KR102068665B1

KR102068665B1 - 세포 배양용 지지체, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 세포 배양 방법

Info

Publication number: KR102068665B1
Application number: KR1020170177492A
Authority: KR
Inventors: 홍수린; 최용수; 김지나; 윤창구; 황정욱
Original assignee: 주식회사 에스피엘
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2020-01-21
Also published as: US20190194591A1; KR20190075690A; CN109943517A

Abstract

세포 배양용 지지체, 이를 제조하는 방법, 및 이를 이용한 세포 배양 방법을 제공한다. 이에 따르면, 세포의 부착률, 표면적 및 증식률이 향상되고, 세포의 탈착이 용이해져 세포 회수율을 높일 수 있다. 또한, 생리활성물질이 서방성으로 방출되어 세포 배양의 공정 단가를 낮출 수 있다.

Description

세포 배양용 지지체, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 세포 배양 방법{Support for culturing cell, method for the preparation thereof, and cell culture method using the same}

생리활성물질이 접합된 실리카 나노입자, 및 상기 실리카 나노입자가 접합된 고체 지지체를 포함하는 세포 배양용 지지체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 관한 것이다.

세포 배양은 바이오 분야의 연구에서 가장 기본이 되는 연구 방법으로서 생명체의 기능 연구뿐만 아니라 인체 질환을 연구하는데 매우 광범위하게 이용되고 있다. 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 방법은 폴리스티렌(polystyrene) 혹은 유리(glass)로 된 고체 지지체에서 세포를 배양하는 것이다.

세포 배양시 세포의 접착이 잘 일어나고 세포와 세포 사이에 충분한 공간이 확보되어 체액의 확산에 의해 산소나 영양분의 공급이 잘 일어나고 노폐물을 배출할 수 있도록 다공성 구조를 갖는 지지체들이 개발되고 있다(한국 특허공개번호 KR 10-2014-0063964 A).

또한, 세포 배양을 위해 배지에는 다양한 세포 성장 인자가 함유되어 있다. 그러나 이러한 세포 성장 인자는 세포 배양시 빠르게 고갈되어, 세포 배양 배지를 자주 교체해주어야 하는 문제가 있다.

따라서, 세포를 대량으로 배양하기 위해, 세포 배양을 위한 유효 인자들을 담지하고 서방성으로 방출할 수 있는 다공성 지지체를 개발할 필요가 있다.

세포 배양용 지지체를 제공한다.

세포 배양용 지지체를 제조하는 방법을 제공한다.

세포 배양용 지지체를 사용한 세포 배양 방법을 제공한다.

일 양상에 따르면, 열린 기공을 갖고 생리활성물질이 상기 기공의 내부에 담지된 실리카 나노입자; 및 상기 실리카 나노입자가 접합된 고체 지지체를 포함하는 세포 배양용 지지체가 제공된다.

용어 "세포 배양용 지지체"는 스캐폴드(Scaffold)라고도 하고, 세포 또는 조직의 시험관 내 배양, 생체 외 배양, 또는 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체를 말한다.

용어 "기공(stoma)"은 입자 내 존재하는 공간을 말한다. 상기 열린 기공은 입자의 내부로부터 표면으로 이어진 기공일 수 있다.

용어 "실리카(silica)"는 이산화규소(silicone dioxide, SiO₂)를 포함하는 화합물을 말한다. 실리카 나노입자는 실리카 전구체로부터 제조된 나노입자일 수 있다. 상기 실리카 전구체는 예를 들어 테트라메틸 오소실리케이트(tetramethyl orthosilicate), 테트라에틸 오소실리케이트(tetraethyl orthosilicate), 및 테트라프로필 오소실리케이트(tetrapropyl orthosilicate)일 수 있다.

용어 "나노입자(nano particle)"는 적어도 하나의 차원이 약 1 nm 내지 약 100 nm 인 입자를 말한다. 상기 나노입자는 구형, 막대형, 또는 무정형일 수 있다.

상기 실리카 나노입자는 열린 기공을 하나 이상 가질 수 있다. 상기 실리카 나노입자는 열린 기공을 갖는 다공성 형태일 수 있다.

상기 생리활성물질은 세포의 배양에 필요한 성장 인자, 또는 사이토카인일 수 있다. 상기 생리활성물질은 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor: bFGF), 뇌-유래 신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor: BDNF), 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial cell growth factor: VEGF), 인터류킨(interleukin: IL)-4, IL-6, IL-2, EGF, 상피세포 성장인자(epidermal growth factor: EGF), 줄기세포인자(stem cell factor: SCF), 인터페론 감마(interferon gamma: IFNγ), 및 과립구 대식세포 콜로니-자극인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다.

