KR20150038190A - 배지 조성물 및 당해 조성물을 사용한 세포 또는 조직의 배양 방법 - Google Patents

배지 조성물 및 당해 조성물을 사용한 세포 또는 조직의 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 부정형의 구조체를 액체 배지 중에서 형성하고, 당해 구조체가 당해 용액 중에서 균일하게 분산되어, 당해 용액의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 실질적으로 유지함으로써, 그 침강을 방지하는 효과를 갖는 배지 조성물을 이용하여, 세포 및/또는 조직을 부유 상태로 배양시키는 세포 및/또는 조직의 배양 방법 등을 제공한다.

Description

배지 조성물 및 당해 조성물을 사용한 세포 또는 조직의 배양 방법{CULTURE MEDIUM COMPOSITION, AND METHOD FOR CULTURING CELL OR TISSUE USING SAID COMPOSITION}
본 발명은, 세포 또는 조직을 부유시키는 (suspended) 것을 가능하게 하는 구조체를 함유하는 배지 조성물, 및 당해 배지 조성물을 사용하는 세포 또는 조직의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 배지 조성물 및 그것을 사용한 세포 배양 방법은, 동식물 세포 및/또는 조직을 특히 부유 상태로 배양할 때에 바람직하게 이용할 수 있다.
최근, 동물이나 식물 체내에서 상이한 역할을 하고 있는 다양한 기관, 조직, 및 세포를 생체 외에서 증식 혹은 유지시키기 위한 기술이 발전해 오고 있다. 이들 기관, 조직을 생체 외에서 증식 혹은 유지하는 것은 각각 기관 배양, 조직 배양으로 불리고 있고, 기관, 조직으로부터 분리된 세포를 생체 외에서 증식, 분화 혹은 유지하는 것은 세포 배양으로 불리고 있다. 세포 배양은, 분리한 세포를 배지 중에서 생체 외에서 증식, 분화 혹은 유지하는 기술이고, 생체 내의 각종 기관, 조직, 세포의 기능 및 구조를 상세하게 해석하기 위해서 불가결한 것이 되어 있다. 또, 당해 기술에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은, 화학 물질, 의약품 등의 약효 및 독성 평가나, 효소, 세포 증식 인자, 항체 등의 유용 물질의 대량 생산, 질환이나 결손에 의해 상실된 기관, 조직, 세포를 보충하는 재생 의료, 식물의 품종 개량, 유전자 재조합 작물의 생산 등 다양한 분야에서 이용되고 있다.
동물 유래의 세포는, 그 성상으로부터 비접착 세포와 접착 세포로 크게 이분된다. 비접착 세포는 생육·증식에 스캐폴드 (scaffold)를 필요로 하지 않는 세포이고, 접착 세포는 생육·증식에 스캐폴드를 필요로 하는 세포이지만, 생체를 구성하는 대부분의 세포는 후자의 접착 세포이다. 접착 세포의 배양 방법으로는, 단층 배양, 분산 배양, 포매 (embedded) 배양, 마이크로캐리어 배양, 및 스피어 (sphere) 배양 등이 알려져 있다.
단층 배양은, 유리 혹은 여러 가지 표면 처리를 실시한 합성 고분자 재료로 이루어지는 배양 용기나, 피더 세포로 불리는 보조적인 세포를 스캐폴드로 하여 목적하는 세포를 단층상으로 배양하는 방법이며, 가장 일반적으로 보급되어 있다. 예를 들어, 폴리스티렌에 대해 여러 가지 표면 처리 (플라즈마 처리, 코로나 처리 등) 를 실시한 것, 콜라겐, 피브로넥틴, 폴리리신 등의 세포 접착 인자를 코팅한 것, 혹은 피더 세포를 미리 파종한 것 등, 여러 가지 형상 또는 성상의 배양 용기를 사용한 배양 방법이 개발되어 있다. 그러나, 단층 배양은 그 이차원적 배양 환경이 생체 내에서의 환경과 완전히 상이하기 때문에 세포가 생체 내에서 갖고 있는 특이적인 기능을 장기간 유지할 수 없다는, 생체 내와 동일한 조직을 재구축할 수 없다는, 일정 면적당 세포수가 제한되기 때문에 세포의 대량 배양에는 적합하지 않다는, 등이 문제가 되고 있다 (특허문헌 1). 또, 피더 세포 상에서 목적하는 세포를 배양하는 방법은, 피더 세포와 목적하는 세포의 분리가 문제가 되는 경우가 있다 (비특허문헌 1).
분산 배양은, 배지 중에 세포를 뿌린 후, 세포의 부착을 저해하는 표면 처리를 실시한 배양 용기 중에서, 그 배양액을 계속해 교반함으로써 세포의 배양 용기로의 접착을 저해해, 부유 상태로 접착 세포를 배양하는 방법이다. 그러나, 당해 방법으로 배양되는 접착 세포는 스캐폴드로의 접착이 불가능하기 때문에, 세포 증식을 위해서 스캐폴드로의 접착을 필수로 하는 세포에는 응용할 수 없다. 또, 전단력에 의해 항상 파쇄됨으로써 본래의 세포 기능을 발휘할 수 없기 때문에, 기능을 갖는 세포를 대량으로 배양할 수 없는 경우가 있다 (비특허문헌 2).
포매 배양은, 한천, 메틸셀룰로오스, 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 아가로스, 알긴산염 등의 고형 혹은 반고체의 젤 기재 중에 세포를 매립하고, 고정시켜 배양하는 방법이다. 당해 방법은, 세포를 생체 내에 가까운 형태로 삼차원적으로 배양하는 것을 가능하게 하고, 젤 기재 그 자체가 세포의 증식이나 분화를 촉진하는 경우도 있기 때문에 단층 배양이나 분산 배양과 비교해, 세포의 기능을 유지하면서 세포를 고밀도로 배양할 수 있다 (특허문헌 2, 3). 또한, 이들 젤 기재를 세포에 매립한 상태에서 크기 100 ∼ 300 ㎛ 의 마이크로캡슐을 제작하고, 당해 마이크로캡슐을 분산시키면서 수용액 배지로 세포를 배양하는 방법도 개발되어 있다 (비특허문헌 3). 그러나, 이들 방법은, 젤 기재가 가시광을 투과하지 않는 경우에는 배양 세포의 계시적인 관찰을 할 수 없다는, 젤 기재를 포함하는 배지나 마이크로캡슐은 점도가 높기 때문에 당해 배지 중에서부터 세포를 회수하기 위해서 효소 처리 (예를 들어, 콜라겐젤의 경우에는 콜라게나아제 처리) 등의 번잡하고 또한 세포에 장애를 입히는 조작을 필요로 한다는, 장기간 배양할 때에 필요한 배지 교환이 곤란하다는 등의 문제를 갖고 있다. 최근, 열이나 전단력 등의 처리에 의해 젤 기재로부터 세포 회수가 가능해지는 기술이 개발되어 있지만, 열이나 전단력 등은 세포 기능에 악영향을 주는 경우가 있음과 아울러, 당해 젤 기재의 생체에 대한 안전성에 대해서는 여전히 명확하게는 되어 있지 않다 (특허문헌 4, 5, 비특허문헌 4, 5, 6, 7). 또, 작게 컷한 과실이나 야채 등의 입상 (粒狀) 식품을 균일하게 분산, 부유시켜, 그 침전이나 부상을 방지하기 위한 졸상 식품이 식품 분야에서 개발되어 있지만, 당해 졸상 식품은 분산시킨 입상 식품을 회수하는 것은 고려되어 있지 않고, 세포나 조직을 부유 상태로 배양할 수 있는지 여부의 검토도 이루어져 있지 않다 (특허문헌 6).
마이크로캐리어 배양은, 물보다 약간 무거운 미립자 (이하, 마이크로캐리어라고도 한다) 의 표면 상에 세포를 단층으로 증식시키고, 당해 미립자를 플라스크 등의 배양 용기 내에서 교반하여, 부유 상태로의 배양을 실시하는 것이다. 통상, 당해 방법에서 사용하는 마이크로캐리어는 직경 100 ∼ 300 ㎛, 표면적 3000 ∼ 6000 ㎠/g, 비중 1.03 ∼ 1.05 의 구상 입자이고, 덱스트란, 젤라틴, 알긴산 혹은 폴리스티렌 등의 소재에 의해 구성되어 있다. 마이크로캐리어의 표면에는 세포가 부착되기 쉽도록 콜라겐, 젤라틴 또는 디메틸아미노에틸 등의 하전기를 부여할 수도 있다. 당해 방법은, 배양 면적을 최대한 증대시킬 수 있게 되기 때문에, 세포의 대량 배양에 응용되고 있다 (특허문헌 7, 8). 그러나, 모든 마이크로캐리어에서 목적으로 하는 세포를 거의 균일하게 부착시키는 것은 곤란하고, 또 교반 중의 전단력에 의해 세포가 마이크로캐리어로부터 탈리한다는, 세포가 장애를 입는다는 등이 문제가 되고 있다 (비특허문헌 8).
스피어 배양은, 목적하는 세포가 수십 ∼ 수백개로 이루어지는 응집 덩어리 (이하, 스피어라고도 한다) 를 형성시킨 후, 당해 응집 덩어리를 배지 중에서 정치 혹은 진탕하여 배양하는 방법이다. 스피어는, 세포 밀도가 높고, 생체 내 환경에 가까운 세포-세포간 상호 작용 및 세포 구조체가 재구축되어 있어, 단층 배양, 분산 배양법보다 세포 기능을 장기적으로 유지한 상태에서 배양할 수 있는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 9, 10). 그러나, 스피어 배양은, 스피어의 사이즈가 지나치게 큰 경우, 스피어 내부의 영양분 공급과 노폐물 배출이 곤란해지기 때문에, 큰 스피어를 형성시킬 수 없다. 또, 형성한 스피어는 배양 용기의 저면에 있어서 분산 상태로 배양할 필요가 있기 때문에, 일정 체적당 스피어수를 증가시키는 것이 곤란하여, 대량 배양에는 적합하지 않다. 또한, 스피어의 제조 방법으로는, 현적 배양, 세포 비접착 표면에서의 배양, 마이크로웰 내에서의 배양, 회전 배양, 세포의 스캐폴드를 이용한 배양, 원심력이나 초음파, 전장·자장에 의한 응집 등이 알려져 있지만, 이들 방법은 조작이 번잡, 스피어의 회수가 곤란, 사이즈의 제어와 대량 생산이 곤란, 세포에 대한 영향이 불명, 특수한 전용 용기나 장치가 필요하다는 등이 문제가 되고 있다 (특허문헌 9).
한편, 식물에 관해서도 세포, 세포벽을 제거한 프로토플라스트 혹은 식물의 잎, 줄기, 뿌리, 성장점, 종자, 배, 화분 등의 기관, 조직, 캘러스를 무균 상태에서 배양해 증가시킬 수 있다. 이와 같은 식물의 조직이나 세포의 배양 기술을 이용하여, 식물의 품종 개량이나 유용 물질 생산도 가능하게 되어 있다. 식물의 세포나 조직을 단기간에 대량으로 증식시키기 위한 수법으로서, 식물 세포나 조직을 액체 배지에서 현탁 배양하는 방법이 알려져 있다 (비특허문헌 11). 그들의 양호한 증식을 달성하기 위해서는, 충분한 산소의 공급과 균일한 혼합 상태의 유지, 또한 세포의 파손을 방지하는 것 등이 중요하다. 배양액으로의 산소 공급과 세포나 조직의 현탁은, 통기와 기계적 교반을 조합하여 실시되는 경우와, 통기만에 의해 실시되는 경우가 있지만, 전자는 교반에 의한 세포나 조직의 파손이 원인으로 증식 불량을 초래하는 경우가 있고, 한편 후자는 세포나 조직의 전단은 적지만, 고밀도 배양에서는 균일한 혼합 상태를 유지하는 것이 곤란해지는 경우가 있기 때문에, 세포나 조직이 침강하여 증식 효율이 저하되는 등의 문제가 있다.
또한, 항암제의 연구 개발 혹은 암 치료에 있어서의 적절한 항암제의 선택을 위해서, 후보 약제 혹은 항암제를 함유하는 배양액 중에서 암세포를 생체 외에서 배양함으로써, 암세포에 대한 약제의 항암 활성을 평가하는 것이 실시되고 있다. 그러나, 기존의 항암 활성의 평가 방법에서는, 생체 외에서의 평가 결과와 실제 임상 효과에 괴리가 있거나 하는 문제가 존재한다. 당해 문제를 개선하기 위해, 체내 환경을 가능한 한 재현한 세포 배양 조건에서 활성 평가를 실시하는 수법이 개발되어 왔다. 예를 들어, 연한천, 콜라겐젤, 하이드로젤 등의 지지체로 암세포를 포매함으로써, 배양 용기로의 접착을 저해한 환경에서 암세포를 배양하여, 항암제의 평가를 실시하는 방법이 개발되어 있다 (특허문헌 10, 비특허문헌 12, 13). 또, 배양 용기 표면을 세포 접착 저해 재료로 코팅하는 것이나, 표면에 특수한 가공을 실시하는 것에 의해 세포 접착을 저해해 암세포를 응집시킨 상태에서 배양 (스피어 배양) 하여, 항암 활성의 평가를 실시할 방법이 개발되어 있다 (특허문헌 11, 12).
그러나, 이들 암세포 배양법은, 배양 용기의 제작 과정 및 세포 배양의 조작이 번잡하다는, 콜라겐 등의 지지체로부터 세포를 회수해 항암 활성을 평가할 때의 조작이 번잡하다는, 지지체가 동물 유래의 성분일 때에는 고가이기 때문에 그 공급이 제한되는 경우가 있다는, 세포 응집 덩어리 (스피어) 끼리의 회합이 생겨 그 크기가 과잉이 되어 세포 생존률이나 재현성이 낮아진다는 등의 여러 가지 문제가 있다. 또한, 항암제의 스크리닝을 실시할 때에는, 간편하고 또한 균일하게 대량의 샘플을 처리할 수 있는, 재현성이 높은 암세포의 배양 방법이 요구되고 있다.
또한, 의약품 후보제 혹은 의약품을 함유하는 배양액 중에서 간세포 (hepatocyte)를 생체 외에서 배양함으로써, 간세포에 대한 의약품 후보제 혹은 의약품의 각종 활성을 평가하는 것이 실시되고 있다. 그러나, 간세포를 생체 외에서 배양하면 본래 생체 내에서 갖고 있는 기능이 상실되는 경우가 있기 때문에, 기존의 간세포 배양 방법으로는 의약품 후보제 혹은 의약품의 정확한 평가를 할 수 없다는, 다수의 샘플의 평가가 곤란하다는 등의 문제가 존재했다. 당해 문제를 극복하기 위해, 체내 환경을 가능한 한 재현한 세포 배양 조건에서 활성 평가를 실시하는 수법이 개발되어 왔다. 예를 들어, 콜라겐, 라미닌, 마트리겔 (등록상표) 등의 세포 외 매트릭스 상에서 간세포를 배양하여, 간세포의 기능을 유지하는 방법이 개발되어 있다 (특허문헌 13, 비특허문헌 14, 15). 또, 배양 용기 표면을 세포 접착 저해 재료로 코팅하는 것, 용기 표면에 특수한 가공을 실시하는 것에 의해 세포 접착을 저해하는, 배양 용기를 진동시키는 등의 처리에 의해 간세포의 응집 덩어리 (스피어) 를 형성시켜, 간세포의 기능을 유지하는 방법이 개발되어 있다 (특허문헌 14, 15, 비특허문헌 16, 17).
그러나, 이들 간세포 배양법은, 배양 용기의 제작 과정 및 세포 배양의 조작이 번잡하다는, 콜라겐 등의 지지체로부터 세포를 회수해 간세포 기능을 평가할 때의 조작이 번잡하다는, 지지체가 동물 유래의 성분이면 고가이기 때문에 그 공급이 제한되는 경우가 있다는, 세포 응집 덩어리 (스피어) 끼리의 회합이 생겨 그 크기가 과잉이 되기 때문에 세포 생존률이나 재현성이 낮아진다는 등의 여러 가지 문제가 있다. 또한, 의약품 후보제 혹은 의약품의 스크리닝을 실시할 때에는, 간편하고 또한 균일하게 대량의 샘플을 처리할 수 있는, 재현성이 높은 간세포의 배양 방법이 요구되고 있다.
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본 발명의 목적은, 상기 종래 기술의 문제를 해결하여, 동식물 세포 및/또는 조직을, 특히 삼차원 혹은 부유 상태로 배양하기 위한 배지 조성물과 당해 배지 조성물을 사용한 동식물 세포 및/또는 조직의 배양 방법을 제공하는 것에 있다.
또, 본 발명의 목적은, 상기 종래 기술의 문제를 해결하여, 암세포의 세포 응집 덩어리 (스피어) 를 삼차원 환경에서 배양하기 위한 배지 조성물과 당해 배지 조성물을 사용한 암세포의 시험 방법을 제공하는 것에 있다.
혹은, 본 발명의 목적은, 상기 종래 기술의 문제를 해결하여, 간세포의 세포 응집 덩어리 (스피어) 를 삼차원 환경에서 배양하기 위한 배지 조성물과 당해 배지 조성물을 사용한 암세포의 시험 방법을 제공하는 것에 있다.
