[C@H](C)CN1C(C(=C1)F)=CC2=C1C(=O)C(C(O)=O)=CN2C1=CC=C(F)C=C1F QKDHBVNJCZBTMR-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- AWDORCFLUJZUQS-ZDUSSCGKSA-N (S)-2-methyl-1-(4-methylisoquinoline-5-sulfonyl)-1,4-diazepane Chemical compound C[C@H]1CNCCCN1S(=O)(=O)C1=CC=CC2=CN=CC(C)=C12 AWDORCFLUJZUQS-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- ZSZRUEAFVQITHH-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methylprop-2-enoyloxy)ethyl 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCOP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ZSZRUEAFVQITHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KTTCLOUATPWTNB-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[4-(6,7-dimethoxy-3,4-dihydro-1h-isoquinolin-2-yl)butylcarbamoyl]-4-methylphenoxy]ethyl methanesulfonate Chemical compound C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CCN1CCCCNC(=O)C1=CC(C)=CC=C1OCCOS(C)(=O)=O KTTCLOUATPWTNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940044192 2-hydroxyethyl methacrylate Drugs 0.000 description 1
- PMYDPQQPEAYXKD-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-n-naphthalen-2-ylnaphthalene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(NC(=O)C3=CC4=CC=CC=C4C=C3O)=CC=C21 PMYDPQQPEAYXKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 1
- LLSFXOUAPAZFIV-SNVBAGLBSA-N 4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-pyridin-4-ylbenzamide Chemical compound C1=CC([C@H](N)C)=CC=C1C(=O)NC1=CC=NC=C1 LLSFXOUAPAZFIV-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 0.000 description 1
- 150000005168 4-hydroxybenzoic acids Chemical class 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 1
- GSDSWSVVBLHKDQ-UHFFFAOYSA-N 9-fluoro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-1-yl)-7-oxo-2,3-dihydro-7H-[1,4]oxazino[2,3,4-ij]quinoline-6-carboxylic acid Chemical compound FC1=CC(C(C(C(O)=O)=C2)=O)=C3N2C(C)COC3=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035495 ADMET Effects 0.000 description 1
- 101150040698 ANGPT2 gene Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108010076365 Adiponectin Proteins 0.000 description 1
- 102000011690 Adiponectin Human genes 0.000 description 1
- 239000000275 Adrenocorticotropic Hormone Substances 0.000 description 1
- PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N Aldosterone Chemical compound C([C@@]1([C@@H](C(=O)CO)CC[C@H]1[C@@H]1CC2)C=O)[C@H](O)[C@@H]1[C@]1(C)C2=CC(=O)CC1 PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N 0.000 description 1
- PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N Aldosterone Natural products C1CC2C3CCC(C(=O)CO)C3(C=O)CC(O)C2C2(C)C1=CC(=O)CC2 PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUXPNBWPIRDVTH-UHFFFAOYSA-N Amifloxacin Chemical compound C1=C2N(NC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCN(C)CC1 RUXPNBWPIRDVTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical class [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010079054 Amyloid beta-Protein Precursor Proteins 0.000 description 1
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 1
- 102100025672 Angiopoietin-related protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710085851 Angiopoietin-related protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100025668 Angiopoietin-related protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710085848 Angiopoietin-related protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100034567 Angiopoietin-related protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100034598 Angiopoietin-related protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710085823 Angiopoietin-related protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 201000003076 Angiosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004881 Angiotensinogen Human genes 0.000 description 1
- 108090001067 Angiotensinogen Proteins 0.000 description 1
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 1
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 1
- 108010005853 Anti-Mullerian Hormone Proteins 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N Antibiotic SQ 26917 Natural products O=C1N(S(O)(=O)=O)C(C)C1NC(=O)C(=NOC(C)(C)C(O)=O)C1=CSC(N)=N1 WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108060006004 Ascorbate peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 241001106067 Atropa Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102400000667 Brain natriuretic peptide 32 Human genes 0.000 description 1
- 101800000407 Brain natriuretic peptide 32 Proteins 0.000 description 1
- 101800002247 Brain natriuretic peptide 45 Proteins 0.000 description 1
- 101710155856 C-C motif chemokine 3 Proteins 0.000 description 1
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 235000021318 Calcifediol Nutrition 0.000 description 1
- WRLFSJXJGJBFJQ-WPUCQFJDSA-N Calcifediol monohydrate Chemical compound O.C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C WRLFSJXJGJBFJQ-WPUCQFJDSA-N 0.000 description 1
- 102400000113 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 241000288950 Callithrix jacchus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004099 Chlortetracycline Substances 0.000 description 1
- 102100025841 Cholecystokinin Human genes 0.000 description 1
- 101800001982 Cholecystokinin Proteins 0.000 description 1
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical class [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000739 Corticotropin Human genes 0.000 description 1
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 1
- 108010022152 Corticotropin-Releasing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000012289 Corticotropin-Releasing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 241001125840 Coryphaenidae Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 108010074918 Cytochrome P-450 CYP1A1 Proteins 0.000 description 1
- 108010074922 Cytochrome P-450 CYP1A2 Proteins 0.000 description 1
- 108010020070 Cytochrome P-450 CYP2B6 Proteins 0.000 description 1
- 102000009666 Cytochrome P-450 CYP2B6 Human genes 0.000 description 1
- 108010026925 Cytochrome P-450 CYP2C19 Proteins 0.000 description 1
- 108010000561 Cytochrome P-450 CYP2C8 Proteins 0.000 description 1
- 108010000543 Cytochrome P-450 CYP2C9 Proteins 0.000 description 1
- 108010001237 Cytochrome P-450 CYP2D6 Proteins 0.000 description 1
- 108010001202 Cytochrome P-450 CYP2E1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031476 Cytochrome P450 1A1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026533 Cytochrome P450 1A2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036194 Cytochrome P450 2A6 Human genes 0.000 description 1
- 102100029363 Cytochrome P450 2C19 Human genes 0.000 description 1
- 102100029359 Cytochrome P450 2C8 Human genes 0.000 description 1
- 102100029358 Cytochrome P450 2C9 Human genes 0.000 description 1
- 102100021704 Cytochrome P450 2D6 Human genes 0.000 description 1
- 102100024889 Cytochrome P450 2E1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039205 Cytochrome P450 3A4 Human genes 0.000 description 1
- 102100039208 Cytochrome P450 3A5 Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N D-mannopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- FMGSKLZLMKYGDP-UHFFFAOYSA-N Dehydroepiandrosterone Natural products C1C(O)CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FMTDIUIBLCQGJB-UHFFFAOYSA-N Demethylchlortetracyclin Natural products C1C2C(O)C3=C(Cl)C=CC(O)=C3C(=O)C2=C(O)C2(O)C1C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C2=O FMTDIUIBLCQGJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000002045 Endothelin Human genes 0.000 description 1
- 108050009340 Endothelin Proteins 0.000 description 1
- 108010092674 Enkephalins Proteins 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- DNXHEGUUPJUMQT-CBZIJGRNSA-N Estrone Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 DNXHEGUUPJUMQT-CBZIJGRNSA-N 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N Everolimus Chemical compound C1C[C@@H](OCCO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003975 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000378 Fibroblast growth factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000003969 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000003967 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102000003968 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 108090000382 Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 102000003956 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100037665 Fibroblast growth factor 9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000367 Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- UIOFUWFRIANQPC-JKIFEVAISA-N Floxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=C(F)C=CC=C1Cl UIOFUWFRIANQPC-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 1
- 102400000442 Ghrelin-28 Human genes 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000001258 Hemangiosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 1
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 1
- 101000924346 Homo sapiens Angiopoietin-related protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000875170 Homo sapiens Cytochrome P450 2A6 Proteins 0.000 description 1
- 101001016865 Homo sapiens Heat shock protein HSP 90-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000713275 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 3 Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000208278 Hyoscyamus Species 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNWYDQPOUQRDLY-UHFFFAOYSA-N L-Selenocystathionine Natural products OC(=O)C(N)CC[Se]CC(N)C(O)=O ZNWYDQPOUQRDLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-UHFFFAOYSA-N L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-proline amide Natural products NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNWYDQPOUQRDLY-WHFBIAKZSA-N L-selenocystathionine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CC[Se]C[C@H]([NH3+])C([O-])=O ZNWYDQPOUQRDLY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 1
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 1
- 239000002136 L01XE07 - Lapatinib Substances 0.000 description 1
- 239000002118 L01XE12 - Vandetanib Substances 0.000 description 1
- 239000002146 L01XE16 - Crizotinib Substances 0.000 description 1
- 239000002144 L01XE18 - Ruxolitinib Substances 0.000 description 1
- 102100020870 La-related protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050008265 La-related protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 1
- XNRVGTHNYCNCFF-UHFFFAOYSA-N Lapatinib ditosylate monohydrate Chemical compound O.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1.O1C(CNCCS(=O)(=O)C)=CC=C1C1=CC=C(N=CN=C2NC=3C=C(Cl)C(OCC=4C=C(F)C=CC=4)=CC=3)C2=C1 XNRVGTHNYCNCFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004640 Melamine resin Substances 0.000 description 1
- 229920000877 Melamine resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000637 Melanocyte-Stimulating Hormone Substances 0.000 description 1
- 108010007013 Melanocyte-Stimulating Hormones Proteins 0.000 description 1
- 101710151321 Melanostatin Proteins 0.000 description 1
- YJPIGAIKUZMOQA-UHFFFAOYSA-N Melatonin Natural products COC1=CC=C2N(C(C)=O)C=C(CCN)C2=C1 YJPIGAIKUZMOQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 240000002769 Morchella esculenta Species 0.000 description 1
- 235000002779 Morchella esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 102100030173 Muellerian-inhibiting factor Human genes 0.000 description 1
- 241000699729 Muridae Species 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010051141 Myeloblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102400000064 Neuropeptide Y Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000289371 Ornithorhynchus anatinus Species 0.000 description 1
- 241000238814 Orthoptera Species 0.000 description 1
- KYGZCKSPAKDVKC-UHFFFAOYSA-N Oxolinic acid Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC2=C1OCO2 KYGZCKSPAKDVKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004100 Oxytetracycline Substances 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 240000004371 Panax ginseng Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000004576 Placental Lactogen Human genes 0.000 description 1
- 108010003044 Placental Lactogen Proteins 0.000 description 1
- 239000000381 Placental Lactogen Substances 0.000 description 1
- 102100039277 Pleiotrophin Human genes 0.000 description 1
- 239000005062 Polybutadiene Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000283080 Proboscidea <mammal> Species 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010087786 Prolactin-Releasing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100028850 Prolactin-releasing peptide Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- MEGPURSNXMUDAE-UHFFFAOYSA-N Scopoline Natural products C1C(O2)CC3N(C)C1C2C3O MEGPURSNXMUDAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDSSPSLGNGIIHP-UHFFFAOYSA-N Se-methyl-L-selenocysteine Natural products C[Se]CC(N)C(O)=O XDSSPSLGNGIIHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037505 Secretin Human genes 0.000 description 1
- 108010086019 Secretin Proteins 0.000 description 1
- RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N Selenium-L-methionine Chemical compound C[Se]CC[C@H](N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N Selenomethionine Natural products C[Se]CCC(N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010208 Seminoma Diseases 0.000 description 1
- 108010005113 Serpin E2 Proteins 0.000 description 1
- 102000005821 Serpin E2 Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 241000790234 Sphingomonas elodea Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- CBPNZQVSJQDFBE-FUXHJELOSA-N Temsirolimus Chemical compound C1C[C@@H](OC(=O)C(C)(CO)CO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 CBPNZQVSJQDFBE-FUXHJELOSA-N 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 239000000627 Thyrotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 102400000336 Thyrotropin-releasing hormone Human genes 0.000 description 1
- 101800004623 Thyrotropin-releasing hormone Proteins 0.000 description 1
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 229920001807 Urea-formaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 208000023915 Ureteral Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046392 Ureteric cancer Diseases 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 235000003095 Vaccinium corymbosum Nutrition 0.000 description 1
- 240000000851 Vaccinium corymbosum Species 0.000 description 1
- 235000017537 Vaccinium myrtillus Nutrition 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 241000863480 Vinca Species 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 1
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 1
- 244000131415 Zanthoxylum piperitum Species 0.000 description 1
- 235000008853 Zanthoxylum piperitum Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical class [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMEGJBVQLJJKKX-HOTMZDKISA-N [(2R,3S,4S,5R,6R)-5-acetyloxy-3,4,6-trihydroxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O1)O)OC(=O)C)O)O SMEGJBVQLJJKKX-HOTMZDKISA-N 0.000 description 1
- KYIKRXIYLAGAKQ-UHFFFAOYSA-N abcn Chemical compound C1CCCCC1(C#N)N=NC1(C#N)CCCCC1 KYIKRXIYLAGAKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010535 acyclic diene metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N aldehydo-D-galacturonic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N 0.000 description 1
- 229960002478 aldosterone Drugs 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical class [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024554 amdinocillin Drugs 0.000 description 1
- 229950009484 amifloxacin Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- XKMRRTOUMJRJIA-UHFFFAOYSA-N ammonia nh3 Chemical compound N.N XKMRRTOUMJRJIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N androst-4-ene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N 0.000 description 1
- 229960003473 androstanolone Drugs 0.000 description 1
- 229960005471 androstenedione Drugs 0.000 description 1
- AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N androstenedione Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 239000000868 anti-mullerian hormone Substances 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003623 azlocillin Drugs 0.000 description 1
- JTWOMNBEOCYFNV-NFFDBFGFSA-N azlocillin Chemical compound N([C@@H](C(=O)N[C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)N1CCNC1=O JTWOMNBEOCYFNV-NFFDBFGFSA-N 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N aztreonam Chemical compound O=C1N(S([O-])(=O)=O)[C@@H](C)[C@@H]1NC(=O)C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)\C1=CSC([NH3+])=N1 WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N 0.000 description 1
- 229960003644 aztreonam Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N berberine Natural products COc1ccc2C=C3N(Cc2c1OC)C=Cc4cc5OCOc5cc34 QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N berberine Chemical compound C1=C2CC[N+]3=CC4=C(OC)C(OC)=CC=C4C=C3C2=CC2=C1OCO2 YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093265 berberine Drugs 0.000 description 1
- 108010042362 beta-Lipotropin Proteins 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- LRCVOOBIVXNBIT-NQUDVWKHSA-N bis[2-[(8s,9s,10r,11s,13s,14s,17r)-11,17-dihydroxy-10,13-dimethyl-3-oxo-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-oxoethyl] butanedioate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]([C@@H](O)C[C@]23C)[C@@H]1[C@@H]3CC[C@]2(O)C(=O)COC(=O)CCC(=O)OCC(=O)[C@@]1(O)CC[C@H]2[C@H](CCC=3[C@@]4(CCC(=O)C=3)C)[C@@H]4[C@@H](O)C[C@@]21C LRCVOOBIVXNBIT-NQUDVWKHSA-N 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 235000021014 blueberries Nutrition 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229960004361 calcifediol Drugs 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960005084 calcitriol Drugs 0.000 description 1
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 description 1
- 235000020964 calcitriol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011612 calcitriol Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 229940105657 catalase Drugs 0.000 description 1
- 229950002823 cefoxazole Drugs 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 229920001727 cellulose butyrate Polymers 0.000 description 1
- 201000007455 central nervous system cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- BWWVAEOLVKTZFQ-ISVUSNJMSA-N chembl530 Chemical compound N(/[C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)=C\N1CCCCCC1 BWWVAEOLVKTZFQ-ISVUSNJMSA-N 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N chlorotetracycline Natural products C1=CC(Cl)=C2C(O)(C)C3CC4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004475 chlortetracycline Drugs 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N chlortetracycline Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940107137 cholecystokinin Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960004621 cinoxacin Drugs 0.000 description 1
- VDUWPHTZYNWKRN-UHFFFAOYSA-N cinoxacin Chemical compound C1=C2N(CC)N=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC2=C1OCO2 VDUWPHTZYNWKRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003326 cloxacillin Drugs 0.000 description 1
- LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N cloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1Cl LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Chemical class 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 229940041967 corticotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- KLVRDXBAMSPYKH-RKYZNNDCSA-N corticotropin-releasing hormone (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(N)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CNC=N1 KLVRDXBAMSPYKH-RKYZNNDCSA-N 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 229960005061 crizotinib Drugs 0.000 description 1
- KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N crizotinib Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NC=1)N)=CC=1C(=C1)C=NN1C1CCNCC1 KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004244 cyclacillin Drugs 0.000 description 1
- HGBLNBBNRORJKI-WCABBAIRSA-N cyclacillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C1(N)CCCCC1 HGBLNBBNRORJKI-WCABBAIRSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N 0.000 description 1
- 229960002398 demeclocycline Drugs 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229960001585 dicloxacillin Drugs 0.000 description 1
- YFAGHNZHGGCZAX-JKIFEVAISA-N dicloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=C(Cl)C=CC=C1Cl YFAGHNZHGGCZAX-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- OYFJQPXVCSSHAI-QFPUQLAESA-N enalapril maleate Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O.C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OYFJQPXVCSSHAI-QFPUQLAESA-N 0.000 description 1
- ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N endothelin-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N 0.000 description 1
- 229960002549 enoxacin Drugs 0.000 description 1
- IDYZIJYBMGIQMJ-UHFFFAOYSA-N enoxacin Chemical compound N1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCNCC1 IDYZIJYBMGIQMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N epoprostenol Chemical compound O1C(=CCCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]21 KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N 0.000 description 1
- 229960001123 epoprostenol Drugs 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 1
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 229960001348 estriol Drugs 0.000 description 1
- PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N estriol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H]([C@H](O)C4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960003399 estrone Drugs 0.000 description 1
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005167 everolimus Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N fasudil Chemical compound C=1C=CC2=CN=CC=C2C=1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940029303 fibroblast growth factor-1 Drugs 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 1
- 150000002213 flavones Chemical class 0.000 description 1
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 229960004273 floxacillin Drugs 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 1
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012835 hanging drop method Methods 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000002386 heptoses Chemical class 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002681 hypalon Polymers 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-LECHCGJUSA-N iduronic acid Chemical compound O=C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-LECHCGJUSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 210000004966 intestinal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920000554 ionomer Polymers 0.000 description 1
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 1
- WBAVLTNIRYDCPM-UHFFFAOYSA-N isoscopolin Natural products COC1=CC=2OC(=O)C=CC=2C=C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O WBAVLTNIRYDCPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229960004891 lapatinib Drugs 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 208000012804 lymphangiosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003987 melatonin Drugs 0.000 description 1
- DRLFMBDRBRZALE-UHFFFAOYSA-N melatonin Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(CCNC(C)=O)C2=C1 DRLFMBDRBRZALE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940042016 methacycline Drugs 0.000 description 1
- GYADARQSUQSWFB-UHFFFAOYSA-N methoxy-N-(2-phenylacetyl)phosphonamidic acid Chemical compound COP(O)(=O)NC(CC1=CC=CC=C1)=O GYADARQSUQSWFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 231100000782 microtubule inhibitor Toxicity 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004023 minocycline Drugs 0.000 description 1
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000515 nafcillin Drugs 0.000 description 1
- GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N nafcillin Chemical compound C1=CC=CC2=C(C(=O)N[C@@H]3C(N4[C@H](C(C)(C)S[C@@H]43)C(O)=O)=O)C(OCC)=CC=C21 GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005709 nerve cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N nesiritide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001180 norfloxacin Drugs 0.000 description 1
- OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N norfloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCNCC1 OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000020205 notochordal tumor Diseases 0.000 description 1
- URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N nucleopeptide y Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229960001699 ofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical group 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 1
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- 229960000321 oxolinic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000625 oxytetracycline Drugs 0.000 description 1
- IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N oxytetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3[C@H](O)[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N 0.000 description 1
- 235000019366 oxytetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- FHFYDNQZQSQIAI-UHFFFAOYSA-N pefloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCN(C)CC1 FHFYDNQZQSQIAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NONJJLVGHLVQQM-JHXYUMNGSA-N phenethicillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C(C)OC1=CC=CC=C1 NONJJLVGHLVQQM-JHXYUMNGSA-N 0.000 description 1
- 229960004894 pheneticillin Drugs 0.000 description 1
- 239000005011 phenolic resin Substances 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229960001732 pipemidic acid Drugs 0.000 description 1
- JOHZPMXAZQZXHR-UHFFFAOYSA-N pipemidic acid Chemical compound N1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CN=C1N1CCNCC1 JOHZPMXAZQZXHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002292 piperacillin Drugs 0.000 description 1
- WCMIIGXFCMNQDS-IDYPWDAWSA-M piperacillin sodium Chemical compound [Na+].O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@H](C=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C([O-])=O)C(C)(C)S[C@@H]21 WCMIIGXFCMNQDS-IDYPWDAWSA-M 0.000 description 1
- 229960004444 piromidic acid Drugs 0.000 description 1
- RCIMBBZXSXFZBV-UHFFFAOYSA-N piromidic acid Chemical compound N1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CN=C1N1CCCC1 RCIMBBZXSXFZBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 235000002378 plant sterols Nutrition 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 150000003057 platinum Chemical class 0.000 description 1
- 229920001084 poly(chloroprene) Polymers 0.000 description 1
- 229920002432 poly(vinyl methyl ether) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002857 polybutadiene Polymers 0.000 description 1
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 1
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002847 prasterone Drugs 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 239000002877 prolactin releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000003197 protein kinase B inhibitor Substances 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003590 rho kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 229960000215 ruxolitinib Drugs 0.000 description 1
- HFNKQEVNSGCOJV-OAHLLOKOSA-N ruxolitinib Chemical compound C1([C@@H](CC#N)N2N=CC(=C2)C=2C=3C=CNC=3N=CN=2)CCCC1 HFNKQEVNSGCOJV-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- SGTCGCCQZOUMJJ-YMILTQATSA-N scopolin Chemical compound COC1=CC=2C=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SGTCGCCQZOUMJJ-YMILTQATSA-N 0.000 description 1
- SGTCGCCQZOUMJJ-UHFFFAOYSA-N scopolin Natural products COC1=CC=2C=CC(=O)OC=2C=C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O SGTCGCCQZOUMJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 description 1
- OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N secretin human Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N 0.000 description 1
- SPVXKVOXSXTJOY-UHFFFAOYSA-N selane Chemical compound [SeH2] SPVXKVOXSXTJOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000058 selane Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960002718 selenomethionine Drugs 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 230000035936 sexual power Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004447 silicone coating Substances 0.000 description 1
- 229920002050 silicone resin Polymers 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000011655 sodium selenate Substances 0.000 description 1
- 235000018716 sodium selenate Nutrition 0.000 description 1
- 229960001881 sodium selenate Drugs 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000012879 subculture medium Substances 0.000 description 1
- 229940032330 sulfuric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-HZAMXZRMSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-HZAMXZRMSA-N 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- LPQZKKCYTLCDGQ-WEDXCCLWSA-N tazobactam Chemical compound C([C@]1(C)S([C@H]2N(C(C2)=O)[C@H]1C(O)=O)(=O)=O)N1C=CN=N1 LPQZKKCYTLCDGQ-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- 229960003865 tazobactam Drugs 0.000 description 1