상기 실리카 나노입자의 기공 내부는 양전하를 갖는 기능기, 음전하를 갖는 기능기, 또는 소수성을 갖는 기능기로 개질된(modified) 것일 수 있다. 상기 기능기(functional group)는 탄화수소(예를 들어, 알칸, 알켄, 알킨, 벤젠 유도체, 및 톨루엔 유도체), 할로겐을 함유하는 기능기, 산소를 함유하는 기능기, 질소를 함유하는 기능기, 황을 함유하는 기능기, 인을 함유하는 기능기, 또는 붕소를 함유하는 기능기일 수 있다. 상기 양전하를 갖는 기능기의 예로는 -NH₃ ⁺ 기능기를 들 수 있고, 상기 음전하를 띠는 기능기의 예로는 -COO^- 기능기를 들 수 있으며, 상기 소수성을 갖는 기능기의 예로는 알킬(alkyl) 기능기를 들 수 있다.

상기 생리활성물질은 실리카 나노입자의 기공 내부의 기능기에 결합된 것일 수 있다. 상기 결합은 정전기적 결합, 화학적 결합, 소수성 결합, 또는 흡착일 수 있다. 양전하를 띠는 기능기로 개질된 실리카 나노입자는 음전하를 띠는 생리활성물질과 정전기적으로 결합함으로써 실리카 나노입자에 생리활성물질이 담지될 수 있다. 음전하를 띠는 기능기로 개질된 실리카 나노입자는 양전하를 띠는 생리활성물질과 정전기적으로 결합함으로써 생리활성물질이 실리카 나노입자에 담지될 수 있다. 소수성 기능기로 개질된 실리카 나노입자는 소수성 생리활성물질과 소수성 결합으로 결합함으로써 생리활성물질이 실리카 나노입자에 담지될 수 있다.

상기 실리카 나노입자는 pH 민감성 입자, 온도 민감성 입자, 또는 이들의 조합일 수 있다. pH, 온도, 또는 이들의 조합을 변경함으로써 실리카 나노입자에 담지된 약물이 방출될 수 있다. 예를 들어, 상기 실리카 나노입자는 산성 조건(약 pH = 2.0)에서 약물을 담지하고 중성 조건(약 pH = 7.0)에서 약물을 방출할 수 있다. 예를 들어, 상기 실리카 나노입자는 실온에서 약물을 담지하고 체온에서 약물을 방출할 수 있다. 따라서, 상기 실리카 나노입자는 pH, 온도, 또는 이들의 조합을 제어함으로써 약물의 담지 및 방출을 제어할 수 있다.

상기 생리활성물질은 실리카 나노입자로부터 서방성으로 방출될 수 있다. 생리활성물질이 실리카 나노입자로부터 서방성으로 방출되기 때문에, 생리활성물질이 빨리 고갈되지 않을 수 있다. 생리활성물질의 서방성 방출로 인해, 세포 배양 배지의 교체 주기가 증가하고, 세포 배양을 위한 공정 단가를 낮출 수 있다.

상기 실리카 나노입자는 세틸피리디늄 브로마이드(cetylpydinium bromide: CPB), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cethyltrimetylammonium bromide: CTAB), 또는 이들의 조합을 기반으로 하는 나노입자일 수 있다. 상기 실리카 나노입자의 구조를 이루는 계면활성제는 CPB, CTAB, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 실리카 나노입자의 직경은 약 50 nm 내지 약 3000 nm, 약 100 nm 내지 약 2000 nm, 약 150 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 900 nm, 약 300 nm 내지 약 900 nm, 약 300 nm 내지 약 800 nm, 약 300 nm 내지 약 700 nm, 약 300 nm 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 550 nm, 약 400 nm 내지 약 900 nm, 약 500 nm 내지 약 900 nm, 약 600 nm 내지 약 900 nm, 약 700 nm 내지 약 900 nm, 또는 약 750 nm 내지 약 900 nm일 수 있다.

상기 실리카 나노입자의 평균 직경은 약 100 nm 내지 약 2000 nm, 약 200 nm 내지 약 1500 nm, 약 300 nm 내지 약 1000 nm, 약 400 nm 내지 약 900 nm, 또는 약 450 nm 내지 약 850 nm일 수 있다.

상기 실리카 나노입자에서 기공의 직경은 약 1 nm 내지 약 100 nm, 약 3 nm내지 약 90 nm, 약 5 nm 내지 약 80 nm, 약 7 nm 내지 약 70 nm, 약 10 nm 내지 약 60 nm, 약 12 nm 내지 약 50 nm, 약 15 nm 내지 약 40 nm, 약 15 nm 내지 약 30 nm, 약 17 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 50 nm일 수 있다.

상기 실리카 나노입자는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 상기 접합은 이온결합 또는 소수성 상호작용일 수 있다. 예를 들어, 상기 실리카 나노입자는 고체 지지체에 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)으로 접합된다.

상기 고체 지지체는 비드(bead)일 수 있다. 상기 비드는 폴리스티렌(polystyrene), 아가로스, 메틸셀룰로스, 히알루로난(hyaluronan), 또는 이들의 조합을 포함하는 비드일 수 있다. 상기 고체 지지체는 구형, 타원형, 또는 불규칙적 형태를 가질 수 있다.

상기 고체 지지체는 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 마트리겔(matrigel), 겔라틴(gelatin), 라미닌(laminin), 헤파린(heparin), 폴리리신(poly-lysine), 세포외 기질(extracellular matix), 또는 이들의 조합으로 코팅된 것일 수 있다.