또한, 본 발명의 목적은, 암세포의 배양에 있어서 암세포의 증식을 촉진하는 배지 첨가제를 제공하는 것, 및 간세포의 배양에 있어서 간세포수의 감소를 억제하는 배지 첨가제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 각종 화합물 및 그것들을 함유하는 액체 배지에 있어서의 세포 및/또는 조직의 부유 효과에 대해 예의 연구한 결과, 당해 액체 배지 중의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 부유 상태로 균일하게 분산시킬 수 있는 구조체의 발견에 성공했다. 당해 구조체를 적어도 포함하는 배지 조성물을 사용하면, 부유 상태를 유지한 채 세포 및/또는 조직이 증식, 분화 혹은 유지 가능한 것을 알아냈다. 또한, 당해 배지 조성물로부터, 배양한 세포 및/또는 조직을 용이하게 회수할 수 있는 것도 찾아내, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
또, 본 발명자들은, 각종 화합물 및 그것들을 함유하는 액체 배지의 암세포 응집 덩어리 (스피어) 에 대한 효과에 대해 예의 연구한 결과, 당해 스피어끼리의 회합을 방지해, 균일하게 분산시킬 수 있는 배지 조성물의 발견에 성공하였다. 당해 배지 조성물을 사용하면 당해 스피어를 생존률 높게 배양할 수 있고, 암세포에 대한 항암제의 활성을 효율적으로 또한 양호한 감도로 평가할 수 있는 것을 알아냈다. 또한, 당해 배지 조성물로부터, 배양한 스피어를 용이하게 회수해 평가할 수 있는 것도 찾아내, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
혹은, 본 발명자들은, 각종 화합물 및 그것들을 함유하는 액체 배지의 간세포 응집 덩어리 (스피어) 에 대한 효과에 대해 예의 연구한 결과, 당해 스피어끼리의 회합을 방지해, 균일하게 분산시킬 수 있는 배지 조성물의 발견에 성공했다. 당해 배지 조성물을 사용하면 당해 스피어를 생존률 높게, 간세포로서의 기능을 유지한 채 배양하는 것이 가능하며, 간세포에 대한 의약품 후보제 혹은 의약품의 효과를 효율적이고 또한 양호한 감도로 평가할 수 있는 것을 알아냈다. 또한, 당해 배지 조성물로부터, 배양한 스피어를 용이하게 회수해 평가할 수 있는 것도 찾아내, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
또한, 본 발명자들은 암세포를 포함하는 배지에, 탈아실화젤란검 또는 그 염을 첨가한 바, 암세포의 증식이 크게 촉진되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
또한, 본 발명자들은 간세포를 포함하는 배지에, 탈아실화젤란검 또는 그 염을 첨가한 바, 간세포수의 감소가 억제되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다 :
(1) 세포 또는 조직을 부유시켜 배양할 수 있는 구조체를 함유하는 배지 조성물.
(2) 배양시의 배지 조성물의 교환 처리 및 배양 종료 후에 있어서 세포 또는 조직의 회수가 가능한 (1) 에 기재된 배지 조성물.
(3) 배지 조성물로부터의 세포 또는 조직의 회수시에, 온도 변화, 화학 처리, 효소 처리, 전단력 중 어느 것도 필요로 하지 않는 (1) 에 기재된 배지 조성물.
(4) 점도가, 8 mPa·s 이하인 (1) 에 기재된 배지 조성물.
(5) 상기 구조체의 크기가, 필터로 여과한 경우 구멍 지름이 0.2 ㎛ 내지 200 ㎛ 의 필터를 통과하는 (1) 에 기재된 배지 조성물.
(6) 상기 구조체가, 고분자 화합물을 함유하는 (1) 에 기재된 배지 조성물.
(7) 상기 고분자 화합물이, 음이온성 관능기를 갖는 고분자 화합물을 함유하는 (6) 에 기재된 배지 조성물.
(8) 상기 고분자 화합물이, 다당류인 (6) 에 기재된 배지 조성물.
(9) 상기 음이온성 관능기가, 카르복실기, 술포기 및 인산기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (7) 에 기재된 배지 조성물.
(10) 상기 다당류가 히알루론산, 젤란검, 탈아실화젤란검, 람산검, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난, 후코이단, 펙틴, 펙트산, 펙틴산, 헤파란황산, 헤파린, 헤파리틴황산, 케라토황산, 콘드로이틴황산, 데르마탄황산, 람난황산 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (8) 에 기재된 배지 조성물.
(11) 상기 다당류가, 히알루론산, 탈아실화젤란검, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (10) 에 기재된 배지 조성물.
(12) 상기 다당류가, 탈아실화젤란검 또는 그 염인 (10) 또는 (11) 에 기재된 배지 조성물.
(13) 상기 탈아실화젤란검 또는 그 염의 배지 조성물에 대한 최종 농도가, 0.001 ∼ 1.0 ％ (중량/용량) 인 (12) 에 기재된 배지 조성물.
(14) 추가로, 탈아실화젤란검 또는 그 염 이외의 다당류를 함유하는 (13) 에 기재된 배지 조성물.
(15) 상기 다당류가, 크산탄검, 알긴산, 카라기난, 디우탄검 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (14) 에 기재된 배지 조성물.
(16) 상기 다당류가, 메틸셀룰로오스, 로커스트빈검 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (14) 에 기재된 배지 조성물.
(17) 추가로, 금속 이온을 함유하는 (1) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물.
(18) 상기 금속 이온이, 2 가의 금속 이온인 (17) 에 기재된 배지 조성물.
(19) 상기 금속 이온이, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온 및 구리 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (18) 에 기재된 배지 조성물.
(20) 상기 금속 이온이, 칼슘 이온인 (19) 에 기재된 배지 조성물.
(21) 추가로, 칼슘 이온 이외의 금속 이온을 함유하는 (20) 에 기재된 배지 조성물.
(22) 상기 금속 이온이, 마그네슘 이온, 나트륨 이온 및 칼륨 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (21) 에 기재된 배지 조성물.
(23) 추가로, 세포 외 매트릭스 및/또는 세포 접착 분자를 함유하는 (1) 내지 (22) 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물.
(24) 상기 세포 외 매트릭스가, 콜라겐, 히알루론산 및 프로테오글리칸으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (23) 에 기재된 배지 조성물.
(25) 상기 세포 접착 분자가, 카드헤린, 라미닌, 피브로넥틴 및 비트로넥틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 (23) 에 기재된 배지 조성물.
(26) 세포 배양용인, (1) 내지 (25) 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물.
(27) 상기 세포가, 접착 세포 또는 비접착 세포인 (26) 에 기재된 배지 조성물.
(28) 상기 접착 세포가, 마이크로캐리어에 부착된 상태인 (27) 에 기재된 배지 조성물.
(29) 상기 접착 세포가, 담체에 포매된 상태인 (27) 에 기재된 배지 조성물.
(30) 상기 접착 세포가, 스피어인 (27) 에 기재된 배지 조성물.
(31) 상기 접착 세포가, 다능성 줄기세포, 암세포 및 간세포로 이루어지는 군에서 선택되는 (27) 에 기재된 배지 조성물.
(32) (1) 내지 (31) 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물과, 세포 또는 조직을 포함하는, 세포 또는 조직 배양물.
(33) (1) 내지 (31) 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물 중에서 세포 또는 조직을 배양하는 세포 또는 조직의 배양 방법.
(34) 상기 세포가, 다능성 줄기세포, 암세포, 간세포로 이루어지는 군에서 선택되는 (33) 에 기재된 배양 방법.
(35) (32) 의 배양물로부터 세포 또는 조직을 분리하는 세포 또는 조직의 회수 방법.
(36) 상기 분리가, 여과, 원심 분리 또는 자성 분리로 실시되는 (35) 에 기재된 회수 방법.
(37) (1) 내지 (31) 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물 중에서 접착 세포를 배양하는 스피어의 제조 방법.
(38) 항암제를 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 피험 물질의 존재하 및 비존재하, 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물 중에서 암세포를 배양하는 공정, 및
(b) 암세포의 증식 변화를 해석하는 공정을 포함하는 방법.
(39) 추가로, 피험 물질의 비존재하의 경우와 비교해, 암세포의 증식을 억제하는 물질을 후보 물질로서 선택하는 공정을 포함하는 (38) 에 기재된 방법.
(40) 간세포에 작용하는 의약품 후보 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 피험 물질의 존재하 및 비존재하, 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물 중에서 간세포를 배양하는 공정, 및
(b) 간세포의 생리학적 기능의 변화를 해석하는 공정을 포함하는 방법.
(41) 추가로, 피험 물질의 비존재하의 경우와 비교해, 간세포의 생리학적 기능을 억제 또는 증가시키는 물질을 후보 물질로서 선택하는 공정을 포함하는 (40) 에 기재된 방법.
(42) 간세포에 작용하는 의약품 후보 물질의 약효 또는 독성을 평가하는 방법으로서,
(a) 피험 물질의 존재하 및 비존재하, 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물 중에서 간세포를 배양하는 공정, 및
(b) 간세포의 생리학적 기능의 변화를 해석하는 공정을 포함하는 방법.
(43) 세포 또는 조직을 부유시켜 배양할 수 있는 배지 조성물을 조제하기 위한 배지 첨가제로서, 고분자 화합물이 용매 중에 용해 또는 분산되어 있는 배지 첨가제.
(44) 멸균된 상태인 (43) 에 기재된 배지 첨가제.
(45) 상기 고분자 화합물이 음이온성 관능기를 갖는 고분자 화합물인, (43) 또는 (44) 에 기재된 배지 첨가제.
(46) 상기 고분자 화합물이 탈아실화젤란검 또는 그 염인, (43) 또는 (44) 에 기재된 배지 첨가제.
(47) 세포 또는 조직을 부유시켜 배양할 수 있는 배지 조성물의 제조 방법으로서, 고분자 화합물과 배지를 혼합하는 배지 조성물의 제조 방법.
(48) (43) 내지 (46) 중 어느 한 항에 기재된 배지 첨가제와 배지를 혼합하는 (47) 에 기재된 배지 조성물의 제조 방법.
(49) 상기 배지가 용매 중에 용해 또는 분산되어 있는 (48) 에 기재된 배지 조성물의 제조 방법.
(50) 상기 고분자 화합물이 음이온성 관능기를 갖는 고분자 화합물인, (47) 에 기재된 배지 조성물의 제조 방법.
(51) 상기 고분자 화합물이 탈아실화젤란검 또는 그 염인, (50) 에 기재된 배지 조성물의 제조 방법.
(52) 상기 고분자 화합물과 배지를, 물과 혼합하는 (47) 에 기재된 배지 조성물의 제조 방법.
(53) 물과 혼합한 후, 80 ∼ 130 ℃ 에서 가열하는 (52) 에 기재된 배지 조성물의 제조 방법.
(54) 100 ∼ 125 ℃ 에서 가열하는 (53) 에 기재된 배지 조성물의 제조 방법.
(55) 여과 멸균하는 (47) 에 기재된 배지 조성물의 제조 방법.
(56) 상기 여과 멸균이 0.1 ∼ 0.5 ㎛ 의 필터를 통과시키는 조성물의 제조 방법.
(57) 탈아실화젤란검 혹은 그 염, 또는 디우탄검 혹은 그 염을 포함하는 암세포용 배지 첨가제.
(58) 암세포의 배양에 있어서, 암세포의 증식을 촉진하는, (57) 에 기재된 첨가제.
(59) 항암제의 항암 활성을 평가하기 위해서 사용되는, (57) 에 기재된 첨가제.
(60) (57) 내지 (59) 중 어느 한 항에 기재된 첨가제를 함유하여 이루어지는 암세포용 배지 조성물.
(61) 암세포의 배양 방법으로서, (57) 내지 (59) 중 어느 한 항에 기재된 첨가제의 존재하 또는 (60) 에 기재된 배지 조성물 중에서 그 암세포를 배양하는 방법.
(62) 암세포에 대한 항암제의 활성 평가 방법으로서, (57) 내지 (59) 중 어느 한 항에 기재된 첨가제의 존재하 또는 (60) 에 기재된 배지 조성물 중에서 그 암세포를 배양하는 방법.
(63) 그 암세포가 그 암세포용 배지 조성물 중에 있어서 세포 응집 덩어리를 형성하고 있는 (61) 또는 (62) 에 기재된 방법.
(64) 그 암세포를 배양할 때의 배양 용기가 암세포의 부착을 억제하는 (61) 또는 (62) 에 기재된 방법.
(65) 탈아실화젤란검 혹은 그 염, 또는 디우탄검 혹은 그 염을 포함하는 간세포용 배지 첨가제.
(66) 간세포의 배양에 있어서, 간세포수의 감소를 억제하는, (65) 에 기재된 첨가제.
(67) 의약품 및 의약품 후보제의 간세포에 대한 효과를 평가하기 위해서 사용되는, (65) 에 기재된 첨가제.
(68) (65) 내지 (67) 중 어느 한 항에 기재된 첨가제를 함유하여 이루어지는 간세포용 배지 조성물.
(69) 간세포에 대한 의약품 및 의약품 후보제의 활성 평가 방법으로서, (65) 내지 (67) 중 어느 한 항에 기재된 첨가제의 존재하 또는 (68) 에 기재된 배지 조성물 중에서 그 간세포를 배양하는 방법.
(70) 그 간세포가 그 간세포용 배지 조성물 중에 있어서 세포 응집 덩어리를 형성하고 있는 (69) 에 기재된 방법.
(71) 그 간세포를 배양할 때의 배양 용기가 간세포의 부착을 억제하는 (69) 에 기재된 방법.
본 발명은, 특정한 화합물 (이하, 특정 화합물이라고도 한다), 특히 음이온성 관능기를 갖는 고분자 화합물의 구조체를 포함하는 배지 조성물을 제공한다. 당해 배지 조성물을 사용하면, 세포나 조직의 장애나 기능 상실을 일으킬 리스크가 있는 진탕이나 회전 등의 조작을 수반하지 않고 세포 및/또는 조직을 부유 상태로 배양할 수 있다. 또한, 당해 배지 조성물을 사용하면, 배양시 용이하게 배지를 교환할 수 있음과 아울러, 배양한 세포 및/또는 조직을 용이하게 회수할 수도 있다. 본 발명은, 당해 배양 방법을 동물 생체 혹은 식물체로부터 채취한 세포 및/또는 조직에 적용하여, 목적하는 세포 및/또는 조직을 그 기능을 손상시키지 않고 대량으로 조제할 수 있다. 그리고, 당해 배양 방법으로 얻어지는 세포 및/또는 조직은, 화학 물질, 의약품 등의 약효 및 독성 평가나, 효소, 세포 증식 인자, 항체 등의 유용 물질의 대량 생산, 질환이나 결손에 의해 상실된 기관, 조직, 세포를 보충하는 재생 의료 등을 실시할 때에 이용할 수 있다. 특히, 탈아실화젤란검으로부터 제조되는 배지 조성물이 우수하고, 이하의 특징을 갖고 있다. 성능을 발현시키기 위한 농도가 매우 낮기 때문에 (1 자리 (order) 정도 낮다), 배지 성분에 주는 영향이 최저한으로 억제된다. 또, 물에 용해시킬 때에 응어리가 되기 어렵기 때문에, 대량으로 제조할 때에도 문제가 잘 일어나지 않는다. 또한, 성능을 발현하는 농도역에서의 점도가 낮기 때문에, 세포 및/또는 조직의 회수 등의 조작성이 매우 양호하다.
또, 본 발명의 배지 조성물을 사용하면, 암세포의 응집 덩어리 (스피어) 끼리의 회합이 억제되어 당해 스피어를 분산 상태로 배양할 수 있기 때문에, 암세포의 증식을 촉진할 수 있다. 또한, 당해 배지 조성물을 사용하면, 항암제의 평가를 실시할 때에 용이하게 항암제를 배지에 첨가할 수 있음과 아울러, 세포 증식을 평가하기 위한 검출 시약을 용이하게 첨가할 수 있다. 또, 배양한 암세포를 회수할 수 있기 때문에, 회수한 세포의 기능 평가를 용이하게 실시할 수도 있다. 본 발명은, 당해 배양 방법으로 얻어지는 암세포를 이용하여 화학 물질, 항암제 등의 약효 평가나 스크리닝을 실시할 때에 바람직하게 이용할 수 있다.
본 발명의 배지 조성물로 배양하면, 이차원 배양에 있어서의 비생체내적 환경으로부터의 영향이 적은 것과 세포끼리의 접착만이 일어나기 때문에, 암화를 촉진하는 HB-EGF (헤파린 결합성 상피 성장 인자 유사 증식 인자) 의 감수성이 암세포에서 높아지고, 그 하류에 있어서의 EGF 수용체 저해제에 대한 감수성을 높일 수 있다. 또한 암세포 스캐폴드 비의존적인 증식에 대한 중요한 시그널 전달 경로인 MEK 저해제 및 Akt 저해제에 대한 감수성도 높일 수 있다.
혹은, 본 발명의 배지 조성물을 사용하면, 간세포의 응집 덩어리 (스피어) 끼리의 회합이 억제되어 당해 스피어를 분산 상태로 배양할 수 있기 때문에, 간세포의 생존과 세포 기능을 생체 외에서 유지할 수 있다. 또한, 당해 배지 조성물을 사용하면 의약품 후보제 혹은 의약품의 평가를 실시할 때에, 용이하게 의약품 후보제 혹은 의약품을 배지에 첨가할 수 있음과 아울러, 세포 기능을 평가하기 위한 검출 시약을 용이하게 첨가할 수 있다. 또, 배양한 간세포를 회수할 수 있기 때문에 회수한 세포의 기능 평가를 용이하게 실시할 수도 있다. 본 발명은, 당해 배양 방법으로 얻어지는 간세포를 이용하여 화학 물질, 의약품 후보제 혹은 의약품 등의 약효 및 독성 평가나 스크리닝을 실시할 때에 바람직하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 탈아실화젤란검 또는 그 염을 포함하는 배지 첨가제는, 암세포의 배양에 있어서 암세포의 증식을 크게 촉진할 수 있다.
또한, 본 발명의 탈아실화젤란검 또는 그 염을 포함하는 배지 첨가제는, 간세포의 배양에 있어서 간세포수의 감소를 억제할 수 있다.