- 229960004576 temafloxacin Drugs 0.000 description 1
- 229960000235 temsirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-UHFFFAOYSA-N temsirolimus Natural products C1CC(O)C(OC)CC1CC(C)C1OC(=O)C2CCCCN2C(=O)C(=O)C(O)(O2)C(C)CCC2CC(OC)C(C)=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C(OC)C(O)C(C)=CC(C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N terramycin dehydrate Natural products C1=CC=C2C(O)(C)C3C(O)C4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003538 tetroses Chemical class 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005979 thermal decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002803 thermoplastic polyurethane Polymers 0.000 description 1
- RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N thromboxane Chemical compound CCCCCCCC[C@H]1OCCC[C@@H]1CCCCCCC RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940034199 thyrotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004659 ticarcillin Drugs 0.000 description 1
- OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N ticarcillin Chemical compound C=1([C@@H](C(O)=O)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)C=CSC=1 OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 229960004066 trametinib Drugs 0.000 description 1
- LIRYPHYGHXZJBZ-UHFFFAOYSA-N trametinib Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC(N2C(N(C3CC3)C(=O)C3=C(NC=4C(=CC(I)=CC=4)F)N(C)C(=O)C(C)=C32)=O)=C1 LIRYPHYGHXZJBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N trans-Zeatin Natural products OCC(/C)=C\CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 1
- 150000003641 trioses Chemical class 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229960000241 vandetanib Drugs 0.000 description 1
- UHTHHESEBZOYNR-UHFFFAOYSA-N vandetanib Chemical compound COC1=CC(C(/N=CN2)=N/C=3C(=CC(Br)=CC=3)F)=C2C=C1OCC1CCN(C)CC1 UHTHHESEBZOYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229940023877 zeatin Drugs 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Chemical class 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/002—Culture media for tissue culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
【課題】動植物細胞及び/又は組織を、特に三次元或いは浮遊状態にて培養するための培地組成物と当該培地組成物を用いた動植物細胞及び/又は組織の培養方法を提供すること。【解決手段】本発明は、不定形な構造体を液体培地中で形成し、当該構造体が当該溶液中にて均一に分散し、当該溶液の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を実質的に保持することで、その沈降を防ぐ効果を有する培地組成物を用いて、細胞及び/又は組織を浮遊状態にて培養させることを特徴とする細胞及び/又は組織の培養方法等を提供する。【選択図】図1
Description
本発明は、細胞又は組織を浮遊させることを可能とする構造体を含有する培地組成物、及び当該培地組成物を用いることを特徴とする細胞又は組織の培養方法に関する。本発明の培地組成物及びそれを用いた細胞培養方法は、動植物細胞及び/又は組織を特に浮遊状態にて培養する際に好適に利用することができる。
近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖或いは維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖或いは維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化或いは維持することは細胞培養と呼ばれている。細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。また、当該技術により培養された細胞及び/又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。
動物由来の細胞は、その性状から浮遊細胞と接着細胞に大きく2分される。浮遊細胞は、生育・増殖に足場を必要としない細胞であり、接着細胞は、生育・増殖に足場を必要とする細胞であるが、生体を構成する大部分の細胞は後者の接着細胞である。接着細胞の培養方法としては、単層培養、分散培養、包埋培養、マイクロキャリア培養、及びスフェア培養等が知られている。
単層培養は、ガラス或いは種々の表面処理を行った合成高分子材料から成る培養容器や、フィーダー細胞と呼ばれる補助的な細胞を足場として目的の細胞を単層状に培養する方法であり、最も一般的に普及している。例えば、ポリスチレンに対して種々の表面処理(プラズマ処理、コロナ処理等)を施したもの、コラーゲン、フィブロネクチン、ポリリジンなどの細胞接着因子をコーティングしたもの、或いはフィーダー細胞を予め播種したもの等、種々の形状又は性状の培養容器を用いた培養方法が開発されている。しかしながら、単層培養は、その二次元的培養環境が生体内での環境と全く異なるために細胞が生体内で有している特異的な機能を長期間維持することができない、生体内と同様な組織を再構築する事ができない、一定面積当たりの細胞数が制限されるため細胞の大量培養には向かない、等が問題となっている(特許文献1)。また、フィーダー細胞上にて目的の細胞を培養する方法は、フィーダー細胞と目的の細胞との分離が問題となる場合がある(非特許文献1)。
分散培養は、培地中に細胞を播いた後、細胞の付着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて、その培養液を撹拌し続けることにより細胞の培養容器への接着を阻害し、浮遊状態で接着細胞を培養する方法である。しかしながら、当該方法で培養される接着細胞は足場への接着ができないため、細胞増殖のために足場への接着を必須とする細胞には応用できない。また、せん断力で常時破砕されることにより本来の細胞機能を発揮できないため、機能を有する細胞を大量に培養することができない場合がある(非特許文献2)。
包埋培養は、寒天、メチルセルロース、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アガロース、アルギン酸塩等の固形或いは半固体のゲル基材の中に細胞を埋め込み、固定させて培養する方法である。当該方法は、細胞を生体内に近い形で三次元的に培養することを可能
とし、ゲル基材そのものが細胞の増殖や分化を促進する場合もあるため単層培養や分散培養と比較して、細胞の機能を維持したまま細胞を高密度に培養することが可能である(特許文献2、3)。更に、これらのゲル基材を細胞に埋め込んだ状態で大きさ100~300μmのマイクロカプセルを作成し、当該マイクロカプセルを分散させながら水溶液培地で細胞を培養する方法も開発されている(非特許文献3)。しかしながら、これらの方法は、ゲル基材が可視光を透過しない場合は培養細胞の継時的な観察ができない、ゲル基材を含む培地やマイクロカプセルは粘度が高いため当該培地中から細胞を回収するために酵素処理(例えば、コラーゲンゲルの場合はコラゲナーゼ処理)等の煩雑かつ細胞に障害を与える操作を必要とする、長期間培養する際に必要な培地交換が困難である等の問題を有している。近年、熱やせん断力などの処理によりゲル基材から細胞回収が可能となる技術が開発されているが、熱やせん断力等は細胞機能に悪影響を与えることがある上に、当該ゲル基材の生体に対する安全性については未だ明らかにはなっていない(特許文献4、5、非特許文献4、5、6、7)。また、小さくカットした果実や野菜等の粒状食品を均一に分散、浮遊させ、その沈殿や浮上を防ぐためのゾル状食品が食品分野にて開発されているが、当該ゾル状食品は分散させた粒状食品を回収することは考慮しておらず、細胞や組織を浮遊状態で培養できるかどうかの検討もなされていない(特許文献6)。
とし、ゲル基材そのものが細胞の増殖や分化を促進する場合もあるため単層培養や分散培養と比較して、細胞の機能を維持したまま細胞を高密度に培養することが可能である(特許文献2、3)。更に、これらのゲル基材を細胞に埋め込んだ状態で大きさ100~300μmのマイクロカプセルを作成し、当該マイクロカプセルを分散させながら水溶液培地で細胞を培養する方法も開発されている(非特許文献3)。しかしながら、これらの方法は、ゲル基材が可視光を透過しない場合は培養細胞の継時的な観察ができない、ゲル基材を含む培地やマイクロカプセルは粘度が高いため当該培地中から細胞を回収するために酵素処理(例えば、コラーゲンゲルの場合はコラゲナーゼ処理)等の煩雑かつ細胞に障害を与える操作を必要とする、長期間培養する際に必要な培地交換が困難である等の問題を有している。近年、熱やせん断力などの処理によりゲル基材から細胞回収が可能となる技術が開発されているが、熱やせん断力等は細胞機能に悪影響を与えることがある上に、当該ゲル基材の生体に対する安全性については未だ明らかにはなっていない(特許文献4、5、非特許文献4、5、6、7)。また、小さくカットした果実や野菜等の粒状食品を均一に分散、浮遊させ、その沈殿や浮上を防ぐためのゾル状食品が食品分野にて開発されているが、当該ゾル状食品は分散させた粒状食品を回収することは考慮しておらず、細胞や組織を浮遊状態で培養できるかどうかの検討もなされていない(特許文献6)。
マイクロキャリア培養は、水よりも僅かに重い微粒子(以下、マイクロキャリアともいう)の表面上に細胞を単層に増殖させ、当該微粒子をフラスコ等の培養容器内で撹拌し、浮遊状態での培養を行うものである。通常、当該方法で用いるマイクロキャリアは、直径100~300μm、表面積3000~6000cm2/g、比重1.03~1.05の球状粒子であり、デキストラン、ゼラチン、アルギン酸あるいはポリスチレン等の素材により構成されている。マイクロキャリアの表面には細胞が付着しやすいように、コラーゲン、ゼラチンまたはジメチルアミノエチル等の荷電基を付与することもできる。当該方法は、培養面積を極めて増大させることが可能になるため、細胞の大量培養に応用されている(特許文献7、8)。しかしながら、全てのマイクロキャリアで目的とする細胞をほぼ均一に付着させることは困難であり、また、撹拌中のせん断力により細胞がマイクロキャリアから脱離する、細胞が障害を受ける等が問題となっている(非特許文献8)。
スフェア培養は、目的の細胞が、数十~数百個から成る凝集塊(以下、スフェアともいう)を形成させた後、当該凝集塊を培地中で静置或いは振とうして培養する方法である。スフェアは、細胞密度が高く、生体内環境に近い細胞-細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、単層培養、分散培養法よりも細胞機能を長期的に維持したまま培養できることが知られている(非特許文献9、10)。しかしながら、スフェア培養は、スフェアのサイズが大きすぎる場合、スフェア内部の栄養分の供給と老廃物の排出が困難となるため、大きなスフェアを形成させることができない。また、形成したスフェアは培養容器の底面において分散状態で培養する必要があるため、一定体積あたりのスフェア数を増やすことが困難であり、大量培養には向かない。さらに、スフェアの作成方法としては、懸滴培養、細胞非接着表面での培養、マイクロウェル内での培養、回転培養、細胞の足場を利用した培養、遠心力や超音波、電場・磁場による凝集などが知られているが、これらの方法は操作が煩雑、スフェアの回収が困難、サイズの制御と大量生産が困難、細胞に対する影響が不明、特殊な専用容器や装置が必要である等が問題となっている(特許文献9)。
一方、植物に関しても細胞、細胞壁を除去したプロトプラストあるいは植物の葉、茎、根、成長点、種子、胚、花粉などの器官、組織、カルスを無菌の状態で培養して増やすことができる。このような植物の組織や細胞の培養技術を用いて、植物の品種改良や有用物質生産も可能となっている。植物の細胞や組織を短期間で大量に増殖させるための手法として、植物細胞や組織を液体培地で懸濁培養する方法が知られている(非特許文献11)。それらの良好な増殖を達成するためには、十分な酸素の供給と均一な混合状態の維持、
さらに細胞の破損を防ぐ等が重要である。培養液への酸素の供給と細胞や組織の懸濁は、通気と機械的攪拌とを組み合わせて行なわれる場合と、通気のみにより行なわれる場合とがあるが、前者は、攪拌による細胞や組織の破損が原因で増殖不良を招く場合があり、一方、後者は細胞や組織のせん断は少ないが、高密度培養では均一な混合状態を維持することが困難となる場合があるため、細胞や組織が沈降して増殖効率が低下する等の問題がある。
さらに細胞の破損を防ぐ等が重要である。培養液への酸素の供給と細胞や組織の懸濁は、通気と機械的攪拌とを組み合わせて行なわれる場合と、通気のみにより行なわれる場合とがあるが、前者は、攪拌による細胞や組織の破損が原因で増殖不良を招く場合があり、一方、後者は細胞や組織のせん断は少ないが、高密度培養では均一な混合状態を維持することが困難となる場合があるため、細胞や組織が沈降して増殖効率が低下する等の問題がある。
さらに、抗がん剤の研究開発或いはがん治療における適切な抗がん剤の選択のために、候補薬剤或いは抗がん剤を含有する培養液中でがん細胞を生体外で培養することにより、がん細胞に対する薬剤の抗がん活性を評価することが行われている。しかし、既存の抗がん活性の評価方法では、生体外での評価結果と実際の臨床効果に乖離がある等の問題が存在する。当該問題を改善するため、体内環境をできるだけ再現した細胞培養条件にて活性評価を行う手法が開発されてきた。例えば、軟寒天、コラーゲンゲル、ハイドロゲル等の支持体にてがん細胞を包埋することにより、培養容器への接着を阻害した環境でがん細胞を培養し、抗がん剤の評価を行う方法が開発されている(特許文献10、非特許文献12、13)。また、培養容器表面を細胞接着の阻害材料にてコーティングすることや、表面に特殊な加工を施すことにより細胞接着を阻害してがん細胞を凝集させた状態にて培養(スフェア培養)し、抗がん活性の評価を行う方法が開発されている(特許文献11、12)。
しかしながら、これらのがん細胞培養法は、培養容器の作成過程及び細胞培養の操作が煩雑である、コラーゲン等の支持体から細胞を回収して抗がん活性を評価する際の操作が煩雑である、支持体が動物由来の成分である際には高価であるためにその供給が制限される場合がある、細胞凝集塊(スフェア)同士の会合が生じてその大きさが過剰になり細胞生存率や再現性が低くなる等の様々な問題がある。その上、抗がん剤のスクリーニングを実施する際には、簡便かつ均一で、大量のサンプルを処理できる、再現性の高いがん細胞の培養方法が求められている。
加えて、医薬品候補剤或いは医薬品を含有する培養液中で肝細胞を生体外で培養することにより、肝細胞に対する医薬品候補剤或いは医薬品の各種活性を評価することが行われている。しかし、肝細胞を生体外で培養すると本来生体内で有している機能が失われる場合があるため、既存の肝細胞の培養方法では、医薬品候補剤或いは医薬品の正確な評価ができない、多数のサンプルの評価が困難である等の問題が存在した。当該問題を克服するため、体内環境をできるだけ再現した細胞培養条件にて活性評価を行う手法が開発されてきた。例えば、コラーゲン、ラミニン、マトリゲル(登録商標)等の細胞外マトリックス上にて肝細胞を培養し、肝細胞の機能を維持する方法が開発されている(特許文献13、非特許文献14、15)。また、培養容器表面を細胞接着の阻害材料にてコーティングする、容器表面に特殊な加工を施すことにより細胞接着を阻害する、培養容器を振動させる等の処理により肝細胞の凝集塊(スフェア)を形成させ、肝細胞の機能を維持する方法が開発されている(特許文献14、15、非特許文献16、17)。
しかしながら、これらの肝細胞培養法は、培養容器の作成過程及び細胞培養の操作が煩雑である、コラーゲン等の支持体から細胞を回収して肝細胞機能を評価する際の操作が煩雑である、支持体が動物由来の成分であると高価である故その供給が制限される場合がある、細胞凝集塊(スフェア)同士の会合が生じてその大きさが過剰になるために細胞生存率や再現性が低くなる等の様々な問題がある。その上、医薬品候補剤或いは医薬品のスクリーニングを実施する際には、簡便かつ均一で、大量のサンプルを処理できる、再現性の高い肝細胞の培養方法が求められている。
Klimanskayaら,Lancet 2005,365:1636-1641
Kingら,Curr Opin Chem Biol. 2007,11:394-398
Muruaら,J.of Controlled Release 2008,132:76-83
Mendes, Chemical Society Reviews 2008,37:2512-2529
Moonら,Chemical Society Reviews2012,41:4860-4883
Pekら,Nature Nanotechnol. 2008,3:671-675
Liuら,Soft Matter 2011,7:5430-5436
Leungら,Tissue Engineering 2011,17:165-172
Stahlら,Biochem.Biophys.Res.Comm. 2004,322:684-692
Linら,Biotechnol J. 2008,3:1172-1184
Weathersら,Appl Microbiol Biotechnol 2010,85:1339-1351
Takamuraら,Int.J.Cancer 2002,98:450-455
Yangら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1979,76:3401-3405
Bissellら,J. Clin. Invest.1987,79:801-812
LeCluyseら,Critical Reviews in Toxicology 2012,42:501-548
Brophyら,Hepatology 2009,49:578-586
Franziskaら,World J Hepatol 2010,2:1-7
本発明の目的は、上記の従来技術の問題を解決し、動植物細胞及び/又は組織を、特に三次元或いは浮遊状態にて培養するための培地組成物と当該培地組成物を用いた動植物細胞及び/又は組織の培養方法を提供することにある。
また、本発明の目的は、上記の従来技術の問題を解決し、がん細胞の細胞凝集塊(スフェア)を、三次元環境にて培養するための培地組成物と当該培地組成物を用いたがん細胞の試験方法を提供することにある。
あるいは、本発明の目的は、上記の従来技術の問題を解決し、肝細胞の細胞凝集塊(スフェア)を、三次元環境にて培養するための培地組成物と当該培地組成物を用いたがん細胞の試験方法を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、がん細胞の培養において、がん細胞の増殖を促進する培地添加剤を提供すること、及び、肝細胞の培養において、肝細胞数の減少を抑制する培地添加剤を提供することにある。
また、本発明の目的は、上記の従来技術の問題を解決し、がん細胞の細胞凝集塊(スフェア)を、三次元環境にて培養するための培地組成物と当該培地組成物を用いたがん細胞の試験方法を提供することにある。
あるいは、本発明の目的は、上記の従来技術の問題を解決し、肝細胞の細胞凝集塊(スフェア)を、三次元環境にて培養するための培地組成物と当該培地組成物を用いたがん細胞の試験方法を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、がん細胞の培養において、がん細胞の増殖を促進する培地添加剤を提供すること、及び、肝細胞の培養において、肝細胞数の減少を抑制する培地添加剤を提供することにある。
本発明者らは、各種化合物及びそれらを含有する液体培地における細胞及び/又は組織の浮遊効果について鋭意研究した結果、当該液体培地中の粘度を実質的に高めることなく細胞及び/又は組織を浮遊状態で均一に分散させることができる構造体の発見に成功した。当該構造体を少なくとも含む培地組成物を用いると、浮遊状態を維持したまま、細胞及び/又は組織が増殖、分化或いは維持できることを見出した。更に、当該培地組成物から、培養した細胞及び/又は組織を容易に回収することができることも見出し、本発明を完成させるに至った。
また、本発明者らは、各種化合物及びそれらを含有する液体培地のがん細胞凝集塊(スフェア)に対する効果について鋭意研究した結果、当該スフェア同士の会合を防ぎ、均一に分散させることができる培地組成物の発見に成功した。当該培地組成物を用いると当該スフェアを生存率高く培養することが可能であり、がん細胞に対する抗がん剤の活性を効率的かつ感度よく評価できることを見出した。更に、当該培地組成物から、培養したスフェアを容易に回収して評価することができることも見出し、本発明を完成させるに至った。
あるいは、本発明者らは、各種化合物及びそれらを含有する液体培地の肝細胞凝集塊(スフェア)に対する効果について鋭意研究した結果、当該スフェア同士の会合を防ぎ、均一に分散させることができる培地組成物の発見に成功した。当該培地組成物を用いると当該スフェアを生存率高く、肝細胞としての機能を維持したまま培養することが可能であり、肝細胞に対する医薬品候補剤或いは医薬品の効果を効率的かつ感度よく評価できることを見出した。更に、当該培地組成物から、培養したスフェアを容易に回収して評価することができることも見出し、本発明を完成させるに至った。
さらに、本発明者らは、がん細胞を含む培地に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を添加したところ、がん細胞の増殖が大きく促進されることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
加えて、本発明者らは、肝細胞を含む培地に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を添加したところ、肝細胞数の減少が抑制されることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
また、本発明者らは、各種化合物及びそれらを含有する液体培地のがん細胞凝集塊(スフェア)に対する効果について鋭意研究した結果、当該スフェア同士の会合を防ぎ、均一に分散させることができる培地組成物の発見に成功した。当該培地組成物を用いると当該スフェアを生存率高く培養することが可能であり、がん細胞に対する抗がん剤の活性を効率的かつ感度よく評価できることを見出した。更に、当該培地組成物から、培養したスフェアを容易に回収して評価することができることも見出し、本発明を完成させるに至った。
あるいは、本発明者らは、各種化合物及びそれらを含有する液体培地の肝細胞凝集塊(スフェア)に対する効果について鋭意研究した結果、当該スフェア同士の会合を防ぎ、均一に分散させることができる培地組成物の発見に成功した。当該培地組成物を用いると当該スフェアを生存率高く、肝細胞としての機能を維持したまま培養することが可能であり、肝細胞に対する医薬品候補剤或いは医薬品の効果を効率的かつ感度よく評価できることを見出した。更に、当該培地組成物から、培養したスフェアを容易に回収して評価することができることも見出し、本発明を完成させるに至った。
さらに、本発明者らは、がん細胞を含む培地に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を添加したところ、がん細胞の増殖が大きく促進されることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
加えて、本発明者らは、肝細胞を含む培地に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を添加したところ、肝細胞数の減少が抑制されることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は下記のとおりである:
(1)細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有することを特徴とする培地組
成物。
(2)培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において細胞または組織の回収が可能である(1)記載の培地組成物。
(3)培地組成物からの細胞または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない(1)記載の培地組成物。
(4)粘度が、8mPa・s以下であることを特徴とする(1)記載の培地組成物。
(5)前記構造体の大きさが、フィルターで濾過した場合、孔径が0.2μm乃至200μmのフィルターを通過するものであることを特徴とする(1)記載の培地組成物。
(6)前記構造体が高分子化合物を含有することを特徴とする(1)記載の培地組成物。(7)前記高分子化合物が、アニオン性官能基を有する高分子化合物を含有することを特徴とする(6)記載の培地組成物。
(8)前記高分子化合物が、多糖類であることを特徴とする(6)記載の培地組成物。
(9)前記アニオン性官能基が、カルボキシ基、スルホ基およびリン酸基からなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(7)記載の培地組成物。
(10)前記多糖類が、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(8)に記載の培地組成物。
(11)前記多糖類が、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン及びそれらの塩からなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(10)に記載の培地組成物。
(12)前記多糖類が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩であることを特徴とする(10)又は(11)に記載の培地組成物。
(13)前記脱アシル化ジェランガムまたはその塩の培地組成物に対する最終濃度が、0.001~1.0%(重量/容量)であることを特徴とする(12)に記載の培地組成物。
(14)さらに、脱アシル化ジェランガムまたはその塩以外の多糖類を含有することを特徴とする(13)に記載の培地組成物。
(15)前記多糖類が、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム及びそれらの塩からなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(14)に記載の培地組成物。
(16)前記多糖類が、メチルセルロース、ローカストビーンガム及びそれらの塩からなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(14)に記載の培地組成物。
(17)さらに、金属イオンを含有することを特徴とする(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の培地組成物。
(18)前記金属イオンが、2価の金属イオンであることを特徴とする(17)記載の培地組成物。
(19)前記金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオンからなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(18)記載の培地組成物。
(20)前記金属イオンが、カルシウムイオンであることを特徴とする(19)記載の培地組成物。
(21)さらに、カルシウムイオン以外の金属イオンを含有することを特徴とする(20)に記載の培地組成物。
(22)前記金属イオンが、マグネシウムイオン、ナトリウムイオンおよびカリウムイオンからなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(21)記載の培地組成物。
(23)さらに、細胞外マトリックス及び/又は細胞接着分子を含有することを特徴とする(1)乃至(22)のいずれか1項に記載の培地組成物。
(24)前記細胞外マトリックスが、コラーゲン、ヒアルロン酸およびプロテオグリカンからなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(23)に記載の培地組成物。
(25)前記細胞接着分子が、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンからなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(23)に記載の培地組成物。
(26)細胞培養用である、(1)乃至(25)のいずれか1項に記載の培地組成物。
(27)前記細胞が、接着細胞または浮遊細胞であることを特徴とする(26)に記載の培地組成物。
(28)前記接着細胞が、マイクロキャリアに付着した状態であることを特徴とする(27)に記載の培地組成物。
(29)前記接着細胞が、担体に包埋した状態であることを特徴とする(27)に記載の培地組成物。
(30)前記接着細胞が、スフェアであることを特徴とする(27)に記載の培地組成物。
(31)前記接着細胞が、多能性幹細胞、がん細胞及び肝細胞からなる群から選択されることを特徴とする(27)に記載の培地組成物。
(32)(1)乃至(31)のいずれか1項に記載の培地組成物と、細胞又は組織とを含む、細胞又は組織培養物。
(33)(1)乃至(31)のいずれか1項に記載の培地組成物中で細胞または組織を培養することを特徴とする、細胞又は組織の培養方法。
(34)前記細胞が、多能性幹細胞、がん細胞、肝細胞からなる群から選択されることを特徴とする(33)に記載の培養方法。
(35)(32)の培養物から細胞または組織を分離することを特徴とする、細胞又は組織の回収方法。
(36)前記分離が、ろ過、遠心または磁性分離で行われることを特徴とする(35)に記載の回収方法。
(37)(1)乃至(31)のいずれか1項に記載の培地組成物中で接着細胞を培養することを特徴とするスフェアの製造方法。
(38)抗がん剤をスクリーニングする方法であって、
(a)被験物質の存在下及び非存在下、請求項1乃至31のいずれか1項に記載の培地組成物中でがん細胞を培養する工程、及び
(b)がん細胞の増殖の変化を解析する工程、を含むことを特徴とする方法。
(39)さらに、被験物質の非存在下の場合と比べて、がん細胞の増殖を抑制する物質を候補物質として選択する工程を含むことを特徴とする、(38)に記載の方法。
(40)肝細胞に作用する医薬品候補物質をスクリーニングする方法であって、
(a)被験物質の存在下及び非存在下、請求項1乃至31のいずれか1項に記載の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び
(b)肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含むことを特徴とする方法。
(41)さらに、被験物質の非存在下の場合と比べて、肝細胞の生理学的機能を抑制又は増加する物質を候補物質として選択する工程を含むことを特徴とする、(40)に記載の方法。
(42)肝細胞に作用する医薬品候補物質の薬効又は毒性を評価する方法であって、
(a)被験物質の存在下及び非存在下、請求項1乃至31のいずれか1項に記載の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び
(b)肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含むことを特徴とする方法。
(43)細胞または組織を浮遊させて培養することができる培地組成物を調製するための培地添加剤であって、高分子化合物が溶媒中に溶解または分散していることを特徴とする培地添加剤。
(44)滅菌された状態であることを特徴とする(43)に記載の培地添加剤。
(45)前記高分子化合物がアニオン性官能基を有する高分子化合物である、(43)又は(44)に記載の培地添加剤。
(46)前記高分子化合物が脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、(43)又は(44)に記載の培地添加剤。
(47)細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物の製造方法であって、高分子化合物と培地を混合することを特徴とする培地組成物の製造方法。
(48)(43)乃至(46)のいずれか1項に記載の培地添加剤と培地とを混合するこ
とを特徴とする(47)に記載の培地組成物の製造方法。
(49)前記培地が溶媒中に溶解または分散していることを特徴とする(48)に記載の培地組成物の製造方法。
(50)前記高分子化合物がアニオン性官能基を有する高分子化合物である、(47)に記載の培地組成物の製造方法。
(51)前記高分子化合物が脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、(50)に記載の培地組成物の製造方法。
(52)前記高分子化合物と培地を、水と混合することを特徴とする(47)に記載の培地組成物の製造方法。
(53)水と混合した後、80~130℃で加熱することを特徴とする(52)に記載の培地組成物の製造方法。
(54)100~125℃で加熱することを特徴とする(53)に記載の培地組成物の製造方法。
(55)ろ過滅菌することを特徴とする(47)に記載の培地組成物の製造方法。
(56)前記ろ過滅菌が0.1~0.5μmのフィルターを通過させることを特徴とする(55)に記載の培地組成物の製造方法。
(57)脱アシル化ジェランガム若しくはその塩、又はダイユータンガム若しくはその塩を含むがん細胞用培地添加剤。
(58)がん細胞の培養において、がん細胞の増殖を促進する、(57)に記載の添加剤。
(59)抗がん剤の抗がん活性を評価するために用いられる、(57)に記載の添加剤。(60)(57)乃至(59)のいずれか1項に記載の添加剤を含有してなるがん細胞用培地組成物。
(61)がん細胞の培養方法であって、(57)乃至(59)のいずれか1項に記載の添加剤の存在下又は(60)に記載の培地組成物中で、該がん細胞を培養することを特徴とする、方法。
(62)がん細胞に対する抗がん剤の活性評価方法であって、(57)乃至(59)のいずれか1項に記載の添加剤の存在下又は(60)に記載の培地組成物中で、該がん細胞を培養することを特徴とする、方法。
(63)該がん細胞が該がん細胞用培地組成物中において細胞凝集塊を形成していることを特徴とする、(61)又は(62)に記載の方法。
(64)該がん細胞を培養する際の培養容器ががん細胞の付着を抑制することを特徴とする、(61)又は(62)に記載の方法。
(65)脱アシル化ジェランガム若しくはその塩、又はダイユータンガム若しくはその塩を含む肝細胞用培地添加剤。
(66)肝細胞の培養において、肝細胞数の減少を抑制する、(65)に記載の添加剤。(67)医薬品及び医薬品候補剤の肝細胞に対する効果を評価するために用いられる、(65)に記載の添加剤。
(68)(65)乃至(67)のいずれか1項に記載の添加剤を含有してなる肝細胞用培地組成物。
(69)肝細胞に対する医薬品及び医薬品候補剤の活性評価方法であって、(65)乃至(67)のいずれか1項に記載の添加剤の存在下又は(68)に記載の培地組成物中で、該肝細胞を培養することを特徴とする、方法。
(70)該肝細胞が該肝細胞用培地組成物中において細胞凝集塊を形成していることを特徴とする、(69)に記載の方法。
(71)該肝細胞を培養する際の培養容器が肝細胞の付着を抑制することを特徴とする、(69)に記載の方法。
成物。
(2)培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において細胞または組織の回収が可能である(1)記載の培地組成物。
(3)培地組成物からの細胞または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない(1)記載の培地組成物。
(4)粘度が、8mPa・s以下であることを特徴とする(1)記載の培地組成物。
(5)前記構造体の大きさが、フィルターで濾過した場合、孔径が0.2μm乃至200μmのフィルターを通過するものであることを特徴とする(1)記載の培地組成物。
(6)前記構造体が高分子化合物を含有することを特徴とする(1)記載の培地組成物。(7)前記高分子化合物が、アニオン性官能基を有する高分子化合物を含有することを特徴とする(6)記載の培地組成物。
(8)前記高分子化合物が、多糖類であることを特徴とする(6)記載の培地組成物。
(9)前記アニオン性官能基が、カルボキシ基、スルホ基およびリン酸基からなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(7)記載の培地組成物。
(10)前記多糖類が、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(8)に記載の培地組成物。
(11)前記多糖類が、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン及びそれらの塩からなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(10)に記載の培地組成物。
(12)前記多糖類が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩であることを特徴とする(10)又は(11)に記載の培地組成物。
(13)前記脱アシル化ジェランガムまたはその塩の培地組成物に対する最終濃度が、0.001~1.0%(重量/容量)であることを特徴とする(12)に記載の培地組成物。
(14)さらに、脱アシル化ジェランガムまたはその塩以外の多糖類を含有することを特徴とする(13)に記載の培地組成物。
(15)前記多糖類が、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム及びそれらの塩からなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(14)に記載の培地組成物。
(16)前記多糖類が、メチルセルロース、ローカストビーンガム及びそれらの塩からなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(14)に記載の培地組成物。
(17)さらに、金属イオンを含有することを特徴とする(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の培地組成物。
(18)前記金属イオンが、2価の金属イオンであることを特徴とする(17)記載の培地組成物。
(19)前記金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオンからなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(18)記載の培地組成物。
(20)前記金属イオンが、カルシウムイオンであることを特徴とする(19)記載の培地組成物。
(21)さらに、カルシウムイオン以外の金属イオンを含有することを特徴とする(20)に記載の培地組成物。
(22)前記金属イオンが、マグネシウムイオン、ナトリウムイオンおよびカリウムイオンからなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(21)記載の培地組成物。
(23)さらに、細胞外マトリックス及び/又は細胞接着分子を含有することを特徴とする(1)乃至(22)のいずれか1項に記載の培地組成物。
(24)前記細胞外マトリックスが、コラーゲン、ヒアルロン酸およびプロテオグリカンからなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(23)に記載の培地組成物。
(25)前記細胞接着分子が、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンからなる群から少なくとも1種選択されることを特徴とする(23)に記載の培地組成物。
(26)細胞培養用である、(1)乃至(25)のいずれか1項に記載の培地組成物。
(27)前記細胞が、接着細胞または浮遊細胞であることを特徴とする(26)に記載の培地組成物。
(28)前記接着細胞が、マイクロキャリアに付着した状態であることを特徴とする(27)に記載の培地組成物。
(29)前記接着細胞が、担体に包埋した状態であることを特徴とする(27)に記載の培地組成物。
(30)前記接着細胞が、スフェアであることを特徴とする(27)に記載の培地組成物。
(31)前記接着細胞が、多能性幹細胞、がん細胞及び肝細胞からなる群から選択されることを特徴とする(27)に記載の培地組成物。
(32)(1)乃至(31)のいずれか1項に記載の培地組成物と、細胞又は組織とを含む、細胞又は組織培養物。
(33)(1)乃至(31)のいずれか1項に記載の培地組成物中で細胞または組織を培養することを特徴とする、細胞又は組織の培養方法。
(34)前記細胞が、多能性幹細胞、がん細胞、肝細胞からなる群から選択されることを特徴とする(33)に記載の培養方法。
(35)(32)の培養物から細胞または組織を分離することを特徴とする、細胞又は組織の回収方法。
(36)前記分離が、ろ過、遠心または磁性分離で行われることを特徴とする(35)に記載の回収方法。
(37)(1)乃至(31)のいずれか1項に記載の培地組成物中で接着細胞を培養することを特徴とするスフェアの製造方法。
(38)抗がん剤をスクリーニングする方法であって、
(a)被験物質の存在下及び非存在下、請求項1乃至31のいずれか1項に記載の培地組成物中でがん細胞を培養する工程、及び
(b)がん細胞の増殖の変化を解析する工程、を含むことを特徴とする方法。
(39)さらに、被験物質の非存在下の場合と比べて、がん細胞の増殖を抑制する物質を候補物質として選択する工程を含むことを特徴とする、(38)に記載の方法。
(40)肝細胞に作用する医薬品候補物質をスクリーニングする方法であって、
(a)被験物質の存在下及び非存在下、請求項1乃至31のいずれか1項に記載の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び
(b)肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含むことを特徴とする方法。
(41)さらに、被験物質の非存在下の場合と比べて、肝細胞の生理学的機能を抑制又は増加する物質を候補物質として選択する工程を含むことを特徴とする、(40)に記載の方法。
(42)肝細胞に作用する医薬品候補物質の薬効又は毒性を評価する方法であって、
(a)被験物質の存在下及び非存在下、請求項1乃至31のいずれか1項に記載の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び
(b)肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含むことを特徴とする方法。
(43)細胞または組織を浮遊させて培養することができる培地組成物を調製するための培地添加剤であって、高分子化合物が溶媒中に溶解または分散していることを特徴とする培地添加剤。
(44)滅菌された状態であることを特徴とする(43)に記載の培地添加剤。
(45)前記高分子化合物がアニオン性官能基を有する高分子化合物である、(43)又は(44)に記載の培地添加剤。
(46)前記高分子化合物が脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、(43)又は(44)に記載の培地添加剤。
(47)細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物の製造方法であって、高分子化合物と培地を混合することを特徴とする培地組成物の製造方法。
(48)(43)乃至(46)のいずれか1項に記載の培地添加剤と培地とを混合するこ
とを特徴とする(47)に記載の培地組成物の製造方法。
(49)前記培地が溶媒中に溶解または分散していることを特徴とする(48)に記載の培地組成物の製造方法。
(50)前記高分子化合物がアニオン性官能基を有する高分子化合物である、(47)に記載の培地組成物の製造方法。
(51)前記高分子化合物が脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、(50)に記載の培地組成物の製造方法。
(52)前記高分子化合物と培地を、水と混合することを特徴とする(47)に記載の培地組成物の製造方法。
(53)水と混合した後、80~130℃で加熱することを特徴とする(52)に記載の培地組成物の製造方法。
(54)100~125℃で加熱することを特徴とする(53)に記載の培地組成物の製造方法。
(55)ろ過滅菌することを特徴とする(47)に記載の培地組成物の製造方法。
(56)前記ろ過滅菌が0.1~0.5μmのフィルターを通過させることを特徴とする(55)に記載の培地組成物の製造方法。
(57)脱アシル化ジェランガム若しくはその塩、又はダイユータンガム若しくはその塩を含むがん細胞用培地添加剤。
(58)がん細胞の培養において、がん細胞の増殖を促進する、(57)に記載の添加剤。
(59)抗がん剤の抗がん活性を評価するために用いられる、(57)に記載の添加剤。(60)(57)乃至(59)のいずれか1項に記載の添加剤を含有してなるがん細胞用培地組成物。
(61)がん細胞の培養方法であって、(57)乃至(59)のいずれか1項に記載の添加剤の存在下又は(60)に記載の培地組成物中で、該がん細胞を培養することを特徴とする、方法。
(62)がん細胞に対する抗がん剤の活性評価方法であって、(57)乃至(59)のいずれか1項に記載の添加剤の存在下又は(60)に記載の培地組成物中で、該がん細胞を培養することを特徴とする、方法。
(63)該がん細胞が該がん細胞用培地組成物中において細胞凝集塊を形成していることを特徴とする、(61)又は(62)に記載の方法。
(64)該がん細胞を培養する際の培養容器ががん細胞の付着を抑制することを特徴とする、(61)又は(62)に記載の方法。
(65)脱アシル化ジェランガム若しくはその塩、又はダイユータンガム若しくはその塩を含む肝細胞用培地添加剤。
(66)肝細胞の培養において、肝細胞数の減少を抑制する、(65)に記載の添加剤。(67)医薬品及び医薬品候補剤の肝細胞に対する効果を評価するために用いられる、(65)に記載の添加剤。
(68)(65)乃至(67)のいずれか1項に記載の添加剤を含有してなる肝細胞用培地組成物。
(69)肝細胞に対する医薬品及び医薬品候補剤の活性評価方法であって、(65)乃至(67)のいずれか1項に記載の添加剤の存在下又は(68)に記載の培地組成物中で、該肝細胞を培養することを特徴とする、方法。
(70)該肝細胞が該肝細胞用培地組成物中において細胞凝集塊を形成していることを特徴とする、(69)に記載の方法。
(71)該肝細胞を培養する際の培養容器が肝細胞の付着を抑制することを特徴とする、(69)に記載の方法。
本発明は、特定の化合物(以下、特定化合物ともいう)、特にアニオン性官能基を有する高分子化合物の構造体を含む培地組成物を提供する。当該培地組成物を用いると、細胞や組織の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに細胞及び/又は組織を浮遊状態にて培養することができる。更に、当該培地組成物を用いると、培養の際、容易に培地を交換することができる上に、培養した細胞及び/又は組織を容易に回収することもできる。本発明は、当該培養方法を、動物生体或いは植物体から採取した細胞及び/又は組織に適用し、目的の細胞及び/又は組織をその機能を損なうことなく大量に調製することができる。そして、当該培養方法で得られる細胞及び/又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療等を実施する際に利用することができる。特に、脱アシル化ジェランガムから作製される培地組成物が優れており、以下の特徴を有している。性能を発現させるための濃度が極めて低いので(1桁程度低い)、培地成分に与える影響が最低限に抑えられる。また、水に溶解させる際にダマになりにくいので、大量に製造する際にも、トラブルが起こりにくい。さらに、性能を発現する濃度域での、粘度が低いので、細胞及び/又は組織の回収等の操作性が極めて良好である。
また、本発明の培地組成物を用いると、がん細胞の凝集塊(スフェア)同士の会合が抑制され、当該スフェアを分散状態にて培養することができるために、がん細胞の増殖を促進することができる。更に、当該培地組成物を用いると、抗がん剤の評価を実施する際に、容易に抗がん剤を培地に添加することができる上に、細胞増殖を評価するための検出試薬を容易に添加することができる。また、培養したがん細胞を回収することができるため、回収した細胞の機能評価を容易に実施することもできる。本発明は、当該培養方法で得られるがん細胞を用いて化学物質、抗がん剤等の薬効評価やスクリーニングを実施する際に好適に利用することができる。
本発明の培地組成物で培養すると、二次元培養における非生体内的環境からの影響が少ないことと細胞同士の接着のみが起こるため、がん化を促進するHB-EGF(ヘパリン結合性上皮成長因子様増殖因子)の感受性ががん細胞で高まり、その下流におけるEGF受容体阻害剤に対する感受性を高めることができる。さらにがん細胞足場非依存的な増殖に対する重要なシグナル伝達経路であるMEK阻害剤およびAkt阻害剤に対する感受性も高めることができる。
あるいは、本発明の培地組成物を用いると、肝細胞の凝集塊(スフェア)同士の会合が抑制され、当該スフェアを分散状態にて培養することができるために、肝細胞の生存と細胞機能を生体外で維持することができる。更に、当該培地組成物を用いると、医薬品候補剤或いは医薬品の評価を実施する際に、容易に医薬品候補剤或いは医薬品を培地に添加することができる上に、細胞機能を評価するための検出試薬を容易に添加することができる。また、培養した肝細胞を回収することができるため、回収した細胞の機能評価を容易に実施することもできる。本発明は、当該培養方法で得られる肝細胞を用いて化学物質、医薬品候補剤或いは医薬品等の薬効及び毒性評価やスクリーニングを実施する際に好適に利用することができる。
さらに、本発明の脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含む培地添加剤は、がん細胞の培養において、がん細胞の増殖を大きく促進することができる。
加えて、本発明の脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含む培地添加剤は、肝細胞の培養において、肝細胞数の減少を抑制することができる。
また、本発明の培地組成物を用いると、がん細胞の凝集塊(スフェア)同士の会合が抑制され、当該スフェアを分散状態にて培養することができるために、がん細胞の増殖を促進することができる。更に、当該培地組成物を用いると、抗がん剤の評価を実施する際に、容易に抗がん剤を培地に添加することができる上に、細胞増殖を評価するための検出試薬を容易に添加することができる。また、培養したがん細胞を回収することができるため、回収した細胞の機能評価を容易に実施することもできる。本発明は、当該培養方法で得られるがん細胞を用いて化学物質、抗がん剤等の薬効評価やスクリーニングを実施する際に好適に利用することができる。
本発明の培地組成物で培養すると、二次元培養における非生体内的環境からの影響が少ないことと細胞同士の接着のみが起こるため、がん化を促進するHB-EGF(ヘパリン結合性上皮成長因子様増殖因子)の感受性ががん細胞で高まり、その下流におけるEGF受容体阻害剤に対する感受性を高めることができる。さらにがん細胞足場非依存的な増殖に対する重要なシグナル伝達経路であるMEK阻害剤およびAkt阻害剤に対する感受性も高めることができる。
あるいは、本発明の培地組成物を用いると、肝細胞の凝集塊(スフェア)同士の会合が抑制され、当該スフェアを分散状態にて培養することができるために、肝細胞の生存と細胞機能を生体外で維持することができる。更に、当該培地組成物を用いると、医薬品候補剤或いは医薬品の評価を実施する際に、容易に医薬品候補剤或いは医薬品を培地に添加することができる上に、細胞機能を評価するための検出試薬を容易に添加することができる。また、培養した肝細胞を回収することができるため、回収した細胞の機能評価を容易に実施することもできる。本発明は、当該培養方法で得られる肝細胞を用いて化学物質、医薬品候補剤或いは医薬品等の薬効及び毒性評価やスクリーニングを実施する際に好適に利用することができる。
さらに、本発明の脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含む培地添加剤は、がん細胞の培養において、がん細胞の増殖を大きく促進することができる。
加えて、本発明の脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含む培地添加剤は、肝細胞の培養において、肝細胞数の減少を抑制することができる。
以下、更に詳細に本発明を説明する。
本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。
本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。
本発明における細胞とは、動物或いは植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、DNAを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞(多能性幹細胞等)、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞(細胞株)、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞(たとえば、平滑筋細胞または骨格筋細胞)、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞(例えば、臍帯血由来のCD34陽性細胞)、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液(臍帯血を含む)、骨髄、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ES細胞、胚性生殖幹細胞、iPS細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。
がん組織の例としては、以下に限定されるものではないが、胃がん、食道がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、骨髄がん、腎細胞がん、尿管がん、肝がん、胆管がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、頭蓋咽頭がん、喉頭がん、舌がん、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽種、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、がん患者由来の血液等の組織が挙げられる。がん細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳がん細胞株としてHBC-4、BSY-1、BSY-2、MCF-7、MCF-7/ADR RES、HS578T、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T47D、ヒト子宮頸がん細胞株としてHeLa、ヒト肺がん細胞株としてA549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、DMS273、DMS114、ヒト大腸がん細胞株としてCaco-2、COLO-205
、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr、ヒト前立腺がん細胞株としてDU-145、PC-3、LNCaP、ヒト中枢神経系がん細胞株としてU251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19、ヒト卵巣がん細胞株としてOVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3、IGROV-1、ヒト腎がん細胞株としてRXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10、ヒト胃がん細胞株としてMKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74、皮膚がん細胞株としてLOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14、白血病細胞株としてCCRF-CRM、K562、MOLT-4、HL-60TB、RPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat、ヒト上皮様癌細胞株として、A431、ヒトメラノーマ細胞株としてA375、ヒト骨肉腫細胞株として、MNNG/H
OS、ヒト膵臓癌細胞株として、MIAPaCa-2等が挙げられる。細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、HEK293(ヒト胎児腎細胞)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、AE-1、3D9、Ns0/1、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(登録商標)、Vero等が含まれる。
、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr、ヒト前立腺がん細胞株としてDU-145、PC-3、LNCaP、ヒト中枢神経系がん細胞株としてU251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19、ヒト卵巣がん細胞株としてOVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3、IGROV-1、ヒト腎がん細胞株としてRXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10、ヒト胃がん細胞株としてMKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74、皮膚がん細胞株としてLOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14、白血病細胞株としてCCRF-CRM、K562、MOLT-4、HL-60TB、RPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat、ヒト上皮様癌細胞株として、A431、ヒトメラノーマ細胞株としてA375、ヒト骨肉腫細胞株として、MNNG/H
OS、ヒト膵臓癌細胞株として、MIAPaCa-2等が挙げられる。細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、HEK293(ヒト胎児腎細胞)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、AE-1、3D9、Ns0/1、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(登録商標)、Vero等が含まれる。
本発明における肝細胞とは、肝臓組織から採取された初代肝細胞のほか、生体外での培養に最適化した条件で継代培養され確立された肝細胞株、及び肝臓以外の組織由来の細胞、iPS細胞やES細胞等の多能性幹細胞、間葉系幹細胞、末梢血由来幹細胞、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、肝幹細胞、肝前駆細胞等から生体外にて分化誘導された肝細胞等が挙げられる。肝臓組織は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、或いはサル等から採取された肝臓であり、正常な肝臓だけでなくがん化した肝臓であってもよい。初代肝細胞は、これらの肝臓からコラゲナーゼを用いた灌流法により分離し、採取することができるが、株式会社プライマリーセル、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、タカラバイオ株式会社、北海道システム・サイエンス株式会社、ロンザジャパン株式会社、株式会社ベリタス、ライフテクノロジーズジャパン株式会社等の試薬会社から購入したものであってもよい。購入する肝細胞は、凍結された状態或いはコラーゲン等の担体に付着した状態でありうる。肝細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、HepG2、Hep3B、HepaRG(登録商標)、JHH7、HLF、HLE、PLC/PRF/5、WRL68、HB611、SK-HEP-1、HuH-4、HuH-7等が挙げられる。
本発明における肝細胞の機能とは、特に制限されないが、CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5等のシトクロムP450(CYPともいう)活性の発現並びに本酵素による医薬品等の代謝、グルクロン酸、グルタチオン、硫酸、グリシン等による医薬品等の抱合、アルブミン、アポリポ蛋白質、トロンボポイエチン等の有用蛋白質の生産、ビリルビンの分泌、尿素の合成、胆汁酸や脂肪酸の合成、トランスポーターによる医薬品等の輸送等が含まれる。本発明における実施形態では、肝細胞は上記の機能の内、チトクロムP450の活性、アルブミンの生産及び/又はトランスポーターによる医薬品等の輸送(例えばCarboxydichlorofluorescein diacetate、Tetraethylammonium Bromide、Taurocholate、Rosvastatinの取り込みやCarboxydichlorofluoresceinの排泄)を維持していることが好ましい。
本発明における医薬品には、医療の用に供される物質全てが含まれる。医薬品候補剤とは、医薬品の候補として探索或いは開発研究がなされている物質であり、合成化合物、蛋白質、核酸、糖類、天然物等が挙げられる。