상기 고체 지지체 상의 실리카 나노입자의 밀도는 약 1,000개/㎟ 내지 약 500,000개/㎟, 약 2,000개/㎟ 내지 약 400,000개/㎟, 약 3,000개/㎟ 내지 약 300,000개/㎟, 약 4,000개/㎟ 내지 약 200,000개/㎟, 약 5,000개/㎟ 내지 약 100,000개/㎟, 약 6,000개/㎟ 내지 약 90,000개/㎟, 약 7,000개/㎟ 내지 약 80,000개/㎟, 약 8,000개/㎟ 내지 약 70,000개/㎟, 약 9,000개/㎟ 내지 약 60,000개/㎟, 약 10,000개/㎟ 내지 약 50,000개/㎟, 약 15,000개/㎟ 내지 약 40,000개/㎟, 약 20,000개/㎟ 내지 약 30,000개/㎟, 또는 약 25,000개/㎟ 내지 약 30,000개/㎟ 일 수 있다.

상기 세포 배양용 지지체는 멸균된 것일 수 있다. 상기 멸균은 고온 고압 하에서 멸균된 것일 수 있다.

다른 양상에 따르면, 실리카 전구체, 극성 용매, 비극성 용매, 이온성 계면활성제, 및 염기성 화합물을 포함하는 용액을 압력 용기에서 수열 처리하여 실리카 나노입자를 제조하는 단계;

상기 실리카 나노입자와 생리활성물질을 인큐베이션하여 상기 생리활성물질을 실리카 나노입자의 기공의 내부에 접합시키는 단계; 및

상기 생리활성물질이 접합된 실리카 나노입자를 고체 지지체에 접합시키는 단계를 포함하는 세포 배양용 지지체를 제조하는 방법이 제공된다.

상기 실리카, 나노입자, 생리활성물질, 접합, 고체 지지체, 및 세포 배양용 지지체는 전술한 바와 같다.

상기 방법은 실리카 전구체, 극성 용매, 비극성 용매, 이온성 계면활성제, 및 염기성 화합물을 포함하는 용액을 압력 용기에서 수열 처리하여 실리카 나노입자를 제조하는 단계를 포함한다.

상기 실리카 전구체로는 알콕시 실란(alkoxy silane) 화합물을 사용할 수 있다. 상기 실리카 전구체는 예를 들어, 테트라메틸 오소실리케이트(tetramethyl orthosilicate: TMOS), 테트라에틸 오소실리케이트(tetraethyl orthosilicate: TEOS), 테트라프로필 오소실리케이트(tetrapropyl orthosilicate: TPOS), 및 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 극성 용매로는 물, 알코올, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 알코올은 예를 들어, 프로판올(propanol), 부탄올(butanol), 펜탄올(pentanol), 헥산올(hexanol), 및 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 비극성 용매는 상기 극성 용매와 작용하여 에멀젼을 형성할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 비극성 용매로는 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 메틸시클로헥산(methylcyclohexane), 톨루엔(toluene), 헵탄(heptane), 옥탄(octane), 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 극성 용매와 비극성 용매의 사용량은 에멀젼을 구성하기에 충분한 정도라면 특별히 제한되지 않으며, 예들 들어 극성 용매와 비극성 용매를 약 0.5:1 내지 5:1, 또는 약 0.6:1 내지 3:1의 부피 비율로 사용할 수 있다.

상기 이온성 계면활성제는 상기 극성 용매와 비극성 용매 사이의 계면을 안정화시켜 에멀젼을 형성하고, 실리카 결합의 성장을 공간적으로 방해하여 기공 자기를 만드는 역할을 한다. 한편 계면활성제는 극성 머리 부분의 유효 면적(effective area)과 비극성 꼬리 부분의 길이 및 부피에 따라 다양한 구조의 미셀을 형성하게 되는데, 3차원 형태의 열린 기공 구조를 만들기 위해서는 계면활성제의 이러한 요소들을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 상기 계면활성제는 예를 들어, 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride), 세틸피리디늄 브로마이드(cetylpyridinium bromide), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimetylammoniumchloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimetylammonium bromide), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

상기 염기성 화합물은 실리카 전구체의 가수 분해와 축합 반응을 촉진하는 촉매로 작용할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 염기성 화합물로는 암모니아 수용액, 요소(urea) 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 염기성 화합물은 실리카 전구체 약 1 몰 당 0.1 내지 2 몰의 비율로 사용할 수 있다.

상기 수열 처리는 오토클레이브(autoclave)와 같이 밀폐된 압력 용기를 이용하여, 자체적으로 발생하는 압력을 조절하지 않으면서 수행할 수 있다. 상기 수열 처리의 온도는 실리카 전구체의 가수 분해 및 축합 반응이 이루어질 수 있는 범위라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 수열 처리는 약 50℃ 내지 약 250℃, 약 80℃ 내지 약 200℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃의 범위에서 진행할 수 있다.

상기 방법은 실리카 나노입자와 생리활성물질을 인큐베이션하여 상기 생리활성물질을 실리카 나노입자의 기공의 내부에 접합시키는 단계를 포함한다.