도 1 은 본 발명의 배지 조성물로 HepG2 세포의 스피어를 배양한 바, 스피어가 균일하게 분산되고, 또한 부유 상태로 배양할 수 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 2 는 본 발명의 배지 조성물로 HeLa 세포의 스피어를 배양한 바, 스피어가 균일하게 분산되고, 또한 부유 상태로 배양할 수 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 3 은 본 발명의 배지 조성물로 HeLa 세포의 스피어를 배양하여, 본 스피어를 현미경 관찰한 바, 기존 배지에 비해 스피어끼리의 회합이 억제되는 것을 나타내는 도면이다.
도 4 는 본 발명의 배지 조성물로 다능성 줄기세포를 배양한 바, 당해 세포에 대한 독성이 보이지 않는 것을 나타내는 도면이다.
도 5 는 본 발명의 배지 조성물로 다능성 줄기세포의 스피어를 배양한 바, 스피어가 균일하게 분산되고, 또한 부유 상태에 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 6 은 본 발명의 배지 조성물로 다능성 줄기세포의 스피어를 배양한 바, 다능성 줄기세포가 효율적으로 증식한 것을 나타내는 도면이다.
도 7 은 본 발명의 배지 조성물로 배양한 다능성 줄기세포는, 미분화성을 유지하고 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 8 은 본 발명의 배지 조성물로 부유 정치 배양한 다능성 줄기세포는, 정상 핵형을 유지하고 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 9 는 본 발명의 배지 조성물로 배양한 다능성 줄기세포는, 미분화성을 유지하고 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 10 은 본 발명의 배지 조성물로 HepG2 세포를 부착시킨 마이크로캐리어를 배양한 바, HepG2 세포가 마이크로캐리어 상에서 증식할 수 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 11 은 본 발명의 배지 조성물에 HeLa 세포의 스피어를 첨가했을 때에, 스피어가 균일하게 분산되고, 또한 부유 상태에 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 12 는 본 발명의 배지 조성물에 의해 HeLa 세포의 스피어가 형성되는 것을 나타내는 도면이다.
도 13 은 본 발명 구조체의 일양태인 필름을 나타내는 도면이다. 배지 조성물에 대한 탈아실화젤란검의 농도는 0.02 ％ (중량/용량).
도 14 는 본 발명의 배지 조성물에 의해 HepG2 세포의 스피어가 형성되는 것을 나타내는 도면이다.
도 15 는 HepG2 세포를 부착시킨 라미닌 코팅 GEM 을 본 발명의 배지 조성물로 배양했을 때의 부유 상태를 나타내는 도면이다.
도 16 은 HepG2 세포를 포매한 알긴산 비즈를 본 발명의 배지 조성물로 배양했을 때의 부유 상태를 나타내는 도면이다.
도 17 은 HepG2 세포를 포매한 콜라겐젤 캡슐을 본 발명의 배지 조성물로 배양했을 때의 부유 상태를 나타내는 도면이다.
도 18 은 본 발명의 배지 조성물로 벼 유래 캘러스를 배양했을 때의 부유 상태를 나타내는 도면이다.
도 19 는 본 발명의 배지 조성물로 HeLa 세포의 스피어를 배양한 바, 스피어가 균일하게 분산되고, 또한 부유 상태로 배양할 수 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 20 은 본 발명의 배지 조성물로 A549 세포 및 HCT116 세포의 스피어를 배양한 바, 스피어가 균일하게 분산되고, 또한 부유 상태로 배양할 수 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 21 은 본 발명의 배지 조성물로 인간 초대 (primary) 간세포를 배양한 바, 스피어를 형성해 배양할 수 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 22 는 본 발명의 배지 조성물로 필리핀 원숭이 초대 간세포 (Cynomolgus monkey primary hepatocytes)를 배양한 바, 스피어를 형성해 배양할 수 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 23 은 본 발명의 배지 조성물로 MCF-7 세포를 5 일간 배양한 후의 MCF-7 세포의 응집 덩어리를 나타내는 도면이다.
도 24 는 본 발명의 배지 조성물로 A375 세포 및 MNNG/HOS 세포를 4 일간 배양한 후의 응집 덩어리를 나타내는 도면이다.
도 25 는 본 발명의 배지 조성물로 MIAPaCa-2 세포를 6 일간 배양한 후의 응집 덩어리를 나타내는 도면이다.
이하, 더욱 상세하게 본 발명을 설명한다.
본 명세서에 있어서 사용하는 용어에 대해, 이하와 같이 정의한다.
본 발명에 있어서의 세포란, 동물 혹은 식물을 구성하는 가장 기본적인 단위이고, 그 요소로서 세포막의 내부에 세포질과 각종 세포 소기관을 갖는 것이다. 이때, DNA 를 내포하는 핵은 세포 내부에 포함되어도 되고 포함되지 않아도 된다. 예를 들어, 본 발명에 있어서의 동물 유래 세포에는, 정자나 난자 등의 생식 세포, 생체를 구성하는 체세포, 줄기세포 (다능성 줄기세포 등), 전구 세포, 생체로부터 분리된 암세포, 생체로부터 분리되어 불사화능을 획득해 체외에서 안정적으로 유지되는 세포 (세포주), 생체로부터 분리되어 인위적으로 유전자 개변이 이루어진 세포, 생체로부터 분리되어 인위적으로 핵이 교환된 세포 등이 포함된다. 생체를 구성하는 체세포의 예로는 이하에 한정되는 것은 아니지만, 선유아 세포, 골수 세포, B 림프구, T 림프구, 호중구, 적혈구, 혈소판, 매크로파지, 단구, 골 세포, 골수 세포, 주피 세포, 수지상 세포, 케라티노사이트, 지방 세포, 최종 농도 세포, 상피 세포, 표피 세포, 내피 세포, 혈관 내피 세포, 간실질 세포, 연골 세포, 난구 세포, 신경계 세포, 글리아 세포, 뉴런, 올리고덴드로사이트, 마이크로글리아, 성상 교세포, 심장 세포, 식도 세포, 근육 세포 (예를 들어, 평활근 세포 또는 골격근 세포), 췌장 베타 세포, 멜라닌 세포, 조혈 전구 세포 (예를 들어, 제대혈 유래의 CD34 양성 세포), 및 단핵 세포 등이 포함된다. 당해 체세포는, 예를 들어 피부, 신장, 비장, 부신, 간장, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 방광, 전립선, 정소, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 혈액 (제대혈을 포함한다), 골수, 심장, 눈, 뇌 또는 신경 조직 등의 임의의 조직으로부터 채취되는 세포가 포함된다. 줄기세포란, 최종 농도 자신을 복제하는 능력과 다른 복수 계통의 세포로 분화하는 능력을 겸비한 세포이고, 그 예로는 이하에 한정되는 것은 아니지만, 배성 줄기세포 (ES 세포), 배성 종양 세포, 배성 생식 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포 (iPS 세포), 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 (mesenchymal) 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 근육 줄기세포, 생식 줄기세포, 장 줄기세포, 암 줄기세포, 모낭 줄기세포 등이 포함된다. 다능성 줄기세포로는, 상기 줄기세포 중 ES 세포, 배성 생식 줄기세포, iPS 세포를 들 수 있다. 전구 세포란, 상기 줄기세포로부터 특정 체세포나 생식 세포로 분화하는 도중의 단계에 있는 세포이다. 암 세포란, 체세포로부터 파생되어 무한 증식능을 획득한 세포이다. 세포주란, 생체 외에서의 인위적인 조작에 의해 무한 증식능을 획득한 세포이다.
암 조직의 예로는 이하에 한정되는 것은 아니지만, 위암, 식도암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 유암, 난소암, 전립선암, 편평 상피 세포암, 기저 세포암, 선암, 골수암, 신장 세포암, 요관암, 간암, 담관암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 정소암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 방광암, 상피암, 두개 인두암, 후두암, 설암, 섬유 육종, 점막 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근 육종, 횡문근 육종, 정상피종, 윌름스 종양, 신경 교종, 성장 세포종, 골수아종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 수아종, 망막아세포종, 악성 림프종, 암환자 유래의 혈액 등의 조직을 들 수 있다. 암세포주의 예로는 이하에 한정되는 것은 아니지만, 인간 유암 세포주로서 HBC-4, BSY-1, BSY-2, MCF-7, MCF-7/ADR RES, HS578T, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, T47D, 인간 자궁 경부암 세포주로서 HeLa, 인간 폐암 세포주로서 A549, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H23, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522, DMS273, DMS114, 인간 대장암 세포주로서 Caco-2, COLO-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT-29, KM-12, SW-620, WiDr, 인간 전립선암 세포주로서 DU-145, PC-3, LNCaP, 인간 중추신경계암 세포주로서 U251, SF-295, SF-539, SF-268, SNB-75, SNB-78, SNB-19, 인간 난소암 세포주로서 OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, SK-OV-3, IGROV-1, 인간 신장암 세포주로서 RXF-631L, ACHN, UO-31, SN-12C, A498, CAKI-1, RXF-393L, 786-0, TK-10, 인간 위암 세포주로서 MKN45, MKN28, St-4, MKN-1, MKN-7, MKN-74, 피부암 세포주로서 LOX-IMVI, LOX, MALME-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-5, SK-MEL-28, UACC-62, UACC-257, M14, 백혈병 세포주로서 CCRF-CRM, K562, MOLT-4, HL-60TB, RPMI8226, SR, UT7/TPO, Jurkat, 인간 상피 유사암 세포주로서 A431, 인간 멜라노마 세포주로서 A375, 인간 골육종 세포주로서 MNNG/HOS, 인간 췌장암 세포주로서 MIAPaCa-2 등을 들 수 있다. 세포주의 예로는 이하에 한정되는 것은 아니지만, HEK293 (인간 태아 신장 세포), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, AE-1, 3D9, Ns0/1, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five (등록상표), Vero 등이 포함된다.
본 발명에 있어서의 간세포란, 간장 조직으로부터 채취된 초대 간세포 외에, 생체 외에서의 배양에 최적화된 조건으로 계대 배양되어 확립된 간세포주, 및 간장 이외의 조직 유래의 세포, iPS 세포나 ES 세포 등의 다능성 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 말초혈 유래 줄기세포, 골수 줄기세포, 지방 줄기세포, 간 줄기세포, 간 전구 세포 등으로부터 생체 외에서 분화 유도된 간세포 등을 들 수 있다. 간장 조직은 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 혹은 원숭이 등에서 채취된 간장이고, 정상적인 간장뿐만 아니라 암화된 간장이어도 된다. 초대 간세포는, 이들 간장으로부터 콜라게나아제를 사용한 관류법에 의해 분리해 채취할 수 있지만, 주식회사 프라이머리셀, 닛폰 백톤 딕킨슨 주식회사, 타카라 바이오 주식회사, 홋카이도 시스템 사이언스 주식회사, 론자 재팬 주식회사, 주식회사 베리타스, 라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사 등의 시약 회사로부터 구입한 것이어도 된다. 구입하는 간세포는, 동결된 상태 혹은 콜라겐 등의 담체에 부착된 상태일 수 있다. 간세포주의 예로는 이하에 한정되는 것은 아니지만, HepG2, Hep3B, HepaRG (등록상표), JHH7, HLF, HLE, PLC/PRF/5, WRL68, HB611, SK-HEP-1, HuH-4, HuH-7 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 간세포의 기능으로는 특별히 제한되지 않지만, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5 등의 시토크롬 P450 (CYP 라고도 한다) 활성의 발현 그리고 본 효소에 의한 의약품 등의 대사, 글루쿠론산, 글루타티온, 황산, 글리신 등에 의한 의약품 등의 포합, 알부민, 아포리포 단백질, 트롬보포이에틴 등의 유용 단백질의 생산, 빌리루빈의 분비, 우레아의 합성, 담즙산이나 지방산의 합성, 트랜스포터에 의한 의약품 등의 수송 등이 포함된다. 본 발명에 있어서의 실시형태에서는, 간세포는 상기 기능 중 시토크롬 P450 의 활성, 알부민의 생산 및/또는 트랜스포터에 의한 의약품 등의 수송 (예를 들어 카복시디클로로플루오레세인 디아세테이트, 테트라에틸암모늄 브로마이드, 타우로콜레이트, 로스바스타틴의 흡수나 카복시디클로로플루오레세인의 배설) 을 유지하고 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 의약품에는, 의료용으로 제공되는 물질 전부가 포함된다. 의약품 후보제란, 의약품의 후보로서 탐색 혹은 개발 연구가 이루어지고 있는 물질이고, 합성 화합물, 단백질, 핵산, 당류, 천연물 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 항암제란, 암세포에 직접적으로 작용하여 암세포의 증식이나 기능을 억제하는 약제 외에, 암세포에 직접적으로는 작용하지 않지만 생체 내의 면역 세포 또는 기타 약제와의 협동적인 작용에 의해 암세포의 증식 또는 기능을 억제하거나, 또는 암세포를 사멸시키는 약제도 포함된다. 이와 같은 항암제의 예로는 특별히 제한되지 않지만, 알킬화제, 백금 유도체, 5FU 계 항암제로 대표되는 대사 길항제, 토포이소머라아제 저해제, 미소관 저해제, 에피루비신으로 대표되는 항암성 항생 물질, 게피티닙, 트라스투주맙, 세툭시맙, 에를로티닙, 파니투무맙, 라파티닙, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 이필리무맙, 반데타닙, 크리조티닙, 룩솔리티닙, 트라메티닙으로 대표되는 분자 표적약 등을 들 수 있다. 분자 표적약의 표적 분자로는 특별히 제한되지 않지만, 각종 키나아제, Her2, EGFR (상피 성장 인자 수용체), PI3K (포스파티딜이노시톨3-키나아제), mTOR (포유류 라파마이신 표적 단백질), Akt, CDK (사이클린 의존 키나아제), VEGFR (혈관 내피 세포 증식 인자 수용체), PDGFR (혈소판 유래 성장 인자 수용체), FGFR (선유아 세포 성장 인자 수용체), c-Met, Raf, p38MAPK, CTLA-4, ALK, JAK, MEK (MAPK/ERK 키나아제), Hsp90, 히스톤디아세틸라아제 등을 들 수 있다. 또한, 이와 같은 효과를 갖는 약제의 후보가 되는 합성 화합물, 단백질, 핵산, 당류, 천연물 등도 본 발명에 있어서의 항암제에 포함된다.
본 발명에 있어서의 식물 유래의 세포에는, 식물체의 각 조직으로부터 분리된 세포가 포함되고, 당해 세포로부터 세포벽을 인위적으로 제거한 프로토플라스토도 포함된다.
본 발명에 있어서의 조직이란, 몇 종류인가의 상이한 성질이나 기능을 갖는 세포가 일정한 양식으로 집합한 구조의 단위이고, 동물 조직의 예로는 상피 조직, 결합 조직, 근 조직, 신경 조직 등이 포함된다. 식물 조직의 예로는 분열 조직, 표피 조직, 동화 조직, 엽육 조직, 통도 조직, 기계 조직, 유조직, 탈분화한 세포 덩어리 (캘러스) 등이 포함된다.
세포 및/또는 조직을 본 발명의 방법으로 배양할 때, 배양하는 세포 및/또는 조직은 상기에 기재한 세포 및/또는 조직으로부터 임의로 선택하여 배양할 수 있다. 세포 및/또는 조직은 동물 혹은 식물체로부터 직접 채취할 수 있다. 세포 및/또는 조직은, 특정 처리를 실시함으로써 동물 혹은 식물체로부터 유도시키거나, 성장시키거나, 또는 형질 전환시킨 후에 채취해도 된다. 이때, 당해 처리는 생체 내여도 되고 생체 외여도 된다. 동물로는, 예를 들어 곤충, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 범갑각류, 육각류, 포유류 등을 들 수 있다. 포유 동물의 예로는 한정되는 것은 아니지만, 래트, 마우스, 토끼, 모르모트, 다람쥐, 햄스터, 들쥐, 오리너구리, 돌고래, 고래, 개, 고양이, 염소, 소, 말, 양, 돼지, 코끼리, 코먼마모셋, 다람쥐원숭이, 히말라야원숭이, 침팬지 및 인간을 들 수 있다. 식물로는, 채취한 세포 및/또는 조직이 액체 배양 가능한 것이면 특별히 한정은 없다. 예를 들어, 생약류 (예를 들어, 사포닌, 알카로이드류, 베르베린, 스코폴린, 식물 스테롤 등) 를 생산하는 식물 (예를 들어, 약용 인삼, 일일초, 사리풀, 호황련, 벨라돈나 등) 이나, 화장품·식품 원료가 되는 색소나 다당체 (예를 들어, 안토시아닌, 홍화 색소, 꼭두서니 색소, 사프란 색소, 플라본류 등) 를 생산하는 식물 (예를 들어, 블루베리, 홍화, 서양 꼭두서니, 사프란 등), 혹은 의약품 원체를 생산하는 식물, 사료 또는 식품이 되는 식물 (벼, 옥수수, 소맥 또는 대맥 등) 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되지 않다.
본 발명에 있어서의 세포 및/또는 조직의 부유란, 배양 용기에 대해 세포 및/또는 조직이 접착되지 않은 상태 (비접착) 인 것을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 세포 및/또는 조직을 증식, 분화 혹은 유지시킬 때, 액체 배지 조성물에 대한 외부로부터의 압력이나 진동 혹은 당해 조성물 중에서의 진탕, 회전 조작 등을 수반하지 않고 세포 및/또는 조직이 당해 액체 배지 조성물 중에서 균일하게 분산되고 또한 부유 상태에 있는 상태를 "부유 정치 (suspension standing)"라고 하고, 당해 상태로 세포 및/또는 조직을 배양하는 것을 "부유 정치 배양"이라고 한다. 또, "부유 정치"에 있어서 부유시킬 수 있는 기간으로는 적어도 5 ∼ 60 분, 1 시간 ∼ 24 시간, 1 일 ∼ 21 일이 포함되지만, 부유 상태를 유지하는 한 이들 기간에 한정되지 않다.
본 발명의 배지 조성물은, 세포 또는 조직을 부유시켜 배양할 수 있는 (바람직하게는 부유 정치 배양할 수 있는) 구조체와 배지를 함유하는 조성물이다.