本発明における抗がん剤とは、がん細胞に直接的に作用してがん細胞の増殖や機能を抑制する薬剤の他、がん細胞に直接的には作用しないが、生体内の免疫細胞又はその他の薬剤との協働的な作用により、がん細胞の増殖又は機能を抑制する、又はがん細胞を死滅させる薬剤も含まれる。この様な抗がん剤の例としては、特に制限されないが、アルキル化剤、白金誘導体、5FU系抗がん剤に代表される代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、エピルビシンに代表される抗がん性抗生物質、ゲフィチニブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、エルロチニブ、パニツムマブ、ラパチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、イピリムマブ、バンデタニブ、クリゾチニブ、ルキソリチニブ、トラメチニブに代表される分子標的薬などが挙げられる。分子標的薬の標的分子としては、特に制限されないが、各種キナーゼ、Her2、EGFR(上皮成長因子受容体)、PI3K(ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ)、mTOR(哺乳類ラパマイシン標的タンパク質)、Akt、CDK(サイクリン依存キナーゼ)、VEGFR(血管内皮細胞増殖因子受容体)、PDGFR(血小板由来成長因子受容体)、FGFR(線維芽細胞成長因子受容体)、c-Met、Raf、p38MAPK、CTLA-4、ALK、JAK、MEK(MAPK/ERKキナーゼ)、Hsp90、ヒストンデアセチラーゼ等が挙げられる。更に、この様な効果を有する薬剤の候補となる合成化合物、蛋白質、核酸、糖類、天然物等も本発明における抗がん剤に含まれる。
本発明における植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたプロトプラストも含まれる。
本発明における組織とは、何種類かの異なった性質や機能を有する細胞が一定の様式で集合した構造の単位であり、動物の組織の例としては、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等が含まれる。植物の組織の例としては、分裂組織、表皮組織、同化組織、葉肉組織、通道組織、機械組織、柔組織、脱分化した細胞塊(カルス)等が含まれる。
細胞及び/又は組織を本発明の方法で培養するに際し、培養する細胞及び/又は組織は、前記に記載した細胞及び/又は組織から任意に選択して培養することができる。細胞及び/又は組織は、動物或いは植物体より直接採取することができる。細胞及び/又は組織は、特定の処理を施すことにより動物或いは植物体から誘導させたり、成長させたり、または形質転換させた後に採取してもよい。この際、当該処理は生体内であっても生体外であってもよい。動物としては、例えば昆虫、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられる。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジーおよびヒトが挙げられる。植物としては、採取した細胞及び/又は組織が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類(例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等)を生産する植物(例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等)や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体(例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等)を生産する植物(例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等)、或いは医薬品原体を生産する植物、飼料又は食品となる植物(イネ、トウモロコシ、コムギ又はオオムギ等)などがあげられるが、それらに限定されない。
本発明における細胞及び/又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞及び/又は組織が接着しない状態(非接着)であることをいう。さらに、本発明において、細胞及び/又は組織を増殖、分化或いは維持させる際、液体培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞及び/又は組織が当該液体培
地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び/又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、少なくとも5~60分、1時間~24時間、1日~21日、が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び/又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、少なくとも5~60分、1時間~24時間、1日~21日、が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
本発明の培地組成物は、細胞または組織を浮遊させて培養できる(好ましくは浮遊静置培養できる)構造体と培地を含有する組成物である。
本発明の培地組成物は、好ましくは、培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において、培地組成物からの細胞または組織の回収が可能である組成物であり、より好ましくは、培地組成物からの細胞または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない組成物である。
本発明における構造体とは、特定化合物から形成されたもので、細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる効果を示すものである。より詳細には、高分子化合物がイオンを介して集合したもの、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成したもの等が含まれる。また、多糖類が金属イオンを介してマイクロゲルを形成することは公知であり(例えば、特開2004-129596号公報)、本発明の構造体には、一態様として当該マイクロゲルも含まれる。
また、高分子化合物がイオンを介して集合したものとしては、その一態様としてフィルム状の構造体が挙げられる。当該フィルムを図13に例示する。
本発明における構造体の大きさは、フィルターで濾過した場合、孔径が0.2μm乃至200μmのフィルターを通過するものが好ましい。当該孔径の下限としては、より好ましくは、1μmを超えるものであり、安定に細胞または組織を浮遊させることを考慮すると、さらに好ましくは5μmを超えるものである。当該孔径の上限としては、より好ましくは、100μm以下のもの、細胞または組織の大きさを考慮すると、さらに好ましくは70μm以下のものである。
本発明における特定化合物とは、特定化合物を液体培地と混合した際、不定形な構造体を形成し、当該構造体が当該液体中で均一に分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を実質的に保持し、その沈降を防ぐ効果を有するものである。「液体の粘度を実質的に高めない」とは、液体の粘度が8mPa・sを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度(すなわち、本発明の培地組成物の粘度)は、8mPa・s以下であり、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下である。さらに、当該構造体を液体培地中に形成し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)効果を示すものであれば、特定化合物の化学構造、分子量、物性等は何ら制限されない。
構造体を含む液体の粘度は、例えば後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には37℃条件下でE型粘度計(東機産業株式会社製、TV-22型粘度計、機種:TVE-22L、コーンロータ:標準ロータ 1°34´×R24、回転数100rpm)を用いて測定することができる。
本発明の培地組成物は、好ましくは、培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において、培地組成物からの細胞または組織の回収が可能である組成物であり、より好ましくは、培地組成物からの細胞または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない組成物である。
本発明における構造体とは、特定化合物から形成されたもので、細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる効果を示すものである。より詳細には、高分子化合物がイオンを介して集合したもの、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成したもの等が含まれる。また、多糖類が金属イオンを介してマイクロゲルを形成することは公知であり(例えば、特開2004-129596号公報)、本発明の構造体には、一態様として当該マイクロゲルも含まれる。
また、高分子化合物がイオンを介して集合したものとしては、その一態様としてフィルム状の構造体が挙げられる。当該フィルムを図13に例示する。
本発明における構造体の大きさは、フィルターで濾過した場合、孔径が0.2μm乃至200μmのフィルターを通過するものが好ましい。当該孔径の下限としては、より好ましくは、1μmを超えるものであり、安定に細胞または組織を浮遊させることを考慮すると、さらに好ましくは5μmを超えるものである。当該孔径の上限としては、より好ましくは、100μm以下のもの、細胞または組織の大きさを考慮すると、さらに好ましくは70μm以下のものである。
本発明における特定化合物とは、特定化合物を液体培地と混合した際、不定形な構造体を形成し、当該構造体が当該液体中で均一に分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を実質的に保持し、その沈降を防ぐ効果を有するものである。「液体の粘度を実質的に高めない」とは、液体の粘度が8mPa・sを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度(すなわち、本発明の培地組成物の粘度)は、8mPa・s以下であり、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下である。さらに、当該構造体を液体培地中に形成し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)効果を示すものであれば、特定化合物の化学構造、分子量、物性等は何ら制限されない。
構造体を含む液体の粘度は、例えば後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には37℃条件下でE型粘度計(東機産業株式会社製、TV-22型粘度計、機種:TVE-22L、コーンロータ:標準ロータ 1°34´×R24、回転数100rpm)を用いて測定することができる。
本発明に用いる特定化合物の例としては、特に制限されるものではないが、高分子化合物が挙げられ、好ましくはアニオン性の官能基を有する高分子化合物が挙げられる。
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。
本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される1種又は2種以上を有するものを使用できる。
本発明に用いる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類(例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等)が10個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸(例えば、グルクロン酸、イズロン
酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸)を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム(以下、DAGという場合もある)、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より1種又は2種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、DAG、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で細胞又は組織を浮遊させることができ、かつ細胞又は組織の回収のしやすさを考慮すると、最も好ましくは、DAGである。
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
これらの高分子化合物(多糖類等)の重量平均分子量は、好ましくは10,000乃至50,000,000であり、より好ましくは100,000乃至20,000,000、更に好ましくは1,000,000乃至10,000,000である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によるプルラン換算で測定できる。
さらに、後述の実施例で記載するように、DAGはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。
本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される1種又は2種以上を有するものを使用できる。
本発明に用いる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類(例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等)が10個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸(例えば、グルクロン酸、イズロン
酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸)を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム(以下、DAGという場合もある)、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より1種又は2種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、DAG、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で細胞又は組織を浮遊させることができ、かつ細胞又は組織の回収のしやすさを考慮すると、最も好ましくは、DAGである。
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
これらの高分子化合物(多糖類等)の重量平均分子量は、好ましくは10,000乃至50,000,000であり、より好ましくは100,000乃至20,000,000、更に好ましくは1,000,000乃至10,000,000である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によるプルラン換算で測定できる。
さらに、後述の実施例で記載するように、DAGはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
本発明においては、上記多糖類を複数種(好ましくは2種)組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は、上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことのできるものあれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともDAG又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、DAG又はその塩、及びDAG又はその塩以外の多糖類(例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩)が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、DAGとラムザンガム、DAGとダイユータンガム、DAGとキサンタンガム、DAGとカラギーナン、DAGとザンタンガム、DAGとローカストビーンガム、DAGとκ-カラギーナン、DAGとアルギン酸ナトリウム、DAGとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明に用いる特定化合物の更に好ましい具体例としては、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、カラギーナン及びキサンタンガム及びそれらの塩が挙げられ、培地組成物の粘度を低くできる点と細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、最も好ましい例としては脱アシル化ジェランガムまたはその塩が挙げられる。
本発明における脱アシル化ジェランガムとは、1-3結合したグルコース、1-4結合したグルクロン酸、1-4結合したグルコース及び1―4結合したラムノースの4分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式(I)において、R1、R2が共に水素原子であり、nは2以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、R1がグリセリル基を、R2がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは10%以下であり、より好ましくは1%以下である。
本発明における構造体は特定化合物により様々な形態となるが、脱アシル化ジェランガムの場合について記載すると、脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の金属イオン(例えば、カルシウムイオン)を取り込み、当該金属イオンを介した不定形な構造体を形成し、細胞及び/又は組織を浮遊させる。脱アシル化ジェランガムから調製される本発明の培地組成物の粘度は、8mPa・s以下であり、好ましくは4mPa・s以下であり、細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、より好ましく
は2mPa・s以下である。
本発明における脱アシル化ジェランガムとは、1-3結合したグルコース、1-4結合したグルクロン酸、1-4結合したグルコース及び1―4結合したラムノースの4分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式(I)において、R1、R2が共に水素原子であり、nは2以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、R1がグリセリル基を、R2がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは10%以下であり、より好ましくは1%以下である。
本発明における構造体は特定化合物により様々な形態となるが、脱アシル化ジェランガムの場合について記載すると、脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の金属イオン(例えば、カルシウムイオン)を取り込み、当該金属イオンを介した不定形な構造体を形成し、細胞及び/又は組織を浮遊させる。脱アシル化ジェランガムから調製される本発明の培地組成物の粘度は、8mPa・s以下であり、好ましくは4mPa・s以下であり、細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、より好ましく
は2mPa・s以下である。
本発明における特定化合物は、化学合成法でも得ることができるが、当該化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得るのが好適である。その抽出においては、水や超臨界ガスを用いると当該化合物を効率よく抽出できる。例えば、ジェランガムの製造方法としては、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすればよい。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、1-3結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。精製方法としては、例えば、液-液抽出、分別沈澱、結晶化、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスLH-20等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、不純物を除き精製することができる。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア(Sphingomonas elodea)及び当該
微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
そして、脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「KELCOGEL(シーピー・ケルコ社の登録商標)CG-LA」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)HT」等を使用することができる。
微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
そして、脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「KELCOGEL(シーピー・ケルコ社の登録商標)CG-LA」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)HT」等を使用することができる。
培地中での特定化合物の濃度は、特定化合物の種類に依存し、特定化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことのできる範囲で、適宜設定することができるが、通常0.0005%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは0.001%乃至0.4%(重量/容量)、より好ましくは0.005%乃至0.1%(重量/容量)、さらに好ましくは0.005%乃至0.05%(重量/容量)となるようにすれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは0.003%乃至0.5%(重量/容量)、より好ましくは0.005%乃至0.1%(重量/容量)、更に好ましくは0.01%乃至0.05%(重量/容量)、最も好ましくは、0.01%乃至0.03%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、0.001%乃至5.0%(重量/容量)、好ましくは0.01%乃至1.0%(重量/容量)、より好ましくは0.05%乃至0.5%(重量/容量)、最も好ましくは、0.1%乃至0.2%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。κ-カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、0.001%乃至5.0%(重量/容量)、好ましくは0.005%乃至1.0%(重量/容量)、より好ましくは0
.01%乃至0.1%(重量/容量)、最も好ましくは、0.03%乃至0.05%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。ネイティブ型ジェランガムの場合、0.05%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは、0.05%乃至0.1%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。
.01%乃至0.1%(重量/容量)、最も好ましくは、0.03%乃至0.05%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。ネイティブ型ジェランガムの場合、0.05%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは、0.05%乃至0.1%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。
上記多糖類を複数種(好ましくは2種)組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、DAG又はその塩と、DAG又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、DAG又はその塩の濃度としては0.005~0.02%(重量/容量)、好ましくは0.01~0.02%(重量/容量)が例示され、DAG又はその塩以外の多糖類の濃度としては、0.005~0.4%(重量/容量)、好ましくは0.1~0.4%(重量/容量)が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
DAG又はその塩:0.005~0.02%(好ましくは0.01~0.02%)(重量/容量)
DAG以外の多糖類
キサンタンガム:0.1~0.4%(重量/容量)
アルギン酸ナトリウム:0.1~0.4%(重量/容量)
ローカトビーンガム:0.1~0.4%(重量/容量)
メチルセルロース:0.1~0.4%(重量/容量)(好ましくは0.2~0.4%(重量/容量))
カラギーナン:0.05~0.1%(重量/容量)
ダイユータンガム:0.05~0.1%(重量/容量)
DAG又はその塩:0.005~0.02%(好ましくは0.01~0.02%)(重量/容量)
DAG以外の多糖類
キサンタンガム:0.1~0.4%(重量/容量)
アルギン酸ナトリウム:0.1~0.4%(重量/容量)
ローカトビーンガム:0.1~0.4%(重量/容量)
メチルセルロース:0.1~0.4%(重量/容量)(好ましくは0.2~0.4%(重量/容量))
カラギーナン:0.05~0.1%(重量/容量)
ダイユータンガム:0.05~0.1%(重量/容量)
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度(%)=特定化合物の重量(g)/培地組成物の容量(ml)×100
濃度(%)=特定化合物の重量(g)/培地組成物の容量(ml)×100
前記化合物は、化学合成法によってさらに別の誘導体に変えることもでき、そのようにして得た当該誘導体も、本発明において有効に使用できる。具体的には、脱アシル化ジェランガムの場合、その一般式(I)で表される化合物のR1及び/又はR2に当たる水酸基を、C1-3アルコキシ基、C1-3アルキルスルホニル基、グルコースあるいはフルクトースなどの単糖残基、スクロース、ラクトースなどのオリゴ糖残基、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸残基などに置換した誘導体も本発明に使用できる。また、1-ethyl-3-(3-di-methylaminopropyl)carbodiimide(EDC)等のクロスリンカーを用いて当該化合物を架橋することもできる。
本発明に使用される特定化合物或いはその塩は製造条件により任意の結晶形として存在することができ、任意の水和物として存在することができるが、これら結晶形や水和物及びそれらの混合物も本発明の範囲に含有される。また、アセトン、エタノール、テトラヒドロフランなどの有機溶媒を含む溶媒和物として存在することもあるが、これらの形態はいずれも本発明の範囲に含有される。
本発明に使用される特定化合物は、環内或いは環外異性化により生成する互変異性体、幾何異性体、互変異性体若しくは幾何異性体の混合物、又はそれらの混合物の形で存在しもよい。本発明の化合物は、異性化により生じるか否かに拘わらず、不斉中心を有する場合は、分割された光学異性体或いはそれらを任意の比率で含む混合物の形で存在してよい。
本発明の培地組成物には、金属イオン、例えば2価の金属イオン(カルシウムイオン、
マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等)が存在してもよく、好ましくはカルシウムイオンを含有する。当該金属イオンは、例えばカルシウムイオンとマグネシウムイオン、カルシウムイオンと亜鉛イオン、カルシウムイオンと鉄イオン、カルシウムイオンと銅イオンのように、2種類以上を組み合わせて使用することができる。当業者は適宜その組み合わせを決定することができる。一態様において、培地組成物に金属イオンが含まれることにより、高分子化合物が金属イオンを介して集合し、高分子化合物が三次元ネットワークを形成することにより(例えば、多糖類が金属イオンを介してマイクロゲルを形成することにより)本発明の構造体が形成される。金属イオンの濃度は、特定化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことのできる範囲で、適宜設定することができる。塩濃度は0.1mM及至300mMで、好ましくは、0.5mM及至100mMであるが、これらに限定されない。当該金属イオンは、培地と共に混合する、あるいは、塩溶液を別途調製しておき、培地に添加してもよい。また本発明の培地組成物には、後述の細胞外マトリックス、接着分子等を含んでもよい。
本発明は、当該培地組成物を用いて、細胞又は組織を増殖させる培養方法、得られる細胞又は組織を、例えばろ過、遠心又は磁性分離により、回収する方法、当該培地組成物を用いて、スフェアを製造する方法も含む。
マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等)が存在してもよく、好ましくはカルシウムイオンを含有する。当該金属イオンは、例えばカルシウムイオンとマグネシウムイオン、カルシウムイオンと亜鉛イオン、カルシウムイオンと鉄イオン、カルシウムイオンと銅イオンのように、2種類以上を組み合わせて使用することができる。当業者は適宜その組み合わせを決定することができる。一態様において、培地組成物に金属イオンが含まれることにより、高分子化合物が金属イオンを介して集合し、高分子化合物が三次元ネットワークを形成することにより(例えば、多糖類が金属イオンを介してマイクロゲルを形成することにより)本発明の構造体が形成される。金属イオンの濃度は、特定化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことのできる範囲で、適宜設定することができる。塩濃度は0.1mM及至300mMで、好ましくは、0.5mM及至100mMであるが、これらに限定されない。当該金属イオンは、培地と共に混合する、あるいは、塩溶液を別途調製しておき、培地に添加してもよい。また本発明の培地組成物には、後述の細胞外マトリックス、接着分子等を含んでもよい。
本発明は、当該培地組成物を用いて、細胞又は組織を増殖させる培養方法、得られる細胞又は組織を、例えばろ過、遠心又は磁性分離により、回収する方法、当該培地組成物を用いて、スフェアを製造する方法も含む。
本発明で用いる特定化合物から構成された構造体は、細胞及び/又は組織を生体外で培養した時に、当該細胞及び/又は組織を、当該特定化合物の構造体を含有する液体中で浮遊させる効果(好ましくは浮遊静置させる効果)を示すものである。当該浮遊効果により、単層培養に比べて、一定体積あたりの細胞及び/又は組織を増やして培養することが可能である。また、従来の浮遊培養方法において回転や振とう操作を伴う場合、細胞及び/又は組織に対するせん断力が働くため、細胞及び/又は組織の増殖率や回収率が低い、或いは細胞の機能が損なわれてしまう場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに細胞及び/又は組織を均一に分散することができるため、目的とする細胞及び/又は組織を細胞機能の損失無く容易かつ大量に取得することができる。また、従来のゲル基材を含む培地において細胞及び/又は組織を浮遊培養する際、細胞及び/又は組織の観察や回収が困難であったり、回収の際にその機能を損なったりする場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、細胞及び/又は組織を浮遊培養し、その機能を損なうこと無く観察し、回収することができる。また、従来のゲル基材を含む培地は、粘度が高く培地の交換が困難である場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物は、低粘度であるためピペットやポンプ等を用いて容易に培地を交換することができる。
本発明の方法により培養されたヒト由来の細胞及び/又は組織は、疾患や障害を有する患者に対し治療目的にて移植することができる。この際、治療の対象とする疾患や障害の種類、前処置方法並びに細胞移植方法は、当事者により適宜選択される。移植された細胞のレシピエントへの生着と疾患や障害からの回復や、移植に伴う副作用の有無、治療の効果は、移植治療における一般的な方法により適宜検査され、判断することができる。
さらに、本発明の方法により細胞及び/又は組織が効率よく増殖されるため、本発明における特定化合物及びその構造体を含有する培地組成物は細胞の研究用試薬として用いることができる。例えば、細胞や組織の分化や増殖を調節する因子を解明する際、細胞と目的の因子を共存させて培養した時の細胞の数や種類、細胞表面分化マーカーや発現遺伝子の変化を解析するが、この際に本発明の培地組成物を用いることにより解析対象となる細胞の数を効率よく増幅するだけでなく、効率よく回収することができる。目的とする因子を解明する際の培養条件、培養装置、培地の種類、本発明化合物の種類、特定化合物の含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度などは、本明細書に記載した範囲から当事者により適宜選択される。培養により増殖或いは出現した細胞は、当該分野にて
標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。この際、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色してもよい。目的の因子により変化した発現遺伝子は、培養した細胞からDNA(デオキシリボ核酸)或いはRNA(リボ核酸)を抽出しサザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、RT-PCR法などによって検出することができる。また、細胞表面分化マーカーは、特異的抗体を用いてELISAやフローサイトメトリーにより検出し、目的の因子による分化や増殖に対する効果を観察することができる。
標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。この際、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色してもよい。目的の因子により変化した発現遺伝子は、培養した細胞からDNA(デオキシリボ核酸)或いはRNA(リボ核酸)を抽出しサザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、RT-PCR法などによって検出することができる。また、細胞表面分化マーカーは、特異的抗体を用いてELISAやフローサイトメトリーにより検出し、目的の因子による分化や増殖に対する効果を観察することができる。
本発明の培養方法を用いて細胞及び/又は組織を培養する際には、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン(登録商標)バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養器材を用いて培養することが可能である。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、エチルセルロースやアセチルセルロース等のセルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブタジエン、ポリ(エチレン-ビニルアセテート)コポリマー、ポリ(ブタジエン-スチレン)コポリマー、ポリ(ブタジエン-アクリロニトリル)コポリマー、ポリ(エチレン-エチルアクリレート)コポリマー、ポリ(エチレン-メタアクリレート)コポリマー、ポリクロロプレン、スチロール樹脂、クロロスルフォン化ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル、アクリル系ブロックコポリマー等のプラスチック等が挙げられる。これらのプラスチックは、酸素や二酸化炭素等のガス透過性に優れるだけでなく、工業的に成形加工性に優れ、各種の滅菌処理に耐えうるものであり、かつ培養器材内部の様子を観察することができる透明性の材質であることが好ましい。ここで、滅菌処理を施す方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌等が挙げられる。また、これらのプラスチックに対して種々の表面処理(例えば、プラズマ処理、コロナ処理等)を施してもよい。更に、これらの培養器材に対しては、予め細胞外マトリックスや細胞接着分子などをコーティングしてもよい。このようなコーティング材料としては、コラーゲンI乃至XIX、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン-1乃至12、ニトジェン、テネイシン,トロンボスポンジン,フォンビルブランド(von Willebrand)因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、E-セレクチン、P-セレクチン、L-セレクチン、免疫グロブリン、ヒアルロン酸、スーパーファミリー、マトリゲル、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。これらのコーティング材料は、遺伝子組換え技術によりアミノ酸配列を人為的に改変させたものも使用することできる。また、細胞及び/又は組織の培養器材に対する接着を阻害するためのコーティング材料を用いることもできる。このようなコーティング材料としては、シリコン、ポリ(2-ヒドロキシメチルメタクリレート)、ポリ(2-メトキシメチルアクリレート)、ポリ(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド、メビオールジェル(登録商標)等が挙げられるが、これらに限られるわけではない。
細胞及び/又は組織の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、pH、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これら装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞及び/又は組織に供給する手法として、流加培養、連続培養及び灌流培養があるが、いずれの手法も本発明の培養方法に用いることができる。また、バイオリアクターや自動培養装置に用いられる培養容器には、開閉が容易で外界との接触面積が大きい開放系培養容器
(例えば蓋を有する培養容器)と、開閉が容易ではなく外界との接触面積の小さい閉鎖系培養容器(例えばカートリッジ型培養容器)があるが、いずれの培養容器も本発明の培養方法に用いることができる。
(例えば蓋を有する培養容器)と、開閉が容易ではなく外界との接触面積の小さい閉鎖系培養容器(例えばカートリッジ型培養容器)があるが、いずれの培養容器も本発明の培養方法に用いることができる。
本発明における特定化合物を用いて細胞及び/又は組織を培養する際には、細胞及び/又は組織を培養する際に用いられる培地と特定化合物を混合して培地組成物を調製することができる。このような培地の組成による分類では天然培地、半合成培地、合成培地、また、形状による分類では半固形培地、液体培地、粉末培地(以下、粉培地という場合もある)などが挙げられる。細胞及び/又は組織が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。このような培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium;DMEM)、ハムF12培地(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培地、マッコイ5A培地(McCoy’s 5A medium)、イーグルMEM培地(Eagles’s Minimum Essential Medium;EMEM)、αMEM培地(alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium;αMEM)、MEM培地(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium;IMDM)、MCDB131培地、ウィリアム培地E、IPL41培地、Fischer‘s培地、StemPro34(インビトロジェン社製
)、X-VIVO 10(ケンブレックス社製)、X-VIVO 15(ケンブレックス社製)、HPGM(ケンブレックス社製)、StemSpan H3000(ステムセルテクノロジー社製)、StemSpanSFEM(ステムセルテクノロジー社製)、StemlineII(シグマアルドリッチ社製)、QBSF-60(クオリティバイオロジカル社製)、StemProhESCSFM(インビトロジェン社製)、Essential8(登録商標)培地(ギブコ社製)、mTeSR1或いは2培地(ステムセルテクノロジー社製)、リプロFF或いはリプロFF2(リプロセル社製)、PSGro hESC/iPSC培地(システムバイオサイエンス社製)、NutriStem(登録商標)培地(バイオロジカルインダストリーズ社製)、CSTI-7培地(細胞科学研究所社製)、MesenPRO RS培地(ギブコ社製)、MF-Medium(登録商標)間葉系幹細胞増殖培地(東洋紡株式会社製)、Sf-900II(インビトロジェン社製)、Opti-Pro(インビトロジェン社製)、などが挙げられる。
)、X-VIVO 10(ケンブレックス社製)、X-VIVO 15(ケンブレックス社製)、HPGM(ケンブレックス社製)、StemSpan H3000(ステムセルテクノロジー社製)、StemSpanSFEM(ステムセルテクノロジー社製)、StemlineII(シグマアルドリッチ社製)、QBSF-60(クオリティバイオロジカル社製)、StemProhESCSFM(インビトロジェン社製)、Essential8(登録商標)培地(ギブコ社製)、mTeSR1或いは2培地(ステムセルテクノロジー社製)、リプロFF或いはリプロFF2(リプロセル社製)、PSGro hESC/iPSC培地(システムバイオサイエンス社製)、NutriStem(登録商標)培地(バイオロジカルインダストリーズ社製)、CSTI-7培地(細胞科学研究所社製)、MesenPRO RS培地(ギブコ社製)、MF-Medium(登録商標)間葉系幹細胞増殖培地(東洋紡株式会社製)、Sf-900II(インビトロジェン社製)、Opti-Pro(インビトロジェン社製)、などが挙げられる。
がん細胞の培養に用いられる培地には、上記培地に、細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、2種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、がん細胞スフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を更に混合することができる。
肝細胞の培養に用いられる培地としては、上記培地に加えて、HepatoZYME-SFM(ライフテクノロジーズ社製)、HCM(登録商標)-肝細胞培養培地BulletKit(登録商標、ロンザ社製)、HBM(登録商標)-肝細胞基本培地(ロンザ社製)、HMM(登録商標)-肝細胞メンテナンス培地(ロンザ社製)、変法ランフォード培地(日水製薬株式会社製)、ISOM’s培地、肝細胞増殖培地(タカラバイオ株式会社製)、肝細胞維持培地(タカラバイオ株式会社製)、肝細胞基本培地(タカラバイオ株式会社製)、活性維持スーパー培地(In Vitro ADMET Laboratories社製)などが挙げられる。これらの培地には細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-
D-リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、2種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、がん細胞又は肝細胞のスフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を更に混合することができる。
D-リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、2種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、がん細胞又は肝細胞のスフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を更に混合することができる。
細胞及び/又は組織が植物由来である場合、植物組織培養に通常用いられるムラシゲ・スクーグ(MS)培地、リンズマイヤー・スクーグ(LS)培地、ホワイト培地、ガンボーグB5培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地、或いは、これら培地成分を至適濃度に修正した修正培地(例えば、アンモニア態窒素濃度を半分にする等)に、オーキシン類及び必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質(植物ホルモン)を適当な濃度で添加した培地が培地として挙げられる。これらの培地には、必要に応じて、カゼイン分解酵素、コーンスティープリカー、ビタミン類等をさらに補充することができる。オーキシン類としては、例えば、3-インドール酢酸(IAA)、3-インドール酪酸(IBA)、1-ナフタレン酢酸(NAA)、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)等が挙げられるが、それらに限定されない。オーキシン類は、例えば、約0.1~約10ppmの濃度で培地に添加され得る。サイトカイニン類としては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニン(BA)、ゼアチン等が挙げられるが、それらに限定されない。サイトカイニン類は、例えば、約0.1~約10ppmの濃度で培地に添加され得る。
上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。動物由来の細胞及び/又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。
動物由来の細胞及び/又は組織の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、2-メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。培地に添加されるサイトカインとしては、例えばインターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-5(IL-5)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-9(IL-9)、インターロイキン-10(IL-10)、インターロイキン-11(IL-11)、インターロイキン-12(IL-12)、インターロイキン-13(IL-13)、インターロイキン-14(IL-14)、インターロイキン-15(IL-15)、インターロイキン-18(IL-18)、インターロイキン-21(IL-21)、インターフェロン-α(IFN-α)、インターフェロン-β(IFN-β)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、単球コロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、flk2/flt3リガンド(FL)、白血病細胞阻害因子(LIF)、オンコスタチンM(OM)、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
培地に添加されるホルモンとしては、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コ
ルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドY、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
培地に添加される増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子-α(TGF-α)、トランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)、マクロファージ炎症蛋白質-1α(MIP-1α)、上皮細胞増殖因子(EGF)、繊維芽細胞増殖因子-1、2、3、4、5、6、7、8、又は9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神経細胞増殖因子(NGF)肝細胞増殖因子(HGF)、白血病阻止因子(LIF)、プロテアーゼネキシンI、プロテアーゼネキシンII、血小板由来成長因子(PDGF)、コリン作動性分化因子(CDF)、ケモカイン、Notchリガンド(Delta1など)、Wnt蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質2、3、5または7(Angpt2、3、5、7)、インスリン様成長因子(IGF)、インスリン様成長因子結合蛋白質(IGFBP)、プレイオトロフィン(Pleiotrophin)などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
また、遺伝子組替え技術によりこれらのサイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものも添加させることもできる。その例としては、IL-6/可溶性IL-6受容体複合体あるいはHyper IL-6(IL-6と可溶性IL-6受容体との融合タンパク質)などが挙げられる。
各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子の例としては、コラーゲンI乃至XIX、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン-1乃至12、ニトジェン、テネイシン,トロンボスポンジン,フォンビルブランド(von Willebrand)因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、E-セレクチン、P-セレクチン、L-セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。
動物由来の細胞及び/又は組織の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、2-メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。培地に添加されるサイトカインとしては、例えばインターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-5(IL-5)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-9(IL-9)、インターロイキン-10(IL-10)、インターロイキン-11(IL-11)、インターロイキン-12(IL-12)、インターロイキン-13(IL-13)、インターロイキン-14(IL-14)、インターロイキン-15(IL-15)、インターロイキン-18(IL-18)、インターロイキン-21(IL-21)、インターフェロン-α(IFN-α)、インターフェロン-β(IFN-β)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、単球コロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、flk2/flt3リガンド(FL)、白血病細胞阻害因子(LIF)、オンコスタチンM(OM)、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
培地に添加されるホルモンとしては、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コ
ルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドY、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
培地に添加される増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子-α(TGF-α)、トランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)、マクロファージ炎症蛋白質-1α(MIP-1α)、上皮細胞増殖因子(EGF)、繊維芽細胞増殖因子-1、2、3、4、5、6、7、8、又は9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神経細胞増殖因子(NGF)肝細胞増殖因子(HGF)、白血病阻止因子(LIF)、プロテアーゼネキシンI、プロテアーゼネキシンII、血小板由来成長因子(PDGF)、コリン作動性分化因子(CDF)、ケモカイン、Notchリガンド(Delta1など)、Wnt蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質2、3、5または7(Angpt2、3、5、7)、インスリン様成長因子(IGF)、インスリン様成長因子結合蛋白質(IGFBP)、プレイオトロフィン(Pleiotrophin)などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
また、遺伝子組替え技術によりこれらのサイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものも添加させることもできる。その例としては、IL-6/可溶性IL-6受容体複合体あるいはHyper IL-6(IL-6と可溶性IL-6受容体との融合タンパク質)などが挙げられる。
各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子の例としては、コラーゲンI乃至XIX、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン-1乃至12、ニトジェン、テネイシン,トロンボスポンジン,フォンビルブランド(von Willebrand)因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、E-セレクチン、P-セレクチン、L-セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。
培地に添加される抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β-ブロモペニシラン酸、β-クロロペニシラン酸、6-アセチルメチレン-ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリ
ン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノルカディシン、m-カルボキシフェニル、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。
ン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノルカディシン、m-カルボキシフェニル、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。
本発明における特定化合物を上記の培地に添加する場合には、まず適切な溶媒にて当該特定化合物を用時溶解または分散させる(これを、培地添加剤とする。)。その後、培地中での特定化合物濃度として、上に詳述したように、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことのできる濃度、例えば0.0005%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは0.001%乃至0.4%(重量/容量)、より好ましくは0.005%乃至0.1%(重量/容量)、さらに好ましくは0.005%乃至0.05%(重量/容量)となるように、当該培地添加剤を培地中に添加すれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは0.003%乃至0.5%(重量/容量)、より好ましくは0.005%乃至0.1%(重量/容量)、最も好ましくは、0.01%乃至0.03%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。また、別の局面では、脱アシル化ジェランガムの場合、0.0005%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは0.001%乃至0.5%(重量/容量)、より好ましくは0.003%乃至0.1%(重量/容量)、最も好ましくは、0.005%乃至0.03%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、0.001%乃至5.0%(重量/容量)、好ましくは0.01%乃至1.0%(重量/容量)、より好ましくは0.05%乃至0.5%(重量/容量)、最も好ましくは、0.1%乃至0.2%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。κ-カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、0.001%乃至5.0%(重量/容量)、好ましくは0.005%乃至1.0%(重量/容量)、より好ましくは0.01%乃至0.1%、最も好ましくは、0.03%乃至0.05%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとダイユータンガムの混合系の場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、最も好ましくは、0.005%乃至0.01%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとメチルセルロースの混合系の場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、最も好ましくは、0.005%乃至0.2%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとローカストビーンガムの混合系の場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、最も好ましくは、0.01%乃至0.1% (重量/容量)培地中に添加すれば良い。脱ア
シル化ジェランガムとアルギン酸ナトリウムの混合系の場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、最も好ましくは、0.01%乃至0.1%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとキサンタンガムの混合系の場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、最も好ましくは、0.01%乃至0.1%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとκ-カラギーナンの混合系の場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、最も好ましくは、0.01%乃至0.1%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度(%)=特定化合物の重量(g)/培地組成物の容量(ml)×100
シル化ジェランガムとアルギン酸ナトリウムの混合系の場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、最も好ましくは、0.01%乃至0.1%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとキサンタンガムの混合系の場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、最も好ましくは、0.01%乃至0.1%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとκ-カラギーナンの混合系の場合、0.001%乃至1.0%(重量/容量)、最も好ましくは、0.01%乃至0.1%(重量/容量)培地中に添加すれば良い。なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度(%)=特定化合物の重量(g)/培地組成物の容量(ml)×100
ここで、培地添加剤に用いる適切な溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド(DMSO)、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の各種アルコールなどの水性溶媒が挙げられるが、これらに限られるわけではない。この際、特定化合物濃度は0.001%乃至5.0%(重量/容量)、好ましくは0.01%乃至1.0%(重量/容量)、より好ましくは0.1%乃至0.6%(重量/容量)とすることが望ましい。その際、当該特定化合物の効果を高めたり、使用する際の濃度を下げたりするような添加物を更に添加することもできる。この様な添加剤の例として、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の多糖類を1種以上混合することができる。また、当該特定化合物を培養の際に担体表面上に固定化或いは、担体内部に担持して使用することもできる。当該特定化合物は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該特定化合物は、錠剤、丸剤、カプ
セル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や単体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤;乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤;ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤;ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤;脂肪酸エステル等の界面活性剤;グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。また、本発明における特定化合物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌(以下、ろ過滅菌という場合もある)を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、PES(ポリエーテルスルホン)、親水性PVDF(ポリフッ化ビニリデン)、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、0.1μm乃至10μm、より好ましくは、0.1μm乃至1μm、最も好ましくは、0.1μm乃至0.5μmである。これらの滅菌処理は、特定化合物が固形でも溶液の状態でもよい。
セル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や単体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤;乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤;ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤;ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤;脂肪酸エステル等の界面活性剤;グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。また、本発明における特定化合物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌(以下、ろ過滅菌という場合もある)を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、PES(ポリエーテルスルホン)、親水性PVDF(ポリフッ化ビニリデン)、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、0.1μm乃至10μm、より好ましくは、0.1μm乃至1μm、最も好ましくは、0.1μm乃至0.5μmである。これらの滅菌処理は、特定化合物が固形でも溶液の状態でもよい。