상기 생리활성물질을 실리카 나노입자에 접합시키는 단계는 생리활성물질이 용해된 용액에 상기 개질된 실리카를 투입하고 일정한 시간 동안 교반하는 형태로 수행할 수 있다. 이때, 교반하는 시간이 길어질수록 결합하는 생리활성물질의 양이 증가하는 경향을 보인다.

상기 생리활성물질이 접합된 실리카 나노입자를 고체 지지체에 접합시키는 단계를 포함한다.

상기 실리카 나노입자를 고체 지지체에 접합시키는 단계는 실리카 나노입자와 고체 지지체를 혼합하고 일정한 시간 동안 교반하는 형태로 수행할 수 있다. 이때, 교반하는 시간이 길어질수록 결합하는 실리카 나노입자의 양이 증가하는 경향을 보인다.

상기 방법은 상기 실리카 나노입자가 접합된 고체 지지체를 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있다.

다른 양상에 따르면, 일 양상에 따른 세포 배양용 지지체의 존재 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법이 제공된다.

상기 세포 배양용 지지체는 전술한 바와 같다.

상기 세포는 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 양, 소, 말, 원숭이, 침팬지, 또는 인간으로부터 유래된 세포일 수 있다. 상기 세포는 줄기 세포, 신경 세포, 면역 세포, 생식 세포, 피부 세포, 근육 세포, 혈액 세포, 지방 세포, 연골 세포, 상피 세포, 및 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

일 양상에 따른 세포 배양용 지지체, 이를 제조하는 방법, 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 따르면, 세포의 부착률, 표면적 및 증식률이 향상되고, 세포의 탈착이 용이해져 세포 회수율을 높일 수 있다. 또한, 생리활성물질이 서방성으로 방출되어 세포 배양의 공정 단가를 낮출 수 있다.

도 1a 및 도 1b은 일 양상에 따라 제조된 실리카 나노입자들의 FE-SEM 이미지이다(도 1a: CPB 기반 실리카 나노입자, 도 1b: CTAB 기반 실리카 나노입자).
도 2a는 일 양상에 따라 제조된 스캐폴드의 모식도이고, 도 2b 내지 도 2d는 Col-PS-OSN-004 내지 Col-PS-OSN-006의 스캐폴드 및 스캐폴드 내 실리카 나노입자의 FE-SEM 이미지이다(좌: 스캐폴드, 우: 실리카 나노입자).
도 3은 Col-PS-OSN-001 내지 Col-PS-OSN-006의 스캐폴드의 멸균 전후의 FE-SEM 이미지이다.
도 4a는 인큐베이션 시간에 따라 담지된 bFGF의 흡광도(임의 단위)를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실리카 나노입자의 농도(㎍/mL)에 따른 세포 생존율(대조군 대비 %)를 나타내는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 세포 배양 기간 동안 마이크로 비드에 부착하여 증식하는 AD-MSC의 총 세포의 수(x10⁶ 개) 및 글루코스의 농도를 나타내는 그래프이고, 도 6c는 배양 시간(일)에 따른 마이크로비드(PS: 폴리스티렌 비드, OSN: 폴리스티렌-OSN 비드)에 부착된 세포의 이미지(x100)이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 실리카 나노입자의 제조

(1) 세틸피리디늄 브로마이드 기반 실리카 나노입자의 제조

1 g의 세틸피리디늄 브로마이드(cetylpydinium bromide: CPB)(Sigma-Aldrich), 0.6 g의 우레아(Sigma-Aldrich), 및 30 ㎖의 증류수를 혼합하고 약 10분간 교반하여 제1 용액을 준비하였다. 2.5 g의 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate: TEOS)(Sigma-Aldrich), 1.5 ㎖의 1-펜탄올(pentanol)(삼전화학), 및 30 ㎖의 시클로헥산(cyclohexane)(Sigma-Aldrich)을 혼합하고 약 10분간 교반하여 제2 용액을 준비하였다.

준비된 제1 용액과 제2 용액을 혼합하고, 실온에서 약 30분 동안 교반하였다. 교반한 용액을 테프론 용기에 넣고, 수열합성반응기에서 약 120℃ 및 300 rpm으로 약 4시간 동안 수열 처리하였다. 그후 반응물을 분별 깔대기에 붓고 밤새 두었다. 깔대기에서 분리된 3개의 층 중 가운데 층만 분리하였다. 분리된 용액에 동량의 증류수를 가하고, 12,000 rpm의 속도로 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 펠렛에 에탄올과 아세톤의 1:1 혼합물을 가하였다. 반응물을 12,000 rpm의 속도로 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 펠렛을 상온에서 잘 건조시켰다. 건조된 입자는 막자사발에 갈고, 약 550℃에서 약 6 시간 동안 소성(calcination)하였다.