본 발명의 배지 조성물은, 바람직하게는 배양시의 배지 조성물의 교환 처리 및 배양 종료 후에 있어서, 배지 조성물로부터의 세포 또는 조직의 회수가 가능한 조성물이고, 보다 바람직하게는 배지 조성물로부터의 세포 또는 조직의 회수시에 온도 변화, 화학 처리, 효소 처리, 전단력 중 어느 것도 필요로 하지 않는 조성물이다.
본 발명에 있어서의 구조체란 특정 화합물로 형성된 것이고, 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시키는 효과를 나타내는 것이다. 보다 상세하게는, 고분자 화합물이 이온을 개재하여 집합한 것, 혹은 고분자 화합물이 삼차원의 네트워크를 형성한 것 등이 포함된다. 또, 다당류가 금속 이온을 개재하여 마이크로겔을 형성하는 것은 공지이고 (예를 들어, 일본 공개특허공보 2004-129596호), 본 발명의 구조체에는 일양태로서 당해 마이크로겔도 포함된다.
또, 고분자 화합물이 이온을 개재하여 집합한 것으로는, 그 일양태로서 필름상 구조체를 들 수 있다. 당해 필름을 도 13 에 예시한다.
본 발명에 있어서의 구조체의 크기는, 필터로 여과했을 경우 구멍 직경이 0.2 ㎛ 내지 200 ㎛ 인 필터를 통과하는 것이 바람직하다. 당해 구멍 직경의 하한으로는, 보다 바람직하게는 1 ㎛ 를 초과하는 것이고, 안정적으로 세포 또는 조직을 부유시키는 것을 고려하면, 더욱 바람직하게는 5 ㎛ 를 초과하는 것이다. 당해 구멍 직경의 상한으로는, 보다 바람직하게는 100 ㎛ 이하인 것, 세포 또는 조직의 크기를 고려하면 더욱 바람직하게는 70 ㎛ 이하인 것이다.
본 발명에 있어서의 특정 화합물이란, 특정 화합물을 액체 배지와 혼합했을 때 부정형인 구조체를 형성하여, 당해 구조체가 당해 액체 중에서 균일하게 분산되어, 당해 액체의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 실질적으로 유지하고, 그 침강을 방지하는 효과를 갖는 것이다. "액체의 점도를 실질적으로 높이지 않는다"란, 액체의 점도가 8 mPa·s 를 상회하지 않는 것을 의미한다. 이때의 당해 액체의 점도 (즉, 본 발명의 배지 조성물의 점도) 는 8 mPa·s 이하이고, 바람직하게는 4 mPa·s 이하이며, 보다 바람직하게는 2 mPa·s 이하이다. 또한, 당해 구조체를 액체 배지 중에 형성하고, 당해 액체의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시키는 (바람직하게는 부유 정치시키는) 효과를 나타내는 것이면, 특정 화합물의 화학 구조, 분자량, 물성 등은 전혀 제한되지 않다.
구조체를 포함하는 액체의 점도는, 예를 들어 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있다. 구체적으로는 37 ℃ 조건하에서 E 형 점도계 (토키 산업 주식회사 제조, TV-22 형 점도계, 기종 : TVE-22L, 콘 로터 : 표준 로터 1°34' x R24, 회전수 100 rpm) 를 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명에 사용하는 특정 화합물의 예로는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 고분자 화합물을 들 수 있고, 바람직하게는 음이온성 관능기를 갖는 고분자 화합물을 들 수 있다.
음이온성 관능기로는, 카르복실기, 술포기, 인산기 및 그들의 염을 들 수 있고, 카르복실기 또는 그 염이 바람직하다.
본 발명에 사용하는 고분자 화합물은, 상기 음이온성 관능기의 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 갖는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용하는 고분자 화합물의 바람직한 구체예로는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 단당류 (예를 들어, 트리오스, 테트로스, 펜토스, 헥소스, 헵토스 등) 가 10 개 이상 중합된 다당류를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 음이온성 관능기를 갖는 산성 다당류를 들 수 있다. 여기서 말하는 산성 다당류란, 그 구조 중에 음이온성 관능기를 가지면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 우론산 (예를 들어, 글루쿠론산, 이두론산, 갈락투론산, 만누론산) 을 갖는 다당류, 구조 중의 일부에 황산기 또는 인산기를 갖는 다당류, 혹은 그 양방의 구조를 갖는 다당류이고, 천연으로부터 얻어지는 다당류뿐만 아니라, 미생물에 의해 산생된 다당류, 유전자 공학적으로 산생된 다당류, 혹은 효소를 이용하여 인공적으로 합성된 다당류도 포함된다. 보다 구체적으로는, 히알루론산, 젤란검, 탈아실화젤란검 (이하, DAG 라고 하는 경우도 있다), 람산검, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난, 잔탄검, 헥수론산, 후코이단, 펙틴, 펙트산, 펙틴산, 헤파란황산, 헤파린, 헤파리틴황산, 케라토황산, 콘드로이틴황산, 데르마탄황산, 람난황산 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 1 종 또는 2 종 이상으로 구성되는 것이 예시된다. 다당류는, 바람직하게는 히알루론산, DAG, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난 또는 그들의 염이고, 저농도의 사용으로 세포 또는 조직을 부유시킬 수 있고, 또한 세포 또는 조직 회수의 용이함을 고려하면, 가장 바람직하게는 DAG 이다.
여기서 말하는 염이란, 예를 들어 리튬, 나트륨, 칼륨과 같은 알칼리 금속의 염, 칼슘, 바륨, 마그네슘과 같은 알칼리 토금속의 염 또는 알루미늄, 아연, 구리, 철, 암모늄, 유기 염기 및 아미노산 등의 염을 들 수 있다.
이들 고분자 화합물 (다당류 등) 의 중량 평균 분자량은, 바람직하게는 10,000 내지 50,000,000 이고, 보다 바람직하게는 100,000 내지 20,000,000, 더욱 바람직하게는 1,000,000 내지 10,000,000 이다. 예를 들어, 당해 분자량은 젤 침투 크로마토그래피 (GPC) 에 의한 풀루란 환산으로 측정할 수 있다.
또한, 후술하는 실시예에서 기재하는 바와 같이, DAG 는 인산화한 것을 사용할 수도 있다. 당해 인산화는 공지된 수법으로 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 상기 다당류를 복수종 (바람직하게는 2 종) 조합하여 사용할 수 있다. 다당류의 조합의 종류는, 상기 서술한 구조체를 액체 배지 중에 형성하고, 당해 액체 배지의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시키는 (바람직하게는 부유 정치시키는) 것이 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 당해 조합은 적어도 DAG 또는 그 염을 포함한다. 즉, 바람직한 다당류의 조합에는 DAG 또는 그 염, 및 DAG 또는 그 염 이외의 다당류 (예, 크산탄검, 알긴산, 카라기난, 디우탄검, 메틸셀룰로오스, 로커스트빈검 또는 그들의 염) 가 포함된다. 구체적인 다당류의 조합으로는, DAG 와 람산검, DAG 와 디우탄검, DAG 와 크산탄검, DAG 와 카라기난, DAG 와 잔탄컴, DAG 와 로커스트빈검, DAG 와 κ-카라기난, DAG 와 알긴산나트륨, DAG 와 메틸셀룰로오스 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않다.
본 발명에 사용하는 특정 화합물의 더욱 바람직한 구체예로는, 히알루론산, 탈아실화젤란검, 디우탄검, 카라기난 및 크산탄검 및 그들의 염을 들 수 있고, 배지 조성물의 점도를 낮게 할 수 있는 점과 세포 또는 조직 회수의 용이함의 점을 고려하면, 가장 바람직한 예로는 탈아실화젤란검 또는 그 염을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 탈아실화젤란검이란, 1-3 결합한 글루코오스, 1-4 결합한 글루쿠론산, 1-4 결합한 글루코오스 및 1-4 결합한 람노스의 4 분자의 당을 구성 단위로 하는 직사슬형의 고분자 다당류이고, 이하의 일반식 (I) 에 있어서 R1, R2 가 모두 수소 원자이고, n 은 2 이상의 정수로 나타내는 다당류이다. 단, R1 이 글리세릴기를, R2 가 아세틸기를 포함하고 있어도 되지만, 아세틸기 및 글리세릴기의 함유량은 바람직하게는 10 ％ 이하이고, 보다 바람직하게는 1 ％ 이하이다.
본 발명에 있어서의 구조체는 특정 화합물에 의해 여러 가지 형태가 되지만, 탈아실화젤란검의 경우에 대해 기재하면, 탈아실화젤란검은 액체 배지와 혼합했을 때에 액체 배지 중의 금속 이온 (예를 들어, 칼슘 이온) 을 흡수해, 당해 금속 이온을 개재한 부정형의 구조체를 형성하여, 세포 및/또는 조직을 부유시킨다. 탈아실화젤란검으로부터 조제되는 본 발명의 배지 조성물의 점도는 8 mPa·s 이하이고, 바람직하게는 4 mPa·s 이하이며, 세포 또는 조직 회수의 용이함의 점을 고려하면, 보다 바람직하게는 2 mPa·s 이하이다.
[화학식 1]
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본 발명에 있어서의 특정 화합물은 화학 합성법으로도 얻을 수 있지만, 당해 화합물이 천연물인 경우에는, 당해 화합물을 함유하고 있는 각종 식물, 각종 동물, 각종 미생물로부터 관용 기술을 이용하여 추출 및 분리 정제함으로써 얻는 것이 바람직하다. 그 추출에 있어서는, 물이나 초임계 가스를 사용하면 당해 화합물을 효율적으로 추출할 수 있다. 예를 들어, 젤란검의 제조 방법으로는, 발효 배지로 생산 미생물을 배양하고, 균체 외에 생산된 점막물을 통상적인 정제 방법으로 회수해, 건조, 분쇄 등의 공정 후, 분말상으로 하면 된다. 또, 탈아실화젤란검의 경우에는, 점막물을 회수할 때에 알칼리 처리를 실시하여, 1-3 결합한 글루코오스 잔기에 결합한 글리세릴기와 아세틸기를 탈아실화한 후에 회수하면 된다. 정제 방법으로는, 예를 들어 액-액 추출, 분별 침전, 결정화, 각종 이온 교환 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 등을 사용한 젤 여과 크로마토그래피, 활성탄, 실리카젤 등에 의한 흡착 크로마토그래피 혹은 박층 크로마토그래피에 의한 활성 물질의 흡탈착 처리, 혹은 역상 칼럼을 사용한 고속 액체 크로마토그래피 등을 단독 혹은 임의의 순서로 조합, 또 반복해 사용함으로써 불순물을 제거해 정제할 수 있다. 젤란검의 생산 미생물의 예로는 이것에 한정되는 것은 아니지만, 스핑고모나스 엘로디아 (Sphingomonas elodea) 및 당해 미생물의 유전자를 개변한 미생물을 들 수 있다.
그리고, 탈아실화젤란검의 경우, 시판되는 것, 예를 들어 산쇼 주식회사 제조 "KELCOGEL (시피 켈코사의 등록상표) CG-LA", 산에이겐 에프에프아이 주식회사 제조 "켈코겔 (시피 켈코사의 등록상표)"등을 사용할 수 있다. 또, 네이티브형 젤란검으로서 산에이겐 에프에프아이 주식회사 제조 "켈코겔 (시피 켈코사의 등록상표) HT"등을 사용할 수 있다.
배지 중에서의 특정 화합물의 농도는 특정 화합물의 종류에 의존하고, 특정 화합물이 상기 서술한 구조체를 액체 배지 중에 형성하고, 당해 액체 배지의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시키는 (바람직하게는 부유 정치시키는) 것이 가능한 범위에서 적절히 설정할 수 있지만, 통상 0.0005 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.001 ％ 내지 0.4 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량), 더욱 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.05 ％ (중량/용량) 가 되도록 하면 된다. 예를 들어, 탈아실화젤란검의 경우 0.001 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.003 ％ 내지 0.5 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량), 더욱 바람직하게는 0.01 ％ 내지 0.05 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.01 ％ 내지 0.03 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 크산탄검의 경우, 0.001 ％ 내지 5.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.01 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.05 ％ 내지 0.5 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.1 ％ 내지 0.2 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. κ-카라기난 및 로커스트빈검 혼합계의 경우, 0.001 ％ 내지 5.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.005 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.01 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.03 ％ 내지 0.05 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 네이티브형 젤란검의 경우, 0.05 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.05 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다.
상기 다당류를 복수종 (바람직하게는 2 종) 조합하여 사용하는 경우, 당해 다당류의 농도는 당해 다당류의 조합이 상기 서술한 구조체를 액체 배지 중에 형성하고, 당해 액체 배지의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시키는 (바람직하게는 부유 정치시키는) 것이 가능한 범위에서 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, DAG 또는 그 염과, DAG 또는 그 염 이외의 다당류의 조합을 사용하는 경우, DAG 또는 그 염의 농도로는 0.005 ∼ 0.02 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.01 ∼ 0.02 ％ (중량/용량) 가 예시되고, DAG 또는 그 염 이외의 다당류의 농도로는 0.005 ∼ 0.4 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.1 ∼ 0.4 ％ (중량/용량) 가 예시된다. 구체적인 농도 범위의 조합으로는 이하가 예시된다.
DAG 또는 그 염 : 0.005 ∼ 0.02 ％ (바람직하게는 0.01 ∼ 0.02 ％) (중량/용량)
DAG 이외의 다당류
크산탄검 : 0.1 ∼ 0.4 ％ (중량/용량)
알긴산나트륨 : 0.1 ∼ 0.4 ％ (중량/용량)
로커스트빈검 : 0.1 ∼ 0.4 ％ (중량/용량)
메틸셀룰로오스 : 0.1 ∼ 0.4 ％ (중량/용량) (바람직하게는 0.2 ∼ 0.4 ％ (중량/용량))
카라기난 : 0.05 ∼ 0.1 ％ (중량/용량)
디우탄검 : 0.05 ∼ 0.1 ％ (중량/용량)
또한 그 농도는, 이하의 식으로 산출할 수 있다.
농도 (％) = 특정 화합물의 중량 (g)/배지 조성물의 용량 (㎖) x 100
상기 화합물은 화학 합성법에 의해 더 다른 유도체로 바꿀 수도 있고, 그와 같이 하여 얻은 당해 유도체도 본 발명에 있어서 유효하게 사용할 수 있다. 구체적으로는, 탈아실화젤란검의 경우 그 일반식 (I) 로 나타내는 화합물의 R1 및/또는 R2 에 해당하는 수산기를 C1-3 알콕시기, C1-3 알킬술포닐기, 글루코오스 혹은 프룩토오스 등의 단당 잔기, 수크로오스, 락토오스 등의 올리고당 잔기, 글리신, 아르기닌 등의 아미노산 잔기 등으로 치환한 유도체도 본 발명에 사용할 수 있다. 또, 1-에틸-3-(3-디-메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC) 등의 크로스링커를 이용하여 당해 화합물을 가교할 수도 있다.
본 발명에 사용되는 특정 화합물 혹은 그 염은 제조 조건에 따라 임의의 결정형으로서 존재할 수 있고, 임의의 수화물로서 존재할 수 있지만, 이들 결정형이나 수화물 및 그들의 혼합물도 본 발명의 범위에 함유된다. 또, 아세톤, 에탄올, 테트라하이드로푸란 등의 유기 용매를 포함하는 용매화물로서 존재하는 경우도 있지만, 이들 형태는 모두 본 발명의 범위에 함유된다.
본 발명에 사용되는 특정 화합물은, 고리 내 혹은 고리 외 이성화에 의해 생성되는 호변 이성체, 기하 이성체, 호변 이성체 혹은 기하 이성체의 혼합물, 또는 그들의 혼합물의 형태로 존재해도 된다. 본 발명의 화합물은, 이성화에 의해 생기는지의 여부를 불문하고, 부제 중심을 갖는 경우에는 분할된 광학 이성체 혹은 그것들을 임의의 비율로 포함하는 혼합물의 형태로 존재하면 된다.
본 발명의 배지 조성물에는, 금속 이온, 예를 들어 2 가의 금속 이온 (칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온 및 구리 이온 등) 이 존재해도 되고, 바람직하게는 칼슘 이온을 함유한다. 당해 금속 이온은, 예를 들어 칼슘 이온과 마그네슘 이온, 칼슘 이온과 아연 이온, 칼슘 이온과 철 이온, 칼슘 이온과 구리 이온과 같이, 2 종류 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 당업자는 적절히 그 조합을 결정할 수 있다. 일양태에 있어서, 배지 조성물에 금속 이온이 포함됨으로써, 고분자 화합물이 금속 이온을 개재하여 집합하여, 고분자 화합물이 삼차원 네트워크를 형성함으로써 (예를 들어, 다당류가 금속 이온을 개재하여 마이크로겔을 형성함으로써) 본 발명의 구조체가 형성된다. 금속 이온의 농도는, 특정 화합물이 상기 서술한 구조체를 액체 배지 중에 형성하고, 당해 액체 배지의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시키는 (바람직하게는 부유 정치시키는) 것이 가능한 범위에서 적절히 설정할 수 있다. 염 농도는 0.1 mM 내지 300 mM 이고, 바람직하게는 0.5 mM 내지 100 mM 이지만, 이들에 한정되지 않다. 당해 금속 이온은 배지와 함께 혼합하거나, 혹은 염 용액을 별도로 조제해 두고, 배지에 첨가해도 된다. 또 본 발명의 배지 조성물에는, 후술하는 세포 외 매트릭스, 접착 분자 등을 포함해도 된다.
본 발명은, 당해 배지 조성물을 이용하여 세포 또는 조직을 증식시키는 배양 방법, 얻어지는 세포 또는 조직을, 예를 들어 여과, 원심 분리 또는 자성 분리에 의해 회수하는 방법, 당해 배지 조성물을 이용하여 스피어를 제조하는 방법도 포함한다.