上記調製により特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加することにより、液体培地中に上記構造体が形成され、本発明の培地組成物を得ることができる。培地には通常、高分子化合物がイオンを介して集合、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成するのに十分な濃度の金属イオンが含まれるので、本発明の特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加するのみで、本発明の培地組成物を得ることができる。あるいは、培地添加剤(特定化合物の溶液又は分散液)に培地を添加してもよい。さらに、本発明の培地組成物は、特定化合物と培地成分とを、水性溶媒(例えばイオン交換水や超純水等を含む水)中で混合して調製することもできる。混合の態様としては、(1)液体培地と培地添加剤(溶液)とを混合する、(2)液体培地に上記高分子化合物(粉末等の固体)を混合する、(3)培地添加剤(溶液)に粉末培地を混合する、(4)粉末培地及び上記高分子化合物(粉末等の固体)を水性溶媒と混合する、等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の培地組成物における特定化合物の分布が不均一になるのを防ぐために、(1)若しくは(4)又は(1)若しくは(3)の態様が好ましい。
特定化合物を溶媒(例、水、液体培地等の水性溶媒)へ溶解する、または、特定化合物及び粉末培地を溶媒へ溶解する際、溶解促進のため、当該混合液を加熱するのが好ましい。加熱する温度としては、例えば80℃~130℃、好ましくは加熱滅菌されるような100℃~125℃(例、121℃)が挙げられる。加熱後、得られた特定化合物の溶液を室温まで冷却する。当該溶液に、上述の金属イオンを添加することにより(例えば、当該溶液を液体培地へ添加することにより)、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。或いは、特定化合物を、上述の金属イオンを含む溶媒(例、水、液体培地等の水性溶媒)へ溶解する際に、加熱(例えば80℃~130℃、好ましくは100℃~125℃(例、121℃))し、得られた溶液を室温まで冷却することによっても、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。
特定化合物を溶媒(例、水、液体培地等の水性溶媒)へ溶解する、または、特定化合物及び粉末培地を溶媒へ溶解する際、溶解促進のため、当該混合液を加熱するのが好ましい。加熱する温度としては、例えば80℃~130℃、好ましくは加熱滅菌されるような100℃~125℃(例、121℃)が挙げられる。加熱後、得られた特定化合物の溶液を室温まで冷却する。当該溶液に、上述の金属イオンを添加することにより(例えば、当該溶液を液体培地へ添加することにより)、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。或いは、特定化合物を、上述の金属イオンを含む溶媒(例、水、液体培地等の水性溶媒)へ溶解する際に、加熱(例えば80℃~130℃、好ましくは100℃~125℃(例、121℃))し、得られた溶液を室温まで冷却することによっても、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。
本発明の培地組成物の調製方法を例示するが、本発明はこれによって限定されるものではない。特定化合物をイオン交換水あるいは超純水に添加する。そして、当該特定化合物を溶解できる温度(例えば、60℃以上、80℃以上、90℃以上)で加熱しながら撹拌して透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、滅菌(例えば、121℃にて20分でのオートクレーブ滅菌)を行う。室温に戻した後、静置培養に使用する任意の培地を撹拌(例えば、ホモミキサー等)しながら、当該培地に前記滅菌後の水溶液を添加し、当該培地と均一になるように混合する。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また
、混合後に本発明の培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、5μm乃至100μm、好ましくは5μm乃至70μm、より好ましくは10μm乃至70μmである。
、混合後に本発明の培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、5μm乃至100μm、好ましくは5μm乃至70μm、より好ましくは10μm乃至70μmである。
あるいは、粉末培地及び上記高分子化合物(粉末等の固体)を水性溶媒と混合し、上記温度で加熱することで本発明の培地組成物を調製する。
例えば、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、0.1%乃至1%(重量/容量)、好ましくは0.2%乃至0.5%(重量/容量)、より好ましくは0.3%乃至0.4%(重量/容量)となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。また、別の局面では、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、0.1%乃至1%(重量/容量)、好ましくは0.2%乃至0.8%(重量/容量)、より好ましくは0.3%乃至0.6%(重量/容量)となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。
そして、前記脱アシル化ジェランガムを溶解できる温度であれば何度でもよいが、60℃以上、好ましくは80℃以上、より好ましくは90℃以上(例、80~130℃)に加熱しながら撹拌することにより透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、例えば121℃にて20分間オートクレーブ滅菌を行う。室温に戻した後に、例えばDMEM/F12培地をホモミキサー等で攪拌しながら、当該培地に本水溶液を所望の最終濃度となるように添加し(例えば終濃度が0.015%の場合は0.3%水溶液:培地の比率は1:19)、均一に混合させる。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に本発明の培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、5μm乃至100μm、好ましくは5μm乃至70μm、より好ましくは10μm乃至70μmである。
さらに、本発明の培地組成物は調製後、遠心処理により構造体を沈降させることができる。
例えば、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、0.1%乃至1%(重量/容量)、好ましくは0.2%乃至0.5%(重量/容量)、より好ましくは0.3%乃至0.4%(重量/容量)となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。また、別の局面では、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、0.1%乃至1%(重量/容量)、好ましくは0.2%乃至0.8%(重量/容量)、より好ましくは0.3%乃至0.6%(重量/容量)となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。
そして、前記脱アシル化ジェランガムを溶解できる温度であれば何度でもよいが、60℃以上、好ましくは80℃以上、より好ましくは90℃以上(例、80~130℃)に加熱しながら撹拌することにより透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、例えば121℃にて20分間オートクレーブ滅菌を行う。室温に戻した後に、例えばDMEM/F12培地をホモミキサー等で攪拌しながら、当該培地に本水溶液を所望の最終濃度となるように添加し(例えば終濃度が0.015%の場合は0.3%水溶液:培地の比率は1:19)、均一に混合させる。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に本発明の培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、5μm乃至100μm、好ましくは5μm乃至70μm、より好ましくは10μm乃至70μmである。
さらに、本発明の培地組成物は調製後、遠心処理により構造体を沈降させることができる。
本発明の方法で培養する細胞及び/又は組織の形態や状態は、当業者が任意に選択することができる。その好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、細胞及び/又は組織が単独で培地組成物中に分散した状態、細胞及び/又は組織が担体表面上に接着した状態、細胞及び/又は組織が担体内部に包埋した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊(スフェア)を形成した状態、或いは2種以上の細胞が集合して細胞塊(スフェア)を形成した状態等が、より好ましくは細胞及び/又は組織が担体表面上に接着した状態、細胞及び/又は組織が担体内部に包埋した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊(スフェア)を形成した状態、或いは2種以上の細胞が集合して細胞塊(スフェア)を形成した状態が、さらに好ましくは細胞及び/又は組織が担体表面上に接着した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊(スフェア)を形成した状態、或いは2種以上の細胞が集合して細胞塊(スフェア)を形成した状態が挙げられる。これらの状態の内、細胞塊(スフェア)を形成した状態は、生体内環境に近い細胞-細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、細胞機能を長期的に維持したまま培養でき、また細胞の回収が比較的容易であるため、本発明の方法で培養する最も好ましい状態として挙げることができる。
細胞及び/又は組織を表面上に担持させる担体としては、種々の高分子から構成されたマイクロキャリアやガラスビーズ、セラミックスビーズ、ポリスチレンビーズ、デキストランビーズ等が挙げられる。当該高分子の例としては、ビニル樹脂、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、シリコン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、アニリン樹脂、アイオノマー樹脂、ポリカーボネート、コラーゲン、デキストラン、ゼラチン、セルロース、アルギン酸塩及びこれらの混合物等が使用できる。当該担体は、細胞の接着を高める、或
いは細胞からの物質の放出を高める化合物でコートされてもよい。この様なコーティング材料の例としては、ポリ(モノステアロイルグリセリドココハク酸)、ポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、n-イソプロピルアクリルアミド、コラーゲンI乃至XIX、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン-1乃至12、ニトジェン、テネイシン,トロンボスポンジン,フォンビルブランド(von Willebrand)因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、E-セレクチン、P-セレクチン、L-セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。この際、2種以上のコーティング材料を組みわせても良い。また更に、細胞及び/又は組織を表面上に担持した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の多糖類を1種以上混合することができる。また、当該担体は、磁性体材料、例えばフェライトを含有していてもよい。当該担体の直径は数10μmから数100μm、より好ましくは100μmから200μmであり、その比重は、1に近いことが好ましく、より好ましくは0.9~1.2、特に好ましくは約1.0である。当該担体の例としては、これに限られるものではないが、Cytodex 1(登録商標)、Cytodex 3(登録商標)、Cytoline1(登録商標)、Cytoline2(登録商標)、Cytopore1(登録商標)、Cytopore2(登録商標)、(以上、GE Healthcare Life Sciences)、Biosilon(登録商標)(NUNC)、Cult
ispher-G(登録商標)、Cultispher-S(登録商標)(以上、Thermo SCIENTIFIC)、HILLEXCT(登録商標)、ProNectinF-COATED(登録商標)、及びHILLEXII(登録商標)(SoloHillEngineering)、GEM(登録商標)(Global Eukaryotic
Microcarrier)等が挙げられる。当該担体は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。当該担体を用いて動物細胞を培養する方法としては特に制限はなく、通常の流動層型培養槽又は充填層型培養槽を用いる培養方法等を用いることができる。この際、細胞及び/又は組織を表面上に担持させた担体は、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び/又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び/又は組織は、培養後に担体に担持させたまま遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度(G)は、50G乃至1000G、より好ましくは、100G乃至500Gであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは10μm乃至100μmであるが、これらに制限されることは無い。また、担体中にフェライト等の磁性を有する材料を内包させておけば、磁力により培養した担体を回収することができる。本法により培養された細胞及び/又は組織は、各種キレート剤、熱処理や酵素を用いて担体から剥離することにより回収することができる。
いは細胞からの物質の放出を高める化合物でコートされてもよい。この様なコーティング材料の例としては、ポリ(モノステアロイルグリセリドココハク酸)、ポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、n-イソプロピルアクリルアミド、コラーゲンI乃至XIX、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン-1乃至12、ニトジェン、テネイシン,トロンボスポンジン,フォンビルブランド(von Willebrand)因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、E-セレクチン、P-セレクチン、L-セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。この際、2種以上のコーティング材料を組みわせても良い。また更に、細胞及び/又は組織を表面上に担持した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の多糖類を1種以上混合することができる。また、当該担体は、磁性体材料、例えばフェライトを含有していてもよい。当該担体の直径は数10μmから数100μm、より好ましくは100μmから200μmであり、その比重は、1に近いことが好ましく、より好ましくは0.9~1.2、特に好ましくは約1.0である。当該担体の例としては、これに限られるものではないが、Cytodex 1(登録商標)、Cytodex 3(登録商標)、Cytoline1(登録商標)、Cytoline2(登録商標)、Cytopore1(登録商標)、Cytopore2(登録商標)、(以上、GE Healthcare Life Sciences)、Biosilon(登録商標)(NUNC)、Cult
ispher-G(登録商標)、Cultispher-S(登録商標)(以上、Thermo SCIENTIFIC)、HILLEXCT(登録商標)、ProNectinF-COATED(登録商標)、及びHILLEXII(登録商標)(SoloHillEngineering)、GEM(登録商標)(Global Eukaryotic
Microcarrier)等が挙げられる。当該担体は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。当該担体を用いて動物細胞を培養する方法としては特に制限はなく、通常の流動層型培養槽又は充填層型培養槽を用いる培養方法等を用いることができる。この際、細胞及び/又は組織を表面上に担持させた担体は、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び/又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び/又は組織は、培養後に担体に担持させたまま遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度(G)は、50G乃至1000G、より好ましくは、100G乃至500Gであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは10μm乃至100μmであるが、これらに制限されることは無い。また、担体中にフェライト等の磁性を有する材料を内包させておけば、磁力により培養した担体を回収することができる。本法により培養された細胞及び/又は組織は、各種キレート剤、熱処理や酵素を用いて担体から剥離することにより回収することができる。
細胞及び/又は組織を担体内部に包埋する際、種々の高分子から構成された材料を当該担体として選択することができる。この様な高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン接着剤、ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン、ポリウレタンフォーム等のスポンジ、DseA―3D(登録商標)、ポリN-置換アクリルアミド誘導体、ポリN-置換メタアクリルアミド誘導体およびこれらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド、ポリビニ
ルアルコール部分酢化物等の温度感受性高分子、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ニトロセルロース、セルロースブチレート、ポリエチレンオキシド、poly(2-hydroxyethylmethacrylate)/polycaprolactone等のハイドロゲルが挙げられる。また、これらの高分子を2種以上用いて細胞を包埋するための担体を作製することも可能である。更に、当該担体には、これらの高分子以外に生理活性物質を有していても良い。この生理活性物質の例としては、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、又は細胞外マトリックス等が挙げられ、これらを複数含有させことも可能である。細胞接着因子の例としては、ポリ(モノステアロイルグリセリドココハク酸)、ポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、n-イソプロピルアクリルアミド、コラーゲンI乃至XIX、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン-1乃至12、ニトジェン、テネイシン,トロンボスポンジン,フォンビルブランド(von Willebrand)因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、E-セレクチン、P-セレクチン、L-セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。この際、2種以上の細胞接着因子を組みわせても良い。また更に、細胞及び/又は組織を包埋した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の増粘剤を1種以上混合することができる。
これらの担体に細胞及び/又は組織を包埋させる方法は特に制限されないが、例えば、細胞と前記高分子の混液をシリンジに吸引し、25G~19G程度の注射針を介して培地中に滴下する、あるいはマイクロピペットを用いて培地中に滴下するなどの方法を用いても良い。ここで形成されるビーズ状担体のサイズは、細胞と前記高分子混合液を滴下する際に用いる器具先端の形状により決定され、好ましくは数10μmから数1000μm、より好ましくは100μmから2000μmである。ビーズ状担体で培養できる細胞数は特に制限されないが、このビーズサイズに合わせて自由に選択すれば良い。例えば、直径約2000μmのビーズ状担体の場合、500万個までの細胞をこのサイズのビーズ状担体中に包埋することができる。また、細胞は担体内にて一つずつ分散していても、複数個の細胞が集合した細胞塊を形成していても良い。この際、細胞及び/又は組織を包埋させた担体は、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより撹拌等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び/又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び/又は組織は、培養後に担体に包埋した状態で遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度(G)は、50G乃至1000G、より好ましくは、100G乃至500Gであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは10μm乃至100μmであるが、これらに制限されることは無い。本法により培養された細胞及び/又は組織は、各種キレート剤、熱や酵素等の処理を用いて担体を分解することにより分散させ、回収することができる。
ルアルコール部分酢化物等の温度感受性高分子、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ニトロセルロース、セルロースブチレート、ポリエチレンオキシド、poly(2-hydroxyethylmethacrylate)/polycaprolactone等のハイドロゲルが挙げられる。また、これらの高分子を2種以上用いて細胞を包埋するための担体を作製することも可能である。更に、当該担体には、これらの高分子以外に生理活性物質を有していても良い。この生理活性物質の例としては、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、又は細胞外マトリックス等が挙げられ、これらを複数含有させことも可能である。細胞接着因子の例としては、ポリ(モノステアロイルグリセリドココハク酸)、ポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、n-イソプロピルアクリルアミド、コラーゲンI乃至XIX、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン-1乃至12、ニトジェン、テネイシン,トロンボスポンジン,フォンビルブランド(von Willebrand)因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、E-セレクチン、P-セレクチン、L-セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。この際、2種以上の細胞接着因子を組みわせても良い。また更に、細胞及び/又は組織を包埋した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の増粘剤を1種以上混合することができる。
これらの担体に細胞及び/又は組織を包埋させる方法は特に制限されないが、例えば、細胞と前記高分子の混液をシリンジに吸引し、25G~19G程度の注射針を介して培地中に滴下する、あるいはマイクロピペットを用いて培地中に滴下するなどの方法を用いても良い。ここで形成されるビーズ状担体のサイズは、細胞と前記高分子混合液を滴下する際に用いる器具先端の形状により決定され、好ましくは数10μmから数1000μm、より好ましくは100μmから2000μmである。ビーズ状担体で培養できる細胞数は特に制限されないが、このビーズサイズに合わせて自由に選択すれば良い。例えば、直径約2000μmのビーズ状担体の場合、500万個までの細胞をこのサイズのビーズ状担体中に包埋することができる。また、細胞は担体内にて一つずつ分散していても、複数個の細胞が集合した細胞塊を形成していても良い。この際、細胞及び/又は組織を包埋させた担体は、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより撹拌等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び/又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び/又は組織は、培養後に担体に包埋した状態で遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度(G)は、50G乃至1000G、より好ましくは、100G乃至500Gであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは10μm乃至100μmであるが、これらに制限されることは無い。本法により培養された細胞及び/又は組織は、各種キレート剤、熱や酵素等の処理を用いて担体を分解することにより分散させ、回収することができる。
細胞凝集塊(スフェア)を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法、ハンギングドロップ法、旋回培養法、3次元スキャフォールド法、遠心法、電場や磁場による凝集を用いた方法等が挙げられる。例えば、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法については、目的の細胞を、細胞接着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて培養し、スフェアを形成させることができる。この細胞非接着性培養容器を使用する場合は、まず、目的
の細胞を採取した後にその細胞浮遊液を調製し、当該培養容器中に播種して培養を行なう。一週間ほど培養を続けると、細胞は自発的にスフェアを形成する。このとき用いる細胞非接着性表面としては、一般に用いられるシャーレなどの培養容器の表面に、細胞接着を阻害する物質をコートしたものなどを用いることができる。このような物質としては、アガロース、寒天、ポリ-HEMA(ポリ-(2-ハイドロキシ-エチルメタクリレート)2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー(例えばブチルメタクリレート等)との共重合体、ポリ(2-メトキシメチルアクリレート)、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド、メビオールジェル(登録商標)などが挙げられるが、細胞毒性がなければ、これらに限定されるものではない。
また、細胞凝集塊(スフェア)を形成させる方法として、NATURE BIOTECHNOLOGY,VOL.28,NO.4,APRIL 2010,361-366、NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,689-700、NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,572-579、Stem Cell Research,7,2011,97-111、Stem Cell Rev and Rep,6,2010,248-259等に記載された方法を用いることもできる。
また、スフェアを形成させる培養の際に用いる培地中に、スフェアの形成を早める、或いはその維持を促進する成分を含有させることもできる。このような効果を有する成分の例としては、ジメチルスルホキシド、スーパーオキシドジムスターゼ、セルロプラスミン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸リン酸エステル、トコフェロール、フラボノイド、尿酸、ビリルビン、含セレン化合物、トランスフェリン、不飽和脂肪酸、アルブミン、テオフィリン、フォルスコリン、グルカゴン、ヂブチルリルcAMPなどを挙げることができる。含セレン化合物としては、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、ジメチルセレニド、セレン化水素、セレノメチオニン、Se― メチルセレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノシステイン、セレノホモ
システイン、アデノシン-5’-ホスホセレン酸、Se―アデノシルセレノメチオニン、Y27632、Fasudil(HA1077)、H-1152、Wf-536等のROCK阻害剤が挙げられる。また、目的とするサイズの均一な細胞凝集塊を得るためには、使用する細胞非付着性培養容器上に、目的とする細胞凝集塊と同一径の複数の凹みを導入することもできる。これらの凹みが互いに接しているか、あるいは目的とする細胞凝集塊の直径の範囲内であれば、細胞を播種した際、播種した細胞は凹みと凹みの間で細胞凝集塊を形成することなく、確実に凹みの中でその容積に応じた大きさの細胞凝集塊を形成し、均一サイズの細胞凝集塊集団を得ることができる。この際の凹みの形状としては半球または円錐上が好ましい。
あるいは、細胞接着性を有する支持体を基にスフェアを形成させることもできる。この様な支持体の例としては、コラーゲン、ポリロタキサン、ポリ乳酸(PLA)、ポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)、ハイドロゲル等を挙げることができる。
また、フィーダー細胞と共培養することにより、スフェアを形成させることもできる。スフェア形成を促進させるためのフィーダー細胞としては、如何なる接着性細胞でも用いることが可能であるが、好適には各種細胞に応じたフィーダー細胞が望ましい。限定されるものではないが、例えば肝臓や軟骨由来の細胞のスフェアを形成させる場合、そのフィーダー細胞の例としてはCOS-1細胞や血管内皮細胞が好適な細胞種として挙げられる。
さらに、本発明の特定化合物の構造体を含有する培養組成物を用いてスフェアを形成させることもできる。その際、当該特定化合物の濃度が、上に詳述したように、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことのできる濃度、例えば0.0005%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは0.001%乃至0.3%(重量/容量)、より好ましくは0.005%乃至0.1%(重量/容量)、さらに好ましくは0.01%乃至0.05%(重量/容量)となるように、当該特定化合物をスフェア形成の際に用いる培地中に添加すれば良い。ま
た、別の局面では、当該特定化合物の濃度が、上に詳述したように、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことのできる濃度、例えば0.0005%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは0.001%乃至0.3%(重量/容量)、より好ましくは0.003%乃至0.1%(重量/容量)、さらに好ましくは0.005%乃至0.05%(重量/容量)となるように、当該特定化合物をスフェア形成の際に用いる培地中に添加すれば良い。
スフェアは、当該特定化合物の構造体を含む培地中に目的とする細胞を均一に分散させ、3日間乃至10日間静置して培養することにより調製される。ここで調製されたスフェアは、遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。例えば、遠心する際の重力加速度(G)は、50G乃至1000G、より好ましくは、100G乃至500Gであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは10μm乃至100μmであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ(ヴェリタス社製)、MACSマイクロビーズ(ミルテニーバイオテク社製)、BioMag(テクノケミカル社製)等が挙げられる。
スフェアの大きさは、細胞種及び培養期間によって異なり特に限定されないが、球形状或いは楕円球形状であるとした際には20μm乃至1000μm、好ましくは40μm乃至500μm、より好ましくは50μm乃至300μm、最も好ましくは80μm乃至200μmの直径を有する。
このようなスフェアは、そのまま静置培養を続けることでも10日以上、好ましくは13日以上、さらに好ましくは30日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに静置培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
スフェアの培養に用いられる培養容器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル、EZ SPHERE(
旭硝子社製)、スミロンセルタイトプレート(住友ベークライト社製)等が挙げられる。
これらの培養容器のうち、多数の抗がん剤の評価、医薬品候補化合物又は医薬品の評価を実施する際には、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレートが好適に用いられる。これらのプレートのウェル底形状は、特に制限されないが、平底、U字型、V字型のものを用いることが可能であり、好ましくはU字型のものが用いられる。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック等が挙げられる。
の細胞を採取した後にその細胞浮遊液を調製し、当該培養容器中に播種して培養を行なう。一週間ほど培養を続けると、細胞は自発的にスフェアを形成する。このとき用いる細胞非接着性表面としては、一般に用いられるシャーレなどの培養容器の表面に、細胞接着を阻害する物質をコートしたものなどを用いることができる。このような物質としては、アガロース、寒天、ポリ-HEMA(ポリ-(2-ハイドロキシ-エチルメタクリレート)2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー(例えばブチルメタクリレート等)との共重合体、ポリ(2-メトキシメチルアクリレート)、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド、メビオールジェル(登録商標)などが挙げられるが、細胞毒性がなければ、これらに限定されるものではない。
また、細胞凝集塊(スフェア)を形成させる方法として、NATURE BIOTECHNOLOGY,VOL.28,NO.4,APRIL 2010,361-366、NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,689-700、NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,572-579、Stem Cell Research,7,2011,97-111、Stem Cell Rev and Rep,6,2010,248-259等に記載された方法を用いることもできる。
また、スフェアを形成させる培養の際に用いる培地中に、スフェアの形成を早める、或いはその維持を促進する成分を含有させることもできる。このような効果を有する成分の例としては、ジメチルスルホキシド、スーパーオキシドジムスターゼ、セルロプラスミン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸リン酸エステル、トコフェロール、フラボノイド、尿酸、ビリルビン、含セレン化合物、トランスフェリン、不飽和脂肪酸、アルブミン、テオフィリン、フォルスコリン、グルカゴン、ヂブチルリルcAMPなどを挙げることができる。含セレン化合物としては、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、ジメチルセレニド、セレン化水素、セレノメチオニン、Se― メチルセレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノシステイン、セレノホモ
システイン、アデノシン-5’-ホスホセレン酸、Se―アデノシルセレノメチオニン、Y27632、Fasudil(HA1077)、H-1152、Wf-536等のROCK阻害剤が挙げられる。また、目的とするサイズの均一な細胞凝集塊を得るためには、使用する細胞非付着性培養容器上に、目的とする細胞凝集塊と同一径の複数の凹みを導入することもできる。これらの凹みが互いに接しているか、あるいは目的とする細胞凝集塊の直径の範囲内であれば、細胞を播種した際、播種した細胞は凹みと凹みの間で細胞凝集塊を形成することなく、確実に凹みの中でその容積に応じた大きさの細胞凝集塊を形成し、均一サイズの細胞凝集塊集団を得ることができる。この際の凹みの形状としては半球または円錐上が好ましい。
あるいは、細胞接着性を有する支持体を基にスフェアを形成させることもできる。この様な支持体の例としては、コラーゲン、ポリロタキサン、ポリ乳酸(PLA)、ポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)、ハイドロゲル等を挙げることができる。
また、フィーダー細胞と共培養することにより、スフェアを形成させることもできる。スフェア形成を促進させるためのフィーダー細胞としては、如何なる接着性細胞でも用いることが可能であるが、好適には各種細胞に応じたフィーダー細胞が望ましい。限定されるものではないが、例えば肝臓や軟骨由来の細胞のスフェアを形成させる場合、そのフィーダー細胞の例としてはCOS-1細胞や血管内皮細胞が好適な細胞種として挙げられる。
さらに、本発明の特定化合物の構造体を含有する培養組成物を用いてスフェアを形成させることもできる。その際、当該特定化合物の濃度が、上に詳述したように、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことのできる濃度、例えば0.0005%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは0.001%乃至0.3%(重量/容量)、より好ましくは0.005%乃至0.1%(重量/容量)、さらに好ましくは0.01%乃至0.05%(重量/容量)となるように、当該特定化合物をスフェア形成の際に用いる培地中に添加すれば良い。ま
た、別の局面では、当該特定化合物の濃度が、上に詳述したように、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことのできる濃度、例えば0.0005%乃至1.0%(重量/容量)、好ましくは0.001%乃至0.3%(重量/容量)、より好ましくは0.003%乃至0.1%(重量/容量)、さらに好ましくは0.005%乃至0.05%(重量/容量)となるように、当該特定化合物をスフェア形成の際に用いる培地中に添加すれば良い。
スフェアは、当該特定化合物の構造体を含む培地中に目的とする細胞を均一に分散させ、3日間乃至10日間静置して培養することにより調製される。ここで調製されたスフェアは、遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。例えば、遠心する際の重力加速度(G)は、50G乃至1000G、より好ましくは、100G乃至500Gであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは10μm乃至100μmであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ(ヴェリタス社製)、MACSマイクロビーズ(ミルテニーバイオテク社製)、BioMag(テクノケミカル社製)等が挙げられる。
スフェアの大きさは、細胞種及び培養期間によって異なり特に限定されないが、球形状或いは楕円球形状であるとした際には20μm乃至1000μm、好ましくは40μm乃至500μm、より好ましくは50μm乃至300μm、最も好ましくは80μm乃至200μmの直径を有する。
このようなスフェアは、そのまま静置培養を続けることでも10日以上、好ましくは13日以上、さらに好ましくは30日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに静置培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
スフェアの培養に用いられる培養容器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル、EZ SPHERE(
旭硝子社製)、スミロンセルタイトプレート(住友ベークライト社製)等が挙げられる。
これらの培養容器のうち、多数の抗がん剤の評価、医薬品候補化合物又は医薬品の評価を実施する際には、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレートが好適に用いられる。これらのプレートのウェル底形状は、特に制限されないが、平底、U字型、V字型のものを用いることが可能であり、好ましくはU字型のものが用いられる。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック等が挙げられる。
スフェアの静置培養に用いられる培地は、細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、2種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、スフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の増粘剤を更に混合することができる。
本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、振とう等の操作を行わずに均一に培養液中に分散することができるため、目的とする細胞及び/又は組織を細胞機能の損失無くスフェアとして培養することができる。本法により静置培養され
たスフェアは、培養後に遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度(G)は、50G乃至1000G、より好ましくは、100G乃至500Gであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは10μm乃至100μmであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ(ヴェリタス社製)、MACSマイクロビーズ(ミルテニーバイオテク社製)、BioMag(テクノケミカル社製)等が挙げられる。回収されたスフェアは、更に各種キレート剤、熱、フィルターや酵素等の処理を用いて解すことにより単一な細胞として分散させることができる。細胞の回収や培地組成物の交換は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で実行が可能なバイオリアクターや自動培養装置を用いて遠心やろ過処理或いは磁気による回収処理を行うことにより達成することもできる。
本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、振とう等の操作を行わずに均一に培養液中に分散することができるため、目的とする細胞及び/又は組織を細胞機能の損失無くスフェアとして培養することができる。本法により静置培養され
たスフェアは、培養後に遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度(G)は、50G乃至1000G、より好ましくは、100G乃至500Gであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは10μm乃至100μmであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ(ヴェリタス社製)、MACSマイクロビーズ(ミルテニーバイオテク社製)、BioMag(テクノケミカル社製)等が挙げられる。回収されたスフェアは、更に各種キレート剤、熱、フィルターや酵素等の処理を用いて解すことにより単一な細胞として分散させることができる。細胞の回収や培地組成物の交換は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で実行が可能なバイオリアクターや自動培養装置を用いて遠心やろ過処理或いは磁気による回収処理を行うことにより達成することもできる。
植物由来の細胞及び/又は組織を静置培養する際の方法として、分化していない植物細胞塊であるカルスを培養することができる。カルスの誘導は、使用する植物種についてそれぞれ公知の方法により行うことができる。例えば、分化した植物体の一部の組織(例えば、根、茎、葉の切片、種子、生長点、胚、花粉等)表面を、必要に応じて70%アルコールや1%次亜塩素酸ナトリウム溶液等を用いて滅菌した後、必要に応じてメス等を用いて適当な大きさの組織片(例えば、約1~約5mm角の根切片)を切り出し、クリーンベンチ等を用いた無菌操作により、当該組織片を予め滅菌したカルス誘導培地に播種して適当な条件下で無菌培養する。ここで誘導されたカルスは、すぐに大量増殖のために液体培養に付されてもよいし、あるいは継代用培地で継代培養することにより種株として維持することもできる。継代培養は、液体培地及び固形培地のいずれを用いて行ってもよい。
本発明の培地組成物を用いて静置培養を開始する際に接種される植物細胞塊の量は、目的の細胞の増殖速度、培養様式(回分培養、流加培養、連続培養等)、培養期間などに応じて変動するが、例えば、カルス等の植物細胞塊を培養する場合、本発明の培地組成物に対する細胞塊の湿重量が4~8(重量/容積(w/v))%、好ましくは5~7(w/v)%となるように本発明の培地組成物に接種される。培養の際の植物細胞塊の粒径は1mm乃至40mm、好ましくは3mm乃至20mm、より好ましくは5mm乃至15mmである。ここで「粒径」とは、例えば植物細胞塊が球形である場合はその直径を意味し、楕円球形である場合にはその長径を意味し、その他の形状においても同様にとり得る最大長を意味する。
本発明の培地組成物を用いて静置培養を開始する際に接種される植物細胞塊の量は、目的の細胞の増殖速度、培養様式(回分培養、流加培養、連続培養等)、培養期間などに応じて変動するが、例えば、カルス等の植物細胞塊を培養する場合、本発明の培地組成物に対する細胞塊の湿重量が4~8(重量/容積(w/v))%、好ましくは5~7(w/v)%となるように本発明の培地組成物に接種される。培養の際の植物細胞塊の粒径は1mm乃至40mm、好ましくは3mm乃至20mm、より好ましくは5mm乃至15mmである。ここで「粒径」とは、例えば植物細胞塊が球形である場合はその直径を意味し、楕円球形である場合にはその長径を意味し、その他の形状においても同様にとり得る最大長を意味する。
細胞及び/又は組織を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常25乃至39℃、好ましくは33乃至39℃である。CO2濃度は、通常、培養の雰囲気中、4乃至10体積%であり、4乃至6%体積が好ましい。培養期間は通常3乃至35日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。植物細胞の培養温度は、通常20乃至30℃であり、光が必要であれば照度2000~8000ルクスの照度条件下にて培養すればよい。
培養期間は通常3乃至70日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。
培養期間は通常3乃至70日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。
本発明の方法で細胞及び/又は組織を培養する際には、本発明の培養組成物に対して別途調製した細胞及び/又は組織を添加し、均一に分散される様に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は培養液を静置状態にしてもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。また、静置培養の期間において培地組成物の交換が必要となった際には、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び/又は組織と培地組成物を分離した後、新しい培地組成
物を細胞及び/又は組織に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び/又は組織を適宜濃縮した後、新しい培地組成物をこの濃縮液に添加すればよい。
例えば、遠心する際の重力加速度(G)は、50G乃至1000G、より好ましくは、100G乃至500Gであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは10μm乃至100μmであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養した細胞及び/又は組織を分離することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ(ヴェリタス社製)、MACSマイクロビーズ(ミルテニーバイオテク社製)、BioMag(テクノケミカル社製)、磁性ミクロスフェア(Polysciences Inc.製)等が挙げられる。これらの培地組成物の交換は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で実行が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。
物を細胞及び/又は組織に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び/又は組織を適宜濃縮した後、新しい培地組成物をこの濃縮液に添加すればよい。
例えば、遠心する際の重力加速度(G)は、50G乃至1000G、より好ましくは、100G乃至500Gであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは10μm乃至100μmであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養した細胞及び/又は組織を分離することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ(ヴェリタス社製)、MACSマイクロビーズ(ミルテニーバイオテク社製)、BioMag(テクノケミカル社製)、磁性ミクロスフェア(Polysciences Inc.製)等が挙げられる。これらの培地組成物の交換は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で実行が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。
本発明の方法によりがん細胞が効率よく増殖されるため、本発明における特定化合物を含有する培地組成物は、がん細胞に対する抗がん剤の評価に用いることができる。例えば、がん細胞の増殖を阻害する抗がん剤を評価する際、がん細胞と抗がん剤を共存させて培養した時の細胞の数や種類、細胞表面分化マーカーや発現遺伝子の変化を解析するが、この際に本発明の培地組成物を用いることにより解析対象となる細胞の数を効率よく増幅するだけでなく、効率よく回収することができる。本発明においては、特に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含むがん細胞用培地添加剤、該添加剤を含むがん細胞用培地組成物を、がん細胞の増殖、又は抗がん活性の評価等に使用することができる。その際の脱アシル化ジェランガムまたはその塩の濃度は、前述のとおりである。
そして、ダイユータンガムを使用しても、がん細胞が増殖されるが、がん細胞への増殖効果が格別に優れている点、並びに、低濃度で使用(前述の好ましい濃度)できることから培養液に気泡が発生しにくい点、及びがん細胞を回収しやすい点を考慮すると脱アシル化ジェランガムがより好ましい。
そして、ダイユータンガムを使用しても、がん細胞が増殖されるが、がん細胞への増殖効果が格別に優れている点、並びに、低濃度で使用(前述の好ましい濃度)できることから培養液に気泡が発生しにくい点、及びがん細胞を回収しやすい点を考慮すると脱アシル化ジェランガムがより好ましい。
より具体的な抗がん剤のスクリーニング方法としては、(a)被験物質の存在下及び非存在下、本発明の培地組成物中でがん細胞を培養する工程、及び(b)がん細胞の増殖の変化を解析する工程、を含む方法が挙げられる。当該方法はさらに、被験物質の非存在下の場合と比べて、がん細胞の増殖を抑制する物質を選択する工程、及び/又は、がん細胞を回収する工程を含むことができる。変化とは、がん細胞の増殖が増加又は減少することをいう。解析は上記方法を行うことができるが、これらに限定されない。
抗がん剤の活性を評価する際の培養条件、培養器具、培養装置、培地の種類、特定合物の種類、特定化合物の含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度、抗がん剤の種類、抗がん剤の含量などは、本明細書に記載した範囲から当事者が適宜決定し得る。培養により増殖或いは出現した細胞は、当該分野にて標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。細胞数を測定する際には、コロニー形成法、クリスタルバイオレッド法、チミジン取り込み法、トリパンブルー染色法、ATP(アデノシン3リン酸)測定法、3-(4,5-Dimethylthial-2-yl )-2,5-Diphenylt
etrazalium Bromide(MTT)染色法、WST-1(登録商標)染色法、WST-8(登録商標)染色法、フローサイトメトリー法、細胞数自動測定装置を用いた方法などを用いることができる。これらの中では、WST-8(登録商標)染色法が最も好適に利用することができる。また、細胞に対する障害性を評価する際には、乳酸脱水素酵素(LDH)活性測定法、CytoTox-ONE(登録商標)法等を用いることができる。あるいは、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色した後、細胞表面分化マーカーをELISAやフローサイトメトリーにより検出し、抗がん剤による増殖やアポトーシスに対する効果を観察することができる。さらに、抗がんにより発現が変化した遺伝子は、培養した細胞からDNA(デオキシリボ核酸)或いはRNA(リボ核酸)を抽
出し、サザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、RT-PCR法などによって検出することができる。
etrazalium Bromide(MTT)染色法、WST-1(登録商標)染色法、WST-8(登録商標)染色法、フローサイトメトリー法、細胞数自動測定装置を用いた方法などを用いることができる。これらの中では、WST-8(登録商標)染色法が最も好適に利用することができる。また、細胞に対する障害性を評価する際には、乳酸脱水素酵素(LDH)活性測定法、CytoTox-ONE(登録商標)法等を用いることができる。あるいは、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色した後、細胞表面分化マーカーをELISAやフローサイトメトリーにより検出し、抗がん剤による増殖やアポトーシスに対する効果を観察することができる。さらに、抗がんにより発現が変化した遺伝子は、培養した細胞からDNA(デオキシリボ核酸)或いはRNA(リボ核酸)を抽
出し、サザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、RT-PCR法などによって検出することができる。
本発明の方法により肝細胞の生存及び機能が維持されるため、本発明における特定化合物を含有する培地組成物は、医薬品或いは医薬候補物質の肝細胞に対する各種効果を評価する際に用いることができる。例えば、肝細胞に対する医薬候補物質の毒性効果を評価する際、肝細胞と評価の対象とする被験物質を共存させて培養した時の細胞の数や種類、細胞表面分化マーカーや発現遺伝子の変化を解析する。この際、本発明の培地組成物を用いることにより解析対象となる肝細胞の生存と機能を維持するだけでなく、効率よく肝細胞を回収することができる。
肝細胞に作用する医薬品候補物質をスクリーニングする方法としては、(a)被験物質の存在下及び非存在下、本発明の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び(b)肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含む方法が挙げられる。
肝細胞に作用する医薬品候補物質の薬効又は毒性を評価する方法としては、(a)被験物質の存在下及び非存在下、本発明の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び(b)肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含む方法が挙げられる。これらの方法はさらに、被験物質の非存在下の場合と比べて肝細胞の生理学的機能を抑制又は増加する物質を選択する工程、及び/又は、肝細胞を回収する工程を含むことができる。当該変化とは、肝細胞の生理学的機能(例えば、肝細胞増殖、シトクロムP450の酵素活性など)が増加又は減少することをいう。そして、肝細胞の生理学的機能が増加する場合、薬効又は毒性が低い、肝細胞の生理学的機能が低下する場合、薬効又は毒性が高い、等の評価を行うことができる。
肝細胞に作用する医薬品候補物質の薬効又は毒性を評価する方法としては、(a)被験物質の存在下及び非存在下、本発明の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び(b)肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含む方法が挙げられる。これらの方法はさらに、被験物質の非存在下の場合と比べて肝細胞の生理学的機能を抑制又は増加する物質を選択する工程、及び/又は、肝細胞を回収する工程を含むことができる。当該変化とは、肝細胞の生理学的機能(例えば、肝細胞増殖、シトクロムP450の酵素活性など)が増加又は減少することをいう。そして、肝細胞の生理学的機能が増加する場合、薬効又は毒性が低い、肝細胞の生理学的機能が低下する場合、薬効又は毒性が高い、等の評価を行うことができる。
当該医薬候補物質の活性を評価する際の培養条件、培養器具、培養装置、培地の種類、特定合物の種類、特定化合物の含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度、医薬品或いは医薬候補物質の種類又はその含量などは、本明細書に記載した範囲から当事者により適宜選択される。培養により維持或いは出現した細胞は、当該分野にて標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。また、細胞数を測定する際には、コロニー形成法、クリスタルバイオレッド法、チミジン取り込み法、トリパンブルー染色法、ATP(アデノシン3リン酸)測定法、3-(4,5-Dimethylthial-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazalium Bromide(MTT)染色法、WST-1(登録商標)染色法、WST-8(登録商標)染色法、フローサイトメトリー法、細胞数自動測定装置を用いた方法などを用いることができる。この中では、WST-8(登録商標)染色法が最も好適に利用することができる。また、細胞に対する障害性を評価する際には、乳酸脱水素酵素(LDH)活性測定法、CytoTox-ONE(登録商標)法等を用いることができる。また、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色した後、細胞表面分化マーカーをELISA(Enzyme-linked immu
nosorbent assay)やフローサイトメトリーにより検出し、医薬品或いは
医薬候補物質による増殖やアポトーシスに対する効果を観察することができる。医薬品或いは医薬候補物質により発現が変化した遺伝子は、培養した細胞からDNA(デオキシリボ核酸)或いはRNA(リボ核酸)を抽出しサザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、RT-PCR法などによって検出することができる。また、医薬品或いは医薬候補物質により発現が変化した蛋白質は、ELISA、ウェスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法等によって検出することができる。更に、シトクロムP450の酵素活性は、当該酵素による基質の構造変換活性を放射性同位体法、高速液体クロマトグラフィー法、発光法、発色法等を用いることにより検出することができる。
nosorbent assay)やフローサイトメトリーにより検出し、医薬品或いは
医薬候補物質による増殖やアポトーシスに対する効果を観察することができる。医薬品或いは医薬候補物質により発現が変化した遺伝子は、培養した細胞からDNA(デオキシリボ核酸)或いはRNA(リボ核酸)を抽出しサザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、RT-PCR法などによって検出することができる。また、医薬品或いは医薬候補物質により発現が変化した蛋白質は、ELISA、ウェスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法等によって検出することができる。更に、シトクロムP450の酵素活性は、当該酵素による基質の構造変換活性を放射性同位体法、高速液体クロマトグラフィー法、発光法、発色法等を用いることにより検出することができる。
以下に本発明の培地組成物の分析例、試験例を実施例として具体的に述べることで、本
発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
(分析例1:脱アシル化ジェランガムを含む培地の粘度測定及び細胞浮遊試験)
脱アシル化ジェランガム含有培地の調製及び粘度測定
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.4%(w/v)となるように純水に懸濁させた後、90℃にて加熱攪拌し溶解させた。本水溶液を攪拌しながら室温まで放冷し、121℃で20分オートクレーブ滅菌した。300mLトールビーカーに2倍濃度のDMEM/F-12培地(Aldrich社製)50mLと滅菌水47.5mLを入れ、室温でホモミキサー(3000rpm)で攪拌しながら脱アシル化ジェランガム水溶液2.5mLを添加し、そのまま1分攪拌を続けることで脱アシル化ジェランガム終濃度0.01%培地組成物を調製した。同様に終濃度が0.02、0.03、0.05%(w/v)となるよう脱アシル化ジェランガム水溶液を添加した培地組成物を調製した。本培地組成物の粘度は37℃条件下でE型粘度計(東機産業株式会社製、Viscometer TVE-22L、標準ロータ1°34´×R24)を用
いて、回転数100rpmで5分間測定した。
脱アシル化ジェランガム含有培地の細胞浮遊試験
ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(WAKO社製)に250000個/mLとなるように懸濁し、本懸濁液10mLをEZ SPHERE(旭硝子社製)に播種した後、CO2インキュベーター(5%CO2)内で3日間培養した。ここで得られたスフェア(直径100~200μm)の懸濁液10mLを遠心処理(200G、5分間)してスフェアを沈降させ、上清を除くことによりスフェア懸濁液1.0mLを調製した。引き続き、上記で調製した脱アシル化ジェランガム含有培地を1.5mLエッペンドルフチューブに1.0mLずつ入れ、更にHeLa細胞スフェア懸濁液10μLを加えた。タッピングにより
細胞塊を分散させ、37℃でインキュベートし、1時間後の細胞の分散状態を目視にて観察した。
脱アシル化ジェランガム含有培地の調製及び粘度測定