제조된 실리카 나노입자는 전계방충 주사 전자 현미경(field emission scanning electron microscope: FE-SEM)으로 입자 크기 및 기공 크기를 확인하였다. 나노입자의 FE-SEM 이미지를 도 1a에 나타내었다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 입자의 크기는 약 300 nm 내지 약 550 nm이고, 입자의 평균 직경은 약 450 nm였다. 또한, 기공의 크기는 약 15 nm 내지 약 30 nm였다. 평균 직경 약 450 nm의 실리카 나노입자는 열린 기공을 갖는 실리카 나노입자(open porous silica nanoparticle: OSN)인 것으로 확인하였다.

(2) 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 기반 실리카 나노입자의 제조

0.3 g의 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cethyltrimetylammonium bromide: CTAB)(Sigma-Aldrich), 0.18 g의 우레아(Sigma-Aldrich), 및 30 ㎖의 증류수를 혼합하고 약 10분간 교반하여 제1 용액을 준비하였다. 1.5 g의 TEOS(Sigma-Aldrich), 1.8 ㎖의 1-펜탄올(삼전화학), 및 30 ㎖의 시클로헥산(Sigma-Aldrich)을 혼합하고 약 10분간 교반하여 제2 용액을 준비하였다.

준비된 제1 용액 및 제2 용액을 사용하고, 1.(1)에 기재된 방법과 동일한 방법으로 실리카 나노입자를 제조하였다. 제조된 실리카 나노입자는 FE-SEM으로 입자 크기 및 기공 크기를 확인하였다. 나노입자의 FE-SEM 이미지를 도 1b에 나타내었다. 도 1b에 나타난 바와 같이, 입자의 크기는 약 750 nm 내지 약 900 nm이고, 입자의 평균 직경은 약 850 nm였다. 또한, 기공의 크기는 약 20 nm 내지 약 50 nm였다. 평균 직경 약 850 nm의 실리카 나노입자는 열린 기공을 갖는 실리카 나노입자(OSN)인 것으로 확인하였다.

2. 서방형 스캐폴드의 제조 및 최적화 조건의 설정

1.에서 제조한 실리카 나노입자를 -NH₃ ⁺의 작용기로 개질하였다.

구체적으로, 20 mg의 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide: NHS)를 8.7 ㎖의 증류수에 용해시켜 NHS 용액을 준비하였다. 60 mg의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide: EDC)를 15.67 ㎖의 증류수에 용해시켜 EDC 용액을 준비하였다. 준비된 NHS 용액과 EDC 용액을 혼합하고, 1.(2)에 기재된 바와 같이 제조된 0.5 g의 CTAB 기반 OSN을 혼합물에 가하였다. 반응물을 실온에서 약 2시간 동안 진탕하여 나노입자에 카르보디이미드를 커플링하였다. 반응물을 원심분리하여, 나노입자에 결합된 OSN, NHS, 및 EDC 외의 다른 화합물을 제거하였다.

5 g의 OSN, 증류수, 및 5 g의 콜라겐 코팅 폴리스티렌(collagen coated polystyrene: "Col-PS") 비드(Sigma-Aldrich)을 혼합하고, 혼합물을 2 시간 동안 진탕하여 스캐폴드를 제조하였다. 혼합물을 매쉬 필터(mash filter)로 걸러 뭉친 실리카 나노입자를 제거하였다. 준비된 스캐폴드에 1000 ㎖의 증류수를 가하고, 진공 여과(vacuum filteration)를 수행하였다. 스캐폴드는 12,000 rpm의 속도로 15분 동안 원심분리하여 세척(3회)하고, 상온에서 잘 건조시켰다.

Col-PS 비드와 OSN의 양을 달리하면서 동일한 방법으로 스캐폴드를 제조하였다. 콜라겐 코팅된 폴리스티렌 비드에 실리카 나노입자가 접합된 스캐폴드를 "Col-PS-OSN"으로 명명하였다. Col-PS 비드와 OSN의 비율을 달리하여 제조한 스캐폴드를 하기 표 1과 같이 명명하였다.

Col-PS 비드(g)	OSN(g)	Col-PS 비드:OSN	명칭
5	5	1:1	Col-PS-OSN-001
5	2.5	1:0.5	Col-PS-OSN-002
5	1.5	1:0.3	Col-PS-OSN-003
5	0.5	1:0.1	Col-PS-OSN-004
5	0.05	1:0.01	Col-PS-OSN-005
5	0.005	1:0.001	Col-PS-OSN-006

준비된 스캐폴드를 FE-SEM으로 확인하였다. 스캐폴드의 모식도를 도 2a에 나타내고, Col-PS-OSN-004 내지 Col-PS-OSN-006의 스캐폴드 및 스캐폴드에 접합된 실리카 나노입자의 이미지를 각각 도 2b 내지 도 2d에 나타내었다. 도 2a 내지 도 2c에 나타난 바와 같이, Col-PS-OSN-004는 비드 위에 약 35168개의 실리카 나노입자가 접합되었고, Col-PS-OSN-005는 비드 위에 약 33438개의 실리카 나노입자가 접합되었고, Col-PS-OSN-006은 비드 위에 약 19785개의 실리카 나노입자가 접합되었다.