본 발명에서 사용하는 특정 화합물로 구성된 구조체는, 세포 및/또는 조직을 생체 외에서 배양했을 때, 당해 세포 및/또는 조직을 당해 특정 화합물의 구조체를 함유하는 액체 중에서 부유시키는 효과 (바람직하게는 부유 정치시키는 효과) 를 나타내는 것이다. 당해 부유 효과에 의해, 단층 배양에 비해 일정 체적당 세포 및/또는 조직을 증가시켜 배양할 수 있다. 또, 종래의 부유 배양 방법에 있어서 회전이나 진탕 조작을 수반하는 경우, 세포 및/또는 조직에 대한 전단력이 작용하기 때문에 세포 및/또는 조직의 증식률이나 회수율이 낮거나, 혹은 세포의 기능이 손상되는 경우가 있지만, 본 발명의 특정 화합물의 구조체를 함유하는 배지 조성물을 사용함으로써 진탕 등의 조작을 실시하지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 분산시킬 수 있기 때문에, 목적으로 하는 세포 및/또는 조직을 세포 기능의 손실없이 용이하고 또한 대량으로 취득할 수 있다. 또, 종래의 젤 기재를 포함하는 배지에 있어서 세포 및/또는 조직을 부유 배양할 때, 세포 및/또는 조직의 관찰이나 회수가 곤란하거나, 회수시에 그 기능을 손상시키거나 하는 경우가 있지만, 본 발명의 특정 화합물의 구조체를 함유하는 배지 조성물을 사용함으로써, 세포 및/또는 조직을 부유 배양하고, 그 기능을 손상시키지 않고 관찰하고, 회수할 수 있다. 또, 종래의 젤 기재를 포함하는 배지는, 점도가 높아 배지의 교환이 곤란한 경우가 있지만, 본 발명의 특정 화합물의 구조체를 함유하는 배지 조성물은, 저점도이기 때문에 피펫이나 펌프 등을 이용하여 용이하게 배지를 교환할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 배양된 인간 유래의 세포 및/또는 조직은, 질환이나 장애를 갖는 환자에 대해 치료 목적으로 이식할 수 있다. 이때, 치료의 대상으로 하는 질환이나 장애의 종류, 전처치 방법 그리고 세포 이식 방법은 당사자에 의해 적절히 선택된다. 이식된 세포의 레시피언트로의 생착과 질환이나 장애로부터의 회복이나, 이식에 수반하는 부작용의 유무, 치료의 효과는, 이식 치료에 있어서의 일반적인 방법에 의해 적절히 검사되고, 판단할 수 있다.
또한, 본 발명 방법에 의해 세포 및/또는 조직이 효율적으로 증식되기 때문에, 본 발명에 있어서의 특정 화합물 및 그 구조체를 함유하는 배지 조성물은 세포의 연구용 시약으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포나 조직의 분화나 증식을 조절하는 인자를 해명할 때, 세포와 목적하는 인자를 공존시켜 배양했을 때의 세포의 수나 종류, 세포 표면 분화 마커나 발현 유전자의 변화를 해석하지만, 이때에 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 해석 대상이 되는 세포의 수를 효율적으로 증폭시킬 뿐만 아니라, 효율적으로 회수할 수 있다. 목적으로 하는 인자를 해명할 때의 배양 조건, 배양 장치, 배지의 종류, 본 발명 화합물의 종류, 특정 화합물의 함량, 첨가물의 종류, 첨가물의 함량, 배양 기간, 배양 온도 등은, 본 명세서에 기재한 범위로부터 당사자에 의해 적절히 선택된다. 배양에 의해 증식 혹은 출현한 세포는, 당해 분야에서 표준적인 현미경을 이용하여 관찰할 수 있다. 이때, 배양한 세포에 대해 특이적 항체를 이용하여 염색해도 된다. 목적하는 인자에 의해 변화한 발현 유전자는, 배양한 세포로부터 DNA (디옥시리보핵산) 혹은 RNA (리보핵산) 를 추출해 서던 블로팅법, 노던 블로팅법, RT-PCR 법 등에 의해 검출할 수 있다. 또, 세포 표면 분화 마커는, 특이적 항체를 이용하여 ELISA 나 플로우 사이토메트리에 의해 검출해, 목적하는 인자에 의한 분화나 증식에 대한 효과를 관찰할 수 있다.
본 발명의 배양 방법을 이용하여 세포 및/또는 조직을 배양할 때에는, 세포의 배양에 일반적으로 사용되는 샬레, 플라스크, 플라스틱 백, 테플론 (등록상표) 백, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 세포 배양 플라스크, 스피너 플라스크, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀 등의 배양 기재를 이용하여 배양할 수 있다. 이들 배양 기재의 재질은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 유리, 폴리염화비닐, 에틸셀룰로오스나 아세틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스계 폴리머, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 폴리술폰, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부타디엔, 폴리(에틸렌-비닐아세테이트) 코폴리머, 폴리(부타디엔-스티렌) 코폴리머, 폴리(부타디엔-아크릴로니트릴) 코폴리머, 폴리(에틸렌-에틸아크릴레이트) 코폴리머, 폴리(에틸렌-메타아크릴레이트) 코폴리머, 폴리클로로프렌, 스티롤 수지, 클로로술폰화폴리에틸렌, 에틸렌아세트산비닐, 아크릴계 블록 코폴리머 등의 플라스틱 등을 들 수 있다. 이들 플라스틱은, 산소나 이산화탄소 등의 가스 투과성이 우수할 뿐만 아니라, 공업적으로 성형 가공성이 우수하고, 각종 멸균 처리에 견딜 수 있는 것이고, 또한 배양 기재 내부의 상태를 관찰할 수 있는 투명성의 재질인 것이 바람직하다. 여기서, 멸균 처리를 실시하는 방법은 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 방사선 멸균, 에틸렌옥사이드 가스 멸균, 오토클레이브 멸균 등을 들 수 있다. 또, 이들 플라스틱에 대해 여러 가지 표면 처리 (예를 들어, 플라즈마 처리, 코로나 처리 등) 를 실시해도 된다. 또한, 이들 배양 기재에 대해서는, 미리 세포 외 매트릭스나 세포 접착 분자 등을 코팅해도 된다. 이와 같은 코팅 재료로는, 콜라겐 I 내지 XIX, 젤라틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌-1 내지 12, 니토젠, 테나신, 트롬보스폰딘, 폰 빌브란드 (von Willebrand) 인자, 오스테오폰틴, 피브리노겐, 각종 엘라스틴, 각종 프로테오글리칸, 각종 카드헤린, 데스모콜린, 데스모글레인, 각종 인테그린, E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 면역 글로불린, 히알루론산, 슈퍼패밀리, 마트리겔, 폴리-D-리신, 폴리-L-리신, 키틴, 키토산, 세파로스, 알긴산젤, 하이드로젤, 또한 이들의 절단 단편 등을 들 수 있다. 이들 코팅 재료는 유전자 재조합 기술에 의해 아미노산 배열을 인위적으로 개변시킨 것도 사용할 수 있다. 또, 세포 및/또는 조직의 배양 기재에 대한 접착을 저해하기 위한 코팅 재료를 사용할 수도 있다. 이와 같은 코팅 재료로는, 실리콘, 폴리(2-하이드록시메틸메타크릴레이트), 폴리(2-메톡시메틸아크릴레이트), 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린), 폴리-N-이소프로필아크릴아미드, 메비올겔 (등록상표) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
세포 및/또는 조직의 배양은, 기계적 제어하에 폐쇄 환경하에서 세포 파종, 배지 교환, 세포 화상 취득, 배양 세포 회수를 자동으로 실행하고, pH, 온도, 산소 농도 등을 제어하면서, 고밀도로의 배양이 가능한 바이오리액터나 자동 배양 장치에 의해 실시할 수도 있다. 이들 장치를 이용하여 배양 도중에 새로운 배지를 보급해, 요구하는 물질을 과부족없이 세포 및/또는 조직에 공급하는 수법으로서 유가 배양, 연속 배양 및 관류 배양이 있지만, 어느 수법도 본 발명의 배양 방법에 사용할 수 있다. 또, 바이오리액터나 자동 배양 장치에 사용되는 배양 용기에는, 개폐가 용이하고 외계와의 접촉 면적이 큰 개방계 배양 용기 (예를 들어 뚜껑을 갖는 배양 용기) 와, 개폐가 용이하지 않고 외계와의 접촉 면적이 작은 폐쇄계 배양 용기 (예를 들어 카트리지형 배양 용기) 가 있지만, 어느 배양 용기도 본 발명의 배양 방법에 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 특정 화합물을 이용하여 세포 및/또는 조직을 배양할 때에는, 세포 및/또는 조직을 배양할 때에 사용되는 배지와 특정 화합물을 혼합해 배지 조성물을 조제할 수 있다. 이와 같은 배지 조성에 의한 분류로는 천연 배지, 반합성 배지, 합성 배지, 또 형상에 의한 분류로는 반고형 배지, 액체 배지, 분말 배지 (이하, 가루 배지라고 하는 경우도 있다) 등을 들 수 있다. 세포 및/또는 조직이 동물 유래인 경우, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지이면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 이와 같은 배지로는, 예를 들어 둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagles's Medium ; DMEM), 함 F12 배지 (Ham's Nutrient Mixture F12), DMEM/F12 배지, 맥코이 5A 배지 (McCoy's 5A medium), 이글 MEM 배지 (Eagles's Minimum Essential Medium ; EMEM), αMEM 배지 (alpha Modified Eagles's Minimum Essential Medium ; αMEM), MEM 배지 (Minimum Essential Medium), RPMI1640 배지, 이스코브 개변 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium ; IMDM), MCDB131 배지, 윌리엄 배지 E, IPL41 배지, Fischer's 배지, StemPro34 (인비트로젠사 제조), X-VIVO 10 (켐브렉스사 제조), X-VIVO 15 (켐브렉스사 제조), HPGM (켐브렉스사 제조), StemSpan H3000 (스템셀 테크놀로지사 제조), StemSpanSFEM (스템셀 테크놀로지사 제조), StemlineII (시그마알드리치사 제조), QBSF-60 (퀄리티바이오로지칼사 제조), StemProhESCSFM (인비트로젠사 제조), Essential8 (등록상표) 배지 (Gibco 제조), mTeSR1 혹은 2 배지 (스템셀 테크놀로지사 제조), 리프로 FF 혹은 리프로 FF2 (리프로셀사 제조), PSGro hESC/iPSC 배지 (시스템바이오사이언스사 제조), NutriStem (등록상표) 배지 (바이오로지컬 인더스트리즈사 제조), CSTI-7 배지 (세포 과학 연구소사 제조), MesenPRO RS 배지 (Gibco 제조), MF-Medium (등록상표) 간엽계 줄기세포 증식 배지 (토요보 주식회사 제조), Sf-900II (인비트로젠사 제조), Opti-Pro (인비트로젠사 제조) 등을 들 수 있다.
암세포의 배양에 사용되는 배지에는, 상기 배지에 세포 접착 인자를 포함하는 것이 가능하고, 그 예로는 마트리겔, 콜라겐젤, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴을 들 수 있다. 이들 세포 접착 인자는, 2 종류 이상을 조합하여 첨가할 수도 있다. 또한, 암세포 스피어의 배양에 사용되는 배지에 대해 구아검, 타마린드검, 알긴산프로필렌글리콜에스테르, 로커스트빈검, 아라비아검, 타라검, 타마린드검, 메틸셀룰로오스 등의 증점제를 추가로 혼합할 수 있다.
간세포의 배양에 사용되는 배지로는, 상기 배지에 추가로 HepatoZYME-SFM (라이프테크놀로지스사 제조), HCM (등록상표)-간세포 배양 배지 BulletKit (등록상표, 론자사 제조), HBM (등록상표)-간세포 기본 배지 (론자사 제조), HMM (등록상표)-간세포 메인터넌스 배지 (론자사 제조), 변법 란포드 배지 (닛스이 제약 주식회사 제조), ISOM's 배지, 간세포 증식 배지 (타카라 바이오 주식회사 제조), 간세포 유지 배지 (타카라 바이오 주식회사 제조), 간세포 기본 배지 (타카라 바이오 주식회사 제조), 활성 유지 슈퍼 배지 (In Vitro ADMET Laboratories 사 제조) 등을 들 수 있다. 이들 배지에는 세포 접착 인자를 포함할 수 있고, 그 예로는 마트리겔, 콜라겐젤, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴을 들 수 있다. 이들 세포 접착 인자는 2 종류 이상을 조합하여 첨가할 수도 있다. 또한, 암세포 또는 간세포의 스피어 배양에 사용되는 배지에 대해 구아검, 타마린드검, 알긴산프로필렌글리콜에스테르, 로커스트빈검, 아라비아검, 타라검, 타마린드검, 메틸셀룰로오스 등의 증점제를 추가로 혼합할 수 있다.
세포 및/또는 조직이 식물 유래인 경우, 식물 조직 배양에 통상 사용되는 무라시게 스쿠그 (MS) 배지, 린즈마이어 스쿠그 (LS) 배지, 화이트 배지, 감보그 B5 배지, 니체 배지, 헬라 배지, 모렐 배지 등의 기본 배지, 혹은 이들 배지 성분을 지적 농도로 수정한 수정 배지 (예를 들어, 암모니아태 질소 농도를 절반으로 하는 등) 에, 옥신류 및 필요에 따라 시토키닌류 등의 식물 생장 조절 물질 (식물 호르몬) 을 적당한 농도로 첨가한 배지를 배지로서 예시할 수 있다. 이들 배지에는, 필요에 따라 카세인 분해 효소, 옥수수 침지액, 비타민류 등을 추가로 보충할 수 있다. 옥신류로는, 예를 들어 3-인돌아세트산 (IAA), 3-인돌부티르산 (IBA), 1-나프탈렌아세트산 (NAA), 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D) 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되지 않다. 옥신류는, 예를 들어 약 0.1 ∼ 약 10 ppm 의 농도로 배지에 첨가될 수 있다. 시토키닌류로는, 예를 들어 키네틴, 벤질아데닌 (BA), 제아틴 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되지 않다. 시토키닌류는, 예를 들어 약 0.1 ∼ 약 10 ppm 의 농도로 배지에 첨가될 수 있다.
상기 배지에는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 인, 염소, 각종 아미노산, 각종 비타민, 항생 물질, 혈청, 지방산, 당 등을 당업자는 목적에 따라 자유롭게 첨가해도 된다. 동물 유래의 세포 및/또는 조직 배양시에는, 당업자는 목적에 따라 기타 화학 성분 혹은 생체 성분을 1 종류 이상 조합하여 첨가할 수도 있다.
동물 유래의 세포 및/또는 조직의 배지에 첨가되는 성분으로는, 소 태아 혈청, 인간 혈청, 말 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 락토페린, 콜레스테롤, 에탄올아민, 아셀렌산나트륨, 모노티오글리세롤, 2-메르캅토에탄올, 소 혈청 알부민, 피루브산나트륨, 폴리에틸렌글리콜, 각종 비타민, 각종 아미노산, 한천, 아가로스, 콜라겐, 메틸셀룰로오스, 각종 시토카인, 각종 호르몬, 각종 증식 인자, 각종 세포 외 매트릭스나 각종 세포 접착 분자 등을 들 수 있다. 배지에 첨가되는 시토카인으로는, 예를 들어 인터류킨-1 (IL-1), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-5 (IL-5), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-7 (IL-7), 인터류킨-8 (IL-8), 인터류킨-9 (IL-9), 인터류킨-10 (IL-10), 인터류킨-11 (IL-11), 인터류킨-12 (IL-12), 인터류킨-13 (IL-13), 인터류킨-14 (IL-14), 인터류킨-15 (IL-15), 인터류킨-18 (IL-18), 인터류킨-21 (IL-21), 인터페론-α (IFN-α), 인터페론-β (IFN-β), 인터페론-γ (IFN-γ), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 단구 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 과립구-매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 줄기세포 인자 (SCF), flk2/flt3 리간드 (FL), 백혈병 세포 저해 인자 (LIF), 온코스타틴M (OM), 에리트로포이에틴 (EPO), 트롬보포이에틴 (TPO) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
배지에 첨가되는 호르몬으로는, 멜라토닌, 세로토닌, 티록신, 트리요오드티로닌, 에피네프린, 노르에피네프린, 도파민, 항뮐러관 호르몬, 아디포넥틴, 부신피질 자극 호르몬, 안지오텐시노젠 및 안지오텐신, 항이뇨 호르몬, 심방 나트륨 이뇨성 펩티드, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 에리트로포이에틴, 난포 자극 호르몬, 가스트린, 그렐린, 글루카곤, 고나도트로핀 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 인간 융모성 고나도트로핀, 인간 태반성 락토겐, 성장 호르몬, 인히빈, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 렙틴, 황체 형성 호르몬, 멜라닌 세포 자극 호르몬, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, 프로락틴, 세크레틴, 소마토스타틴, 트롬보포이에틴, 갑상선 자극 호르몬, 티로트로핀 방출 호르몬, 코르티솔, 알도스테론, 테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 에스트라디올, 에스트론, 에스트리올, 프로게스테론, 칼시트리올, 칼시디올, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 프로스타사이클린, 트롬복산, 프로락틴 방출 호르몬, 리포트로핀, 뇌나트륨 이뇨 펩티드, 신경 펩티드 Y, 히스타민, 엔도셀린, 췌장 폴리펩티드, 레닌, 및 엔케팔린을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
배지에 첨가되는 증식 인자로는, 트랜스포밍 성장 인자-α (TGF-α), 트랜스포밍 성장 인자-β (TGF-β), 매크로파지 염증 단백질-1α (MIP-1α), 상피 세포 증식 인자 (EGF), 섬유아 세포 증식 인자-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 (FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), 신경세포 증식 인자 (NGF) 간세포 증식 인자 (HGF), 백혈병 저지 인자 (LIF), 프로테아제 넥신 I, 프로테아제 넥신 II, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 콜린 작동성 분화 인자 (CDF), 케모카인, Notch 리간드 (Delta1 등), Wnt 단백질, 앙기오포이에틴 유사 단백질 2, 3, 5 또는 7 (Angpt2, 3, 5, 7), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP), 플레이오트로핀 (Pleiotrophin) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또, 유전자 재조합 기술에 의해 이들의 시토카인이나 증식 인자의 아미노산 배열을 인위적으로 개변시킨 것도 첨가시킬 수도 있다. 그 예로는, IL-6/가용성 IL-6 수용체 복합체 혹은 Hyper IL-6 (IL-6 과 가용성 IL-6 수용체의 융합 단백질) 등을 들 수 있다.