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.4%(w/v)となるように純水に懸濁させた後、90℃にて加熱攪拌し溶解させた。本水溶液を攪拌しながら室温まで放冷し、121℃で20分オートクレーブ滅菌した。300mLトールビーカーに2倍濃度のDMEM/F-12培地(Aldrich社製)50mLと滅菌水47.5mLを入れ、室温でホモミキサー(3000rpm)で攪拌しながら脱アシル化ジェランガム水溶液2.5mLを添加し、そのまま1分攪拌を続けることで脱アシル化ジェランガム終濃度0.01%培地組成物を調製した。同様に終濃度が0.02、0.03、0.05%(w/v)となるよう脱アシル化ジェランガム水溶液を添加した培地組成物を調製した。本培地組成物の粘度は37℃条件下でE型粘度計(東機産業株式会社製、Viscometer TVE-22L、標準ロータ1°34´×R24)を用
いて、回転数100rpmで5分間測定した。
脱アシル化ジェランガム含有培地の細胞浮遊試験
ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(WAKO社製)に250000個/mLとなるように懸濁し、本懸濁液10mLをEZ SPHERE(旭硝子社製)に播種した後、CO2インキュベーター(5%CO2)内で3日間培養した。ここで得られたスフェア(直径100~200μm)の懸濁液10mLを遠心処理(200G、5分間)してスフェアを沈降させ、上清を除くことによりスフェア懸濁液1.0mLを調製した。引き続き、上記で調製した脱アシル化ジェランガム含有培地を1.5mLエッペンドルフチューブに1.0mLずつ入れ、更にHeLa細胞スフェア懸濁液10μLを加えた。タッピングにより
細胞塊を分散させ、37℃でインキュベートし、1時間後の細胞の分散状態を目視にて観察した。
(比較例)メチルセルロース、コラーゲン含有培地の調製
メチルセルロース含有培地の調製
200mLナスフラスコにDMEM/F-12培地(Aldrich社製)100mLを入れ、メチルセルロース(M0387、Aldrich社製)0.1gを加えた。氷浴にて冷却しながら攪拌し、メチルセルロースを溶解させた。本溶液を用いて終濃度が0.1、0.3、0.6、1.0%(w/v)となるようメチルセルロース水溶液を添加した培地組成物を調製した。
コラーゲン含有培地の調製
0.3%セルマトリックスタイプI-A(新田ゼラチン社製)6.5mLに10倍濃度のDMEM/F-12培地(Aldrich社製)1mL、再構成用緩衝液(新田ゼラチン社製)1mL及び純水1.5mLを入れ、氷中にて撹拌しながら0.2%のコラーゲン含有培地を調製した。同様に、終濃度が0.01、0.05、0.1、0.2%(w/v)となるようコラーゲンを添加した培地組成物を調製した。
上記で調製した培地組成物についても脱アシル化ジェランガム含有培地と同様にHeLa細胞スフェアの浮遊試験および粘度測定を実施した。ただし、1.0%(w/v)メチルセルロースの粘度は、装置の測定範囲より50rpmにて測定した。
メチルセルロース含有培地の調製
200mLナスフラスコにDMEM/F-12培地(Aldrich社製)100mLを入れ、メチルセルロース(M0387、Aldrich社製)0.1gを加えた。氷浴にて冷却しながら攪拌し、メチルセルロースを溶解させた。本溶液を用いて終濃度が0.1、0.3、0.6、1.0%(w/v)となるようメチルセルロース水溶液を添加した培地組成物を調製した。
コラーゲン含有培地の調製
0.3%セルマトリックスタイプI-A(新田ゼラチン社製)6.5mLに10倍濃度のDMEM/F-12培地(Aldrich社製)1mL、再構成用緩衝液(新田ゼラチン社製)1mL及び純水1.5mLを入れ、氷中にて撹拌しながら0.2%のコラーゲン含有培地を調製した。同様に、終濃度が0.01、0.05、0.1、0.2%(w/v)となるようコラーゲンを添加した培地組成物を調製した。
上記で調製した培地組成物についても脱アシル化ジェランガム含有培地と同様にHeLa細胞スフェアの浮遊試験および粘度測定を実施した。ただし、1.0%(w/v)メチルセルロースの粘度は、装置の測定範囲より50rpmにて測定した。
[試験例]
次に、本発明の培地組成物の細胞培養における有用性について、以下の試験例において具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。なお、CO2インキュベーターにおけるCO2の濃度(%)は、雰囲気中のCO2の体積%で示した。また、PBSはリン酸緩衝生理食塩水(シグマアルドリッチジャパン社製)を意味し、FBSは牛胎児血清(Biological Industries社製)を意味する。また、(w/v)は、1体積あたりの重量を表わす。
次に、本発明の培地組成物の細胞培養における有用性について、以下の試験例において具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。なお、CO2インキュベーターにおけるCO2の濃度(%)は、雰囲気中のCO2の体積%で示した。また、PBSはリン酸緩衝生理食塩水(シグマアルドリッチジャパン社製)を意味し、FBSは牛胎児血清(Biological Industries社製)を意味する。また、(w/v)は、1体積あたりの重量を表わす。
(試験例1:単一の細胞を分散させた際の細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清及び10ng/mLのトロンボポエチン(WAKO社製)を含むIMDM培地(ギブコ社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト白血病細胞株UT7/TPOを、20000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、6ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製)のウェルに1ウェル当たり5mLなるように分注した。同様に、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、20000細胞/mLとなるように10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(WAKO社製)に0.015%(w/v)の脱ア
シル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を添加した培地組成物に播種した後、6ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製)のウェルに1ウェル当たり5mLなるように分注した。これらの細胞懸濁液をCO2インキュベーター(5%CO2)内にて3日間静置状態で培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清及び10ng/mLのトロンボポエチン(WAKO社製)を含むIMDM培地(ギブコ社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト白血病細胞株UT7/TPOを、20000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、6ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製)のウェルに1ウェル当たり5mLなるように分注した。同様に、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、20000細胞/mLとなるように10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(WAKO社製)に0.015%(w/v)の脱ア
シル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を添加した培地組成物に播種した後、6ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製)のウェルに1ウェル当たり5mLなるように分注した。これらの細胞懸濁液をCO2インキュベーター(5%CO2)内にて3日間静置状態で培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。
その結果、UT7/TPO細胞及びHeLa細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。浮遊静置培養3日間後のUT7/TPO細胞及びHeLa細胞の細胞数を表4に示す。
(試験例2:細胞株由来スフェアを培養した際の細胞増殖試験)
ヒト肝癌細胞株HepG2(DSファーマバイオメディカル社製)を、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に250000個/mLとなるように懸濁し、本懸濁液10mLをEZ SPHERE(旭硝子社製)に播種した後、CO2インキュベーター(5%CO2)内で7日間培養した。同様に、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(WAKO社製)に250000個/mLとなるように懸濁し、本懸濁液10mLをEZ SPHERE(旭硝子社製)に播種した後、CO2インキュベーター(5%CO2)内で7日間培養した。ここで得られたそれぞれの細胞株のスフェア(直径100~200μm)の懸濁液2.5mLを遠心処理(200G、5分間)してスフェアを沈降させ上清を除いた。引き続き、本スフェア(約800個)に上記培地10mLを添加して懸濁した後、平底チューブ(BM機器社製)に移した。同様に、上記培地に0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を添加した培地組成物を用いてスフェアの懸濁液を作成し、平底チューブ(BM機器社製)に移した。なお、0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した後、1/20希釈で10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地に添加することにより調製した。
ヒト肝癌細胞株HepG2(DSファーマバイオメディカル社製)を、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に250000個/mLとなるように懸濁し、本懸濁液10mLをEZ SPHERE(旭硝子社製)に播種した後、CO2インキュベーター(5%CO2)内で7日間培養した。同様に、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(WAKO社製)に250000個/mLとなるように懸濁し、本懸濁液10mLをEZ SPHERE(旭硝子社製)に播種した後、CO2インキュベーター(5%CO2)内で7日間培養した。ここで得られたそれぞれの細胞株のスフェア(直径100~200μm)の懸濁液2.5mLを遠心処理(200G、5分間)してスフェアを沈降させ上清を除いた。引き続き、本スフェア(約800個)に上記培地10mLを添加して懸濁した後、平底チューブ(BM機器社製)に移した。同様に、上記培地に0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を添加した培地組成物を用いてスフェアの懸濁液を作成し、平底チューブ(BM機器社製)に移した。なお、0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した後、1/20希釈で10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地に添加することにより調製した。
37℃で3日間、CO2インキュベーター(5%CO2)内で上記スフェア懸濁液を静置培養した後、2倍容量の培地を添加して遠心処理(200G、5分間)を行うことによりスフェアを沈降させ、上清を除いた。ここで、スフェアの一部を分取し、光学顕微鏡(OLMPUS社製、CK30-F100)にてその形状を観察した。引き続き、回収したスフェアをPBS10mLにて1回洗浄した後、1mLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。上記培地を9mL添加した後、遠心処理(200G、5分間)により細胞を回収した。ここで得られた細胞懸濁液2mLの一部に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞及び死細胞の数を測定した。
その結果、HepG2細胞及びHeLa細胞のスフェアは本発明の培地組成物を用いる
ことにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、既存の培地と比べて細胞を増殖させた際に死細胞の割合が少なく、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。この際、既存の培地で培養したスフェアは培養容器の底面に沈降していた。更に、培養したスフェアの形状を光学顕微鏡にて観察したところ、本発明の培地組成物ではスフェア同士の会合が見られないのに対し、既存の培地ではスフェア同士の会合が観察された。
HepG2細胞及びHeLa細胞に関して、脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を1としたときの相対的細胞数を表5に示す。また、脱アシル化ジェランガムを含まない培地で培養した際の死細胞率(死細胞数/生細胞数)を1としたときの相対的死細胞率を表6に示す。また、HepG2細胞及びHeLa細胞のスフェアを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図1及び図2にそれぞれ示す。さらに、培養したHeLa細胞のスフェアの形状を図3に示す。
ことにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、既存の培地と比べて細胞を増殖させた際に死細胞の割合が少なく、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。この際、既存の培地で培養したスフェアは培養容器の底面に沈降していた。更に、培養したスフェアの形状を光学顕微鏡にて観察したところ、本発明の培地組成物ではスフェア同士の会合が見られないのに対し、既存の培地ではスフェア同士の会合が観察された。
HepG2細胞及びHeLa細胞に関して、脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を1としたときの相対的細胞数を表5に示す。また、脱アシル化ジェランガムを含まない培地で培養した際の死細胞率(死細胞数/生細胞数)を1としたときの相対的死細胞率を表6に示す。また、HepG2細胞及びHeLa細胞のスフェアを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図1及び図2にそれぞれ示す。さらに、培養したHeLa細胞のスフェアの形状を図3に示す。
(試験例3:ヒト多能性幹細胞の接着培養における細胞増殖試験)
ヒト多能性幹細胞(hPSCs)は、通常フィーダー上やマトリゲルをコーティングした培養皿上に接着させる平面培養条件下で増殖維持される。脱アシル化ジェランガムのhPSCsに対する毒性を評価するために、マトリゲル(ベクトン・ディッキントン社製)を用いた平面培養条件下で、mTeSR培地(STEM CELL Technologies社製)に0.000%乃至0.020% (w/v)の濃度となるように脱アシル化ジェランガムを添加し、hPSCsの増殖に対する影響を検討した。この際、ヒトiPS細胞として京都大学253G1株、ヒトES細胞株として京都大学KhES-1株を培養した。なお、上記濃度の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した後、所定の濃度となる様にmTeSR培地に添加することにより調製した。その結果、ヒトiPS細胞及びヒトES細胞共に、脱アシル化ジェランガムの添加培地においても、通常のmTeSR培地と同程度の細胞数を得ることができ、脱アシル化ジェランガムによる毒性は認められなかった。その結果を図4に示す。図4における培養後の細胞数は、マトリゲルコーティング培養皿にhPSCsを播種し、脱アシル化ジェランガムを含むmTeSR培地で5日間培養し、得られた細胞数を、脱アシル化ジェランガムを含まないmTeSR培地での細胞数を1として相対値で示した。
ヒト多能性幹細胞(hPSCs)は、通常フィーダー上やマトリゲルをコーティングした培養皿上に接着させる平面培養条件下で増殖維持される。脱アシル化ジェランガムのhPSCsに対する毒性を評価するために、マトリゲル(ベクトン・ディッキントン社製)を用いた平面培養条件下で、mTeSR培地(STEM CELL Technologies社製)に0.000%乃至0.020% (w/v)の濃度となるように脱アシル化ジェランガムを添加し、hPSCsの増殖に対する影響を検討した。この際、ヒトiPS細胞として京都大学253G1株、ヒトES細胞株として京都大学KhES-1株を培養した。なお、上記濃度の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した後、所定の濃度となる様にmTeSR培地に添加することにより調製した。その結果、ヒトiPS細胞及びヒトES細胞共に、脱アシル化ジェランガムの添加培地においても、通常のmTeSR培地と同程度の細胞数を得ることができ、脱アシル化ジェランガムによる毒性は認められなかった。その結果を図4に示す。図4における培養後の細胞数は、マトリゲルコーティング培養皿にhPSCsを播種し、脱アシル化ジェランガムを含むmTeSR培地で5日間培養し、得られた細胞数を、脱アシル化ジェランガムを含まないmTeSR培地での細胞数を1として相対値で示した。
(試験例4:ヒト多能性幹細胞のスフェア培養における脱アシル化ジェランガムの沈降抑制試験)
hPSCsは、ペトリ培養皿など低接着性の培養皿でスフェアを形成する。例えば、該スフェアは、NATURE BIOTECHNOLOGY,VOL.28,NO.4,A
PRIL 2010,361-366、NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,689-700、NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,572-579、Stem Cell Research,7,2011,97-111、Stem Cell Rev and Rep,6,2010,248-259に記載されたいずれの方法を用いても形成できる。フィーダー細胞(マウス胎児線維芽細胞)上で維持したhPSCs(京都大学253G1株或いは京都大学KhES-1株)を回収し、フィーダー細胞を自然沈降で除去した後、Rhoキナーゼ阻害剤のY-27632(10μM)を添加したmTeSR培地にhPSCsを再懸濁した。引き続き、一定のサイズのhPSCsコロニーをペトリ培養皿(BDファルコン社製)に播種し、37℃にてCO2インキュベーター(5%CO2)内で培養することによりスフェアを形成させた。培地交換は、Y-27632を含まないmTeSR培地で継代後1日目と3日目に行い、継代は5日毎にY-27632を含むmTeSR培地で行った。このようにして調製したhPSCsのスフェア(培養4日目)を、mTeSR培地に0.000%乃至0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物(試験例3と同様の方法にて調製)にて懸濁したのち、キュベットに移した。本キュベットを37℃にてCO2インキュベーター(5%CO2)内で一晩放置し、脱アシル化ジェランガムによるスフェアの沈降抑制効果について検討した。その結果を図5に示す。図5に示すように、脱アシル化ジェランガムの添加により全ての濃度域にてスフェアを培地中に三次元的に浮遊状態で保つことができた。一方、脱アシル化ジェランガムを添加していない既存の培地ではスフェアは培養容器の底面に沈降し、浮遊状態に出来ないことが分かった。また、脱アシル化ジェランガムの効果はヒトiPS細胞及びヒトES細胞で共通であった。以上の結果より、脱アシル化ジェランガムはhPSCsのスフェアを浮遊状態に保てることが示された。
hPSCsは、ペトリ培養皿など低接着性の培養皿でスフェアを形成する。例えば、該スフェアは、NATURE BIOTECHNOLOGY,VOL.28,NO.4,A
PRIL 2010,361-366、NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,689-700、NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,572-579、Stem Cell Research,7,2011,97-111、Stem Cell Rev and Rep,6,2010,248-259に記載されたいずれの方法を用いても形成できる。フィーダー細胞(マウス胎児線維芽細胞)上で維持したhPSCs(京都大学253G1株或いは京都大学KhES-1株)を回収し、フィーダー細胞を自然沈降で除去した後、Rhoキナーゼ阻害剤のY-27632(10μM)を添加したmTeSR培地にhPSCsを再懸濁した。引き続き、一定のサイズのhPSCsコロニーをペトリ培養皿(BDファルコン社製)に播種し、37℃にてCO2インキュベーター(5%CO2)内で培養することによりスフェアを形成させた。培地交換は、Y-27632を含まないmTeSR培地で継代後1日目と3日目に行い、継代は5日毎にY-27632を含むmTeSR培地で行った。このようにして調製したhPSCsのスフェア(培養4日目)を、mTeSR培地に0.000%乃至0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物(試験例3と同様の方法にて調製)にて懸濁したのち、キュベットに移した。本キュベットを37℃にてCO2インキュベーター(5%CO2)内で一晩放置し、脱アシル化ジェランガムによるスフェアの沈降抑制効果について検討した。その結果を図5に示す。図5に示すように、脱アシル化ジェランガムの添加により全ての濃度域にてスフェアを培地中に三次元的に浮遊状態で保つことができた。一方、脱アシル化ジェランガムを添加していない既存の培地ではスフェアは培養容器の底面に沈降し、浮遊状態に出来ないことが分かった。また、脱アシル化ジェランガムの効果はヒトiPS細胞及びヒトES細胞で共通であった。以上の結果より、脱アシル化ジェランガムはhPSCsのスフェアを浮遊状態に保てることが示された。
(試験例5:ヒト多能性幹細胞のスフェア培養における細胞増殖試験)
三次元的な浮遊状態でhPSCsがチューブ培養できるかを検討した。0.000%、0.015%或いは0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含むmTeSR培地に対して、試験例4と同様な方法にて調製、継代したhPSCsスフェア(600乃至800個/3mL)を5mLのポリスチレンチューブ(BDファルコン社製)中 にそれぞれ同一のスフェア数となる様に播種し、37℃にて5日間CO2インキュベーター(5%CO2)内で培養した。培地交換は、3倍容量のDMEM/F-12培地(シグマ社製)を培養液に添加した後遠心処理(100G、3分間)によりスフェアを沈降させ、本スフェアに新たな培地を添加する形で、継代後1日目と3日目に行った。5日目に等量のD
MEM/F-12培地(シグマ社製)を添加後、遠心処理(100G、3分間)によりスフェアを全て回収し、トリプシン-EDTA溶液 (インビトロジェン社製) を用いて単細胞に解離した後、ヌクレオカウンター (chemometec社製) にて細胞数を測定した。その結果、脱アシル化ジェランガムを含まない培地では、スフェアはチューブの底に沈み、大きな細胞塊となり増殖を示さなかったが、0.015%或いは0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含む培地では三次元的な浮遊状態でスフェアのサイズは大きくなり、播種した細胞数を1とすると5日目には、約10倍の細胞数が得られ、細胞増殖が認められた。その結果を図6に示す。図6は播種した細胞数を1とした時に5日
目の細胞数を相対的に示している。また、ヒトES細胞では、ポリスチレンチューブ中での培養5日目に3mLあたり3,000,000個の細胞数を実際に得ることができた(培地1000mLの場合には約1,000,000,000個の細胞数に相当する)。
三次元的な浮遊状態でhPSCsがチューブ培養できるかを検討した。0.000%、0.015%或いは0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含むmTeSR培地に対して、試験例4と同様な方法にて調製、継代したhPSCsスフェア(600乃至800個/3mL)を5mLのポリスチレンチューブ(BDファルコン社製)中 にそれぞれ同一のスフェア数となる様に播種し、37℃にて5日間CO2インキュベーター(5%CO2)内で培養した。培地交換は、3倍容量のDMEM/F-12培地(シグマ社製)を培養液に添加した後遠心処理(100G、3分間)によりスフェアを沈降させ、本スフェアに新たな培地を添加する形で、継代後1日目と3日目に行った。5日目に等量のD
MEM/F-12培地(シグマ社製)を添加後、遠心処理(100G、3分間)によりスフェアを全て回収し、トリプシン-EDTA溶液 (インビトロジェン社製) を用いて単細胞に解離した後、ヌクレオカウンター (chemometec社製) にて細胞数を測定した。その結果、脱アシル化ジェランガムを含まない培地では、スフェアはチューブの底に沈み、大きな細胞塊となり増殖を示さなかったが、0.015%或いは0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含む培地では三次元的な浮遊状態でスフェアのサイズは大きくなり、播種した細胞数を1とすると5日目には、約10倍の細胞数が得られ、細胞増殖が認められた。その結果を図6に示す。図6は播種した細胞数を1とした時に5日
目の細胞数を相対的に示している。また、ヒトES細胞では、ポリスチレンチューブ中での培養5日目に3mLあたり3,000,000個の細胞数を実際に得ることができた(培地1000mLの場合には約1,000,000,000個の細胞数に相当する)。
(試験例6:ヒト多能性幹細胞のスフェア培養における未分化性維持の確認試験)
0.015%或いは0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含むmTeSR培地にて浮遊静置培養したhPSCsスフェア細胞に関して、その未分化能の維持をフローサイトメトリーによる解析で検討した。ポリスチレンチューブ中にてスフェア状態でヒトES細胞(KhES-1)は3回継代した細胞、ヒトiPS細胞(253G1)につ
いては4回継代した細胞を回収した後、hPSCsの未分化性を示す表面マーカーであるSSEA4の抗体(#MAB4304、ミリポア社製)とTRA-1-60(#MAB4360、ミリポア社製)の抗体にて染色し、FACSCantoII(ベクトン・ディッキンソン社製)を用いて細胞の抗体染色の陽性率を評価した。その結果を図7に示す。図7に示すように、A:ヒトiPS細胞(253G1)、B:ヒトES細胞(KhES-1)共に、マトリゲル上で維持した細胞と同様、脱アシル化ジェランガムを含む添加培地で浮遊静置培養した細胞の90%以上が多能性幹細胞マーカーを発現していた。なお、ネガティブコントロールとして二次抗体のみの染色を実施した。以上のように、ヒトiPS細胞及びヒトES細胞共に、脱アシル化ジェランガムを含む添加培地で浮遊静置培養したhPSCsスフェアは未分化性を維持していることが判明した。
0.015%或いは0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含むmTeSR培地にて浮遊静置培養したhPSCsスフェア細胞に関して、その未分化能の維持をフローサイトメトリーによる解析で検討した。ポリスチレンチューブ中にてスフェア状態でヒトES細胞(KhES-1)は3回継代した細胞、ヒトiPS細胞(253G1)につ
いては4回継代した細胞を回収した後、hPSCsの未分化性を示す表面マーカーであるSSEA4の抗体(#MAB4304、ミリポア社製)とTRA-1-60(#MAB4360、ミリポア社製)の抗体にて染色し、FACSCantoII(ベクトン・ディッキンソン社製)を用いて細胞の抗体染色の陽性率を評価した。その結果を図7に示す。図7に示すように、A:ヒトiPS細胞(253G1)、B:ヒトES細胞(KhES-1)共に、マトリゲル上で維持した細胞と同様、脱アシル化ジェランガムを含む添加培地で浮遊静置培養した細胞の90%以上が多能性幹細胞マーカーを発現していた。なお、ネガティブコントロールとして二次抗体のみの染色を実施した。以上のように、ヒトiPS細胞及びヒトES細胞共に、脱アシル化ジェランガムを含む添加培地で浮遊静置培養したhPSCsスフェアは未分化性を維持していることが判明した。
(試験例7: スフェア培養したヒト多能性幹細胞の特性解析1)
試験例3と同様の方法にて調製した0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を含むmTeSR培地(STEM C
ELL Technologies社製)を用いて、試験例4と同様の方法にてヒトiP
S細胞 (253G1)或いはヒトES細胞 (KhES-1)のスフェアを合計9回継代培養し、培養後のそれぞれの細胞について継代1日目のスフェアをマウス胎児線維芽細胞上に
播種した。次の日に300μg/mLのチミジン(シグマ・アルドリッチ社製)処理を1晩実施した。引き続き、100ng/mLのコルセミド(ナカライテスク社製)処理を行い、トリプシン-EDTA溶液にて単一細胞に解離後、0.075MのKClで低張処理を行った。その後、カルノア固定液(メタノール:酢酸=3:1)にて細胞を固定した。
本固定細胞の核型解析はQバンディング法で分析した(有限会社クロモソームサイエンスラボへの委託試験)。その結果、ヒトiPS細胞及びヒトES細胞共に、本発明の培地組成物で浮遊静置培養した細胞は、正常核型を保持していることが判明した。その結果を図8に示す。
試験例3と同様の方法にて調製した0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を含むmTeSR培地(STEM C
ELL Technologies社製)を用いて、試験例4と同様の方法にてヒトiP
S細胞 (253G1)或いはヒトES細胞 (KhES-1)のスフェアを合計9回継代培養し、培養後のそれぞれの細胞について継代1日目のスフェアをマウス胎児線維芽細胞上に
播種した。次の日に300μg/mLのチミジン(シグマ・アルドリッチ社製)処理を1晩実施した。引き続き、100ng/mLのコルセミド(ナカライテスク社製)処理を行い、トリプシン-EDTA溶液にて単一細胞に解離後、0.075MのKClで低張処理を行った。その後、カルノア固定液(メタノール:酢酸=3:1)にて細胞を固定した。
本固定細胞の核型解析はQバンディング法で分析した(有限会社クロモソームサイエンスラボへの委託試験)。その結果、ヒトiPS細胞及びヒトES細胞共に、本発明の培地組成物で浮遊静置培養した細胞は、正常核型を保持していることが判明した。その結果を図8に示す。
(試験例8: スフェア培養したヒト多能性幹細胞の特性解析2)
試験例3と同様の方法にて調製した0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を含むmTeSR培地(STEM C
ELL Technologies社製)を用いて、試験例4と同様の方法にてヒトiP
S細胞 (253G1)のスフェアを合計21回から22回、5日間毎に継代培養し、培養
後のスフェアを4%(w/v)パラホルムアルデヒド(ナカライテスク社製)で固定した。20%スクロース(w/v)を含むPBSで浸漬した後、凍結用包埋剤(O.C.Tコンパウンド, サクラファインテックジャパン株式会社製)で包埋した。クライオスタット(サーモサイエンティフィック社製)で厚さ12μmの切片を作成し、hPSCsの未分
化性を示すNANOG(#4903、セルシグナリング社製)とOCT3/4(#sc-5279、サンタクルツ社製)、SSEA4(#MAB4304、ミリポア社製)の抗体にて染色した。その結果、脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物で浮遊静置培養した細胞は、多能性幹細胞の未分化マーカーを発現していることが明らかになった。以上のように、脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物で100日以上浮遊静置培養したヒトiPS細胞のスフェアは未分化性を維持していることが判明した。その結果を図9に示す。
試験例3と同様の方法にて調製した0.020%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を含むmTeSR培地(STEM C
ELL Technologies社製)を用いて、試験例4と同様の方法にてヒトiP
S細胞 (253G1)のスフェアを合計21回から22回、5日間毎に継代培養し、培養
後のスフェアを4%(w/v)パラホルムアルデヒド(ナカライテスク社製)で固定した。20%スクロース(w/v)を含むPBSで浸漬した後、凍結用包埋剤(O.C.Tコンパウンド, サクラファインテックジャパン株式会社製)で包埋した。クライオスタット(サーモサイエンティフィック社製)で厚さ12μmの切片を作成し、hPSCsの未分
化性を示すNANOG(#4903、セルシグナリング社製)とOCT3/4(#sc-5279、サンタクルツ社製)、SSEA4(#MAB4304、ミリポア社製)の抗体にて染色した。その結果、脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物で浮遊静置培養した細胞は、多能性幹細胞の未分化マーカーを発現していることが明らかになった。以上のように、脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物で100日以上浮遊静置培養したヒトiPS細胞のスフェアは未分化性を維持していることが判明した。その結果を図9に示す。
(試験例9:マイクロキャリア上に付着した細胞株を培養した際の細胞増殖試験)
マイクロキャリアCytodex(登録商標) 1(GE Healthcare Li
fe Sciences社製)をPBSに0.02g/mLとなるように懸濁し1晩静置
後、上清を捨てて新たなPBSで本マイクロキャリアを2回洗浄した。その後、再度PBSで0.02g/mLとなるように懸濁し、121℃、20分間オートクレーブ滅菌した。引き続き、本マイクロキャリアを70%エタノールにて2回、PBSにて3回洗浄した後、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)にて0.02g/mLとなるように懸濁した。本マイクロキャリア懸濁液を用いて、120mgのCyt
odex(登録商標) 1及び4000000個のHepG2細胞を含むDMEM培地(
10%(v/v)胎児ウシ血清含有)20mLを調製し、本細胞懸濁液を予めシリコンコーティング剤(旭テクノグラス社製)で処理したビーカー中にて37℃、6時間、スターラーで撹拌(100rpm)しながら培養した。ここで、HepG2細胞がマイクロキャリアに接着していることを顕微鏡にて確認した。引き続き、細胞が接着したマイクロキャリアを10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地にて2回洗浄し、同培地3mLにて懸濁した。
マイクロキャリアCytodex(登録商標) 1(GE Healthcare Li
fe Sciences社製)をPBSに0.02g/mLとなるように懸濁し1晩静置
後、上清を捨てて新たなPBSで本マイクロキャリアを2回洗浄した。その後、再度PBSで0.02g/mLとなるように懸濁し、121℃、20分間オートクレーブ滅菌した。引き続き、本マイクロキャリアを70%エタノールにて2回、PBSにて3回洗浄した後、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)にて0.02g/mLとなるように懸濁した。本マイクロキャリア懸濁液を用いて、120mgのCyt
odex(登録商標) 1及び4000000個のHepG2細胞を含むDMEM培地(
10%(v/v)胎児ウシ血清含有)20mLを調製し、本細胞懸濁液を予めシリコンコーティング剤(旭テクノグラス社製)で処理したビーカー中にて37℃、6時間、スターラーで撹拌(100rpm)しながら培養した。ここで、HepG2細胞がマイクロキャリアに接着していることを顕微鏡にて確認した。引き続き、細胞が接着したマイクロキャリアを10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地にて2回洗浄し、同培地3mLにて懸濁した。
10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地20mL或いは本培地に0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を添加した培地組成物に、上記のマイクロキャリア懸濁液300μLをそれぞれ添加し、3日間、37℃にて培養した。この際、脱アシル化ジェランガムを含まない培養液は、スターラーで撹拌(100rpm)しながら培養した。培養後は、顕微鏡にてマイクロキャリア上の細胞の付着状態を確認した後、遠心処理(200G、5分間)でマイクロキャリアを沈降させた。PBS10mLで本マイクロキャリアを洗浄した後、1mLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。更に、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地を9mL添加した後、メッシュサイズ70μmのセルストレーナー(BDファルコン社製)を用いてマイクロキャリアを除去した。ここで得られたろ液から遠心処理(200G、5分)により細胞を回収した。本細胞を500μLの培地に懸濁し、その一部に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。その結果、脱アシル化ジェランガムを含まない培養液は123,000個の細胞を含んでいたが、脱アシル化ジェランガムを含む培養液は1,320,000個の細胞を含んでいた。上記のとおり、本発明の特定化合物の構造体を含む培地組成物は、マイクロキャリアを用いて細胞培養を実施しても、既存の培地と比べて細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。本発明の特定化合物の構造体を含む培地組成物を用いてマイクロキャリア培養を3日間実施した際の、HepG2細胞の付着状態を図10に示す。
(試験例10:細胞株由来スフェアを用いた細胞浮遊試験)
キサンタンガム(KELTROL CG、三晶株式会社製)を1%(w/v)の濃度となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。本水溶液を用いて、キサンタンガムについて終濃度が0.1、0.15、0.2%(w/v)であるDMEM/F-12培地組成物を調製した。また、0.2%(w/v)のκ-カラギーナン(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社製)及び0.2%(w/v)のローカストビーンガム(GENUGUM RL-200-J、三晶株式会社製)を含む水溶液を90℃にて加熱することにより調製し、本水溶液を用いて0.03、0.04、0.05%(w/v)のκ-カラギーナンとローカストビーンガムを含むDMEM/F-12培地(シグマ社製)組成物を調製した。
キサンタンガム(KELTROL CG、三晶株式会社製)を1%(w/v)の濃度となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。本水溶液を用いて、キサンタンガムについて終濃度が0.1、0.15、0.2%(w/v)であるDMEM/F-12培地組成物を調製した。また、0.2%(w/v)のκ-カラギーナン(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社製)及び0.2%(w/v)のローカストビーンガム(GENUGUM RL-200-J、三晶株式会社製)を含む水溶液を90℃にて加熱することにより調製し、本水溶液を用いて0.03、0.04、0.05%(w/v)のκ-カラギーナンとローカストビーンガムを含むDMEM/F-12培地(シグマ社製)組成物を調製した。
試験例2と同様の方法を用いてHeLa細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地1mLにそれぞれ数10個のスフェアを添加した後、1時間37℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、HeLa細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、本細胞懸濁液に等量の培地を添加した後、遠心処理(300乃至400G、5分)によりHeLa細胞のスフェアが沈降し、回収できることを確認した。HeLa細胞のスフェアを本発明の培地組成物にて培養した際の浮遊状態を図11にそれぞれ示す。また、分析例1と同様の方法で測定した粘度を表7、8に示す。
(試験例11:フィルターろ過した培地組成物を用いた細胞浮遊試験)
試験例2と同様の方法を用いて0.015%の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を含有するDMEM/F-12培地組成物を調製した。引き続き、本培地組成物1mLを70μm、40μmのフィルター(BDファルコン社製)、30μm、20μmのフィルター(アズワン社製)、10μmのフィルター(Partec社製)、5μm、1.2μm、0.45μm、0.2μmのフィルター(ザルトリウス・ステディム・ジャパン社製)を用いてそれぞれろ過した。試験例2と同様の方法を用いて作成したHepG2細胞のスフェアを、上記のろ液に対して約数十個添加した後、1時間37℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、HepG2細胞のスフェアは、10μm以上のフィルターを透過した培地組成物においては浮遊状態にて維持されるが、5μm以下のフィルターを透過した培地組成物においては沈殿することを確認した。更に、ここで浮遊状態にあるHepG2細胞のスフェアは、室温にて300G、5分間の遠心処理、或いは等量の培地を加えた後室温にて200G、5分間の遠心処理を施すことにより沈降し、回収できることを確認した。
試験例2と同様の方法を用いて0.015%の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を含有するDMEM/F-12培地組成物を調製した。引き続き、本培地組成物1mLを70μm、40μmのフィルター(BDファルコン社製)、30μm、20μmのフィルター(アズワン社製)、10μmのフィルター(Partec社製)、5μm、1.2μm、0.45μm、0.2μmのフィルター(ザルトリウス・ステディム・ジャパン社製)を用いてそれぞれろ過した。試験例2と同様の方法を用いて作成したHepG2細胞のスフェアを、上記のろ液に対して約数十個添加した後、1時間37℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、HepG2細胞のスフェアは、10μm以上のフィルターを透過した培地組成物においては浮遊状態にて維持されるが、5μm以下のフィルターを透過した培地組成物においては沈殿することを確認した。更に、ここで浮遊状態にあるHepG2細胞のスフェアは、室温にて300G、5分間の遠心処理、或いは等量の培地を加えた後室温にて200G、5分間の遠心処理を施すことにより沈降し、回収できることを確認した。
(試験例12:スフェア形成試験)
試験例2と同様の方法を用いて0.01%の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)及び10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するEMEM培地(WAKO社製)の組成物を調製した。引き続き、HeLa細胞を、1000個/mLの濃度になるように添加した後、24ウェルプレート(コーニング社製)に分注した。本プレートを9日間、37℃にて浮遊静置培養した後、スフェアの形成を顕微鏡にて確認した。更に、300G、5分間の遠心処理によりスフェア細胞を沈降させ、PBS5mLにて1回洗浄した後、100μLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液100μLに対して10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地を100μL添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。その結果、170000個/mLまでHeLa細胞が増えていることが確認された。本発明の培地組成物にて形成したHeLa細胞のスフェアを図12に示す。
試験例2と同様の方法を用いて0.01%の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)及び10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するEMEM培地(WAKO社製)の組成物を調製した。引き続き、HeLa細胞を、1000個/mLの濃度になるように添加した後、24ウェルプレート(コーニング社製)に分注した。本プレートを9日間、37℃にて浮遊静置培養した後、スフェアの形成を顕微鏡にて確認した。更に、300G、5分間の遠心処理によりスフェア細胞を沈降させ、PBS5mLにて1回洗浄した後、100μLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液100μLに対して10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地を100μL添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。その結果、170000個/mLまでHeLa細胞が増えていることが確認された。本発明の培地組成物にて形成したHeLa細胞のスフェアを図12に示す。
(試験例13:構造体の光学顕微鏡観察)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.4
%(w/v)となるように純水に懸濁させた後、90℃にて加熱攪拌し溶解させた。300mLトールビーカーに2倍濃度のDMEM/F-12培地(Aldrich社製)95mLを入れ、室温でマグネチックスターラーにて攪拌しながら脱アシル化ジェランガム水溶液5mLを添加し、そのまま5分攪拌を続けることで脱アシル化ジェランガム終濃度0.02%培地組成物を調製した。さらに当培地組成物をホモミキサー(3000rpm)により5分間攪拌した。調製した培地組成物を光学顕微鏡(KEYENCE社、BIOREVO BZ-9000)により観察した。観察された構造体を図13に示す。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.4
%(w/v)となるように純水に懸濁させた後、90℃にて加熱攪拌し溶解させた。300mLトールビーカーに2倍濃度のDMEM/F-12培地(Aldrich社製)95mLを入れ、室温でマグネチックスターラーにて攪拌しながら脱アシル化ジェランガム水溶液5mLを添加し、そのまま5分攪拌を続けることで脱アシル化ジェランガム終濃度0.02%培地組成物を調製した。さらに当培地組成物をホモミキサー(3000rpm)により5分間攪拌した。調製した培地組成物を光学顕微鏡(KEYENCE社、BIOREVO BZ-9000)により観察した。観察された構造体を図13に示す。
(試験例14:粉培地とDAGの混合過熱による調製)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)20mgと、DMEM/F-12培地(Life Technologies社製)1.58gを200mL三角フラスコに入れ、純水100mLを注いだ。121℃で20分オートクレーブ滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が0.02%であるDMEM/F-12培地組成物を調製した。調製した培地に、デキストランビーズCytodex1(Size 200μm、GE Healthcare Life Sciences社製)を添加し、ビ
ーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表9に示す。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)20mgと、DMEM/F-12培地(Life Technologies社製)1.58gを200mL三角フラスコに入れ、純水100mLを注いだ。121℃で20分オートクレーブ滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が0.02%であるDMEM/F-12培地組成物を調製した。調製した培地に、デキストランビーズCytodex1(Size 200μm、GE Healthcare Life Sciences社製)を添加し、ビ
ーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表9に示す。
(試験例15:多糖類を混合した培地組成物の調製)
キサンタンガム(KELTROL CG、三晶株式会社製)を0.5%(w/v)の濃度となるように純水に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。同様にアルギン酸ナトリウム(ダックアルギン酸NSPM、フードケミファ製)、ローカストビーンガム(GENUGUM RL-200-J、三晶株式会社製)、κ-カラギーナン(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社製)、ダイユータンガム(KELCO
CRETE DG-F、三晶株式会社製)について、0.5%(w/v)の水溶液を作製した。
本水溶液と0.2もしくは0.1%(w/v)脱アシル化ジェランガム溶液と10倍濃度のDMEM/F-12培地を混合し、80℃で30分過熱した。室温まで放冷した後、7.5%炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度0.01、0.02%(w/v)の脱アシル化ジェランガムと終濃度0.1、0.2、0.3、0.4%(w/v)他の多糖を含有するDMEM/F-12培地組成物を調製した。また、脱アシル化ジェランガムを含む培地を前記同様に調製した後、メチルセルロース(cP400、WAKO株式会社製)の粉末を添加した。氷浴にて攪拌し、メチルセルロースを溶解させ、終濃度0.01、0.02%(w/v)の脱アシル化ジェランガムと終濃度0.1、0.2、0.3、0.4%(w/v)他のメチルセルロースを含有するDMEM/F-12培地組成物を調製した。
キサンタンガム(KELTROL CG、三晶株式会社製)を0.5%(w/v)の濃度となるように純水に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。同様にアルギン酸ナトリウム(ダックアルギン酸NSPM、フードケミファ製)、ローカストビーンガム(GENUGUM RL-200-J、三晶株式会社製)、κ-カラギーナン(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社製)、ダイユータンガム(KELCO
CRETE DG-F、三晶株式会社製)について、0.5%(w/v)の水溶液を作製した。
本水溶液と0.2もしくは0.1%(w/v)脱アシル化ジェランガム溶液と10倍濃度のDMEM/F-12培地を混合し、80℃で30分過熱した。室温まで放冷した後、7.5%炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度0.01、0.02%(w/v)の脱アシル化ジェランガムと終濃度0.1、0.2、0.3、0.4%(w/v)他の多糖を含有するDMEM/F-12培地組成物を調製した。また、脱アシル化ジェランガムを含む培地を前記同様に調製した後、メチルセルロース(cP400、WAKO株式会社製)の粉末を添加した。氷浴にて攪拌し、メチルセルロースを溶解させ、終濃度0.01、0.02%(w/v)の脱アシル化ジェランガムと終濃度0.1、0.2、0.3、0.4%(w/v)他のメチルセルロースを含有するDMEM/F-12培地組成物を調製した。
上記にて調製した培地に、ポリスチレンビーズ(Size 500-600μm、Polysciences Inc.製)を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表10に示す。
(試験例16:多糖類を混合した培地組成物の粘度測定)
試験例15の多糖混合系と同様の方法で、終濃度が0.005、0.01%(w/v)の脱アシル化ジェランガムと他の多糖を含むDMEM/F-12培地を調製した。多糖は最終濃度がキサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、ローカストビーンガムは0.1%(w/v)、メチルセルロースは0.2%(w/v)、κ-カラギーナンとダイユータンガムは0.05%(w/v)となるように調製した。それぞれの培地組成物の状態と分析例1と同様の方法で測定した粘度を表11~16に示す。
試験例15の多糖混合系と同様の方法で、終濃度が0.005、0.01%(w/v)の脱アシル化ジェランガムと他の多糖を含むDMEM/F-12培地を調製した。多糖は最終濃度がキサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、ローカストビーンガムは0.1%(w/v)、メチルセルロースは0.2%(w/v)、κ-カラギーナンとダイユータンガムは0.05%(w/v)となるように調製した。それぞれの培地組成物の状態と分析例1と同様の方法で測定した粘度を表11~16に示す。
(試験例17:2価金属イオン濃度を変更した培地組成物の調製)
塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムを含まないDMEM/F-12(D9785、Aldrich製)を使用し、試験例14の方法と同様に0.02%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含むDMEM/F-12培地組成物を調製した。また、終濃度がDMEM/F-12培地の規定量になるよう、塩化カルシウムまたは硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムを添加したDMEM/F-12培地組成物を調製した。DMEM/F-12培地の規定組成より、それぞれの終濃度は塩化カルシウム0.116g/L、硫酸マグネシウム0.049g/L、塩化マグネシウム0.061g/Lとした。
調製した培地組成物にデキストランビーズCytodex1(GE Healthca
re Life Sciences社製)を加え、2日後にビーズの分散を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表17に示す。
塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムを含まないDMEM/F-12(D9785、Aldrich製)を使用し、試験例14の方法と同様に0.02%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含むDMEM/F-12培地組成物を調製した。また、終濃度がDMEM/F-12培地の規定量になるよう、塩化カルシウムまたは硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムを添加したDMEM/F-12培地組成物を調製した。DMEM/F-12培地の規定組成より、それぞれの終濃度は塩化カルシウム0.116g/L、硫酸マグネシウム0.049g/L、塩化マグネシウム0.061g/Lとした。
調製した培地組成物にデキストランビーズCytodex1(GE Healthca
re Life Sciences社製)を加え、2日後にビーズの分散を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表17に示す。
(試験例18:2価金属イオンを後添加した培地組成物の調製)
0.1%(w/v)脱アシル化ジェランガム溶液と5倍濃度のDMEM/F-12培地(塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム不含、D9785、Aldrich製)、塩化カルシウム1167mg、硫酸マグネシウム489mg、塩化マグネシウム287mgを純水300mLに溶解させた塩溶液を調製した。200mLのトールビーカーに脱アシル化ジェランガム水溶液と純水を入れ、イカリ型攪拌羽を用いて200rpmで溶液を攪拌した。培地液と水を混合したA液を添加し、そのまま10分攪拌した。次いで塩溶液を添加、さらに7.5%炭酸水素ナトリウム水溶液を1.6mL添加し、終濃度0.02%の脱アシル化ジェランガムを含むDMEM/F-12培地組成物を調製した。それぞれの液の混合量を表に示す。調製4時間後に、6本の培地組成物について、ポリスチレンビーズとCytodex1の分散評価を行なった。結果を表18、19に示す。
0.1%(w/v)脱アシル化ジェランガム溶液と5倍濃度のDMEM/F-12培地(塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム不含、D9785、Aldrich製)、塩化カルシウム1167mg、硫酸マグネシウム489mg、塩化マグネシウム287mgを純水300mLに溶解させた塩溶液を調製した。200mLのトールビーカーに脱アシル化ジェランガム水溶液と純水を入れ、イカリ型攪拌羽を用いて200rpmで溶液を攪拌した。培地液と水を混合したA液を添加し、そのまま10分攪拌した。次いで塩溶液を添加、さらに7.5%炭酸水素ナトリウム水溶液を1.6mL添加し、終濃度0.02%の脱アシル化ジェランガムを含むDMEM/F-12培地組成物を調製した。それぞれの液の混合量を表に示す。調製4時間後に、6本の培地組成物について、ポリスチレンビーズとCytodex1の分散評価を行なった。結果を表18、19に示す。
(試験例19:各種培地組成物の調製)
0.1%(w/v)脱アシル化ジェランガム溶液と高濃度の培地液を調製した。高濃度の培地液は10倍濃度のMEM(M0268、Aldrich製)、RPMI-1640(R6504、Aldrich製)と5倍濃度のDMEM(高圧滅菌対応培地、ニッスイ製)を調製した。0.1%(w/v)脱アシル化ジェランガム溶液と各高濃度培地、濃度調整用の純水を混合し、80℃で30分過熱した。室温まで放冷した後、7.5%炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度0.01、0.02、0.03%(w/v)の脱アシル化ジェランガム含有する培地組成物をそれぞれ調製した。
調製した9本の培地組成物について、ポリスチレンビーズとデキストランビーズCytodex1の浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表20、21に示す。
0.1%(w/v)脱アシル化ジェランガム溶液と高濃度の培地液を調製した。高濃度の培地液は10倍濃度のMEM(M0268、Aldrich製)、RPMI-1640(R6504、Aldrich製)と5倍濃度のDMEM(高圧滅菌対応培地、ニッスイ製)を調製した。0.1%(w/v)脱アシル化ジェランガム溶液と各高濃度培地、濃度調整用の純水を混合し、80℃で30分過熱した。室温まで放冷した後、7.5%炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度0.01、0.02、0.03%(w/v)の脱アシル化ジェランガム含有する培地組成物をそれぞれ調製した。
調製した9本の培地組成物について、ポリスチレンビーズとデキストランビーズCytodex1の浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表20、21に示す。
(試験例20:脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の粒度分布測定)
分析例1に倣い、0.038%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含むDMEM/F-12培地組成物を調製した。培地はホモミキサーを用いて3000rpmと6000rpmにて1分攪拌し調製した。本培地組成物の粒度分布について、ベックマン・コールター(株)製Multisizer4(コールター原理による精密粒度分布測定装置)を用いて測定し、体積基準粒度分布のメジアン径(d50)を求めた。結果を表22に示す。
分析例1に倣い、0.038%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含むDMEM/F-12培地組成物を調製した。培地はホモミキサーを用いて3000rpmと6000rpmにて1分攪拌し調製した。本培地組成物の粒度分布について、ベックマン・コールター(株)製Multisizer4(コールター原理による精密粒度分布測定装置)を用いて測定し、体積基準粒度分布のメジアン径(d50)を求めた。結果を表22に示す。
(試験例21:脱アシル化ジェランガムのリン酸化)
ガラス製の100mL試験管に、脱アシルジェランガム1gと、純水40mLを秤りとり、100℃で30分加熱し、懸濁液を調製した。この懸濁液に、リン酸水溶液(85%)1gを添加し、5時間加熱還流した。その後、12時間撹拌しながら、室温まで放冷す
ることで得た白色懸濁液を、99%エタノール(500mL)に注いだ。生じた綿状の白色固体を、ろ取後、乾燥させることで、脱アシルジェランガムのリン酸化物として、淡褐色固体(0.4g)を得た。リン酸基が導入されたことは、フーリエ変換赤外分光分析(株式会社島津製作所製、IR-Prestage21)によって確認した(1700cm-1;P-OH、1296cm-1、1265cm-1;P=O)。淡褐色固体をマイクロ波加熱分解装置(ETHOS TC, マイルストーンゼネラル製)によって分解した後に、誘導結合プラズマ発光分光分析装置(ICP-OES) (SPS 5520, SIIナノテクノロジー社製)によっ
てリン原子の含有率を測定した結果、3.5wt%(n=2)であった。
ガラス製の100mL試験管に、脱アシルジェランガム1gと、純水40mLを秤りとり、100℃で30分加熱し、懸濁液を調製した。この懸濁液に、リン酸水溶液(85%)1gを添加し、5時間加熱還流した。その後、12時間撹拌しながら、室温まで放冷す
ることで得た白色懸濁液を、99%エタノール(500mL)に注いだ。生じた綿状の白色固体を、ろ取後、乾燥させることで、脱アシルジェランガムのリン酸化物として、淡褐色固体(0.4g)を得た。リン酸基が導入されたことは、フーリエ変換赤外分光分析(株式会社島津製作所製、IR-Prestage21)によって確認した(1700cm-1;P-OH、1296cm-1、1265cm-1;P=O)。淡褐色固体をマイクロ波加熱分解装置(ETHOS TC, マイルストーンゼネラル製)によって分解した後に、誘導結合プラズマ発光分光分析装置(ICP-OES) (SPS 5520, SIIナノテクノロジー社製)によっ
てリン原子の含有率を測定した結果、3.5wt%(n=2)であった。
(試験例22:リン酸化した脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の調製)
任意量のリン酸化した脱アシル化ジェランガム(30mg)と、DMEM/F-12培地(ライフテクノロジーズ社製)1.56gを200mL三角フラスコに入れ、純水100mLを注いだ。121℃で20分オートクレーブ滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が0.03%であるDMEM/F-12培地組成物を調製した。調製した培地に、デキストランビーズCytodex1(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。0.03%(w/v)のリン酸化した脱アシル化シェランガム濃度において、ビーズの分散状態が認められた。
任意量のリン酸化した脱アシル化ジェランガム(30mg)と、DMEM/F-12培地(ライフテクノロジーズ社製)1.56gを200mL三角フラスコに入れ、純水100mLを注いだ。121℃で20分オートクレーブ滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が0.03%であるDMEM/F-12培地組成物を調製した。調製した培地に、デキストランビーズCytodex1(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。0.03%(w/v)のリン酸化した脱アシル化シェランガム濃度において、ビーズの分散状態が認められた。
(試験例23:脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の調製)
脱アシル化ジェランガム水溶液と培地溶液とを下表に示す割合で添加することで混合して、脱アシル化ジェランガム濃度が0.02%であるDMEM/F-12培地組成物を調製したときのポリスチレンビーズ(Size 500-600μm、Polyscien
ces Inc.製)の分散状態を評価した。結果を表23、24に示す。1日以上静置することで、全ての条件で、スチレンビーズが分散した。