3. 스캐폴드의 멸균

2.에 기재된 바와 같이 제작된 스캐폴드를 멸균시켜 멸균 전후 비드에 접합된 실리카 나노입자의 갯수를 확인하였다.

구체적으로, Col-PS-OSN-001 내지 Col-PS-OSN-006의 스캐폴드를 0.25 g/ml 농도로 생리식염수에 부유 시키고 멸균 용기에 담아 오토클레이브(Labo Atoclave Sanyo)에서 121℃ 온도 조건을 설정하고 15 분간 멸균하였다. 멸균 전후 스캐폴드를 FE-SEM으로 확인하고, 그 이미지를 도 3에 나타내었다.

또한, 스캐폴드에서 멸균 전후 비드에 접합된 실리카 나노입자의 갯수를 하기 표 2에 나타내었다.

스캐폴드	멸균 전	멸균 후	비고
Col-PS-OSN-001	약 132240개	약 119952개	약 9% 증가
Col-PS-OSN-002	약 51080개	약 71442개	약 23% 증가
Col-PS-OSN-003	약 46303개	약 46413개	약 7% 증가
Col-PS-OSN-004	약 35168개	약 27355개	약 22% 감소
Col-PS-OSN-005	약 33438개	약 14207개	약 58% 감소
Col-PS-OSN-006	약 19785개	약 4612개	약 77% 감소

4. 스캐폴드에 생리활성인자의 접합

3.에 기재된 바와 같이 준비된 Col-PS-OSN-004(Col-PS 비드:OSN=1:0.1)를 -NH₃ ⁺의 작용기로 개질하고 음전하를 띠는 약물을 담지하였다.

구체적으로, 약 1 g의 실리카 나노입자를 약 80 mL의 톨루엔(Sigma-Aldrich)에 현탁시키고, 약 4 mL의 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS)(Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 이 용액을 약 110℃에서 약 24시간 동안 교반한 뒤, 에탄올로 세척하면서 원심분리하여 기능기가 결합된 실리카 나노입자를 수득하였다. 한편, 결합된 기능기가 좀 더 뚜렷하게 양전하를 나타내게 하기 위하여, 기능기가 결합된 실리카 나노입자 약 0.3 g을 에탄올 약 20 mL에 현탁시킨 후 약 0.1 M의 염산 수용액을 이용하여 산성 조건으로 처리하는 과정을 추가로 실시하였다.

이어서, 상기 용액에 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor: bFGF, CHAMEDITECH)을 첨가하고, 실온에서 약 4시간 동안 교반한 다음 원심분리하여 약물이 담지된 실리카 나노입자를 수득하였다.

약물의 담지량은 약물이 용해된 에탄올 용액의 UV 흡광도(파장: 288 nm 내지 290 nm)를 담지 전후에 측정하여 용액에서 감지된 약물의 농도를 관찰함으로써 계산하였다. 인큐베이션 시간에 따른 흡광도(임의 단위)를 도 4a에 나타내었다. 또한, 시료 내 bFGF의 양(mg), 담지된 bFGF의 양(mg), bFGF의 담지 효율(%), 및 OSN의 g 당 담지 효율(%)을 하기 표 3에 나타내었다.

시료 내 bFGF 양(mg)	담지된 bFGF 양 (mg)	bFGF의 담지 효율(%)	건조 OSN 무게(mg)	OSN g 당 담지 효율(%)
0.637	0.3	47	6	5
0.654	0.32	49	5	6.44
0.626	0.3	48	5	6

도 4a 및 표 3에 나타난 바와 같이, OSN을 이용하여 bFGF를 담지한 결과, bFGF의 담지 효율은 약 48%이고 OSN의 g 당 담지 효율은 약 6%임을 확인하였다. 따라서, 초기 반응하는 반응 물질의 양에 따라 담지 효율을 향상시킬 수 있었다.

또한, 약물의 방출 실험을 위해, PBS(phosphate buffered saline) 수용액 약 2 ㎖에 약 10 mg의 OSN을 첨가하고, 용액의 온도를 36.5℃로 유지하면서 교반하였다. 1 시간 간격으로 상기 용액에서 약 1 ㎖의 시료를 채취한 후 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 이후, 상층액의 UV 흡광도(파장: 288 nm 내지 290 nm)를 측정하여 방출된 약물의 비율을 계산하였다.

시간에 따른 흡광도를 하기 표 4에 나타내고, 약물 방출율(%)를 도 4b에 나타내었다.

시간(시)	흡광도(임의 단위)
0	0.062
1	0.568
2	0.578
3	0.557
4	0.569
5	0.546
6	0.572
7	0.567

표 4 및 도 4b에 나타난 바와 같이, 담지된 bFGF는 빠른 시간내에 OSN으로부터 방출되는 것을 확인하였다.

5. 스캐폴드를 이용한 세포 배양 효과

(1) 세포독성의 확인

3.에 기재된 바와 같이 준비된 Col-PS-OSN-004(Col-PS 비드:OSN=1:0.1)의 핵심 성분인 실리카나노입자(OSN) 자체 세포 독성을 확인해보았다.