각종 세포 외 매트릭스나 각종 세포 접착 분자의 예로는, 콜라겐 I 내지 XIX, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌-1 내지 12, 니토젠, 테나신, 트롬보스폰딘, 폰 빌브란드 (von Willebrand) 인자, 오스테오폰틴, 피브리노겐, 각종 엘라스틴, 각종 프로테오글리칸, 각종 카드헤린, 데스모콜린, 데스모글레인, 각종 인테그린, E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 면역 글로불린 슈퍼패밀리, 마트리겔, 폴리-D-리신, 폴리-L-리신, 키틴, 키토산, 세파로스, 히알루론산, 알긴산젤, 각종 하이드로젤, 또한 이들의 절단 단편 등을 들 수 있다.
배지에 첨가되는 항생 물질의 예로는, 설파 제제, 페니실린, 페네티실린, 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 나프실린, 암피실린, 페니실린, 아목시실린, 시클라실린, 카르베니실린, 티카르실린, 피페라실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 메실리남, 안디노실린, 세팔로스포린 및 그 유도체, 옥소인산, 아미플록사신, 테마플록사신, 날리딕스산, 피로미드산, 시프로플록사신, 시녹사신, 노르플록사신, 퍼플록사신, 로작사신, 오플록사신, 에녹사신, 피페미드산, 술박탐, 클라불란산, β-브로모페니실란산, β-클로로페니실란산, 6-아세틸메틸렌-페니실란산, 세폭사졸, 술탐피실린, 아디노시린 및 술박탐의 포름알데히드·후드레이트에스테르, 타조박탐, 아즈트레오남, 술파제틴, 이소술파제틴, 노르카디신, m-카르복시페닐, 페닐아세트아미드포스폰산메틸, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 테트라사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린, 그리고 미노사이클린을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 특정 화합물을 상기 배지에 첨가하는 경우에는, 먼저 적절한 용매로 당해 특정 화합물을 용시 (用時) 용해 또는 분산시킨다 (이것을 배지 첨가제로 한다). 그 후, 배지 중에서의 특정 화합물 농도로서, 위에서 상세히 서술한 바와 같이 당해 액체 배지의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시키는 (바람직하게는 부유 정치시키는) 것이 가능한 농도, 예를 들어 0.0005 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.001 ％ 내지 0.4 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량), 더욱 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.05 ％ (중량/용량) 가 되도록 당해 배지 첨가제를 배지 중에 첨가하면 된다. 예를 들어, 탈아실화젤란검의 경우, 0.001 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.003 ％ 내지 0.5 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.01 ％ 내지 0.03 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 또, 다른 국면에서는, 탈아실화젤란검의 경우 0.0005 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.001 ％ 내지 0.5 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.003 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.03 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 크산탄검의 경우, 0.001 ％ 내지 5.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.01 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.05 ％ 내지 0.5 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.1 ％ 내지 0.2 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. κ-카라기난 및 로커스트빈검 혼합계의 경우, 0.001 ％ 내지 5.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.005 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.01 ％ 내지 0.1 ％, 가장 바람직하게는 0.03 ％ 내지 0.05 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 탈아실화젤란검과 디우탄검의 혼합계의 경우, 0.001 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.01 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 탈아실화젤란검과 메틸셀룰로오스의 혼합계의 경우, 0.001 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.2 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 탈아실화젤란검과 로커스트빈검의 혼합계의 경우, 0.001 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.01 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 탈아실화젤란검과 알긴산나트륨의 혼합계의 경우, 0.001 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.01 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 탈아실화젤란검과 크산탄검의 혼합계의 경우, 0.001 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.01 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 탈아실화젤란검과 κ-카라기난의 혼합계의 경우, 0.001 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 가장 바람직하게는 0.01 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량) 배지 중에 첨가하면 된다. 또한 그 농도는 이하의 식으로 산출할 수 있다.
농도 (％) = 특정 화합물의 중량 (g)/배지 조성물의 용량 (㎖) x 100
여기서, 배지 첨가제에 사용하는 적절한 용매의 예로는, 물, 디메틸술폭시드 (DMSO), 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 등의 각종 알코올 등의 수성 용매를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이때, 특정 화합물 농도는 0.001 ％ 내지 5.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.01 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.1 ％ 내지 0.6 ％ (중량/용량) 로 하는 것이 바람직하다. 그때, 당해 특정 화합물의 효과를 높이거나, 사용할 때의 농도를 낮추거나 하는 첨가물을 추가로 첨가할 수도 있다. 이와 같은 첨가제의 예로서 구아검, 타마린드검, 알긴산프로필렌글리콜에스테르, 로커스트빈검, 아라비아검, 타라검, 타마린드검, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 아가로스, 타마린드시드검, 풀루란 등의 다당류를 1 종 이상 혼합할 수 있다. 또, 당해 특정 화합물을 배양시에 담체 표면 상에 고정화 혹은, 담체 내부에 담지해 사용할 수도 있다. 당해 특정 화합물은, 제공시 혹은 보존시에 임의의 형상일 수 있다. 당해 특정 화합물은 정제, 환제, 캡슐제, 과립제와 같은 제제화된 고체, 적절한 용매 그리고 용해제로 용해한 용액 혹은 현탁액과 같은 액체, 또는 기판이나 단체에 결합시킨 상태일 수 있다. 제제화될 때의 첨가물로는, p-하이드록시벤조산에스테르류 등의 방부제 ; 젖당, 포도당, 자당, 마니트 등의 부형제 ; 스테아르산마그네슘, 탤크 등의 활택제 ; 폴리비닐알코올, 하이드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제 ; 지방산에스테르 등의 계면활성제 ; 글리세린 등의 가소제 등을 들 수 있다. 이들 첨가물은 상기한 것에 한정되는 것은 아니고, 당업자가 이용 가능하면 자유롭게 선택할 수 있다. 또, 본 발명에 있어서의 특정 화합물은 필요에 따라 멸균 처리를 실시해도 된다. 멸균 방법은 특별히 제한은 없고, 예를 들어 방사선 멸균, 에틸렌옥사이드 가스 멸균, 오토클레이브 멸균, 필터 멸균 등을 들 수 있다. 필터 멸균 (이하, 여과 멸균이라고 하는 경우도 있다) 을 실시할 때의 필터 부분의 재질은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 유리 섬유, 나일론, PES (폴리에테르술폰), 친수성 PVDF (폴리불화비닐리덴), 셀룰로오스 혼합 에스테르, 셀룰로오스아세테이트, 폴리테트라플루오로에틸렌 등을 들 수 있다. 필터의 세공 크기는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.1 ㎛ 내지 10 ㎛, 보다 바람직하게는 0.1 ㎛ 내지 1 ㎛, 가장 바람직하게는 0.1 ㎛ 내지 0.5 ㎛ 이다. 이들 멸균 처리는, 특정 화합물이 고형이어도 되고 용액 상태여도 된다.
상기 조제에 의해 특정 화합물의 용액 또는 분산액을 액체 배지에 첨가함으로써 액체 배지 중에 상기 구조체가 형성되어, 본 발명의 배지 조성물을 얻을 수 있다. 배지에는 통상, 고분자 화합물이 이온을 개재하여 집합, 혹은 고분자 화합물이 삼차원의 네트워크를 형성하는 데에 충분한 농도의 금속 이온이 포함되므로, 본 발명의 특정 화합물의 용액 또는 분산액을 액체 배지에 첨가하는 것만으로 본 발명의 배지 조성물을 얻을 수 있다. 혹은, 배지 첨가제 (특정 화합물의 용액 또는 분산액) 에 배지를 첨가해도 된다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은, 특정 화합물과 배지 성분을 수성 용매 (예를 들어 이온 교환수나 초순수 등을 포함하는 물) 중에서 혼합하여 조제할 수도 있다. 혼합의 양태로는, (1) 액체 배지와 배지 첨가제 (용액) 를 혼합하거나, (2) 액체 배지에 상기 고분자 화합물 (분말 등의 고체) 을 혼합하거나, (3) 배지 첨가제 (용액) 에 분말 배지를 혼합하거나, (4) 분말 배지 및 상기 고분자 화합물 (분말 등의 고체) 을 수성 용매와 혼합하거나 하는 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 배지 조성물에 있어서의 특정 화합물의 분포가 불균일해지는 것을 방지하기 위해, (1) 혹은 (4) 또는 (1) 혹은 (3) 의 양태가 바람직하다.
특정 화합물을 용매 (예, 물, 액체 배지 등의 수성 용매) 에 용해하거나, 또는 특정 화합물 및 분말 배지를 용매에 용해할 때, 용해 촉진을 위해 당해 혼합액을 가열하는 것이 바람직하다. 가열하는 온도로는, 예를 들어 80 ℃ ∼ 130 ℃, 바람직하게는 가열 멸균되는 100 ℃ ∼ 125 ℃ (예, 121 ℃) 를 들 수 있다. 가열 후, 얻어진 특정 화합물의 용액을 실온까지 냉각한다. 당해 용액에 상기 서술한 금속 이온을 첨가함으로써 (예를 들어, 당해 용액을 액체 배지에 첨가함으로써), 당해 특정 화합물로 구성된 상기 구조체가 형성된다. 혹은, 특정 화합물을 상기 서술한 금속 이온을 포함하는 용매 (예, 물, 액체 배지 등의 수성 용매) 에 용해할 때에, 가열 (예를 들어 80 ℃ ∼ 130 ℃, 바람직하게는 100 ℃ ∼ 125 ℃ (예, 121 ℃)) 하고, 얻어진 용액을 실온까지 냉각함으로써도 당해 특정 화합물로 구성된 상기 구조체가 형성된다.
본 발명의 배지 조성물의 조제 방법을 예시하지만, 본 발명은 이것에 의해 한정되는 것은 아니다. 특정 화합물을 이온 교환수 혹은 초순수에 첨가한다. 그리고, 당해 특정 화합물을 용해할 수 있는 온도 (예를 들어, 60 ℃ 이상, 80 ℃ 이상, 90 ℃ 이상) 에서 가열하면서 교반해 투명한 상태가 될 때까지 용해시킨다. 용해 후, 교반하면서 방랭하고, 멸균 (예를 들어, 121 ℃ 에서 20 분으로의 오토클레이브 멸균) 을 실시한다. 실온으로 되돌린 후, 정치 배양에 사용하는 임의의 배지를 교반 (예를 들어, 호모믹서 등) 하면서, 당해 배지에 상기 멸균 후의 수용액을 첨가해, 당해 배지와 균일하게 되도록 혼합한다. 본 수용액과 배지의 혼합 방법은 특별히 제한은 없고, 예를 들어 피펫팅 등의 수동으로의 혼합, 마그네틱 스터러나 메커니컬 스터러, 호모믹서, 호모게나이저 등의 기기를 사용한 혼합을 들 수 있다. 또, 혼합 후에 본 발명의 배지 조성물을 필터로 여과해도 된다. 여과 처리를 할 때에 사용하는 필터의 세공 크기는 5 ㎛ 내지 100 ㎛, 바람직하게는 5 ㎛ 내지 70 ㎛, 보다 바람직하게는 10 ㎛ 내지 70 ㎛ 이다.
혹은, 분말 배지 및 상기 고분자 화합물 (분말 등의 고체) 을 수성 용매와 혼합하고, 상기 온도에서 가열함으로써 본 발명의 배지 조성물을 조제한다.
예를 들어, 탈아실화젤란검을 조제하는 경우, 0.1 ％ 내지 1 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.2 ％ 내지 0.5 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.3 ％ 내지 0.4 ％ (중량/용량) 가 되도록 이온 교환수 혹은 초순수에 탈아실화젤란검을 첨가한다. 또, 다른 국면에서는 탈아실화젤란검을 조제하는 경우, 0.1 ％ 내지 1 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.2 ％ 내지 0.8 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.3 ％ 내지 0.6 ％ (중량/용량) 가 되도록 이온 교환수 혹은 초순수에 탈아실화젤란검을 첨가한다.
그리고, 상기 탈아실화젤란검을 용해할 수 있는 온도라면 몇 번이라도 되지만, 60 ℃ 이상, 바람직하게는 80 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 90 ℃ 이상 (예, 80 ∼ 130 ℃) 으로 가열하면서 교반함으로써 투명한 상태가 될 때까지 용해시킨다. 용해 후, 교반하면서 방랭하고, 예를 들어 121 ℃ 에서 20 분간 오토클레이브 멸균을 실시한다. 실온으로 되돌린 후에, 예를 들어 DMEM/F12 배지를 호모믹서 등으로 교반하면서, 당해 배지에 본 수용액을 원하는 최종 농도가 되도록 첨가하고 (예를 들어 최종 농도가 0.015 ％ 인 경우에는 0.3 ％ 수용액 : 배지의 비율은 1 : 19), 균일하게 혼합시킨다. 본 수용액과 배지의 혼합 방법은 특별히 제한은 없고, 예를 들어 피펫팅 등의 수동으로의 혼합, 마그네틱 스터러나 메커니컬 스터러, 호모믹서, 호모게나이저 등의 기기를 사용한 혼합을 들 수 있다. 또, 혼합 후에 본 발명의 배지 조성물을 필터로 여과해도 된다. 여과 처리를 할 때에 사용하는 필터의 세공 크기는 5 ㎛ 내지 100 ㎛, 바람직하게는 5 ㎛ 내지 70 ㎛, 보다 바람직하게는 10 ㎛ 내지 70 ㎛ 이다.
또한, 본 발명의 배지 조성물은 조제 후, 원심 처리에 의해 구조체를 침강시킬 수 있다.
본 발명 방법으로 배양하는 세포 및/또는 조직의 형태나 상태는, 당업자가 임의로 선택할 수 있다. 그 바람직한 구체예로는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 세포 및/또는 조직이 단독으로 배지 조성물 중에 분산된 상태, 세포 및/또는 조직이 담체 표면 상에 접착한 상태, 세포 및/또는 조직이 담체 내부에 포매된 상태, 복수개의 세포가 집합하여 세포 덩어리 (스피어) 를 형성한 상태, 혹은 2 종 이상의 세포가 집합하여 세포 덩어리 (스피어) 를 형성한 상태 등이, 보다 바람직하게는 세포 및/또는 조직이 담체 표면 상에 접착한 상태, 세포 및/또는 조직이 담체 내부에 포매된 상태, 복수개의 세포가 집합하여 세포 덩어리 (스피어) 를 형성한 상태, 혹은 2 종 이상의 세포가 집합하여 세포 덩어리 (스피어) 를 형성한 상태가, 더욱 바람직하게는 세포 및/또는 조직이 담체 표면 상에 접착한 상태, 복수개의 세포가 집합하여 세포 덩어리 (스피어) 를 형성한 상태, 혹은 2 종 이상의 세포가 집합하여 세포 덩어리 (스피어) 를 형성한 상태를 들 수 있다. 이들 상태 중, 세포 덩어리 (스피어) 를 형성한 상태는, 생체 내 환경에 가까운 세포-세포간 상호작용 및 세포 구조체가 재구축되어 있어, 세포 기능을 장기적으로 유지한 채 배양할 수 있고, 또 세포의 회수가 비교적 용이하기 때문에, 본 발명 방법으로 배양하는 가장 바람직한 상태로서 예시할 수 있다.