脱アシル化ジェランガム水溶液と培地溶液とを下表に示す割合で添加することで混合して、脱アシル化ジェランガム濃度が0.02%であるDMEM/F-12培地組成物を調製したときのポリスチレンビーズ(Size 500-600μm、Polyscien
ces Inc.製)の分散状態を評価した。結果を表23、24に示す。1日以上静置することで、全ての条件で、スチレンビーズが分散した。
(試験例24:フィルターを用いた培地組成物の調製)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を最終濃度が0.02或いは0.04%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて30分間或いは121℃にて20分間加熱することにより溶解した。更に、本水溶液100mLを孔径が0.22μmのポリエーテルスルホン製メンブレンフィルター(コーニング社製)にてろ過した。引き続き、本ろ液を2乃至4倍濃度のDMEM/F-12培地(シグマ・アルドリッチ社製)と混合した後、マイルドミキサー(SI-24、タイテック社製)にて1時間振とうし、最終濃度0.01或いは0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物をそれぞれ調製した(例えば、0.02%(w/v)脱アシル化ジェランガム水溶液と2倍濃度のDMEM/F-12培地を25mLずつ混合し、0.01%(w/v)の脱アシル化ジェランガム培地組成物を50mL調製した)。試験例2と同様の方法を用いてHepG2細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地1mLにそれぞれ数10個のスフェアを添加した後、37℃にて静置して、1時間及び1晩後のスフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、HepG2細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを
確認した。更に、2倍容量の培地を添加した後、本細胞懸濁液を遠心処理(500G、5分)することによりHepG2細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを全ての培地組成物において確認した。1晩後のスフェアの分散状態を目視にて確認した際、浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した結果を表25に示す。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を最終濃度が0.02或いは0.04%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて30分間或いは121℃にて20分間加熱することにより溶解した。更に、本水溶液100mLを孔径が0.22μmのポリエーテルスルホン製メンブレンフィルター(コーニング社製)にてろ過した。引き続き、本ろ液を2乃至4倍濃度のDMEM/F-12培地(シグマ・アルドリッチ社製)と混合した後、マイルドミキサー(SI-24、タイテック社製)にて1時間振とうし、最終濃度0.01或いは0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物をそれぞれ調製した(例えば、0.02%(w/v)脱アシル化ジェランガム水溶液と2倍濃度のDMEM/F-12培地を25mLずつ混合し、0.01%(w/v)の脱アシル化ジェランガム培地組成物を50mL調製した)。試験例2と同様の方法を用いてHepG2細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地1mLにそれぞれ数10個のスフェアを添加した後、37℃にて静置して、1時間及び1晩後のスフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、HepG2細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを
確認した。更に、2倍容量の培地を添加した後、本細胞懸濁液を遠心処理(500G、5分)することによりHepG2細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを全ての培地組成物において確認した。1晩後のスフェアの分散状態を目視にて確認した際、浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した結果を表25に示す。
(試験例25:細胞株由来スフェアを培養した際の細胞増殖試験)
ヒト胎児腎細胞株HEK293(DSファーマバイオメディカル社製)を、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(WAKO社製)に250000個/mLとなるように懸濁し、本懸濁液10mLをEZ SPHERE(旭硝子社製)に播種した後、CO2インキュベーター(5%CO2)内で2日間培養した。ここで得られたHEK293細胞のスフェア(直径100~200μm)の懸濁液10mLを遠心処理(200G、5分間)してスフェアを沈降させ上清を除いた後、1mLに懸濁した。引き続き、本スフェア懸濁液200μL(細胞数は約200000個)に上記培地10mLを添加して懸濁した後、平底チューブ(BM機器社製)に移した。同様に、上記培地に0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を添加した培地組成物を用いてスフェアの懸濁液を作成し、平底チューブ(BM機器社製)に移した。なお、0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した後、1/20希釈で10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地に添加することにより調製した。
ヒト胎児腎細胞株HEK293(DSファーマバイオメディカル社製)を、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(WAKO社製)に250000個/mLとなるように懸濁し、本懸濁液10mLをEZ SPHERE(旭硝子社製)に播種した後、CO2インキュベーター(5%CO2)内で2日間培養した。ここで得られたHEK293細胞のスフェア(直径100~200μm)の懸濁液10mLを遠心処理(200G、5分間)してスフェアを沈降させ上清を除いた後、1mLに懸濁した。引き続き、本スフェア懸濁液200μL(細胞数は約200000個)に上記培地10mLを添加して懸濁した後、平底チューブ(BM機器社製)に移した。同様に、上記培地に0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を添加した培地組成物を用いてスフェアの懸濁液を作成し、平底チューブ(BM機器社製)に移した。なお、0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した後、1/20希釈で10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地に添加することにより調製した。
37℃で5日間、CO2インキュベーター(5%CO2)内で上記スフェア懸濁液を静置培養した後、2倍容量の培地を添加して遠心処理(500G、5分間)を行うことによりスフェアを沈降させ、上清を除いた。引き続き、回収したスフェアをPBS10mLにて1回洗浄した後、1mLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。上記培地を9mL添加した後、遠心処理(500G、5分間)により細胞を回収した。ここで得られた細胞懸濁液2mLの一部に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞及び死細胞の数を測定した。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。
その結果、HEK293細胞のスフェアは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊
状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物と比べて細胞を増殖させた際に死細胞の割合が少なく、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。この際、既存の培地で培養したスフェアは培養容器の底面に沈降していた。
HEK293細胞に関して、脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を1としたときの相対的細胞数を表26に示す。また、脱アシル化ジェランガムを含まない培地で培養した際の死細胞率(死細胞数/生細胞数)を1としたときの相対的死細胞率を表27に示す。
状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物と比べて細胞を増殖させた際に死細胞の割合が少なく、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。この際、既存の培地で培養したスフェアは培養容器の底面に沈降していた。
HEK293細胞に関して、脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を1としたときの相対的細胞数を表26に示す。また、脱アシル化ジェランガムを含まない培地で培養した際の死細胞率(死細胞数/生細胞数)を1としたときの相対的死細胞率を表27に示す。
(試験例26:昆虫細胞を培養した際の細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてSf-900(登録商標)IIISFM培地(ギブコ社製)に終濃度0.015
%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、Spodoptera frugiperda由来のSf9細胞(ギブコ社製)を、100000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、24ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製)のウェルに1ウェル当たり1mLとなるように分注した。これらの細胞懸濁液をインキュベーター内にて25℃で5日間静置培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてSf-900(登録商標)IIISFM培地(ギブコ社製)に終濃度0.015
%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、Spodoptera frugiperda由来のSf9細胞(ギブコ社製)を、100000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、24ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製)のウェルに1ウェル当たり1mLとなるように分注した。これらの細胞懸濁液をインキュベーター内にて25℃で5日間静置培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。
その結果、Sf9細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。更に、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物と比べて細胞を増殖させた際に細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。浮遊静置培養5日間後のSf9細胞の細胞数を表28に示す。
(試験例27:CD34陽性細胞を培養した際の細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてStemSpan SFEM培地(StemCell Technologies社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム、20ng/mLのトロンボポエチン(WAKO社製)及び100ng/mLの幹細胞因子(SCF、WAKO社製)を添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト臍帯血由来のCD34陽性細胞(ロンザ社製)を、10000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、24ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製)のウェルに1ウェル当たり1mLとなるように分注した。これらの細胞懸濁液を37℃で7日間、CO2インキュベーター(5%CO2)内で静置培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。また、残りの培養液に3倍容量の培地を添加して遠心処理(500G、5分間)を行うことにより全ての細胞を沈降させた。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてStemSpan SFEM培地(StemCell Technologies社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム、20ng/mLのトロンボポエチン(WAKO社製)及び100ng/mLの幹細胞因子(SCF、WAKO社製)を添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト臍帯血由来のCD34陽性細胞(ロンザ社製)を、10000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、24ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製)のウェルに1ウェル当たり1mLとなるように分注した。これらの細胞懸濁液を37℃で7日間、CO2インキュベーター(5%CO2)内で静置培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。また、残りの培養液に3倍容量の培地を添加して遠心処理(500G、5分間)を行うことにより全ての細胞を沈降させた。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。
その結果、CD34陽性細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。更に、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて同等以上の細胞増殖促進効果を有することが確認された。また、遠心処理により細胞が沈降し、細胞が回収できることを確認した。脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を1としたときの、浮遊静置培養7日間後におけるCD34陽性細胞から増殖した細胞の相対的細胞数を表29に示す。
(試験例28:スフェア形成試験)
試験例2と同様の方法を用いて0.015%の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)及び10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)の組成物を調製した。引き続き、HepG2細胞を、15000個/mLの細胞濃度になるように添加した後、24ウェルプレート(コーニング社製)に1mL分注した。本プレートを7日間、37℃にて浮遊静置培養した後、スフェアの形成を顕微鏡にて確認した。更に、400G、5分間の遠心処理によりスフェア細胞を沈降させ、PBS5mLにて1回洗浄した後、100μLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液100μLに対して10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地を100μL添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。その結果、HepG2細胞は、本発明の培地組成物にてスフェアを形成し、また細胞数も80800個/mLまでが増えていることが確認された。本発明の培地組成物にて形成したHepG2細胞のスフェアを図14に示す。
試験例2と同様の方法を用いて0.015%の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)及び10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)の組成物を調製した。引き続き、HepG2細胞を、15000個/mLの細胞濃度になるように添加した後、24ウェルプレート(コーニング社製)に1mL分注した。本プレートを7日間、37℃にて浮遊静置培養した後、スフェアの形成を顕微鏡にて確認した。更に、400G、5分間の遠心処理によりスフェア細胞を沈降させ、PBS5mLにて1回洗浄した後、100μLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液100μLに対して10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地を100μL添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。その結果、HepG2細胞は、本発明の培地組成物にてスフェアを形成し、また細胞数も80800個/mLまでが増えていることが確認された。本発明の培地組成物にて形成したHepG2細胞のスフェアを図14に示す。
(試験例29:細胞株由来スフェアを用いた細胞浮遊試験)
ダイユータンガム(KELKO-CRETE DG、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)の濃度となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱し
ながらの撹拌により溶解した。本水溶液を用いて、ダイユータンガムについて終濃度が0.1%(w/v)であるDMEM/F-12培地組成物を調製した。また、0.5%(w/v)のネイティブ型ジェランガム(ケルコゲル HT、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製)を含む水溶液を90℃にて加熱することにより調製し、本水溶液を用いて0.05、0.1%(w/v)のネイティブ型ジェランガムを含むDMEM/F-12培地(シグマ社製)組成物を調製した。
ダイユータンガム(KELKO-CRETE DG、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)の濃度となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱し
ながらの撹拌により溶解した。本水溶液を用いて、ダイユータンガムについて終濃度が0.1%(w/v)であるDMEM/F-12培地組成物を調製した。また、0.5%(w/v)のネイティブ型ジェランガム(ケルコゲル HT、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製)を含む水溶液を90℃にて加熱することにより調製し、本水溶液を用いて0.05、0.1%(w/v)のネイティブ型ジェランガムを含むDMEM/F-12培地(シグマ社製)組成物を調製した。
試験例2と同様の方法を用いてHeLa細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地1mLにそれぞれ数10個のスフェアを添加した後、1時間37℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、HeLa細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、0.1%(w/v)のダイユータンガムを含む本細胞懸濁液を遠心処理(200G、5分)することによりHeLa細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを確認した。
(試験例30:細胞接着能を有する磁気ビーズを用いた細胞浮遊試験1)
ラミニン或いはフィブロネクチンにてコーティングしたGEM(登録商標、Global Eukaryotic Microcarrier、ジーエルサイエンス株式会社製
)懸濁溶液を500μLずつ1.5mL容量のマイクロテストチューブ(エッペンドルフ社製)に分注し、磁石スタンド(TA4899N12、多摩川精機株式会社製)を使用して上記GEM懸濁溶液からGEMを集積させて溶媒を除去した。更に、10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)500μLによりGEMを2回洗浄した後、同上培地500μLに懸濁した。本懸濁液を細胞低接着プレートであるスミロンセルタイトプレート24F(住友ベークライト株式会社製)に1ウェルあたり50μL分注した。引き続き、別途調製したHepG2細胞を250000細胞/mLとなる様に添加し、同上培地にて最終容量を500μL/ウェルとした。本細胞懸濁液を手動にて撹拌した後、本プレートを一晩、CO2インキュベーター(5%CO2)内で静置した。GEM上での細胞の接着を顕微鏡にて確認した後、細胞懸濁液を1.5mL容量のマイクロテストチューブ(エッペンドルフ社製)に移し、上記磁石スタンドを用いて細胞付着GEMを集積させて上清を除去した。
ラミニン或いはフィブロネクチンにてコーティングしたGEM(登録商標、Global Eukaryotic Microcarrier、ジーエルサイエンス株式会社製
)懸濁溶液を500μLずつ1.5mL容量のマイクロテストチューブ(エッペンドルフ社製)に分注し、磁石スタンド(TA4899N12、多摩川精機株式会社製)を使用して上記GEM懸濁溶液からGEMを集積させて溶媒を除去した。更に、10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)500μLによりGEMを2回洗浄した後、同上培地500μLに懸濁した。本懸濁液を細胞低接着プレートであるスミロンセルタイトプレート24F(住友ベークライト株式会社製)に1ウェルあたり50μL分注した。引き続き、別途調製したHepG2細胞を250000細胞/mLとなる様に添加し、同上培地にて最終容量を500μL/ウェルとした。本細胞懸濁液を手動にて撹拌した後、本プレートを一晩、CO2インキュベーター(5%CO2)内で静置した。GEM上での細胞の接着を顕微鏡にて確認した後、細胞懸濁液を1.5mL容量のマイクロテストチューブ(エッペンドルフ社製)に移し、上記磁石スタンドを用いて細胞付着GEMを集積させて上清を除去した。
試験例2と同様の方法を用いて0.015%の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)及び10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)の組成物を調製した。本培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ1mLを上記にて調製したHepG2細胞付着GEM(ラミニン或いはフィブロネクチンコーティング)に添加し、懸濁させた後、スミロンセルタイトプレート24Fに移した。引き続き、本プレートを6日間、CO2インキュベーター(5%CO2)内で静置した後、細胞培養液を1.5mL容量のマイクロテストチューブ(エッペンドルフ社製)に移し、上記磁石スタンド上にて緩やかにピペッティングしながら細胞付着GEMを集積させて上清を除去した。本GEMをPBS1mLにて1回洗浄し、200μLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で10分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液200μLに対して10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地を800μL添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。
その結果、HepG2細胞を接着させたGEMは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。また、磁力を用いることにより本発明の培地組成物からHepG2細胞付着GEMを集積させることが可
能であり、更に本GEMからHepG2細胞が回収できることを確認した。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてHepG2細胞をGEM上で6日間培養した際の細胞数を表30に示す。また、HepG2細胞を付着させたラミニンコートGEMを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図14に示す。
能であり、更に本GEMからHepG2細胞が回収できることを確認した。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてHepG2細胞をGEM上で6日間培養した際の細胞数を表30に示す。また、HepG2細胞を付着させたラミニンコートGEMを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図14に示す。
(試験例31:細胞接着能を有する磁気ビーズを用いた細胞浮遊試験2)
試験例30と同様に、フィブロネクチンにてコーティングしたGEM(登録商標、Global Eukaryotic Microcarrier、ジーエルサイエンス株式
会社製)をMF-Medium(登録商標)間葉系幹細胞増殖培地(東洋紡株式会社製)に懸濁した。本懸濁液を細胞低接着プレートであるスミロンセルタイトプレート24F(住友ベークライト株式会社製)に1ウェルあたり50μL分注した。引き続き、別途調製したヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(Cell Applications社製)を250000細胞/mLとなる様に添加し、試験例30と同様に、本プレートを一晩、CO2インキュベーター(5%CO2)内で静置させて間葉系幹細胞が接着したGEMを調製した。
試験例30と同様に、フィブロネクチンにてコーティングしたGEM(登録商標、Global Eukaryotic Microcarrier、ジーエルサイエンス株式
会社製)をMF-Medium(登録商標)間葉系幹細胞増殖培地(東洋紡株式会社製)に懸濁した。本懸濁液を細胞低接着プレートであるスミロンセルタイトプレート24F(住友ベークライト株式会社製)に1ウェルあたり50μL分注した。引き続き、別途調製したヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(Cell Applications社製)を250000細胞/mLとなる様に添加し、試験例30と同様に、本プレートを一晩、CO2インキュベーター(5%CO2)内で静置させて間葉系幹細胞が接着したGEMを調製した。
試験例2と同様の方法を用いて0.015%の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を含有するMF-Medium(登録商標)間葉系幹細胞増殖培地(東洋紡株式会社製)の組成物を調製した。本培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ1mLを上記にて調製した間葉系幹細胞付着GEM(フィブロネクチンコーティング)に添加し、懸濁させた後、スミロンセルタイトプレート24Fに移した。引き続き、本プレートを4日間、CO2インキュベーター(5%CO2)内で静置した後、細胞培養液を1.5mL容量のマイクロテストチューブ(エッペンドルフ社製)に移し、上記磁石スタンド上にて緩やかにピペッティングしながら細胞付着GEMを集積させて上清を除去した。本GEMをPBS1mLにて1回洗浄し、200μLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で10分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液200μLに対して10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地を800μL添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。
その結果、間葉系幹細胞を接着させたGEMは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。また、磁力を用いることにより本発明の培地組成物から間葉系幹細胞付着GEMを集積させることが可能であり、更に本GEMから間葉系幹細胞が回収できることを確認した。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にて間葉系幹細胞をGEM上で4日間培養した際の細胞数を表31に示す。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にて間葉系幹細胞をGEM上で4日間培養した際の細胞数を表31に示す。
(試験例32:アルギン酸ビーズを用いた細胞浮遊試験)
以下の試験は、株式会社PGリサーチ製アルギン酸三次元培養キットの方法に準じて実施した。別途調製したHepG2細胞を400000細胞/mLとなる様にアルギン酸ナトリウム溶液(株式会社PGリサーチ製)2.5mLに添加し、更にヒト組み換えラミニン511(株式会社ベリタス製)を5μg/mLとなる様に添加し、細胞懸濁液を調製した。本細胞懸濁液についてゾンデを装着した5mLシリンジ(テルモ株式会社製)で回収した後、本シリンジに22G注射針(テルモ株式会社製)を装着した。引き続き、塩化カルシウム水溶液(株式会社PGリサーチ製)が2mLずつ添加してある24ウェル平底マイクロプレート(株式会社PGリサーチ製)のウェルに対して、本細胞懸濁液を10滴ずつ添加した。10分間、室温にて静置してからアルギン酸ビーズの形成を確認した後、塩化カルシウム溶液を除去し、PBS2mLを添加して室温で15分静置した。更に、PBSを除去した後、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)2mLを添加し室温で15分静置した。培地を除去した後、試験例2と同様の方法を用いて調製した0.03%の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)及び10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)の培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ1mLを各ウェルに添加し、8日間、CO2インキュベーター(5%CO2)内で静置培養した。なお、培地交換は、培養4日目に実施した。
以下の試験は、株式会社PGリサーチ製アルギン酸三次元培養キットの方法に準じて実施した。別途調製したHepG2細胞を400000細胞/mLとなる様にアルギン酸ナトリウム溶液(株式会社PGリサーチ製)2.5mLに添加し、更にヒト組み換えラミニン511(株式会社ベリタス製)を5μg/mLとなる様に添加し、細胞懸濁液を調製した。本細胞懸濁液についてゾンデを装着した5mLシリンジ(テルモ株式会社製)で回収した後、本シリンジに22G注射針(テルモ株式会社製)を装着した。引き続き、塩化カルシウム水溶液(株式会社PGリサーチ製)が2mLずつ添加してある24ウェル平底マイクロプレート(株式会社PGリサーチ製)のウェルに対して、本細胞懸濁液を10滴ずつ添加した。10分間、室温にて静置してからアルギン酸ビーズの形成を確認した後、塩化カルシウム溶液を除去し、PBS2mLを添加して室温で15分静置した。更に、PBSを除去した後、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)2mLを添加し室温で15分静置した。培地を除去した後、試験例2と同様の方法を用いて調製した0.03%の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)及び10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)の培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ1mLを各ウェルに添加し、8日間、CO2インキュベーター(5%CO2)内で静置培養した。なお、培地交換は、培養4日目に実施した。
培養したアルギン酸ビーズを1mL容量のチップを用いて1.5mL容量のマイクロテストチューブ(エッペンドルフ社製)に移した後、クエン酸ナトリウム溶液(株式会社PGリサーチ製)1mLを各チューブに添加し、室温15分間攪拌してアルギン酸ビーズを溶解させた。引き続き、300G、3分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。本細胞に対して200μLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液200μLに対して10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地を800μL添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。
その結果、HepG2細胞を包埋したアルギン酸ビーズは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてHepG2細胞をアルギン酸ビーズ内で8日間培養した際の細胞数を表32に示す。また、HepG2細胞を包埋したアルギン酸ビーズを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図16に示す。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてHepG2細胞をアルギン酸ビーズ内で8日間培養した際の細胞数を表32に示す。また、HepG2細胞を包埋したアルギン酸ビーズを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図16に示す。
(試験例33:コラーゲンゲルカプセルを用いた細胞浮遊試験)
A:組織培養用コラーゲンCellmatrix(登録商標)TypeI‐A (セルマトリックス、新田ゼラチン株式会社製)、B:10倍濃度のDMEM/F-12培地(A
ldrich社製)、C:再構成用緩衝液(0.05N水酸化ナトリウム溶液100mLに炭酸水素ナトリウム2.2g、HEPES(4‐(2‐hydroxyethyl)‐1‐piperazineethanesulfonic acid))4.77gを加え
てろ過滅菌したもの)のそれぞれを氷中にて冷却しながらA:B:C=8:1:1となるように混合した。更に、ヒト組み換えラミニン511(株式会社ベリタス製)を5μg/mLとなる様に添加し、コラーゲン混合溶液500μLを調製した。本混合溶液に対して別途調製したHepG2細胞を200000細胞/mLとなる様に添加し、25G注射針(テルモ株式会社製)を装着した1.5mLシリンジ(テルモ株式会社製)を用いて全量を回収した。引き続き、37℃にて予め保温した10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)10mLを添加した平底チューブ(BM機器社製)に対して、上記シリンジを用いて1滴ずつ細胞懸濁液を滴下した。37℃水浴中にて10分間保温して、直径2mm程度の不定形なコラーゲンゲルカプセルの形成を確認した後、試験例2と同様の方法にて最終濃度0.04%となるように脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を添加し、軽く撹拌して上記カプセルを浮遊させた。引き続き、5日間、CO2インキュベーター(5%CO2)内で本チューブを静置培養した。
A:組織培養用コラーゲンCellmatrix(登録商標)TypeI‐A (セルマトリックス、新田ゼラチン株式会社製)、B:10倍濃度のDMEM/F-12培地(A
ldrich社製)、C:再構成用緩衝液(0.05N水酸化ナトリウム溶液100mLに炭酸水素ナトリウム2.2g、HEPES(4‐(2‐hydroxyethyl)‐1‐piperazineethanesulfonic acid))4.77gを加え
てろ過滅菌したもの)のそれぞれを氷中にて冷却しながらA:B:C=8:1:1となるように混合した。更に、ヒト組み換えラミニン511(株式会社ベリタス製)を5μg/mLとなる様に添加し、コラーゲン混合溶液500μLを調製した。本混合溶液に対して別途調製したHepG2細胞を200000細胞/mLとなる様に添加し、25G注射針(テルモ株式会社製)を装着した1.5mLシリンジ(テルモ株式会社製)を用いて全量を回収した。引き続き、37℃にて予め保温した10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)10mLを添加した平底チューブ(BM機器社製)に対して、上記シリンジを用いて1滴ずつ細胞懸濁液を滴下した。37℃水浴中にて10分間保温して、直径2mm程度の不定形なコラーゲンゲルカプセルの形成を確認した後、試験例2と同様の方法にて最終濃度0.04%となるように脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を添加し、軽く撹拌して上記カプセルを浮遊させた。引き続き、5日間、CO2インキュベーター(5%CO2)内で本チューブを静置培養した。
コラーゲンゲルカプセルを含む培養液に対してPBS25mLを添加し、400G、5分間の遠心処理によりコラーゲンゲルカプセルを沈降させ、上清を除去した。再度、PBS25mLを加えて遠心処理を行い、残量が5mLとなるように上清を除去した。本液に対して1%(W/V)のコラゲナーゼL(新田ゼラチン株式会社製)20μLを添加した後、37℃にて2時間振とうした。コラーゲンゲルの溶解を確認した後、PBS10mLを加え、400G、5分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。本細胞に対して1mLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液に対して10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地を4mL添加し、400G、5分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。得られた細胞を2mLの同上培地にて懸濁し、その一部に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。
その結果、HepG2細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてHepG2細胞をコラーゲンゲルカプセル内で5日間培養した際の細胞数を表33に示す。また、HepG2細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図17に示す。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてHepG2細胞をコラーゲンゲルカプセル内で5日間培養した際の細胞数を表33に示す。また、HepG2細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図17に示す。
(試験例34:フィルターを用いたスフェアの回収試験)
試験例2と同様の方法を用いて0.015%の脱アシル化ジェランガム(KELCOG
EL CG-LA、三晶株式会社製)及び10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)の組成物を調製した。また、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地を調製した。試験例2と同様の方法を用いてHepG2細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地1mLにそれぞれ86000個の細胞数となるようにスフェアを添加した後、1時間37℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。更に、メッシュサイズが40μmのセルストレーナー(ベクトン・ディッキントン社製)上に本細胞懸濁液を添加し、スフェアをフィルター上に捕捉した。引き続き、フィルターの裏面からPBS10mLを流し込むことによりスフェアを15mLチューブに回収し、300G、5分間の遠心処理によりスフェアを沈降させた。上清を除去した後、スフェアに対して500μLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液に対して10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地を1mL添加し、その一部に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。その結果、HepG2細胞のスフェアは、上記の培地組成物において浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、0.015%の脱アシル化ジェランガムを含む本スフェア懸濁液をフィルター処理することにより、HepG2細胞のスフェアを、脱アシル化ジェランガムを含まない培地と同等の回収率にて細胞が回収できることを確認した。脱アシル化ジェランガムを含まない培地を用いてフィルターにて回収されたHepG2細胞数を1としたときの、脱アシル化ジェランガムを含む培地から回収された相対的細胞数を表34に示す。
試験例2と同様の方法を用いて0.015%の脱アシル化ジェランガム(KELCOG
EL CG-LA、三晶株式会社製)及び10%(v/v)胎児ウシ血清を含有するDMEM培地(WAKO社製)の組成物を調製した。また、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地を調製した。試験例2と同様の方法を用いてHepG2細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地1mLにそれぞれ86000個の細胞数となるようにスフェアを添加した後、1時間37℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。更に、メッシュサイズが40μmのセルストレーナー(ベクトン・ディッキントン社製)上に本細胞懸濁液を添加し、スフェアをフィルター上に捕捉した。引き続き、フィルターの裏面からPBS10mLを流し込むことによりスフェアを15mLチューブに回収し、300G、5分間の遠心処理によりスフェアを沈降させた。上清を除去した後、スフェアに対して500μLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(WAKO社製)を添加し、37℃で5分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液に対して10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地を1mL添加し、その一部に対してトリパンブルー染色液(インヴィトロジェン社製)を同量添加した後、血球計算板(エルマ販売株式会社製)にて生細胞の数を測定した。その結果、HepG2細胞のスフェアは、上記の培地組成物において浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、0.015%の脱アシル化ジェランガムを含む本スフェア懸濁液をフィルター処理することにより、HepG2細胞のスフェアを、脱アシル化ジェランガムを含まない培地と同等の回収率にて細胞が回収できることを確認した。脱アシル化ジェランガムを含まない培地を用いてフィルターにて回収されたHepG2細胞数を1としたときの、脱アシル化ジェランガムを含む培地から回収された相対的細胞数を表34に示す。
(試験例35:各種多糖類の混合剤を用いたスフェアの細胞浮遊試験)
試験例15と同様の方法を用いて、キサンタンガム(KELTROL CG、三晶株式会社製)、アルギン酸ナトリウム(ダックアルギン酸NSPM、フードケミファ製)、ローカストビーンガム(GENUGUM RL-200-J、三晶株式会社製)、メチルセルロース(cP400、WAKO株式会社製)、κ-カラギーナン(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社製)、ペクチン(GENU pectin LM-102AS、三晶株式会社製)或いはダイユータンガム(KELCO CRETE DG-F、三晶株式会社製)と脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を組み合わせて混合したDMEM/F-12培地組成物を調製した。試験例2と同様の方法を用いてHepG2細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地1mLにそれぞれ数10個のスフェアを添加した後、37℃にて静置して、1時間及び1晩後のスフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、HepG2細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、2倍容量の培地を添加した後、本細胞懸濁液を遠心処理(500G、5分)することによりHepG2細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを全ての培地組成物において確認した。1晩後のスフェアの分散状態を目視にて確認した際、浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した結果を表35及び表36に示す。なお、表中の-は未実施を示す。
試験例15と同様の方法を用いて、キサンタンガム(KELTROL CG、三晶株式会社製)、アルギン酸ナトリウム(ダックアルギン酸NSPM、フードケミファ製)、ローカストビーンガム(GENUGUM RL-200-J、三晶株式会社製)、メチルセルロース(cP400、WAKO株式会社製)、κ-カラギーナン(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社製)、ペクチン(GENU pectin LM-102AS、三晶株式会社製)或いはダイユータンガム(KELCO CRETE DG-F、三晶株式会社製)と脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を組み合わせて混合したDMEM/F-12培地組成物を調製した。試験例2と同様の方法を用いてHepG2細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地1mLにそれぞれ数10個のスフェアを添加した後、37℃にて静置して、1時間及び1晩後のスフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、HepG2細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、2倍容量の培地を添加した後、本細胞懸濁液を遠心処理(500G、5分)することによりHepG2細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを全ての培地組成物において確認した。1晩後のスフェアの分散状態を目視にて確認した際、浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状態を△、沈降状態を×として評価した結果を表35及び表36に示す。なお、表中の-は未実施を示す。
ビーズと細胞の分散性比較1
上記(比較例)にて調製した脱アシルジェランガム含有培地とメチルセルロース含有培地について、デキストランビーズCytodex(登録商標) 1(GE Healthcare Life Sciences社製)とHeLa細胞スフェアの分散状態を比較した。結果を表に示す。Cytodex1とHeLa細胞スフェアの分散状態はよく相関していることから、Cytodex1を細胞スフェアモデルとして使用することができる。
上記(比較例)にて調製した脱アシルジェランガム含有培地とメチルセルロース含有培地について、デキストランビーズCytodex(登録商標) 1(GE Healthcare Life Sciences社製)とHeLa細胞スフェアの分散状態を比較した。結果を表に示す。Cytodex1とHeLa細胞スフェアの分散状態はよく相関していることから、Cytodex1を細胞スフェアモデルとして使用することができる。
ビーズと細胞の分散性比較2
試験例15にて調製した多糖および脱アシルジェランガム含有培地について、ポリスチレンビーズ(Size 500-600μm、Polysciences Inc.製)とHepG2細胞スフェアの分散状態を比較した。浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状
態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表に示す。ポリスチレンビーズとHepG2細胞スフェアの分散状態はよく相関していることから、ポリスチレンビーズを細胞スフェアモデルとして使用することができる。
試験例15にて調製した多糖および脱アシルジェランガム含有培地について、ポリスチレンビーズ(Size 500-600μm、Polysciences Inc.製)とHepG2細胞スフェアの分散状態を比較した。浮遊分散状態を○、一部沈降/分散状
態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表に示す。ポリスチレンビーズとHepG2細胞スフェアの分散状態はよく相関していることから、ポリスチレンビーズを細胞スフェアモデルとして使用することができる。
(試験例36:イネ由来植物カルスの浮遊培養試験)
塩水選にて精選されたイネ日本晴の完熟種子(湖東農業協同組合より購入)50粒を50mLポリスチレンチューブ(BDファルコン社製)に移し、滅菌水50mLにて洗浄し
た後、70%エタノール水30mL中にて1分間撹拌した。エタノール水を除去した後、キッチンハイター(花王株式会社製)30mLを添加し、1時間撹拌した。キッチンハイターを除去した後、滅菌水50mLにて4回洗浄した。ここで滅菌した種子を、2μg/mLの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(シグマ・アルドリッチ社製)及び寒天を含むムラシゲ・スクーグ基礎培地(M9274、シグマ・アルドリッチ社製)1.5mL/ウェル(24ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製))上に置床した。30℃、16時間暗所/8時間暗所の条件にて3週間培養し、種子の胚盤上で増殖したクリーム色のカルス(1~2mm)を採取した。
塩水選にて精選されたイネ日本晴の完熟種子(湖東農業協同組合より購入)50粒を50mLポリスチレンチューブ(BDファルコン社製)に移し、滅菌水50mLにて洗浄し
た後、70%エタノール水30mL中にて1分間撹拌した。エタノール水を除去した後、キッチンハイター(花王株式会社製)30mLを添加し、1時間撹拌した。キッチンハイターを除去した後、滅菌水50mLにて4回洗浄した。ここで滅菌した種子を、2μg/mLの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(シグマ・アルドリッチ社製)及び寒天を含むムラシゲ・スクーグ基礎培地(M9274、シグマ・アルドリッチ社製)1.5mL/ウェル(24ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製))上に置床した。30℃、16時間暗所/8時間暗所の条件にて3週間培養し、種子の胚盤上で増殖したクリーム色のカルス(1~2mm)を採取した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて、2μg/mLの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(シグマ・アルドリッチ社製)を含むムラシゲ・スクーグ基礎培地(M9274、シグマ・アルドリッチ社製)に終濃度0.03%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。上記にて調製したカルス15個を本培地組成物10mL/平底チューブ(BM機器社製)に添加し、7日間、25℃にて振とう培養を行った。その結果、イネ由来カルスは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物にてカルスが維持されることが確認された。イネ由来カルスを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図18に示す。
(試験例37:HeLa細胞を分散させた際の細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にHeLa細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて8日間静置状態で培養した。3、8日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECT
RA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。細胞密度は、8日間培養後の細胞を含んだ培養液をピペットで攪拌を行い、得られた攪拌液20μLとTrypan Blue stain 0.4%(Invitrogen社製)20μLを混合した後、顕微鏡下で計測した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にHeLa細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて8日間静置状態で培養した。3、8日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECT
RA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。細胞密度は、8日間培養後の細胞を含んだ培養液をピペットで攪拌を行い、得られた攪拌液20μLとTrypan Blue stain 0.4%(Invitrogen社製)20μLを混合した後、顕微鏡下で計測した。
その結果、HeLa細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。8日間培養後のHeLa細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図19に示す。また、静置培養3、8日間後の450nmの吸光度(HeLa細胞の細胞数に相当する)を表40に示す。8日間培養後のHeLa細胞の細胞密度を表41に示す。
(試験例38:A549細胞及びHCT116細胞を分散させた際の細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)或いはMcCoy’s 5a培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)或いはヒト大腸癌細胞株HCT116(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にA549細胞およびHCT116細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて7日間静置状態で培養した。3、5、7日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)或いはMcCoy’s 5a培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)或いはヒト大腸癌細胞株HCT116(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にA549細胞およびHCT116細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて7日間静置状態で培養した。3、5、7日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、A549細胞およびHCT116細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。5日間培養後の
A549細胞およびHCT116細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図20に示す。また、静置培養3、5、7日間後の450nmの吸光度(A549細胞の細胞数に相当する)を表42に、450nmの吸光度(HCT116細胞の細胞数に相当する)を表43に示す。
A549細胞およびHCT116細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図20に示す。また、静置培養3、5、7日間後の450nmの吸光度(A549細胞の細胞数に相当する)を表42に、450nmの吸光度(HCT116細胞の細胞数に相当する)を表43に示す。
(試験例39:U底の低接着表面プレートを用いた際の細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェルU底低接着表面マイクロプレート(住友ベークライト製、#MS-9096U)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にHeLa細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて7日間静置状態で培養した。2、5、7日間培養後の培養液に対して、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェルU底低接着表面マイクロプレート(住友ベークライト製、#MS-9096U)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にHeLa細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて7日間静置状態で培養した。2、5、7日間培養後の培養液に対して、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、他の低接着プレートでも当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。静置培養2、5、7日間後の450nmの吸光度(HeLa細胞の細胞数に相当する)を表44に示す。
(試験例40:他社の低接着表面プレートを用いた際の細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱し
ながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.005%及び0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底低接着表面マイクロプレート(IWAKI製、#Ez-BindShut)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にHeLa細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて7日間静置状態で培養した。3日間培養後の培養液に対して、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱し
ながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.005%及び0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底低接着表面マイクロプレート(IWAKI製、#Ez-BindShut)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にHeLa細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて7日間静置状態で培養した。3日間培養後の培養液に対して、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、他の低接着プレートでも当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。静置培養3日間後の450nmの吸光度(HeLa細胞の細胞数に相当する)を表45に示す。
(試験例41:Happy Cell ASM培地との細胞増殖比較試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。Happy Cell ASM培地(biocroi社製)はあらかじめ指定の濃度(1:1で混合)になるようにDMEM培地(WAKO社製)で調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)或いはヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物或いはHappy Cell ASM培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にHeLa細胞およびA549細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて5日間静置状態で培養した。3、5日間培養後の培養液に対して、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。Happy Cell ASM培地(biocroi社製)はあらかじめ指定の濃度(1:1で混合)になるようにDMEM培地(WAKO社製)で調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)或いはヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物或いはHappy Cell ASM培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にHeLa細胞およびA549細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて5日間静置状態で培養した。3、5日間培養後の培養液に対して、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、Happy Cell ASMと比較して当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。静置培養3、5日間後の
450nmの吸光度(HeLa細胞の細胞数に相当する)を表46に、450nmの吸光度(A549細胞の細胞数に相当する)を表47に示す。
450nmの吸光度(HeLa細胞の細胞数に相当する)を表46に、450nmの吸光度(A549細胞の細胞数に相当する)を表47に示す。
(試験例42:他の多糖類を用いた際の細胞増殖試験)
ダイユータンガム(KELCO CRETE DG-F、三晶株式会社製)を1.5%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(日水製薬社製)に終濃度0.2%及び0.3%(w/v)のダイユータンガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記のダイユータンガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照としてダイユータンガムを含まない同上培地にA549細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて3日間静置状態で培養した。3日間培養後の培養液に対して、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular
Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
ダイユータンガム(KELCO CRETE DG-F、三晶株式会社製)を1.5%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(日水製薬社製)に終濃度0.2%及び0.3%(w/v)のダイユータンガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記のダイユータンガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照としてダイユータンガムを含まない同上培地にA549細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて3日間静置状態で培養した。3日間培養後の培養液に対して、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular
Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、他の多糖類を含む当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。静置培養3日間後の450nmの吸光度(A549細胞の細胞数に相当する)を表48に示す。
(試験例43:各種抗がん剤を用いた細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3
%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムと終濃度0.001、0.01、0.1、1μMの各種抗がん剤を添加した培地組成物を調製した。抗がん剤はAdriamycin(WAKO社製)、Paclitaxel(WAKO社製)或いはMitomycin C(WAKO社製)を用いた。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。
なお、無添加として、終濃度0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムのみを含む同上培地にHeLa細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて7日間静置状態で培養した。3、5、7日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular
Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。細胞密度は、5日間培養後の細胞を含んだ培養液をピペットで攪拌を行い、攪拌液20μLとTrypan
Blue stain 0.4%(Invitrogen社製)20μLを混合し顕微鏡下で計測した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3
%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムと終濃度0.001、0.01、0.1、1μMの各種抗がん剤を添加した培地組成物を調製した。抗がん剤はAdriamycin(WAKO社製)、Paclitaxel(WAKO社製)或いはMitomycin C(WAKO社製)を用いた。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。
なお、無添加として、終濃度0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムのみを含む同上培地にHeLa細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて7日間静置状態で培養した。3、5、7日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular
Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。細胞密度は、5日間培養後の細胞を含んだ培養液をピペットで攪拌を行い、攪拌液20μLとTrypan
Blue stain 0.4%(Invitrogen社製)20μLを混合し顕微鏡下で計測した。
その結果、本発明の培地組成物を用いた細胞増殖試験法により、抗がん剤を効率的に評価できることが確認された。また、静置培養3、5、7日間後の450nmの吸光度(HeLa細胞の細胞数に相当する)を表49に示す。5日間後のHeLa細胞の細胞密度を表50に示す。
(試験例44:ヒト初代肝細胞の維持及び機能試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて添加剤(HCMsingleQuots(登録商標)、BSA-Fatty acid free,EGF,Ascorbic acid,Transferrin,Insulin,GA-1000,Hydrocortisone 21 hemisuccinate;ロンザジャパン株式会社製)を添加したHBM培地(ロンザジャパン株式会社製)に終濃度0.015%或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、凍結されていたヒト初代肝細胞(Xenotech社製)を、250000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェルU底超低接着表面マイクロプレート(住友ベークライト株式会社製、PrimeSurface、MS-9096U)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にヒト初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で3日間培養した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて添加剤(HCMsingleQuots(登録商標)、BSA-Fatty acid free,EGF,Ascorbic acid,Transferrin,Insulin,GA-1000,Hydrocortisone 21 hemisuccinate;ロンザジャパン株式会社製)を添加したHBM培地(ロンザジャパン株式会社製)に終濃度0.015%或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、凍結されていたヒト初代肝細胞(Xenotech社製)を、250000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェルU底超低接着表面マイクロプレート(住友ベークライト株式会社製、PrimeSurface、MS-9096U)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にヒト初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で3日間培養した。
1.生細胞数測定
4時間、8時間、1日間培養後の培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
4時間、8時間、1日間培養後の培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
2.アルブミン分泌量の解析
3日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで培養上清を回収した。培地中のヒトアルブミン濃度は、Albumin ELISA
Quantitation kit(Bethyl Laboratories社製)を用いて測定した。
3日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで培養上清を回収した。培地中のヒトアルブミン濃度は、Albumin ELISA
Quantitation kit(Bethyl Laboratories社製)を用いて測定した。
3.リアルタイムPCR法によるmRNAの発現解析
8時間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで細胞を回収した。細胞からRNeasy Mini kit(QIAGEN社製)を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScript(登録商標) RT Master Mix(タカラバイオ社製)を使用し、GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems社製)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。PCR反応に用いた各cDNAサンプルは、分注し滅菌水で1/10に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合させたcD
NAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCR反応は、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)と各種Taqmanプローブ(Applied Biosystems社製)を使用し、7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems社製)を用いて実施した。特異性はGAPDHのmRNAを内在性コントロールとし、各mRNAの発現はGAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)の値で補正し、陰性対照を100%として算出した。
8時間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで細胞を回収した。細胞からRNeasy Mini kit(QIAGEN社製)を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScript(登録商標) RT Master Mix(タカラバイオ社製)を使用し、GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems社製)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。PCR反応に用いた各cDNAサンプルは、分注し滅菌水で1/10に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合させたcD
NAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCR反応は、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)と各種Taqmanプローブ(Applied Biosystems社製)を使用し、7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems社製)を用いて実施した。特異性はGAPDHのmRNAを内在性コントロールとし、各mRNAの発現はGAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)の値で補正し、陰性対照を100%として算出した。
用いた各プローブ(Applied Biosystems社製)を以下に示す。
GAPDH:HS99999905
Albumin:HS99999922
Cyp3A4:HS00604506
Cyp2C9:HS02383631
PXR(Pregnane X receptor):HS01114267
ApoA1(Apolipoprotein A1):HS00163641
GAPDH:HS99999905
Albumin:HS99999922
Cyp3A4:HS00604506
Cyp2C9:HS02383631
PXR(Pregnane X receptor):HS01114267
ApoA1(Apolipoprotein A1):HS00163641
その結果、本発明の培地組成物は、ヒト初代肝細胞を分散した状態に保ち、保護することにより生細胞数の減少を抑制する効果を有することが確認された。また当該培地組成物でアルブミン産生能と薬物動態に関わるmRNA群発現能が陰性対照に比べて高いことが確認された。静置培養4時間、8時間、1日間後の450nmの吸光度(ヒト初代肝細胞の細胞数に相当する)を表51に示す。静置培養3日間後の培養上清中のアルブミン値を表52に示す。また静置培養8時間後の陰性対照を100%とした際の各mRNA発現値を表53に示す。ヒト初代肝細胞を4時間培養した際の細胞の状態を図21に示す。
(試験例45:カニクイザル初代肝細胞の維持及び機能試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶
液を用いて添加剤(HCMsingleQuots(登録商標)、BSA-Fatty acid free,EGF,Ascorbic acid,Transferrin,Insulin,GA-1000,Hydrocortisone 21 hemisuccinate;ロンザジャパン株式会社製)を添加したHBM培地(ロンザジャパン株式会社製)に終濃度0.015%或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、凍結されていたカニクイザル初代肝細胞(株式会社イナリサーチ社製)を、250000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェルU底超低接着表面マイクロプレート(住友ベークライト株式会社製、PrimeSurface、MS-9096U)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にカニクイザル初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて3日間静置状態で培養した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶
液を用いて添加剤(HCMsingleQuots(登録商標)、BSA-Fatty acid free,EGF,Ascorbic acid,Transferrin,Insulin,GA-1000,Hydrocortisone 21 hemisuccinate;ロンザジャパン株式会社製)を添加したHBM培地(ロンザジャパン株式会社製)に終濃度0.015%或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、凍結されていたカニクイザル初代肝細胞(株式会社イナリサーチ社製)を、250000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェルU底超低接着表面マイクロプレート(住友ベークライト株式会社製、PrimeSurface、MS-9096U)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にカニクイザル初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて3日間静置状態で培養した。
1.生細胞数測定
4時間、8時間、1日、3日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
4時間、8時間、1日、3日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
2.アルブミン分泌量の解析
3日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで培養上清を回収した。培地中のヒトアルブミン濃度は、Albumin ELISA
Quantitation kit(Bethyl Laboratories社製)を用いて測定した。
3日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで培養上清を回収した。培地中のヒトアルブミン濃度は、Albumin ELISA
Quantitation kit(Bethyl Laboratories社製)を用いて測定した。
3.リアルタイムPCR法によるmRNAの発現解析
1、2、3日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで細胞を回収した。細胞からRNeasy Mini kit(QIAGEN社製)を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScript(登録商標) RT Master Mix(タカラバイオ社製)を使用し、GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems社製)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。PCR反応に用いた各cDNAサンプルは、分注し滅菌水で1/10に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合さ
せたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCR反応は、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)と各種Taqmanプローブ(Applied Biosystems社製)を使用し、7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems社製)を用いて実施した。特異性はGAPDHのmRNAを内在性コントロールとし、各mRNAの発現はGAPDHの値で補正し算出した。
1、2、3日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで細胞を回収した。細胞からRNeasy Mini kit(QIAGEN社製)を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScript(登録商標) RT Master Mix(タカラバイオ社製)を使用し、GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems社製)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。PCR反応に用いた各cDNAサンプルは、分注し滅菌水で1/10に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合さ
せたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCR反応は、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)と各種Taqmanプローブ(Applied Biosystems社製)を使用し、7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems社製)を用いて実施した。特異性はGAPDHのmRNAを内在性コントロールとし、各mRNAの発現はGAPDHの値で補正し算出した。
用いた各プローブ(Applied Biosystems社製)を以下に示す。
GAPDH:Rh02621745
Albumin:Rh02789672
ApoA1(Apolipoprotein A1):Rh02794272
GAPDH:Rh02621745
Albumin:Rh02789672
ApoA1(Apolipoprotein A1):Rh02794272
その結果、本発明の培地組成物は、カニクイザル初代肝細胞を保護することにより生細胞数の減少を抑制する効果を有することが確認された。また当該培地組成物で培養した肝細胞は、アルブミン産生能とAlbumin及びApoA1のmRNA群発現能が陰性対
照に比べて高いことが確認された。静置培養4時間、8時間、1日間、3日間後の450nmの吸光度(カニクイザル初代肝細胞の細胞数に相当する)を表54に示す。静置培養3日間後の培養上清中のアルブミン値を表55に示す。また静置培養2、3日後における、陰性対照を100%とした際のAlbuminのmRNA発現値を表56に、ApoA1のmRNA発現値を表57に示す。カニクイザル初代肝細胞を4時間培養した際の細胞の状態を図22に示す。
照に比べて高いことが確認された。静置培養4時間、8時間、1日間、3日間後の450nmの吸光度(カニクイザル初代肝細胞の細胞数に相当する)を表54に示す。静置培養3日間後の培養上清中のアルブミン値を表55に示す。また静置培養2、3日後における、陰性対照を100%とした際のAlbuminのmRNA発現値を表56に、ApoA1のmRNA発現値を表57に示す。カニクイザル初代肝細胞を4時間培養した際の細胞の状態を図22に示す。
(試験例46:コラーゲンコートマイクロプレートにおける肝細胞の維持及び機能試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて添加剤(HCMsingleQuots(登録商標)、BSA-Fatty acid free,EGF,Ascorbic acid,Transferrin,
Insulin,GA-1000,Hydrocortisone 21 hemisuccinate;ロンザジャパン株式会社製)を添加したHBM培地(ロンザジャパン株式会社製)に終濃度0.015%或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、凍結されていたカニクイザル初代肝細胞(株式会社イナリサーチ社製)を、100000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェルコラーゲンコートマイクロプレート(IWAKI社製、4860-010)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にカニクイザル初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて3日間静置状態で培養した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて添加剤(HCMsingleQuots(登録商標)、BSA-Fatty acid free,EGF,Ascorbic acid,Transferrin,
Insulin,GA-1000,Hydrocortisone 21 hemisuccinate;ロンザジャパン株式会社製)を添加したHBM培地(ロンザジャパン株式会社製)に終濃度0.015%或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、凍結されていたカニクイザル初代肝細胞(株式会社イナリサーチ社製)を、100000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェルコラーゲンコートマイクロプレート(IWAKI社製、4860-010)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にカニクイザル初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて3日間静置状態で培養した。
1.生細胞数測定
1日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
1日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
2.アルブミン分泌量の解析
3日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで培養上清を回収した。培地中のヒトアルブミン濃度は、Albumin ELISA
Quantitation kit(Bethyl Laboratories社製)を用いて測定した。
3日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで培養上清を回収した。培地中のヒトアルブミン濃度は、Albumin ELISA
Quantitation kit(Bethyl Laboratories社製)を用いて測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、コラーゲンをコートしたプレートを用いても当該培地組成物で初代肝細胞を保護することで生細胞数の減少を抑制することが確認された。また当該培地組成物でアルブミン産生能が陰性対照に比べて高いことが確認された。静置培養1日間後の450nmの吸光度(カニクイザル初代肝細胞の細胞数に相当する)を表58に示す。また静置培養3日間後の培養上清中のアルブミン値を表59に示す。
(試験例47:Happy Cell ASM培地との比較試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて添加剤(HCMsingleQuots(登録商標)、BSA-Fatty acid free,EGF,Ascorbic acid,Transferrin,Insulin,GA-1000,Hydrocortisone 21 hemisuccinate;ロンザジャパン株式会社製)を添加したHBM培地(ロンザジャパン株式会社製)をDMEM培地(WAKO社製)に1:1で混合し、終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。Happy Cell ASM培地(biocroi社製)はあらかじめ指定の濃度(1:1で混合)になるようにDMEM培地で調製した。引き続き、凍結されていたヒト初代肝細胞(Xenotech社製)を、250000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物或いはHappy Cell ASM培地組成物に播種した後、96ウェルU底超低接着表面マイクロプレート(住友ベークライト株式会社製)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にヒト初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて6日間静置状態で培養した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて添加剤(HCMsingleQuots(登録商標)、BSA-Fatty acid free,EGF,Ascorbic acid,Transferrin,Insulin,GA-1000,Hydrocortisone 21 hemisuccinate;ロンザジャパン株式会社製)を添加したHBM培地(ロンザジャパン株式会社製)をDMEM培地(WAKO社製)に1:1で混合し、終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。Happy Cell ASM培地(biocroi社製)はあらかじめ指定の濃度(1:1で混合)になるようにDMEM培地で調製した。引き続き、凍結されていたヒト初代肝細胞(Xenotech社製)を、250000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物或いはHappy Cell ASM培地組成物に播種した後、96ウェルU底超低接着表面マイクロプレート(住友ベークライト株式会社製)のウェルに1ウェル当たり200μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にヒト初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて6日間静置状態で培養した。
1.生細胞数測定
2時間、4時間、8時間、1日間、4日間、6日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA
MAX 190)にて450nmの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
2時間、4時間、8時間、1日間、4日間、6日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を20μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA
MAX 190)にて450nmの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、Happy Cell ASMと比較して初代肝細胞を保護することで生細胞数の減少を抑制する効果に優れていることが確認された。静置培養2時間、4時間、8時間、1日間、4日間、6日間後の450nmの吸光度(ヒト初代肝細胞の細胞数に相当する)を表60に示す。
(試験例48:肝細胞に対する化合物の毒性試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。一方、DMEM培地(WAKO社製)に対してHepG2細胞を100000細胞/mLとなるように混合し、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり100μLになるように細胞懸濁液を分注した。上記の脱アシル化ジェランガム水溶液に対して各濃度のTroglitazone(WAKO社製、 #71750)を添加し、本溶液を上記の細胞懸濁液100μLに対して10μ
L添加した。以上の処理により、DMSO濃度が0.18%(v/v)、Troglitazone濃度が20.0、40.0、60.0、100 (μmol/L)、脱アシル化ジェランガム濃度0.015%(w/v)となる細胞懸濁液を調製した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて1日間静置状態で培養した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。一方、DMEM培地(WAKO社製)に対してHepG2細胞を100000細胞/mLとなるように混合し、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり100μLになるように細胞懸濁液を分注した。上記の脱アシル化ジェランガム水溶液に対して各濃度のTroglitazone(WAKO社製、 #71750)を添加し、本溶液を上記の細胞懸濁液100μLに対して10μ
L添加した。以上の処理により、DMSO濃度が0.18%(v/v)、Troglitazone濃度が20.0、40.0、60.0、100 (μmol/L)、脱アシル化ジェランガム濃度0.015%(w/v)となる細胞懸濁液を調製した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて1日間静置状態で培養した。
1.生細胞数測定
1日間培養後の培養液50μLを96穴タイタープレート(コーニング社製)に分注し、本培養液に対してCellTiter-Glo(登録商標)試薬(プロメガ社製)を50μL添加した後、10分間室温にてインキュベートし、マルチプレートリーダー(Molecular Devices社製、FlexStation3)にて発光強度を測定することにより生細胞の数を測定した。
2.乳酸脱水素酵素(LDH)活性測定
1日間培養後の培養液100μLに対してDMEM培地(WAKO社製)100μLを添加し、440Gにてプレートごと15分間遠心した。上清100μLを96穴タイタープレート(コーニング社製)に分注し、細胞傷害性検出キット(Roche Applied Science社製)の反応混合液100μLを添加し、室温にて遮光下30分間静置した。引き続き、上記キットのプロトコールに従い、吸光度計(Molecular
Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて490nmの吸光度(リファレンス;600nm)を測定することにより障害を受けた細胞の割合、すなわち細胞障害率(%)を測定した。
1日間培養後の培養液50μLを96穴タイタープレート(コーニング社製)に分注し、本培養液に対してCellTiter-Glo(登録商標)試薬(プロメガ社製)を50μL添加した後、10分間室温にてインキュベートし、マルチプレートリーダー(Molecular Devices社製、FlexStation3)にて発光強度を測定することにより生細胞の数を測定した。
2.乳酸脱水素酵素(LDH)活性測定
1日間培養後の培養液100μLに対してDMEM培地(WAKO社製)100μLを添加し、440Gにてプレートごと15分間遠心した。上清100μLを96穴タイタープレート(コーニング社製)に分注し、細胞傷害性検出キット(Roche Applied Science社製)の反応混合液100μLを添加し、室温にて遮光下30分間静置した。引き続き、上記キットのプロトコールに従い、吸光度計(Molecular
Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて490nmの吸光度(リファレンス;600nm)を測定することにより障害を受けた細胞の割合、すなわち細胞障害率(%)を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いて、Troglitazoneが肝細胞の細胞障害性を有することが確認された。1日間培養後における無添加条件を1とした際の相対的細胞数並びに細胞障害率(%)を表61に示す。
(試験例49:A549細胞を用いたATP定量法による細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.005%(w/v)、0.015%(w/v)或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、100000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり100μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にA549細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて5日間静置状態で培養した。1、3、5日間培養後の培養液に対して、ATP試薬100μL(CellTiter-Glo(登録商標
) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。WST-8測定は、3日間培養後の細胞にWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を10μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.005%(w/v)、0.015%(w/v)或いは0.030%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、100000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり100μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にA549細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて5日間静置状態で培養した。1、3、5日間培養後の培養液に対して、ATP試薬100μL(CellTiter-Glo(登録商標
) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。WST-8測定は、3日間培養後の細胞にWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を10μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、A549細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより効率的に増殖することがATP測定法においても確認された。静置培養1、3、5日間後のRLU値(ATP測定、発光強度)を表62に示す。3日間培養後の450nmの吸光度(WST-8)とRLU値(ATP測定、発光強度)を表63に示す。
(試験例50:抗がん剤を用いた細胞増殖試験における単層培養法との比較)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種
した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度0.001から1μMになるように、10倍濃度の各種抗がん剤と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度の各種抗がん剤のみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き3日間培養を継続した。抗がん剤はAdriamycin(WAKO社製)、Paclitaxel(WAKO社製)或いはMitomycin C(WAKO社製)を用いた。4日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。WST-8測定は、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を15μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種
した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度0.001から1μMになるように、10倍濃度の各種抗がん剤と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度の各種抗がん剤のみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き3日間培養を継続した。抗がん剤はAdriamycin(WAKO社製)、Paclitaxel(WAKO社製)或いはMitomycin C(WAKO社製)を用いた。4日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。WST-8測定は、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を15μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いた細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてMitomycin Cの薬効が強く示されることが分かった。静置培養4日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表64に示す。静置培養4日目の450nmの吸光度(WST-8測定)の%Control値を表65に示す。
(試験例51:アポトーシス誘導剤を用いた細胞増殖試験における単層培養法との比較)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度0.2から10
μMになるように、10倍濃度の各種アポトーシス誘導剤と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度の各種アポトーシス誘導剤のみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を3日間継続した。アポトーシス誘導剤はApoptosis Inducer set(Merck Millipore社製、APT800:Actinomycin D,Camptothecin,Cycloheximide, Dexamethasone, Etoposide)を用いた。4日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。WST-8測定は、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を15μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度0.2から10
μMになるように、10倍濃度の各種アポトーシス誘導剤と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度の各種アポトーシス誘導剤のみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を3日間継続した。アポトーシス誘導剤はApoptosis Inducer set(Merck Millipore社製、APT800:Actinomycin D,Camptothecin,Cycloheximide, Dexamethasone, Etoposide)を用いた。4日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。WST-8測定は、WST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を15μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いた細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてCamptothecinとEtoposideの薬効が強く示されることが分かった。静置培養4日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表66に示す。静置培養4日目の450nmの吸光度(WST-8測定)の%Control値を表67に示す。
(試験例52:TrametinibおよびMK-2206を用いたHeLa細胞増殖試験における単層培養法との比較)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを、7400細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度0.001から3
0μMになるように、10倍濃度の各抗がん剤と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度の各抗がん剤のみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を5日間継続した。抗がん剤はTrametinib(Santa Cruz社製、MEK阻害剤)およびMK-2206(Santa Cruz社製、Akt阻害剤)を用いた。6日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを、7400細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度0.001から3
0μMになるように、10倍濃度の各抗がん剤と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度の各抗がん剤のみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を5日間継続した。抗がん剤はTrametinib(Santa Cruz社製、MEK阻害剤)およびMK-2206(Santa Cruz社製、Akt阻害剤)を用いた。6日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いた細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてMK-2206とTrametinibの薬効が強く示されることが分かった。静置培養4日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表68に示す。
(試験例53:TrametinibおよびMK-2206を用いたA549細胞増殖
試験における単層培養法との比較)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト肺癌細胞株A549を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度0.001から30μMになるように、10倍濃度の各抗がん剤と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度の各抗がん剤のみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を5日間継続した。抗がん剤はTrametinib(Santa Cruz社製、MEK阻害剤)およびMK-2206(Santa Cruz社製、Akt阻害剤)を用いた。6日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
試験における単層培養法との比較)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト肺癌細胞株A549を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度0.001から30μMになるように、10倍濃度の各抗がん剤と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度の各抗がん剤のみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を5日間継続した。抗がん剤はTrametinib(Santa Cruz社製、MEK阻害剤)およびMK-2206(Santa Cruz社製、Akt阻害剤)を用いた。6日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いた細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてMK-2206の薬効が強く示されることが分かった。静置培養4日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表69に示す。
(試験例54:ヒトHB-EGFで刺激したHeLa細胞の増殖作用における単層培養法との比較)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度10、30、1
00ng/mlになるように、10倍濃度のヒトHB-EGF(ヘパリン結合性上皮成長因子様増殖因子、PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度のヒトHB-EGFのみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を7日間継続した。6日目および8日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度10、30、1
00ng/mlになるように、10倍濃度のヒトHB-EGF(ヘパリン結合性上皮成長因子様増殖因子、PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度のヒトHB-EGFのみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を7日間継続した。6日目および8日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いたHeLa細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてヒトHB-EGFの細胞増殖促進効果が強く示されることが分かった。静置培養6日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表70に示す。静置培養8日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表71に示す。
(試験例55:ヒトHB-EGFで刺激したA549細胞の増殖作用における単層培養法との比較)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱し
ながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト肺癌細胞株A549を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度10、30、100ng/mlになるように、10倍濃度のヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度のヒトHB-EGFのみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を7日間継続した。6日目および8日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱し
ながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト肺癌細胞株A549を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度10、30、100ng/mlになるように、10倍濃度のヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度のヒトHB-EGFのみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を7日間継続した。6日目および8日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いたA549細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてヒトHB-EGFの細胞増殖促進効果が強く示されることが分かった。静置培養6日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表72に示す。静置培養8日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表73に示す。
(試験例56:ヒトHB-EGFで刺激したA431細胞の増殖作用における単層培養法との比較)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト扁平上皮癌細胞株A431(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト扁平上皮癌細胞株A431を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度10、30、100ng/mlになるように、10倍濃度のヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度のヒトHB-EGFのみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を7日間継続した。6日目および8日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト扁平上皮癌細胞株A431(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト扁平上皮癌細胞株A431を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度10、30、100ng/mlになるように、10倍濃度のヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度のヒトHB-EGFのみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を7日間継続した。6日目および8日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いたA431細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてヒトHB-EGFの細胞増殖促進効果が強く示されることが分かった。静置培養6日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表74に示す。静置培養8日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表75に示す。
(試験例57:ヒトHB-EGFで刺激したSKOV3細胞の増殖作用における単層培養法との比較)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて15%(v/v)胎児ウシ血清を含むMcCoy’s5a培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト卵巣癌細胞株SKOV3(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト卵巣癌細胞株SKOV3を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度10、30、100ng/mlになるように、10倍濃度のヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度のヒトHB-EGFのみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培
養を8日間継続した。6日目および9日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて15%(v/v)胎児ウシ血清を含むMcCoy’s5a培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト卵巣癌細胞株SKOV3(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト卵巣癌細胞株SKOV3を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度10、30、100ng/mlになるように、10倍濃度のヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度のヒトHB-EGFのみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培
養を8日間継続した。6日目および9日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いたSKOV3細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてヒトHB-EGFの細胞増殖促進効果が強く示されることが分かった。静置培養6日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表76に示す。静置培養9日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表77に示す。
(試験例58:ヒトHB-EGFで刺激したHeLa細胞におけるVEGFのmRNA発現における単層培養法との比較)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株
HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度10、30、100ng/mlになるように、10倍濃度のヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度のヒトHB-EGFのみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を6日間継続した。7日目の癌細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで細胞を回収した。細胞からRNeasy Mini kit(QIAGEN社製)を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScript(登録商標) RT Master Mix(タカラバイオ社製)を使用し、GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems社製)を用いて逆転写反応を行い,cDNAを合成した。PCR反応に用いた各cDNAサンプルは、分注し滅菌水で1/10に希釈したもの
を用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合させたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCR反応は、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)と各種Taqmanプローブ(Applied Biosystems社製)を使用し、7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems社製)を用いて実施した。特異性はGAPDH(Glyceraldehyde
3-phosphate dehydrogenase)のmRNAを内在性コントロールとし、VEGF(Vascular endothelial growth factor)mRNAの発現はGAPDHの値で補正し、陰性対照を100%として算出した。用いた各プローブ(Applied Biosystems社製)を以下に示す。
GAPDH:HS99999905
VEGF: HS00173626
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株
HeLa(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaを、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度10、30、100ng/mlになるように、10倍濃度のヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)および10倍濃度のヒトHB-EGFのみの培地組成物(単層培養群)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を6日間継続した。7日目の癌細胞を含む培養液を回収し、遠心分離(400g、3分間)することで細胞を回収した。細胞からRNeasy Mini kit(QIAGEN社製)を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScript(登録商標) RT Master Mix(タカラバイオ社製)を使用し、GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems社製)を用いて逆転写反応を行い,cDNAを合成した。PCR反応に用いた各cDNAサンプルは、分注し滅菌水で1/10に希釈したもの
を用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合させたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCR反応は、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)と各種Taqmanプローブ(Applied Biosystems社製)を使用し、7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems社製)を用いて実施した。特異性はGAPDH(Glyceraldehyde
3-phosphate dehydrogenase)のmRNAを内在性コントロールとし、VEGF(Vascular endothelial growth factor)mRNAの発現はGAPDHの値で補正し、陰性対照を100%として算出した。用いた各プローブ(Applied Biosystems社製)を以下に示す。
GAPDH:HS99999905
VEGF: HS00173626
その結果、本発明の培地組成物を用いて培養したHeLa細胞は、単層培養法に比べてヒトHB-EGFによるVEGFのmRNA発現促進効果が強く示されることが分かった。また、静置培養7日目の陰性対照を100%とした際のVEGFmRNA発現値を表78に示す。
(試験例59:ヒトHB-EGFで刺激したA549細胞の増殖に対するGefinitibの効果)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、各抗がん剤は終濃度0.1から30μMになるように、ヒトHB-EGFは終濃度0ng/mlあるいは100ng/mlになるように、10倍濃度の各抗がん剤およびヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)を15μLずつ添加し、引き続き培養を5日間継続した。抗がん剤はGefitinib(Santa Cruz社製、EGF受容体阻害剤)を用いた。6日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標)
Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、各抗がん剤は終濃度0.1から30μMになるように、ヒトHB-EGFは終濃度0ng/mlあるいは100ng/mlになるように、10倍濃度の各抗がん剤およびヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)を15μLずつ添加し、引き続き培養を5日間継続した。抗がん剤はGefitinib(Santa Cruz社製、EGF受容体阻害剤)を用いた。6日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標)
Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物とヒトHB-EGFを用いたA549細胞増殖試験法により、HB-EGFを添加した培養条件のほうがGefitinibの抑制効果は強かった。静置培養6日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表79に示す。
(試験例60:ヒトHB-EGFで刺激したA431細胞の増殖作用におけるGefinitib、Elrotinibの効果)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3
%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト扁平上皮癌細胞株A431(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、各抗がん剤は終濃度0.1から30μMになるように、ヒトHB-EGFは終濃度0ng/mlあるいは100ng/mlになるように、10倍濃度の各抗がん剤およびヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)を15μLずつ添加し、引き続き培養を7日間継続した。抗がん剤はGefitinib(Santa Cruz社製、EGF受容体阻害剤)、Elrotinib(Santa Cruz社製、EGF受容体阻害剤)を用いた。4日目、6日目および8日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3
%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト扁平上皮癌細胞株A431(DSファーマバイオメディカル社製)を、37000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、各抗がん剤は終濃度0.1から30μMになるように、ヒトHB-EGFは終濃度0ng/mlあるいは100ng/mlになるように、10倍濃度の各抗がん剤およびヒトHB-EGF(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(脱アシル化ジェランガム添加群)を15μLずつ添加し、引き続き培養を7日間継続した。抗がん剤はGefitinib(Santa Cruz社製、EGF受容体阻害剤)、Elrotinib(Santa Cruz社製、EGF受容体阻害剤)を用いた。4日目、6日目および8日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物とヒトHB-EGFを組み合わせた培養法で、低接着培養条件でのA431細胞増殖を認めた。さらに本発明の培地組成物とヒトHB-EGFを組み合わせたA431細胞増殖試験法により、HB-EGF増殖亢進作用に対するGefitinibおよびElrotinibの抑制効果を判断できた。ヒトHB-EGFの増殖促進作用に関しては、静置培養4日目、6日目、8日目のRLU値(ATP測定、発光強度)を表80に示す。さらにヒトHB-EGF増殖促進作用に対する各抗がん剤の作用に関しては、静置培養4日目、8日目のRLU値(ATP測定、発光強度)の%Control値を表81に示す。