세포독성은 측정은 WST-1(EZ cytox, Dogenbio) 분석방법으로 확인하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 세포 독성 측정을 위해 지방 유래 중간엽 줄기세포를 96웰 플레이트(SPL)의 1웰당 2,000개씩 접종 하고 각 실리카나노입자를 0.002 내지 0.8 ㎍/ml 농도로 첨가 한 후 세포 배양액이 최종 200 ㎕가 되도록 조정 하였다. 이 96웰 플레이트는 37℃의 온도로 설정된 5% CO₂인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 세포 증식도를 측정하기 위하여 각 well에 WST-1 시약을 전체 배양액의 10%인 20 ㎕를 첨가하고 37℃ 및 5% CO₂인큐베이터에서 2시간 반응 후 microplate reader(BioTek instruments)를 이용하여 흡광도(450 nm)를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 이용하고 실리카 나노입자가 첨가되지 않는 96웰의 값을 기준으로 하여 세포 생존율을 백분율로 계산하였다. 세포 생존율을 세로축으로, 실리카 나노입자 농도를 가로축으로 하여 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 약 200 ㎍/㎖ 이상의 OSN에서 세포 성장이 저해(<50%)되는 것을 확인하였다.

(2) 스캐폴드를 이용한 세포 배양

3.에 기재된 바와 같이 준비된 PS-OSN과 대조군인 콜라겐이 코팅된 폴리스티렌 마이크로 비드(Col-PS)(PALL Co.)를 이용하여 인간 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포의 세포 증식 효과를 비교하였다.

우선, 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose derived mesenchymal stem cell: AD-MSC, 분당차병원)를 준비하였다. 유리로 제작된 스피너 플라스크(250 ml scale Glass Spinner Flask, Corning)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS, Gibco)과 10 ng/㎖의 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor: bFGF, CHAmeditech)가 포함된 α-MEM 배지(Hyclone)를 100 ㎖를 가한 후, 각 마이크로 비드를 0.02 g/㎖의 농도로 넣어주었다. 각 마이크로 비드 단위면적(㎠) 당 3,000개에 해당되는 지방 유래 중간엽 줄기세포(2.1x10⁶개)를 접종하였다. 그 후, 마이크로 비드의 표면에서 세포가 잘 결합하도록 37℃에서 약 2시간 동안 방치한 후, 마이크로 비드와 세포가 잘 부착되고 분산되도록 임펠러(impeller)를 사용하여 10분 정치, 1분 작동 주기로 35 rpm에서 세포를 배양하였다. 배양은 총 6일간 진행되었고 4일째에 전체 배지 교체를 1회 수행하였다.

세포 배양 기간 동안 매일 1 ㎖의 세포 배양액을 회수하고, 원심분리하였다. 상등액인 배지를 제거하고 침전된 세포에 동량의 생리식염수를 가하여 2회 세척하였다. 동량의 트립신-EDTA를 첨가하고 37℃에서 5 분간 반응시킨 후, 20 ㎛의 포어를 가진 스트레이너 필터를 사용하여 마이크로 비드를 제거하고 세포 부유액을 회수하였다. 회수된 세포 부유액은 1,500 rpm에서 5 분간 원심분리하고 얻어진 세포 침전물은 1 ㎖의 생리식염수로 재현탁하여 헤모사이토미터를 사용하여 세포수를 측정하였다. 세포 배양 기간 동안 마이크로 비드에 부착하여 증식한 지방 유래 중간엽 줄기세포의 총 세포 수를 도 6a에 나타내었다. 도 6a에 나타난 바와 같이, PS 마이크로 비드는 세포 배양 시간이 지날수록 증식하여 6일째에 4.12x10⁶ 개/㎖ ± 0.1 개로 증식하였고, PS-OSN 마이크로 비드에서는 배양 6일째에 6.77x10⁶ 개/㎖ ± 0.05 개로 증식하였음이 확인되었다. 6일간이 배양 결과 PS-OSN 마이크로 비드가 PS 마이크로 비드에 비해 약 64.5% 높은 세포 증식률을 보여주었다.

한편, 배양 기간 내 매일 1 ㎖씩 세포 배양액 회수하고, 회수 후 즉시 글루코스 농도 분석 키트(AM201, Asan pharmaceutical)를 사용하여 배양 배지 내 글루코스의 농도를 측정하였다. 세포 배양 기간 동안 배지 내 글루코스의 농도(mg/㎖)를 도 6b에 나타내었다. 도 6b에 나타난 바와 같이, 배양 4일째까지의 글루코스 소비 기울기는 PS 마이크로 비드의 경우 -0.15인 반면, PS-OSN 마이크로 비드의 경우 -0.19로 약 29% 높은 글루코스 소비량을 보여주었으며 상대적으로 높은 소비량을 보여준 PS-OSN 마이크로 비드에서 약 29% 높은 증식 세포수가 관찰되었다. 배양 4일에서 6일까지의 글루코스 소비 기울기는 PS 마이크로 비드의 경우 -0.24인 반면, PS-OSN 마이크로 비드의 경우 -0.39로 약 67% 높은 글루코스 소비량을 보여주었다. 배양 4일에서 6일까지의 기간에서 상대적으로 높은 소비량을 보여준 PS-OSN 마이크로 비드에서의 지방 유래 중간엽 줄기세포의 증식은 이 기간 동안 약 4배 높은 증식 배율이 측정되었다.