세포 및/또는 조직을 표면 상에 담지시키는 담체로는, 여러 가지 고분자로 구성된 마이크로캐리어나 유리 비즈, 세라믹스 비즈, 폴리스티렌 비즈, 덱스트란 비즈 등을 들 수 있다. 당해 고분자의 예로는, 비닐 수지, 우레탄 수지, 에폭시 수지, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리이미드, 실리콘 수지, 페놀 수지, 멜라민 수지, 우레아 수지, 아닐린 수지, 아이오노머 수지, 폴리카보네이트, 콜라겐, 덱스트란, 젤라틴, 셀룰로오스, 알긴산염 및 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다. 당해 담체는 세포의 접착을 높이거나, 혹은 세포로부터의 물질의 방출을 높이는 화합물로 코팅되어도 된다. 이와 같은 코팅 재료의 예로는, 폴리(모노스테아로일글리세리드숙신산), 폴리-D,L-락티드-코-글리콜라이드, 히알루론산나트륨, n-이소프로필아크릴아미드, 콜라겐 I 내지 XIX, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌-1 내지 12, 니토젠, 테나신, 트롬보스폰딘, 폰 빌브란드 (von Willebrand) 인자, 오스테오폰틴, 피브리노겐, 각종 엘라스틴, 각종 프로테오글리칸, 각종 카드헤린, 데스모콜린, 데스모글레인, 각종 인테그린, E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 면역 글로불린 슈퍼패밀리, 마트리겔, 폴리-D-리신, 폴리-L-리신, 키틴, 키토산, 세파로스, 알긴산젤, 각종 하이드로젤, 또한 이들의 절단 단편 등을 들 수 있다. 이때, 2 종 이상의 코팅 재료를 조합해도 된다. 또한, 세포 및/또는 조직을 표면 상에 담지한 담체의 배양에 사용되는 배지에 대해, 구아검, 타마린드검, 로커스트빈검, 아라비아검, 타라검, 타마린드검, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 아가로스, 타마린드시드검, 풀루란 등의 다당류를 1 종 이상 혼합할 수 있다. 또, 당해 담체는 자성체 재료, 예를 들어 페라이트를 함유하고 있어도 된다. 당해 담체의 직경은 수 10 ㎛ 내지 수 100 ㎛, 보다 바람직하게는 100 ㎛ 내지 200 ㎛ 이고, 그 비중은 1 에 가까운 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.9 ∼ 1.2, 특히 바람직하게는 약 1.0 이다. 당해 담체의 예로는 이것에 한정되는 것은 아니지만, Cytodex1 (등록상표), Cytodex3 (등록상표), Cytoline1 (등록상표), Cytoline2 (등록상표), Cytopore1 (등록상표), Cytopore2 (등록상표), (이상, GE Healthcare Life Sciences), Biosilon (등록상표) (NUNC), Cultispher-G (등록상표), Cultispher-S (등록상표) (이상, Thermo SCIENTIFIC), HILLEXCT (등록상표), ProNectinF-COATED (등록상표), 및 HILLEXII (등록상표) (SoloHillEngineering), GEM (등록상표) (Global Eukaryotic Microcarrier) 등을 들 수 있다. 당해 담체는, 필요에 따라 멸균 처리를 실시해도 된다. 멸균 방법은 특별히 제한은 없고, 예를 들어 방사선 멸균, 에틸렌옥사이드 가스 멸균, 오토클레이브 멸균 및 건열 멸균 등을 들 수 있다. 당해 담체를 이용하여 동물 세포를 배양하는 방법으로는 특별히 제한은 없고, 통상적인 유동층형 배양조 또는 충전층형 배양조를 사용하는 배양 방법 등을 사용할 수 있다. 이때, 세포 및/또는 조직을 표면 상에 담지시킨 담체는, 본 발명의 특정 화합물의 구조체를 함유하는 배지 조성물을 사용함으로써 진탕 등의 조작을 실시하지 않고 균일하게 분산할 수 있기 때문에, 목적으로 하는 세포 및/또는 조직을 세포 기능의 손실 없이 배양할 수 있다. 본 방법에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은, 배양 후에 담체에 담지시킨 채 원심이나 여과 처리를 실시함으로써 회수할 수 있다. 이때, 사용한 액체 배지를 첨가한 후, 원심이나 여과 처리를 실시해도 된다. 예를 들어, 원심할 때의 중력 가속도 (G) 는 50 G 내지 1000 G, 보다 바람직하게는 100 G 내지 500 G 이고, 여과 처리를 할 때에 사용하는 필터의 세공 크기는 10 ㎛ 내지 100 ㎛ 이지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또, 담체 중에 페라이트 등의 자성을 갖는 재료를 내포시켜 두면, 자력에 의해 배양한 담체를 회수할 수 있다. 본 방법에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은, 각종 킬레이트제, 열처리나 효소를 이용하여 담체로부터 박리함으로써 회수할 수 있다.
세포 및/또는 조직을 담체 내부에 포매할 때, 여러 가지 고분자로 구성된 재료를 당해 담체로서 선택할 수 있다. 이와 같은 고분자의 예로는, 콜라겐, 젤라틴, 알긴산염, 키토산, 아가로스, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 피브린 접착제, 폴리락트산·폴리글리콜산 공중합체, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 폴리우레탄폼 등의 스펀지, DseA-3D (등록상표), 폴리N-치환 아크릴아미드 유도체, 폴리N-치환 메타아크릴아미드 유도체 및 이들의 공중합체, 폴리비닐메틸에테르, 폴리프로필렌옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올 부분 아세트화물 등의 온도 감수성 고분자, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알코올, 메틸셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스부티레이트, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트)/폴리카프로락톤 등의 하이드로젤을 들 수 있다. 또, 이들 고분자를 2 종 이상 이용하여 세포를 포매하기 위한 담체를 제작할 수도 있다. 또한, 당해 담체에는 이들 고분자 이외에 생리 활성 물질을 갖고 있어도 된다. 이 생리 활성 물질의 예로는, 세포 증식 인자, 분화 유도 인자, 세포 접착 인자, 항체, 효소, 시토카인, 호르몬, 렉틴, 또는 세포 외 매트릭스 등을 들 수 있고, 이들을 복수 함유시킬 수도 있다. 세포 접착 인자의 예로는, 폴리(모노스테아로일글리세리드숙신산), 폴리-D,L-락티드-코-글리콜라이드, 히알루론산나트륨, n-이소프로필아크릴아미드, 콜라겐 I 내지 XIX, 젤라틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌-1 내지 12, 니토젠, 테나신, 트롬보스폰딘, 폰 빌브란드 (von Willebrand) 인자, 오스테오폰틴, 피브리노겐, 각종 엘라스틴, 각종 프로테오글리칸, 각종 카드헤린, 데스모콜린, 데스모글레인, 각종 인테그린, E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 면역 글로불린 슈퍼패밀리, 마트리겔, 폴리-D-리신, 폴리-L-리신, 키틴, 키토산, 세파로스, 알긴산젤, 각종 하이드로젤, 또한 이들의 절단 단편 등을 들 수 있다. 이때, 2 종 이상의 세포 접착 인자를 조합해도 된다. 또한, 세포 및/또는 조직을 포매한 담체의 배양에 사용되는 배지에 대해, 구아검, 타마린드검, 알긴산프로필렌글리콜에스테르, 로커스트빈검, 아라비아검, 타라검, 타마린드검, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 아가로스, 타마린드시드검, 풀루란 등의 증점제를 1 종 이상 혼합할 수 있다.
이들 담체에 세포 및/또는 조직을 포매시키는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 세포와 상기 고분자의 혼액을 시린지에 흡인하고, 25 G ∼ 19 G 정도의 주사바늘을 통해 배지 중에 적하하거나, 혹은 마이크로피펫을 이용하여 배지 중에 적하하거나 하는 방법을 이용해도 된다. 여기서 형성되는 비즈상 담체의 사이즈는, 세포와 상기 고분자 혼합액을 적하할 때에 사용하는 기구 선단의 형상에 의해 결정되고, 바람직하게는 수 10 ㎛ 내지 수 1000 ㎛, 보다 바람직하게는 100 ㎛ 내지 2000 ㎛ 이다. 비즈상 담체로 배양할 수 있는 세포수는 특별히 제한되지 않지만, 이 비즈 사이즈에 맞춰 자유롭게 선택하면 된다. 예를 들어, 직경 약 2000 ㎛ 의 비즈상 담체의 경우, 500 만개까지의 세포를 이 사이즈의 비즈상 담체 중에 포매할 수 있다. 또, 세포는 담체 내에서 하나씩 분산되어 있어도 되고, 복수개의 세포가 집합된 세포 덩어리를 형성하고 있어도 된다. 이때, 세포 및/또는 조직을 포매시킨 담체는, 본 발명의 특정 화합물의 구조체를 함유하는 배지 조성물을 사용함으로써 교반 등의 조작을 실시하지 않고 균일하게 분산시킬 수 있기 때문에, 목적으로 하는 세포 및/또는 조직을 세포 기능의 손실 없이 배양할 수 있다. 본 방법에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은, 배양 후에 담체에 포매한 상태로 원심이나 여과 처리를 실시함으로써 회수할 수 있다. 이때, 사용한 액체 배지를 첨가한 후, 원심이나 여과 처리를 실시해도 된다. 예를 들어, 원심할 때의 중력 가속도 (G) 는 50 G 내지 1000 G, 보다 바람직하게는 100 G 내지 500 G 이고, 여과 처리를 할 때에 사용하는 필터의 세공 크기는 10 ㎛ 내지 100 ㎛ 이지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 본 방법에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은, 각종 킬레이트제, 열이나 효소 등의 처리를 이용하여 담체를 분해함으로써 분산시켜, 회수할 수 있다.
세포 응집 덩어리 (스피어) 를 형성시키는 방법은 특별히 제한은 없고, 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 그 예로는, 세포 비접착 표면을 갖는 용기를 사용한 방법, 행잉 드롭법, 선회 배양법, 3 차원 스캐폴드법, 원심법, 전장이나 자장에 의한 응집을 사용한 방법 등을 들 수 있다. 예를 들어, 세포 비접착 표면을 갖는 용기를 사용한 방법에 대해서는, 목적하는 세포를 세포 접착을 저해하는 표면 처리를 실시한 배양 용기 중에서 배양하여 스피어를 형성시킬 수 있다. 이 세포 비접착성 배양 용기를 사용하는 경우에는, 먼저 목적하는 세포를 채취한 후에 그 세포 부유액을 조제해, 당해 배양 용기 중에 파종하여 배양을 실시한다. 일주일간정도 배양을 계속하면, 세포는 자발적으로 스피어를 형성한다. 이때 사용하는 세포 비접착성 표면으로는, 일반적으로 사용되는 샬레 등의 배양 용기의 표면에, 세포 접착을 저해하는 물질을 코팅한 것 등을 사용할 수 있다. 이와 같은 물질로는, 아가로스, 한천, 폴리-HEMA(폴리-(2-하이드록시-에틸메타크릴레이트)2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 다른 모노머 (예를 들어 부틸메타크릴레이트 등) 의 공중합체, 폴리(2-메톡시메틸아크릴레이트), 폴리-N-이소프로필아크릴아미드, 메비올겔 (등록상표) 등을 들 수 있지만, 세포 독성이 없으면 이들에 한정되는 것은 아니다.
또, 세포 응집 덩어리 (스피어) 를 형성시키는 방법으로서 NATURE BIOTECHNOLOGY, VOL. 28, NO. 4, APRIL 2010, 361-366, NATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO. 5, 2011, 689-700, NATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO. 5, 2011, 572-579, Stem Cell Research, 7, 2011, 97-111, Stem Cell Rev and Rep, 6, 2010, 248-259 등에 기재된 방법을 사용할 수도 있다.
또, 스피어를 형성시키는 배양시에 사용하는 배지 중에 스피어의 형성을 앞당기거나, 혹은 그 유지를 촉진하는 성분을 함유시킬 수도 있다. 이와 같은 효과를 갖는 성분의 예로는, 디메틸술폭시드, 슈퍼옥사이드디스무타아제, 세룰로플라스민, 카탈라아제, 페록시다아제, L-아스코르브산, L-아스코르브산인산에스테르, 토코페롤, 플라보노이드, 요산, 빌리루빈, 함셀렌 화합물, 트랜스페린, 불포화 지방산, 알부민, 테오필린, 포스콜린, 글루카곤, 디부티릴 cAMP 등을 들 수 있다. 함셀렌 화합물로는 아셀렌산나트륨, 셀렌산나트륨, 디메틸셀레나이드, 셀렌화수소, 셀레노메티오닌, Se-메틸셀레노시스테인, 셀레노시스타티오닌, 셀레노시스테인, 셀레노호모시스테인, 아데노신-5'-포스포셀렌산, Se-아데노실셀레노메티오닌, Y27632, Fasudil (HA1077), H-1152, Wf-536 등의 ROCK 저해제를 들 수 있다. 또, 목적으로 하는 사이즈의 균일한 세포 응집 덩어리를 얻기 위해서는, 사용하는 세포 비부착성 배양 용기 상에, 목적으로 하는 세포 응집 덩어리와 동일 직경의 복수의 오목부를 도입할 수도 있다. 이들 오목부가 서로 접하고 있거나, 혹은 목적으로 하는 세포 응집 덩어리의 직경 범위 내이면, 세포를 파종했을 때 파종한 세포는 오목부와 오목부 사이에서 세포 응집 덩어리를 형성하지 않고, 확실하게 오목부 안에서 그 용적에 따른 크기의 세포 응집 덩어리를 형성하여, 균일 사이즈의 세포 응집 덩어리 집단을 얻을 수 있다. 이때 오목부의 형상으로는 반구 또는 원추상이 바람직하다.
혹은, 세포 접착성을 갖는 지지체를 기초로 스피어를 형성시킬 수도 있다. 이같은 지지체의 예로는 콜라겐, 폴리로탁산, 폴리락트산 (PLA), 폴리락트산글리콜산 공중합체 (PLGA), 하이드로젤 등을 들 수 있다.
또, 피더 세포와 공배양함으로써 스피어를 형성시킬 수도 있다. 스피어 형성을 촉진시키기 위한 피더 세포로는, 어떤 접착성 세포라도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 각종 세포에 따른 피더 세포가 바람직하다. 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 간장이나 연골 유래 세포의 스피어를 형성시키는 경우, 그 피더 세포의 예로는 COS-1 세포나 혈관 내피 세포를 바람직한 세포종으로서 들 수 있다.
또한, 본 발명의 특정 화합물의 구조체를 함유하는 배양 조성물을 이용하여 스피어를 형성시킬 수도 있다. 그때, 당해 특정 화합물의 농도가 위에서 상세히 서술한 바와 같이, 당해 액체 배지의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시킬 (바람직하게는 부유 정치시킬) 수 있는 농도, 예를 들어 0.0005 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.001 ％ 내지 0.3 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량), 더욱 바람직하게는 0.01 ％ 내지 0.05 ％ (중량/용량) 가 되도록 당해 특정 화합물을 스피어 형성시에 사용하는 배지 중에 첨가하면 된다. 또, 다른 국면에서는 당해 특정 화합물의 농도가 위에서 상세히 서술한 바와 같이, 당해 액체 배지의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시킬 (바람직하게는 부유 정치시킬) 수 있는 농도, 예를 들어 0.0005 ％ 내지 1.0 ％ (중량/용량), 바람직하게는 0.001 ％ 내지 0.3 ％ (중량/용량), 보다 바람직하게는 0.003 ％ 내지 0.1 ％ (중량/용량), 더욱 바람직하게는 0.005 ％ 내지 0.05 ％ (중량/용량) 가 되도록 당해 특정 화합물을 스피어 형성시에 사용하는 배지 중에 첨가하면 된다.
스피어는, 당해 특정 화합물의 구조체를 포함하는 배지 중에 목적으로 하는 세포를 균일하게 분산시켜, 3 일간 내지 10 일간 정치해 배양함으로써 조제된다. 여기서 조제된 스피어는, 원심이나 여과 처리를 실시함으로써 회수할 수 있다. 예를 들어, 원심할 때의 중력 가속도 (G) 는 50 G 내지 1000 G, 보다 바람직하게는 100 G 내지 500 G 이고, 여과 처리를 할 때에 사용하는 필터의 세공 크기는 10 ㎛ 내지 100 ㎛ 이지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또, 목적으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 항체를 표면 상에 코팅한 자성 미립자를 이용하여, 자력에 의해 배양한 스피어를 회수할 수 있다. 이같은 자성 미립자의 예로는, 다이나비즈 (베리타스사 제조), MACS 마이크로비즈 (밀테니바이오테크사 제조), BioMag (테크노케미컬사 제조) 등을 들 수 있다.
스피어의 크기는, 세포종 및 배양 기간에 따라 상이하고 특별히 한정되지 않지만, 구 형상 혹은 타원구 형상으로 했을 때에는 20 ㎛ 내지 1000 ㎛, 바람직하게는 40 ㎛ 내지 500 ㎛, 보다 바람직하게는 50 ㎛ 내지 300 ㎛, 가장 바람직하게는 80 ㎛ 내지 200 ㎛ 의 직경을 갖는다.
이와 같은 스피어는, 그대로 정치 배양을 계속하는 경우라도 10 일 이상, 바람직하게는 13 일 이상, 더욱 바람직하게는 30 일 이상의 기간에 있어서 증식능을 유지할 수 있지만, 추가로 정치 배양 중에 정기적으로 기계적 분할을 실시함으로써, 또는 추가로 단세포화 처리와 응집을 실시함으로써, 실질적으로 무기한으로 증식능을 유지할 수 있다.
스피어의 배양에 사용되는 배양 용기는, 일반적으로 동물 세포의 배양이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 세포 배양 플라스크, 스피너 플라스크, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀, EZ SPHERE (아사히 글라스사 제조), 스밀론 셀 타이트 플레이트 (스미토모 베이클라이트사 제조) 등을 들 수 있다.
이들 배양 용기 중, 다수의 항암제의 평가, 의약품 후보 화합물 또는 의약품의 평가를 실시할 때에는 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티웰 플레이트가 바람직하게 사용된다. 이들 플레이트의 웰 바닥 형상은 특별히 제한되지 않지만, 평평한 바닥, U 자형, V 자형의 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 U 자형의 것이 사용된다. 이들 배양 기재의 재질은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 유리, 폴리염화비닐, 셀룰로오스계 폴리머, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 폴리술폰, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌 등의 플라스틱 등을 들 수 있다.
스피어의 정치 배양에 사용되는 배지는 세포 접착 인자를 포함할 수 있고, 그 예로는 마트리겔, 콜라겐젤, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴을 들 수 있다. 이들 세포 접착 인자는 2 종류 이상을 조합하여 첨가할 수도 있다. 또한, 스피어의 배양에 사용되는 배지에 대해 구아검, 타마린드검, 알긴산프로필렌글리콜에스테르, 로커스트빈검, 아라비아검, 타라검, 타마린드검, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 아가로스, 타마린드시드검, 풀루란 등의 증점제를 추가로 혼합할 수 있다.
본 발명의 특정 화합물의 구조체를 함유하는 배지 조성물을 사용함으로써, 진탕 등의 조작을 실시하지 않고 균일하게 배양액 중에 분산할 수 있기 때문에, 목적으로 하는 세포 및/또는 조직을 세포 기능의 손실 없이 스피어로서 배양할 수 있다. 본 방법에 의해 정치 배양된 스피어는, 배양 후에 원심이나 여과 처리를 실시함으로써 회수할 수 있다. 이때, 사용한 액체 배지를 첨가한 후, 원심이나 여과 처리를 실시해도 된다. 예를 들어, 원심할 때의 중력 가속도 (G) 는 50 G 내지 1000 G, 보다 바람직하게는 100 G 내지 500 G 이고, 여과 처리를 할 때에 사용하는 필터의 세공 크기는 10 ㎛ 내지 100 ㎛ 이지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또, 목적으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 항체를 표면 상에 코팅한 자성 미립자를 이용하여, 자력에 의해 배양한 스피어를 회수할 수 있다. 이같은 자성 미립자의 예로는 다이나비즈 (베리타스사 제조), MACS 마이크로 비즈 (밀테니바이오테크사 제조), BioMag (테크노케미컬사 제조) 등을 들 수 있다. 회수된 스피어는 추가로 각종 킬레이트제, 열, 필터나 효소 등의 처리를 이용하여 푸는 것에 의해 단일의 세포로서 분산시킬 수 있다. 세포의 회수나 배지 조성물의 교환은, 기계적 제어하에 폐쇄 환경하에서 실행이 가능한 바이오리엑터나 자동 배양 장치를 이용하여 원심이나 여과 처리 혹은 최종 농도에 의한 회수 처리를 실시함으로써 달성할 수도 있다.