(試験例61:MCF-7細胞を分散させた際の細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.005%(w/v)或いは0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト乳癌細胞株MCF-7(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり100μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にMCF-7細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて5日間静置状態で培養した。2、5日間培養後の培養液に対して、ATP試薬100μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。WST-8測定は、2、5日間培養後の細胞にWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を10μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むEMEM培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.005%(w/v)或いは0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト乳癌細胞株MCF-7(DSファーマバイオメディカル社製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり100μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にMCF-7細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて5日間静置状態で培養した。2、5日間培養後の培養液に対して、ATP試薬100μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。WST-8測定は、2、5日間培養後の細胞にWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を10μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、MCF-7細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより効率的に増殖す
ることがATP測定法およびWST-8測定法で確認された。静置培養2、5日間後のRLU値(ATP測定、発光強度)を表82に示す。2、5日間培養後の450nmの吸光度(WST-8))を表83に示す。5日間培養後のMCF-7細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図23に示す。
ることがATP測定法およびWST-8測定法で確認された。静置培養2、5日間後のRLU値(ATP測定、発光強度)を表82に示す。2、5日間培養後の450nmの吸光度(WST-8))を表83に示す。5日間培養後のMCF-7細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図23に示す。
(試験例62:A375細胞及びMNNG/HOS細胞を分散させた際の細胞増殖試験
)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)或いはEMEM培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.005%(w/v)或いは0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒトメラノーマ細胞株A375(ATCC製)或いはヒト骨肉腫細胞株MNNG/HOS(ATCC製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェ
ランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり100μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にA375細胞およびMNNG/HOS細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをC
O2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて4日間静置状態で培養した。4日間培養後の培養液に対して、ATP試薬100μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。4日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を10μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)或いはEMEM培地(DSファーマバイオメディカル社製)に終濃度0.005%(w/v)或いは0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒトメラノーマ細胞株A375(ATCC製)或いはヒト骨肉腫細胞株MNNG/HOS(ATCC製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェ
ランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり100μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にA375細胞およびMNNG/HOS細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをC
O2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて4日間静置状態で培養した。4日間培養後の培養液に対して、ATP試薬100μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。4日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を10μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、A375細胞およびMNNG/HOS細胞は、本発明の培地組成物を用いる
ことにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。4日間培養後のA375細胞およびMNNG/HOS細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図24に示
す。また、A375細胞において、静置培養4日間後の450nmの吸光度(WST-8)とRLU値(ATP測定、発光強度)を表84に示す。MNNG/HOS細胞において
、静置培養4日間後の450nmの吸光度(WST-8)とRLU値(ATP測定、発光強度)を表85に示す。
ことにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。4日間培養後のA375細胞およびMNNG/HOS細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図24に示
す。また、A375細胞において、静置培養4日間後の450nmの吸光度(WST-8)とRLU値(ATP測定、発光強度)を表84に示す。MNNG/HOS細胞において
、静置培養4日間後の450nmの吸光度(WST-8)とRLU値(ATP測定、発光強度)を表85に示す。
(試験例63:MIAPaCa-2細胞を分散させた際の細胞増殖試験)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.005%(w/v)或いは0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト膵臓癌細胞株MIAPaCa-2(ATCC製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり100μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にMIAPaCa-2細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて6日間静置状態で培養した。6日間培養後の培養液に対して、ATP試薬100μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell
Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。6日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を10μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した
。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.005%(w/v)或いは0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト膵臓癌細胞株MIAPaCa-2(ATCC製)を、50000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり100μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にMIAPaCa-2細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて6日間静置状態で培養した。6日間培養後の培養液に対して、ATP試薬100μL(CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell
Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。6日間培養後の、培養液に対してWST-8溶液(株式会社同仁化学研究所社製)を10μL添加した後、100分間37℃にてインキュベートし、吸光度計(Molecular Devices社製、SPECTRA MAX 190)にて450nmの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した
。
その結果、MIAPaCa-2細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。6日間培養後のMIAPaCa-2細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図25に示す。また、MIAPaCa-2細胞において、静置培養4日間後の450nmの吸光度(WST-8)とRLU値(ATP測定、発光強度)を表86に示す。
(試験例64:脱アシル化ジェランガムを含む培地の濃縮及び希釈)
試験例2と同様の方法を用いて調製した0.015%(w/v)脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三昌株式会社製)を含むDMEM培地(Wako社製)を、15mL遠心チューブ(VIOLAMO社製)に10mLずつ分注し、スイングローター LC-200(トミー精工社製)にて遠心(700G、5分間)することにより脱アシル化ジェランガムを沈降させた後、上清8mLをアスピレーターで除去し、これにより脱アシル化ジェランガム含有培地の濃縮を行った。更に、本濃縮培地に脱アシル化ジェランガムを含まないDMEM培地(Wako社製)を添加してピペッティングにより混合し、任意の濃縮率の培地をそれぞれ作成した。
一方、ヒト肝癌細胞HepG2(DSファーマバイオメディカル社製)を、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(Wako社製)に500000個/mLとなるように懸濁し、本懸濁液10mLをEZ SPHERE(旭硝子社製)に播種した後、37℃、CO2インキュベーター(5%CO2)内で7日間培養した。ここで得られたスフェア(直径100~200μm)の懸濁液10mLを遠心処理(200G、5分間)により沈降させ、上清を除くことによりスフェア懸濁液1.0mLを調製した。上記の任意濃度にて作成した培地に本スフェア懸濁液を100μLずつ加えてピペッティングによりスフェアを分散させ、37℃でインキュベートし、1時間後のスフェアの分散状態を目視にて観察した。その結果を表87に示す。
試験例2と同様の方法を用いて調製した0.015%(w/v)脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三昌株式会社製)を含むDMEM培地(Wako社製)を、15mL遠心チューブ(VIOLAMO社製)に10mLずつ分注し、スイングローター LC-200(トミー精工社製)にて遠心(700G、5分間)することにより脱アシル化ジェランガムを沈降させた後、上清8mLをアスピレーターで除去し、これにより脱アシル化ジェランガム含有培地の濃縮を行った。更に、本濃縮培地に脱アシル化ジェランガムを含まないDMEM培地(Wako社製)を添加してピペッティングにより混合し、任意の濃縮率の培地をそれぞれ作成した。
一方、ヒト肝癌細胞HepG2(DSファーマバイオメディカル社製)を、10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(Wako社製)に500000個/mLとなるように懸濁し、本懸濁液10mLをEZ SPHERE(旭硝子社製)に播種した後、37℃、CO2インキュベーター(5%CO2)内で7日間培養した。ここで得られたスフェア(直径100~200μm)の懸濁液10mLを遠心処理(200G、5分間)により沈降させ、上清を除くことによりスフェア懸濁液1.0mLを調製した。上記の任意濃度にて作成した培地に本スフェア懸濁液を100μLずつ加えてピペッティングによりスフェアを分散させ、37℃でインキュベートし、1時間後のスフェアの分散状態を目視にて観察した。その結果を表87に示す。
表87に示した様に、脱アシル化ジェランガムは培地組成物として調製後に任意濃度に濃縮及び希釈することが可能であり、この様にして濃縮及び希釈した培地組成物はスフェアの浮遊効果を有することが確認された。
(試験例65:脱アシルジェランガム含有DMEM/Ham’sF12培地の作製)
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)120mgを純水72mLに懸濁させ、90℃にて加熱攪拌し溶解させた。これに、純水を加えて、脱アシルジェランガムが0.017%(w/v)の溶液720mLを調製した後、滅菌フィルター(ポアサイズ0.22μm)を用いて、滅菌した。他方、DMEM/Ham’sF12等量混合の粉末培地(ライフテクノロジー社)と炭酸水素ナトリウムに培地調製時の推奨値の10分の1量に当たる純水を加え、10倍の濃度で80mL水溶液を調製した後、滅菌フィルター(ポアサイズ0.22μm)を用いて、滅菌した。これらを、滅菌条件下、25℃で、攪拌しながら混合することで、脱アシルジェランガム濃度が0.015%(w/v)である目的の培地800mLを調製した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)120mgを純水72mLに懸濁させ、90℃にて加熱攪拌し溶解させた。これに、純水を加えて、脱アシルジェランガムが0.017%(w/v)の溶液720mLを調製した後、滅菌フィルター(ポアサイズ0.22μm)を用いて、滅菌した。他方、DMEM/Ham’sF12等量混合の粉末培地(ライフテクノロジー社)と炭酸水素ナトリウムに培地調製時の推奨値の10分の1量に当たる純水を加え、10倍の濃度で80mL水溶液を調製した後、滅菌フィルター(ポアサイズ0.22μm)を用いて、滅菌した。これらを、滅菌条件下、25℃で、攪拌しながら混合することで、脱アシルジェランガム濃度が0.015%(w/v)である目的の培地800mLを調製した。
本発明に係る培地組成物は、優れた細胞及び/又は組織浮遊効果を示し、動植物由来の細胞及び/又は組織をその機能を維持しながら大量に培養する際に極めて有用である。また、本発明の方法により培養された細胞及び/又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療等の分野において極めて有用である。
本出願は、日本で出願された特願2012-164227(出願日:2012年7月24日)、特願2012-263801(出願日:2012年11月30日)、特願2013-017836(出願日:2013年1月31日)を基礎
としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (1)
- 明細書または図面に記載の発明。
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012164227 | 2012-07-24 | ||
JP2012164227 | 2012-07-24 | ||
JP2012263801 | 2012-11-30 | ||
JP2012263801 | 2012-11-30 | ||
JP2013017836 | 2013-01-31 | ||
JP2013017836 | 2013-01-31 | ||
JP2019109934A JP6879517B2 (ja) | 2012-07-24 | 2019-06-12 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2021071861A JP7113466B2 (ja) | 2012-07-24 | 2021-04-21 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2022112627A JP7319638B2 (ja) | 2012-07-24 | 2022-07-13 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022112627A Division JP7319638B2 (ja) | 2012-07-24 | 2022-07-13 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023130476A true JP2023130476A (ja) | 2023-09-20 |
Family
ID=49997322
Family Applications (7)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014526955A Active JP5629893B2 (ja) | 2012-07-24 | 2013-07-24 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2014177554A Active JP6270152B2 (ja) | 2012-07-24 | 2014-09-01 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2017245611A Active JP6542344B2 (ja) | 2012-07-24 | 2017-12-21 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2019109934A Active JP6879517B2 (ja) | 2012-07-24 | 2019-06-12 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2021071861A Active JP7113466B2 (ja) | 2012-07-24 | 2021-04-21 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2022112627A Active JP7319638B2 (ja) | 2012-07-24 | 2022-07-13 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2023114436A Pending JP2023130476A (ja) | 2012-07-24 | 2023-07-12 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
Family Applications Before (6)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014526955A Active JP5629893B2 (ja) | 2012-07-24 | 2013-07-24 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2014177554A Active JP6270152B2 (ja) | 2012-07-24 | 2014-09-01 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2017245611A Active JP6542344B2 (ja) | 2012-07-24 | 2017-12-21 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2019109934A Active JP6879517B2 (ja) | 2012-07-24 | 2019-06-12 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2021071861A Active JP7113466B2 (ja) | 2012-07-24 | 2021-04-21 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
JP2022112627A Active JP7319638B2 (ja) | 2012-07-24 | 2022-07-13 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP2878664B1 (ja) |
JP (7) | JP5629893B2 (ja) |
KR (5) | KR102458397B1 (ja) |
CN (5) | CN108753679A (ja) |
AU (3) | AU2013294057B2 (ja) |
BR (1) | BR112015001620A2 (ja) |
CA (1) | CA2879624C (ja) |
DK (1) | DK2878664T3 (ja) |
HK (2) | HK1210499A1 (ja) |
IL (4) | IL300460A (ja) |
MY (1) | MY171710A (ja) |
RU (2) | RU2018129432A (ja) |
SG (2) | SG11201500512SA (ja) |
TW (3) | TWI627273B (ja) |
WO (1) | WO2014017513A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201501179B (ja) |
Families Citing this family (100)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101222923B1 (ko) | 2011-05-11 | 2013-01-17 | 김병수 | 폐열을 이용한 냉온수 공급시스템 |
DK2878664T3 (en) * | 2012-07-24 | 2018-11-05 | Nissan Chemical Corp | CULTURE MEDIUM COMPOSITION AND PROCEDURE FOR CULTIVATING CELLS OR TISSUE USING THE COMPOSITION |
US9664671B2 (en) | 2012-07-24 | 2017-05-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
US10017805B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-07-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Enhancing ingredients for protein production from various cells |
TWI612135B (zh) * | 2012-08-23 | 2018-01-21 | 日產化學工業股份有限公司 | 動物細胞用培養基之製造方法、動物細胞用培養基、蛋白質的製造方法、及促進培養中的動物細胞的蛋白質產生量的方法 |
WO2014171486A1 (ja) * | 2013-04-17 | 2014-10-23 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物及び当該培地組成物を用いた赤血球の製造方法 |
WO2014196650A1 (ja) | 2013-06-07 | 2014-12-11 | 日産化学工業株式会社 | 生体物質の付着抑制能を有するイオンコンプレックス材料及びその製造方法 |
CA2921948C (en) | 2013-09-04 | 2019-11-19 | Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. | Method for preparing pluripotent stem cells |
WO2015111734A1 (ja) * | 2014-01-23 | 2015-07-30 | 日産化学工業株式会社 | 未分化性維持培養材料 |
US10519419B2 (en) | 2014-01-23 | 2019-12-31 | Nissan Chemical Corporation | Method for producing culture medium composition |
JP2015149949A (ja) * | 2014-02-17 | 2015-08-24 | 学校法人明治大学 | 免疫抑制剤の評価方法、及び免疫抑制剤評価キット |
WO2015156929A1 (en) * | 2014-04-07 | 2015-10-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for culture of human bladder cell lines and organoids and uses thereof |
SG11201700777VA (en) | 2014-08-04 | 2017-02-27 | Nuevolution As | Optionally fused heterocyclyl-substituted derivatives of pyrimidine useful for the treatment of inflammatory, metabolic, oncologic and autoimmune diseases |
JP6642439B2 (ja) * | 2014-09-09 | 2020-02-05 | 日産化学株式会社 | 細胞回収に関する方法 |
TW201619375A (zh) * | 2014-09-25 | 2016-06-01 | 日產化學工業股份有限公司 | 抗癌劑的篩選方法 |
TWI698528B (zh) * | 2015-01-30 | 2020-07-11 | 日商日產化學工業股份有限公司 | 血管平滑肌細胞的培養方法 |
WO2016125884A1 (ja) * | 2015-02-06 | 2016-08-11 | 日産化学工業株式会社 | 担癌哺乳動物モデルの作成方法 |
CN104651300B (zh) * | 2015-02-11 | 2018-10-12 | 南开大学 | 一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用 |
KR102015205B1 (ko) | 2015-02-27 | 2019-08-27 | 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 | 리프로그래밍 전구체 조성물 및 그의 사용 방법 |
EP3282006B1 (en) * | 2015-04-07 | 2019-07-10 | Nissan Chemical Corporation | Method for preparing liquid medium composition, and preparation device and kit therefor |
CN107532143A (zh) * | 2015-04-16 | 2018-01-02 | 日产化学工业株式会社 | 培养基添加物及培养基组合物以及使用了它们的细胞或组织的培养方法 |
CA2996582A1 (en) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | I Peace, Inc. | Pluripotent stem cell manufacturing system and method for producing induced pluripotent stem cells |
WO2017057599A1 (ja) * | 2015-09-30 | 2017-04-06 | 日産化学工業株式会社 | 癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法 |
CN106474157B (zh) * | 2015-10-14 | 2021-02-26 | 北京昱龙盛世生物科技有限公司 | 一种肝干细胞注射液及其制备方法 |
CN106479978A (zh) * | 2015-10-14 | 2017-03-08 | 北京昱龙盛世生物科技有限公司 | 一种神经干细胞的专用培养基及其培养方法 |
JP6979687B2 (ja) * | 2015-12-29 | 2021-12-15 | アイ ピース インク | 幹細胞の凝集塊の集団の調製方法 |
WO2017126647A1 (ja) * | 2016-01-21 | 2017-07-27 | 国立大学法人大阪大学 | 細胞の培養方法 |
KR102436388B1 (ko) | 2016-03-09 | 2022-08-25 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 세포 회수가 용이한 부유 배양용 배양 배지 조성물 및 세포 회수 방법 |
CN108884445A (zh) | 2016-03-09 | 2018-11-23 | 北京智康博药肿瘤医学研究有限公司 | 肿瘤细胞悬浮培养物和相关方法 |
WO2017163222A1 (en) * | 2016-03-24 | 2017-09-28 | Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa, S.A. | Gellan gum hydrogels, preparation, methods and uses thereof |
TW201738256A (zh) * | 2016-04-04 | 2017-11-01 | 日產化學工業股份有限公司 | 蛋白質產生方法 |
WO2017205511A1 (en) | 2016-05-25 | 2017-11-30 | Salk Institute For Biological Studies | Compositions and methods for organoid generation and disease modeling |
CN109196089A (zh) | 2016-05-27 | 2019-01-11 | 日产化学株式会社 | 细胞培养容器 |
US11470841B2 (en) | 2016-06-15 | 2022-10-18 | Nissan Chemical Corporation | Cryopreservation vessel |
TWI750204B (zh) * | 2016-07-22 | 2021-12-21 | 日商日產化學工業股份有限公司 | 液狀之培養基組成物之製造方法及使用於該製造方法之製造裝置 |
JPWO2018016622A1 (ja) * | 2016-07-22 | 2019-05-16 | 日産化学株式会社 | 液状の培地組成物の製造方法および製造装置 |
CN106085961A (zh) * | 2016-07-28 | 2016-11-09 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种培养巨噬细胞的培养基及培养方法 |
CN109963940A (zh) * | 2016-09-02 | 2019-07-02 | 宝生物工程株式会社 | 从多能干细胞获得小胶质细胞的方法 |
JP6981425B2 (ja) * | 2016-10-31 | 2021-12-15 | 日産化学株式会社 | 粘性の高い無菌の3次元培養用培地組成物の製造方法 |
WO2018079797A1 (ja) * | 2016-10-31 | 2018-05-03 | 日産化学工業株式会社 | 高品質な3次元培養用培地組成物の製造方法、及び3次元培養用培地組成物の保存安定性の評価方法 |
DE102017106867B4 (de) * | 2017-03-30 | 2021-12-02 | Hamilton Bonaduz Ag | Verfahren zur Herstellung einer Portionseinheit |
CN111315811A (zh) * | 2017-04-10 | 2020-06-19 | 时威尔生物科学 | 用于细胞培养和生物医学应用的水凝胶 |
WO2018203548A1 (ja) | 2017-05-01 | 2018-11-08 | 日産化学株式会社 | 水溶性が改善されたアニオン性高分子化合物の調製方法 |
CN114939097A (zh) * | 2017-05-02 | 2022-08-26 | 田边刚士 | 医药品组合物及化妆品组合物 |
CN107034184A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-08-11 | 济南赛尔生物科技股份有限公司 | 一种用于原代培养脐带间充质干细胞的试剂盒 |
EP3653648A4 (en) * | 2017-07-11 | 2020-06-03 | National University Corporation University Of Toyama | POLYMER-COATED SUBSTRATE FOR SELECTIVE CELL SEPARATION OR CELL CULTURE |
CN110945118A (zh) * | 2017-07-28 | 2020-03-31 | 日产化学株式会社 | 培养基添加用组合物及培养基添加用化合物以及使用了它们的细胞或组织的培养方法 |
WO2019049985A1 (ja) * | 2017-09-08 | 2019-03-14 | 日産化学株式会社 | 細胞保存材料 |
TW201923065A (zh) | 2017-09-26 | 2019-06-16 | 日商日產化學股份有限公司 | 具有微小容積之細胞培養容器 |
EP3708648A4 (en) | 2017-11-10 | 2021-01-13 | Nissan Chemical Corporation | CELL CULTURE CONTAINER |
US11530387B2 (en) | 2017-11-16 | 2022-12-20 | Nissan Chemical Corporation | Method for inducing differentiation into and producing beige and white adipocytes |
KR102068665B1 (ko) * | 2017-12-21 | 2020-01-21 | 주식회사 에스피엘 | 세포 배양용 지지체, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 세포 배양 방법 |
JP7336386B2 (ja) | 2017-12-28 | 2023-08-31 | 株式会社カネカ | 多能性幹細胞凝集抑制剤 |
CN108126246A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-08 | 山西医科大学 | 基于复合干细胞的人工皮肤构建方法 |
CN108179133A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-06-19 | 广州大学 | c-kit+心脏干细胞聚集体及分泌合成培养液在制备药物中应用 |
CN108552158A (zh) * | 2018-04-09 | 2018-09-21 | 广东省中医院(广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院) | 一种贴壁细胞冻存液、冻存方法和解冻方法 |
JP6458185B2 (ja) * | 2018-05-30 | 2019-01-23 | 四国計測工業株式会社 | 多層培養容器操作システム、多層培養容器操作装置、および多層培養容器操作方法 |
EP3804707A4 (en) | 2018-06-08 | 2022-03-16 | Nissan Chemical Corporation | KINASE INHIBITORS |
KR102121602B1 (ko) * | 2018-06-27 | 2020-06-10 | 주식회사 티아라줄기세포연구소 | 지방줄기세포배양용 배지 조성물 제조방법, 지방줄기세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물(쉘드줄기세포) 제조방법, 이를 이용한 항관절염 치료용 조성물, 이를 이용한 염증억제 효과를 갖는 조성물 및 세포재생 효과를 갖는 조성물 |
CN108853489B (zh) * | 2018-06-29 | 2019-07-02 | 陕西诺威利华生物科技有限公司 | 一种利用无血清培养基生产pedv弱毒疫苗的方法 |
CN108815516B (zh) * | 2018-06-29 | 2019-03-15 | 陕西诺威利华生物科技有限公司 | 一种利用无血清培养基生产pedv灭活疫苗的方法 |
CN108998441A (zh) * | 2018-08-02 | 2018-12-14 | 南方医科大学深圳医院 | 一种三维肿瘤球培养基添加剂、培养基以及三维肿瘤球培养方法 |
US20210317394A1 (en) | 2018-08-06 | 2021-10-14 | Nissan Chemical Corporation | Cell culture system and cell mass production method using same |
TW202020137A (zh) | 2018-08-06 | 2020-06-01 | 日商日產化學股份有限公司 | 用於分割細胞團的裝置及使用該裝置分割細胞團的方法 |
WO2020036180A1 (ja) | 2018-08-17 | 2020-02-20 | 国立大学法人大阪大学 | 粒子の分配方法 |
JPWO2020067477A1 (ja) | 2018-09-28 | 2021-08-30 | 日産化学株式会社 | パラクライン因子生産促進用培地添加剤 |
WO2020071209A1 (ja) * | 2018-10-02 | 2020-04-09 | 富士フイルム株式会社 | 細胞培養方法 |
WO2020095879A1 (ja) * | 2018-11-08 | 2020-05-14 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 多能性幹細胞の腸管上皮細胞への分化誘導 |
WO2020101461A1 (ko) * | 2018-11-13 | 2020-05-22 | 한국화학연구원 | 세포 배양용 캐리어를 이용하여 제조된 오가노이드 및 이를 이용한 약물 독성 평가방법 |
BR112021010988A2 (pt) * | 2018-12-19 | 2021-08-31 | Regents Of The University Of Minnesota | Métodos para gerar e usar organoides e tecidos nos mesmos |
JP6895662B2 (ja) * | 2019-01-24 | 2021-06-30 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定細胞の分画方法及び捕捉方法 |
EP3915636A4 (en) | 2019-01-30 | 2022-03-09 | Nissan Chemical Corporation | HYDRAZIDE COMPOUND AND KINASE INHIBITOR |
CN110122334B (zh) * | 2019-06-20 | 2023-03-28 | 运城学院 | 一种芦竹快速繁殖专用培养基及其培养方法 |
CN110192526B (zh) * | 2019-06-28 | 2022-06-07 | 大连大学 | 一种蓝莓单倍体的培养方法 |
US20220290106A1 (en) | 2019-07-10 | 2022-09-15 | Osaka University | Method for Promoting Cell Proliferation, and Method for Preparing Cell Cluster |
TWI724528B (zh) * | 2019-09-04 | 2021-04-11 | 三顧股份有限公司 | 高增生活性的3d結構細胞球體、其製造方法與用途 |
RU2728266C1 (ru) * | 2019-09-27 | 2020-07-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) | Способ культивирования клеток злокачественных лимфоидных опухолей |
CN110885873A (zh) * | 2019-10-22 | 2020-03-17 | 中秀科技股份有限公司 | 一种用于血培养瓶生产的试剂及血培养瓶生产工艺 |
JP7493713B2 (ja) | 2019-10-31 | 2024-06-03 | 国立大学法人東京工業大学 | 浮遊培養用培地添加剤、培地組成物及び培養方法 |
CN112760285A (zh) * | 2019-11-04 | 2021-05-07 | 北京基石生命科技有限公司 | 一种泌尿肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法 |
CN112760287A (zh) * | 2019-11-04 | 2021-05-07 | 北京基石生命科技有限公司 | 一种用于培养泌尿肿瘤实体瘤原代细胞的培养基 |
CN111621479A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-09-04 | 北京基石生命科技有限公司 | 一种用于培养妇科肿瘤原代细胞的培养基 |
CN111621478A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-09-04 | 北京基石生命科技有限公司 | 一种妇科肿瘤原代细胞的培养方法 |
CN110872572B (zh) * | 2019-11-27 | 2023-02-14 | 华南理工大学 | 一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养的效率的方法 |
MX2022007265A (es) | 2019-12-20 | 2022-09-09 | Nuevolution As | Compuestos activos frente a receptores nucleares. |
CN111190003A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-05-22 | 吉林省富生医疗器械有限公司 | 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其制备方法 |
US11780843B2 (en) | 2020-03-31 | 2023-10-10 | Nuevolution A/S | Compounds active towards nuclear receptors |
EP4126875A1 (en) | 2020-03-31 | 2023-02-08 | Nuevolution A/S | Compounds active towards nuclear receptors |
JPWO2021230274A1 (ja) * | 2020-05-12 | 2021-11-18 | ||
WO2022045201A1 (ja) * | 2020-08-27 | 2022-03-03 | 株式会社カネカ | 接着性細胞を組織から効率的に製造する方法 |
CN112481202B (zh) * | 2020-11-30 | 2022-11-15 | 深圳博雅感知药业有限公司 | 血小板裂解物无血清分离培养脐带间充质干细胞的方法 |
CN112608892B (zh) * | 2020-12-25 | 2023-11-14 | 深圳博雅感知药业有限公司 | 血小板裂解物用于无血清分离和传代培养脐带间充质干细胞的方法 |
CN112941036B (zh) * | 2021-02-08 | 2023-06-09 | 吉林惠康生物药业有限公司 | 一种提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法 |
CN112961821B (zh) * | 2021-02-24 | 2023-05-30 | 四川大学华西医院 | 三维培养血管内皮细胞的方法 |
US20230227773A1 (en) * | 2021-03-31 | 2023-07-20 | Resonac Corporation | Culture Manufacturing Method and Cell Harvest Method |
CN116007821A (zh) * | 2021-10-22 | 2023-04-25 | 华为技术有限公司 | 电容式力传感器、检测设备所承受外力的测量方法 |
CN114668075A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-06-28 | 四川农业大学 | 一种参麦须根多糖颗粒剂及其制备方法与应用 |
WO2024030482A1 (en) * | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Lundquist Institute For Biomedical Innovation At Harbor-Ucla Medical Center | Preparation and use of functional human tissues |
CN116200451B (zh) * | 2022-11-21 | 2023-08-01 | 浙江省肿瘤医院 | 用于ptc药敏检测的试剂混合物及其混合方法和用途 |
CN117126799B (zh) * | 2023-10-26 | 2024-01-26 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用 |
Family Cites Families (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6255077A (ja) * | 1985-09-03 | 1987-03-10 | Gakken Co Ltd | 植物細胞培養法 |
JPS62171680A (ja) | 1986-01-25 | 1987-07-28 | Nitta Zerachin Kk | 動物細胞培養法 |
JPH07100029B2 (ja) | 1987-02-26 | 1995-11-01 | 雪印乳業株式会社 | 付着依存性動物正常細胞の包埋培養法 |
JPH0823893A (ja) | 1994-07-14 | 1996-01-30 | Sanei Gen F F I Inc | 粒状食品入りゾル状食品の製造法 |
JPH08140673A (ja) * | 1994-11-17 | 1996-06-04 | W R Grace & Co | スフェロイドの作製方法 |
US6372494B1 (en) * | 1999-05-14 | 2002-04-16 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Methods of making conditioned cell culture medium compositions |
JP3553858B2 (ja) | 1999-08-25 | 2004-08-11 | 東洋紡績株式会社 | 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール |
JP3563330B2 (ja) * | 2000-07-10 | 2004-09-08 | 三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 | 粒状食品入り酸性ゾル状食品及びその製造法 |
US20030232430A1 (en) * | 2001-11-26 | 2003-12-18 | Advanced Cell Technology | Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells |
JP4040948B2 (ja) | 2002-10-11 | 2008-01-30 | 三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 | 飲料及びその製造方法 |
JP2004236553A (ja) | 2003-02-05 | 2004-08-26 | Hitachi Ltd | マイクロキャリア並びにこれを使用した細胞培養装置及び細胞培養方法 |
JP4439221B2 (ja) | 2003-08-14 | 2010-03-24 | メビオール株式会社 | 熱可逆ハイドロゲル形成性組成物 |
US20050059150A1 (en) | 2003-09-17 | 2005-03-17 | Becton, Dickinson And Company | Environments that maintain function of primary liver cells |
RU2267532C1 (ru) * | 2004-06-25 | 2006-01-10 | Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН | Клеточная линия а4 т-лимфобластного лейкоза человека, используемая для скрининга противоопухолевых препаратов |
JP2006254832A (ja) * | 2005-03-18 | 2006-09-28 | Sanei Gen Ffi Inc | 固形培地 |
CN101233226B (zh) * | 2005-06-22 | 2017-08-11 | 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 | 人胚胎干细胞的悬浮培养物 |
WO2008003320A2 (en) * | 2006-07-05 | 2008-01-10 | Region Midtjylland | Three-dimensional cell scaffolds |
JP4866162B2 (ja) | 2006-07-06 | 2012-02-01 | 倉敷紡績株式会社 | 抗がん作用の評価方法 |
JP2008061609A (ja) | 2006-09-08 | 2008-03-21 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 細胞培養容器の製造方法および細胞培養容器。 |
US8231921B2 (en) * | 2006-12-15 | 2012-07-31 | Cp Kelco U.S., Inc. | High performance gellan gums and methods for production thereof |
JP5171146B2 (ja) | 2007-07-27 | 2013-03-27 | 学校法人 関西大学 | 温度応答性を有する生分解性ポリマー及びその製造方法 |
JP2009050194A (ja) | 2007-08-27 | 2009-03-12 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 細胞凝集塊形成培養用容器 |
JP2011024423A (ja) * | 2008-06-04 | 2011-02-10 | Masayuki Ishihara | 微粒子細胞担体及びそれを含む細胞導入システム及び細胞培養システム |
EP2138571B1 (en) * | 2008-06-26 | 2017-04-12 | SpheroTec GmbH | Process for the preparation of multicellular spheroids |
JP5316983B2 (ja) * | 2008-08-13 | 2013-10-16 | 学校法人早稲田大学 | 微生物の単離培養方法及び培養キット |
RU2555538C2 (ru) | 2008-11-20 | 2015-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Культура плюрипотентных стволовых клеток на микроносителях |
KR101370222B1 (ko) | 2009-01-08 | 2014-03-05 | 가부시키가이샤 히타치세이사쿠쇼 | 동물 간 세포의 배양 방법 |
US9150829B2 (en) * | 2009-03-20 | 2015-10-06 | Agency For Science, Technoloy And Research | Culture of pluripotent and multipotent cells on microcarriers |
CN101564121B (zh) * | 2009-06-08 | 2012-07-04 | 浙江帝斯曼中肯生物科技有限公司 | 用于制备悬浮饮料的复合食品胶及由其制得的悬浮饮料 |
KR101674517B1 (ko) * | 2009-06-30 | 2016-11-09 | 가부시키가이샤 가네카 | 혈액 성분의 분리 시스템, 분리재 |
JP5734985B2 (ja) * | 2009-09-17 | 2015-06-17 | バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニムBaxter Healthcare SA | ヒアルロニダーゼおよび免疫グロブリンの安定な共製剤およびそれらの使用方法 |
WO2011073912A2 (en) * | 2009-12-15 | 2011-06-23 | Braun Gmbh | Brush section for an electric toothbrush |
CN102382792B (zh) * | 2010-08-31 | 2013-03-13 | 国家纳米科学中心 | 一种选择性损伤培养细胞的方法 |
JP5889523B2 (ja) | 2010-09-21 | 2016-03-22 | 国立大学法人大阪大学 | スフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法 |
JP5905194B2 (ja) * | 2010-11-18 | 2016-04-20 | 大日本印刷株式会社 | 糸状浮遊細胞パターニング基材 |
CN102187812B (zh) * | 2011-03-24 | 2012-11-07 | 广东农垦热带作物科学研究所 | 利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系的方法 |
JP2012249547A (ja) | 2011-05-31 | 2012-12-20 | Oji Holdings Corp | 細胞培養用基材及びその製造方法 |
DK2878664T3 (en) * | 2012-07-24 | 2018-11-05 | Nissan Chemical Corp | CULTURE MEDIUM COMPOSITION AND PROCEDURE FOR CULTIVATING CELLS OR TISSUE USING THE COMPOSITION |
TWI612135B (zh) * | 2012-08-23 | 2018-01-21 | 日產化學工業股份有限公司 | 動物細胞用培養基之製造方法、動物細胞用培養基、蛋白質的製造方法、及促進培養中的動物細胞的蛋白質產生量的方法 |
US10519419B2 (en) * | 2014-01-23 | 2019-12-31 | Nissan Chemical Corporation | Method for producing culture medium composition |
WO2015111734A1 (ja) * | 2014-01-23 | 2015-07-30 | 日産化学工業株式会社 | 未分化性維持培養材料 |
CN107532143A (zh) * | 2015-04-16 | 2018-01-02 | 日产化学工业株式会社 | 培养基添加物及培养基组合物以及使用了它们的细胞或组织的培养方法 |
CN110691845A (zh) * | 2017-05-09 | 2020-01-14 | 公立大学法人名古屋市立大学 | 由多能干细胞制作肠道类器官的方法 |
US11530387B2 (en) * | 2017-11-16 | 2022-12-20 | Nissan Chemical Corporation | Method for inducing differentiation into and producing beige and white adipocytes |
-
2013
- 2013-07-24 DK DK13823078.4T patent/DK2878664T3/en active
- 2013-07-24 JP JP2014526955A patent/JP5629893B2/ja active Active
- 2013-07-24 RU RU2018129432A patent/RU2018129432A/ru not_active Application Discontinuation
- 2013-07-24 EP EP13823078.4A patent/EP2878664B1/en active Active
- 2013-07-24 TW TW102126429A patent/TWI627273B/zh active
- 2013-07-24 BR BR112015001620A patent/BR112015001620A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-07-24 KR KR1020217030224A patent/KR102458397B1/ko active IP Right Grant
- 2013-07-24 AU AU2013294057A patent/AU2013294057B2/en active Active
- 2013-07-24 TW TW107114254A patent/TWI662126B/zh active
- 2013-07-24 SG SG11201500512SA patent/SG11201500512SA/en unknown
- 2013-07-24 EP EP18182707.2A patent/EP3409761A1/en active Pending
- 2013-07-24 CN CN201810566122.5A patent/CN108753679A/zh active Pending
- 2013-07-24 RU RU2015106003A patent/RU2665793C2/ru active
- 2013-07-24 WO PCT/JP2013/070001 patent/WO2014017513A1/ja active Application Filing
- 2013-07-24 CN CN201380049416.6A patent/CN104640974B/zh active Active
- 2013-07-24 MY MYPI2015700183A patent/MY171710A/en unknown
- 2013-07-24 CN CN201810565102.6A patent/CN108795838B/zh active Active
- 2013-07-24 KR KR1020227036376A patent/KR20220147706A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-07-24 IL IL300460A patent/IL300460A/en unknown
- 2013-07-24 SG SG10201704503SA patent/SG10201704503SA/en unknown
- 2013-07-24 TW TW108115065A patent/TWI719468B/zh active
- 2013-07-24 CN CN201810566113.6A patent/CN108796028A/zh active Pending
- 2013-07-24 KR KR1020197034609A patent/KR102221113B1/ko active IP Right Grant
- 2013-07-24 KR KR1020157004433A patent/KR102054034B1/ko active IP Right Grant
- 2013-07-24 CN CN201810566112.1A patent/CN108753678A/zh active Pending
- 2013-07-24 CA CA2879624A patent/CA2879624C/en active Active
- 2013-07-24 KR KR1020217005249A patent/KR102306209B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-09-01 JP JP2014177554A patent/JP6270152B2/ja active Active
-
2015
- 2015-01-22 IL IL236878A patent/IL236878B/en active IP Right Grant
- 2015-02-20 ZA ZA2015/01179A patent/ZA201501179B/en unknown
- 2015-11-16 HK HK15111261.2A patent/HK1210499A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2015-11-23 HK HK15111523.6A patent/HK1210807A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2017
- 2017-12-21 JP JP2017245611A patent/JP6542344B2/ja active Active
-
2019
- 2019-03-19 IL IL265470A patent/IL265470B/en active IP Right Grant
- 2019-06-12 JP JP2019109934A patent/JP6879517B2/ja active Active
- 2019-10-03 AU AU2019240670A patent/AU2019240670B2/en active Active
-
2020
- 2020-03-09 IL IL273159A patent/IL273159B2/en unknown
-
2021
- 2021-04-21 JP JP2021071861A patent/JP7113466B2/ja active Active
-
2022
- 2022-06-02 AU AU2022203805A patent/AU2022203805A1/en active Pending
- 2022-07-13 JP JP2022112627A patent/JP7319638B2/ja active Active
-
2023
- 2023-07-12 JP JP2023114436A patent/JP2023130476A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7319638B2 (ja) | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 | |
US11371013B2 (en) | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof | |
WO2015111686A1 (ja) | 培地組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230810 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240618 |