또한, 배양 기간 내 매일 1 ㎖씩 세포 배양액 회수하고, 회수된 세포 배양액에 1000 mg/㎖의 칼세인-AM(17783, Sigma)(생리식염수 중)을 1 ㎕ 첨가하고, 37℃에서 10 분간 반응한 후 형광현미경으로 관찰하였다. 세포의 이미지(x100)를 도 6c에 나타내었다(좌: Col-PS 비드, 우: Col-PS-OSN 비드). 도 6c에 나타난 바와 같이, 단일 세포로 부착되지 않은 세포가 일부 관찰된 PS 마이크로 비드에 비해 PS-OSN 마이크로 비드에서는 부착된 형태의 세포가 관찰되었다.

따라서, 지방 유래 중간엽 줄기세포에 배양에 대해 폴리스티렌-OSN 마이크로 비드(PS-OSN)는 기존 상용화된 콜라겐-폴리스티렌 마이크로 비드(PS)와 비교하였을 때 동일한 배양 결과가 관찰되었으며, 이로 인해 지방 유래 중간엽 줄기 세포 대하여 배양 독성이 없음이 확인되었다. 그러므로, 성장인자 등의 물질 담지 능력을 갖춘 OSN의 장점을 이용하여 성체 중간엽 줄기세포의 대량 배양 공정 개발로 적용이 가능하다.

Claims

열린 기공을 갖고 생리활성물질이 상기 기공의 내부에 담지된 실리카 나노입자; 및
상기 실리카 나노입자가 접합된 비드를 포함하고,
상기 실리카 나노입자는 상기 비드의 표면 상에 접합되는 것이고,
상기 생리활성물질은 실리카 나노입자로부터 서방성으로 방출되는 것인 세포 배양용 지지체.
청구항 1에 있어서, 상기 생리활성물질은 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor: bFGF), 뇌-유래 신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor: BDNF), 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial cell growth factor: VEGF), 인터류킨(interleukin: IL)-4, IL-6, IL-2, EGF, 상피세포 성장인자(epidermal growth factor: EGF), 줄기세포인자(stem cell factor: SCF), 인터페론 감마(interferon gamma: IFNγ), 및 과립구 대식세포 콜로니-자극인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 세포 배양용 지지체.
청구항 1에 있어서, 상기 실리카 나노입자의 기공 내부는 양전하, 음전하, 또는 소수성을 갖는 기능기로 개질되고, 상기 생리활성물질은 상기 기능기에 결합된 것인 세포 배양용 지지체.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 실리카 나노입자는 세틸피리디늄 브로마이드(cetylpydinium bromide: CPB), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cethyltrimetylammonium bromide: CTAB), 또는 이들의 조합을 기반으로 하는 것인 세포 배양용 지지체.
청구항 1에 있어서, 상기 실리카 나노입자는 고체 지지체에 소수성 상호작용으로 접합된 것인 세포 배양용 지지체.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 비드는 폴리스티렌 비드인 것인 세포 배양용 지지체.
청구항 1에 있어서, 상기 비드는 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 마트리겔(matrigel), 겔라틴(gelatin), 라미닌(laminin), 헤파린(heparin), 폴리리신(poly-lysine), 세포외 기질(extracellular matix), 또는 이들의 조합으로 코팅된 것인 세포 배양용 지지체.
청구항 1에 있어서, 상기 비드 상의 실리카 나노입자의 밀도는 1,000개/㎟ 내지 500,000개/㎟인 것인 세포 배양용 지지체.
청구항 1에 있어서, 상기 세포 배양용 지지체는 멸균된 것인 세포 배양용 지지체.
실리카 전구체, 극성 용매, 비극성 용매, 이온성 계면활성제, 및 염기성 화합물을 포함하는 용액을 압력 용기에서 수열 처리하여 실리카 나노입자를 제조하는 단계;
상기 실리카 나노입자와 생리활성물질을 인큐베이션하여 상기 생리활성물질을 실리카 나노입자의 기공의 내부에 접합시키는 단계; 및
상기 생리활성물질이 접합된 실리카 나노입자를 비드의 표면 상에 접합시키는 단계를 포함하는 세포 배양용 지지체를 제조하는 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 방법은 상기 실리카 나노입자가 접합된 비드를 멸균하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 실리카 전구체는 테트라메틸 오소실리케이트, 테트라에틸 오소실리케이트, 테트라프로필 오소실리케이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 극성 용매는 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 비극성 용매는 헥산, 시클로헥산, 메틸시클로헥산, 톨루엔, 헵탄, 옥탄, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 이온성 계면활성제는 세틸피리디늄 클로라이드, 세틸피리디늄 브로마이드, 세틸트리메틸암모늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 염기성 화합물은 암모니아 수용액, 요소 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
청구항 1의 세포 배양용 지지체의 존재 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법.