식물 유래의 세포 및/또는 조직을 정치 배양할 때의 방법으로서, 분화되어 있지 않은 식물 세포 덩어리인 캘러스를 배양할 수 있다. 캘러스의 유도는, 사용하는 식물종에 대해 각각 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 분화한 식물체의 일부의 조직 (예를 들어, 뿌리, 줄기, 잎의 절편, 종자, 생장점, 배, 화분 등) 표면을, 필요에 따라 70 ％ 알코올이나 1 ％ 차아염소산나트륨 용액 등을 이용하여 멸균한 후, 필요에 따라 메스 등을 이용하여 적당한 크기의 조직편 (예를 들어, 약 1 x 1 ∼ 약 5 x 5 ㎜ 의 뿌리 절편) 을 잘라내, 클린 벤치 등을 사용한 무균 조작에 의해 당해 조직편을 미리 멸균한 캘러스 유도 배지에 파종하여 적당한 조건하에서 무균 배양한다. 여기서 유도된 캘러스는, 곧바로 대량 증식을 위해서 액체 배양에 첨부되어도 되고, 혹은 계대용 배지로 계대 배양함으로써 종주 (種株) 로서 유지할 수도 있다. 계대 배양은, 액체 배지 및 고형 배지 중 어느 것을 사용하여 실시해도 된다.
본 발명의 배지 조성물을 이용하여 정치 배양을 개시할 때에 접종되는 식물 세포 덩어리의 양은, 목적하는 세포의 증식 속도, 배양 양식 (회분 배양, 유가 배양, 연속 배양 등), 배양 기간 등에 따라 변동되지만, 예를 들어 캘러스 등의 식물 세포 덩어리를 배양하는 경우, 본 발명의 배지 조성물에 대한 세포 덩어리의 습중량이 4 ∼ 8 (중량/용적 (w/v)) ％, 바람직하게는 5 ∼ 7 (w/v) ％ 가 되도록 본 발명의 배지 조성물에 접종된다. 배양시의 식물 세포 덩어리의 입경은 1 ㎜ 내지 40 ㎜, 바람직하게는 3 ㎜ 내지 20 ㎜, 보다 바람직하게는 5 ㎜ 내지 15 ㎜ 이다. 여기서 "입경"이란, 예를 들어 식물 세포 덩어리가 구형인 경우에는 그 직경을 의미하고, 타원구형인 경우에는 그 장경을 의미하고, 그 이외의 형상에 있어서도 동일하게 취할 수 있는 최대 길이를 의미한다.
세포 및/또는 조직을 배양할 때의 온도는, 동물 세포이면 통상 25 내지 39 ℃, 바람직하게는 33 내지 39 ℃ 이다. CO2 농도는 통상 배양의 분위기 중 4 내지 10 체적％ 이고, 4 내지 6 체적％ 가 바람직하다. 배양 기간은 통상 3 내지 35 일간이지만, 배양의 목적에 맞춰 자유롭게 설정하면 된다. 식물 세포의 배양 온도는 통상 20 내지 30 ℃ 이고, 광이 필요하면 조도 2000 ∼ 8000 룩스의 조도 조건하에서 배양하면 된다.
배양 기간은 통상 3 내지 70 일간이지만, 배양의 목적에 맞춰 자유롭게 설정하면 된다.
본 발명 방법으로 세포 및/또는 조직을 배양할 때에는, 본 발명의 배양 조성물에 대해 별도 조제한 세포 및/또는 조직을 첨가해, 균일하게 분산되도록 혼합하면 된다. 그때의 혼합 방법은 특별히 제한은 없고, 예를 들어 피펫팅 등의 수동으로의 혼합, 스터러, 볼텍스 믹서, 마이크로 플레이트 믹서, 진탕기 등의 기기를 사용한 혼합을 들 수 있다. 혼합 후에는 배양액을 정치 상태로 해도 되고, 필요에 따라 배양액을 회전, 진탕 혹은 교반해도 된다. 그 회전수와 빈도는 당업자의 목적에 맞춰 적절히 설정하면 된다. 또, 정치 배양의 기간에 있어서 배지 조성물의 교환이 필요해진 때에는, 원심이나 여과 처리를 실시함으로써 세포 및/또는 조직과 배지 조성물을 분리한 후, 새로운 배지 조성물을 세포 및/또는 조직에 첨가하면 된다. 혹은, 원심이나 여과 처리를 실시함으로써 세포 및/또는 조직을 적절히 농축한 후, 새로운 배지 조성물을 이 농축액에 첨가하면 된다.
예를 들어, 원심할 때의 중력 가속도 (G) 는 50 G 내지 1000 G, 보다 바람직하게는 100 G 내지 500 G 이고, 여과 처리를 할 때에 사용하는 필터의 세공 크기는 10 ㎛ 내지 100 ㎛ 이지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또, 목적으로 하는 세포에 특이적으로 결합하는 항체를 표면 상에 코팅한 자성 미립자를 이용하여, 자력에 의해 배양한 세포 및/또는 조직을 분리할 수 있다. 이같은 자성 미립자의 예로는 다이나비즈 (베리타스사 제조), MACS 마이크로 비즈 (밀테니바이오테크사 제조), BioMag (테크노케미컬사 제조), 자성 마이크로스피어 (Polysciences Inc. 제) 등을 들 수 있다. 이들 배지 조성물의 교환은, 기계적 제어하에 폐쇄 환경하에서 실행이 가능한 바이오리엑터나 자동 배양 장치에 의해 실시할 수도 있다.
본 발명 방법에 의해 암세포가 효율적으로 증식되기 때문에, 본 발명에 있어서의 특정 화합물을 함유하는 배지 조성물은 암세포에 대한 항암제의 평가에 사용할 수 있다. 예를 들어, 암세포의 증식을 저해하는 항암제를 평가할 때, 암세포와 항암제를 공존시켜 배양했을 때의 세포의 수나 종류, 세포 표면 분화 마커나 발현 유전자의 변화를 해석하지만, 이때에 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 해석 대상이 되는 세포의 수를 효율적으로 증폭시킬 뿐만 아니라, 효율적으로 회수할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 특히 탈아실화젤란검 또는 그 염을 포함하는 암세포용 배지 첨가제, 그 첨가제를 포함하는 암세포용 배지 조성물을 암세포의 증식, 또는 항암 활성의 평가 등에 사용할 수 있다. 그때의 탈아실화젤란검 또는 그 염의 농도는 전술한 바와 같다.
그리고, 디우탄검을 사용해도 암세포가 증식되지만, 암세포로의 증식 효과가 각별히 우수한 점, 그리고 저농도로 사용 (전술한 바람직한 농도) 할 수 있기 때문에 배양액에 기포가 발생하기 어려운 점, 및 암세포를 회수하기 쉬운 점을 고려하면 탈아실화젤란검이 보다 바람직하다.
보다 구체적인 항암제의 스크리닝 방법으로는, (a) 피험 물질의 존재하 및 비존재하, 본 발명의 배지 조성물 중에서 암세포를 배양하는 공정, 및 (b) 암세포의 증식 변화를 해석하는 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다. 당해 방법은 추가로, 피험 물질의 비존재하의 경우와 비교해 암세포의 증식을 억제하는 물질을 선택하는 공정, 및/또는 암세포를 회수하는 공정을 포함할 수 있다. 변화란, 암세포의 증식이 증가 또는 감소하는 것을 말한다. 해석은 상기 방법을 실시할 수 있지만, 이들에 한정되지 않다.
항암제의 활성을 평가할 때의 배양 조건, 배양 기구, 배양 장치, 배지의 종류, 특정 화합물의 종류, 특정 화합물의 함량, 첨가물의 종류, 첨가물의 함량, 배양 기간, 배양 온도, 항암제의 종류, 항암제의 함량 등은, 본 명세서에 기재한 범위로부터 당사자가 적절히 결정할 수 있다. 배양에 의해 증식 혹은 출현한 세포는 당해 분야에서 표준적인 현미경을 이용하여 관찰할 수 있다. 세포수를 측정할 때에는 콜로니 형성법, 크리스탈 바이올렛법, 티미딘 흡수법, 트리판블루 염색법, ATP (아데노신3인산) 측정법, 3-(4,5-디메틸티알-2-릴)-2,5-디페닐테트라잘륨 브로마이드 (MTT) 염색법, WST-1 (등록상표) 염색법, WST-8 (등록상표) 염색법, 플로우 사이토메트리법, 세포수 자동 측정 장치를 사용한 방법 등을 사용할 수 있다. 이들 중에서는, WST-8 (등록상표) 염색법을 가장 바람직하게 이용할 수 있다. 또, 세포독성을 평가할 때에는 락트산 탈수소 효소 (LDH) 활성 측정법, CytoTox-ONE (등록상표) 법 등을 사용할 수 있다. 혹은, 배양한 세포에 대해 특이적 항체를 이용하여 염색한 후, 세포 표면 분화 마커를 ELISA 나 플로우 사이토메트리에 의해 검출해, 항암제에 의한 증식이나 아포토시스에 대한 효과를 관찰할 수 있다. 또한, 항암에 의해 발현이 변화한 유전자는, 배양한 세포로부터 DNA (디옥시리보핵산) 혹은 RNA (리보핵산) 를 추출해, 서던 블로팅 법, 노던 블로팅법, RT-PCR 법 등에 의해 검출할 수 있다.
본 발명 방법에 의해 간세포의 생존 및 기능이 유지되기 때문에, 본 발명에 있어서의 특정 화합물을 함유하는 배지 조성물은, 의약품 혹은 의약 후보 물질의 간세포에 대한 각종 효과를 평가할 때에 사용할 수 있다. 예를 들어, 간세포에 대한 의약 후보 물질의 독성 효과를 평가할 때, 간세포와 평가 대상으로 하는 피험 물질을 공존시켜 배양했을 때의 세포의 수나 종류, 세포 표면 분화 마커나 발현 유전자의 변화를 해석한다. 이때, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 해석 대상이 되는 간세포의 생존과 기능을 유지할 뿐만 아니라, 효율적으로 간세포를 회수할 수 있다.
간세포에 작용하는 의약품 후보 물질을 스크리닝하는 방법으로는, (a) 피험 물질의 존재하 및 비존재하, 본 발명의 배지 조성물 중에서 간세포를 배양하는 공정, 및 (b) 간세포의 생리학적 기능의 변화를 해석하는 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다.
간세포에 작용하는 의약품 후보 물질의 약효 또는 독성을 평가하는 방법으로는, (a) 피험 물질의 존재하 및 비존재하, 본 발명의 배지 조성물 중에서 간세포를 배양하는 공정, 및 (b) 간세포의 생리학적 기능의 변화를 해석하는 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다. 이들 방법은 추가로, 피험 물질의 비존재하의 경우와 비교해 간세포의 생리학적 기능을 억제 또는 증가하는 물질을 선택하는 공정, 및/또는 간세포를 회수하는 공정을 포함할 수 있다. 당해 변화란, 간세포의 생리학적 기능 (예를 들어, 간세포 증식, 시토크롬 P450 의 효소 활성 등) 이 증가 또는 감소하는 것을 말한다. 그리고, 간세포의 생리학적 기능이 증가하는 경우 약효 또는 독성이 낮다는, 간세포의 생리학적 기능이 저하하는 경우 약효 또는 독성이 높다는 등의 평가를 실시할 수 있다.
당해 의약 후보 물질의 활성을 평가할 때의 배양 조건, 배양 기구, 배양 장치, 배지의 종류, 특정 화합물의 종류, 특정 화합물의 함량, 첨가물의 종류, 첨가물의 함량, 배양 기간, 배양 온도, 의약품 혹은 의약 후보 물질의 종류 또는 그 함량 등은, 본 명세서에 기재한 범위로부터 당사자에 의해 적절히 선택된다. 배양에 의해 유지 혹은 출현한 세포는, 당해 분야에서 표준적인 현미경을 이용하여 관찰할 수 있다. 또, 세포수를 측정할 때에는, 콜로니 형성법, 크리스탈 바이올렛법, 티미딘 흡수법, 트리판블루 염색법, ATP (아데노신3인산) 측정법, 3-(4,5-디메틸티알-2-릴)-2,5-디페닐테트라잘륨 브로마이드 (MTT) 염색법, WST-1 (등록상표) 염색법, WST-8 (등록상표) 염색법, 플로우 사이토메트리법, 세포수 자동 측정 장치를 사용한 방법 등을 사용할 수 있다. 이 중에서는, WST-8 (등록상표) 염색법을 가장 바람직하게 이용할 수 있다. 또, 세포독성을 평가할 때에는 락트산 탈수소 효소 (LDH) 활성 측정법, CytoTox-ONE (등록상표) 법 등을 사용할 수 있다. 또, 배양한 세포에 대해 특이적 항체를 이용하여 염색한 후, 세포 표면 분화 마커를 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 나 플로우 사이토메트리에 의해 검출해, 의약품 혹은 의약 후보 물질에 의한 증식이나 아포토시스에 대한 효과를 관찰할 수 있다. 의약품 혹은 의약 후보 물질에 의해 발현이 변화한 유전자는, 배양한 세포로부터 DNA (디옥시리보핵산) 혹은 RNA (리보핵산) 를 추출해 서던 블로팅법, 노던 블로팅법, RT-PCR 법 등에 의해 검출할 수 있다. 또, 의약품 혹은 의약 후보 물질에 의해 발현이 변화한 단백질은 ELISA, 웨스턴 블로팅법, 플로우 사이토메트리법 등에 의해 검출할 수 있다. 또한, 시토크롬 P450 의 효소 활성은 당해 효소에 의한 기질의 구조 변환 활성을 방사성 동위체법, 고속 액체 크로마토그래피법, 발광법, 발색법 등을 사용함으로써 검출할 수 있다.
실시예
이하에 본 발명의 배지 조성물의 분석예, 시험예를 실시예로서 구체적으로 서술함으로써 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
(분석예 1 : 탈아실화젤란검을 포함하는 배지의 점도 측정 및 세포 부유 시험)
탈아실화젤란검 함유 배지의 조제 및 점도 측정
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.4 ％ (w/v) 가 되도록 순수에 현탁시킨 후, 90 ℃ 에서 가열 교반하여 용해시켰다. 본 수용액을 교반하면서 실온까지 방랭하여, 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 300 ㎖ 톨 비커에 2 배 농도의 DMEM/F-12 배지 (Aldrich 사 제조) 50 ㎖ 와 멸균수 47.5 ㎖ 를 넣어, 실온에서 호모믹서 (3000 rpm) 로 교반하면서 탈아실화젤란검 수용액 2.5 ㎖ 를 첨가해, 그대로 1 분 교반을 계속함으로써 탈아실화젤란검 최종 농도 0.01 ％ 배지 조성물을 조제했다. 마찬가지로 최종 농도가 0.02, 0.03, 0.05 ％ (w/v) 가 되도록 탈아실화젤란검 수용액을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 본 배지 조성물의 점도는 37 ℃ 조건하에서 E 형 점도계 (토키 산업 주식회사 제조, Viscometer TVE-22L, 표준 로터 1°34' x R24) 를 이용하여, 회전수 100 rpm 으로 5 분간 측정하였다.
탈아실화젤란검 함유 배지의 세포 부유 시험
인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를, 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 EMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 250000 개/㎖ 가 되도록 현탁하고, 본 현탁액 10 ㎖ 를 EZ SPHERE (아사히 글라스사 제조) 에 파종한 후, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 3 일간 배양하였다. 여기서 얻어진 스피어 (직경 100 ∼ 200 ㎛) 의 현탁액 10 ㎖ 를 원심 처리 (200 G, 5 분간) 해 스피어를 침강시키고, 상청을 제거함으로써 스피어 현탁액 1.0 ㎖ 를 조제했다. 계속하여, 상기에서 조제한 탈아실화젤란검 함유 배지를 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 1.0 ㎖ 씩 넣고, 추가로 HeLa 세포 스피어 현탁액 10 ㎕ 를 첨가했다. 태핑에 의해 세포 덩어리를 분산시켜, 37 ℃ 에서 인큐베이션해, 1 시간 후의 세포의 분산 상태를 육안으로 관찰하였다.
(비교예) 메틸셀룰로오스, 콜라겐 함유 배지의 조제
메틸셀룰로오스 함유 배지의 조제
200 ㎖ 가지형 플라스크에 DMEM/F-12 배지 (Aldrich 사 제조) 100 ㎖ 를 넣고, 메틸셀룰로오스 (M0387, Aldrich 사 제조) 0.1 g 을 첨가했다. 빙욕에서 냉각하면서 교반하여, 메틸셀룰로오스를 용해시켰다. 본 용액을 이용하여 최종 농도가 0.1, 0.3, 0.6, 1.0 ％ (w/v) 가 되도록 메틸셀룰로오스 수용액을 첨가한 배지 조성물을 조제했다.
콜라겐 함유 배지의 조제
0.3 ％ 셀 매트릭스 타입 I-A (닛타 젤라틴사 제조) 6.5 ㎖ 에 10 배 농도의 DMEM/F-12 배지 (Aldrich 사 제조) 1 ㎖, 재구성용 완충액 (닛타 젤라틴사 제조) 1 ㎖ 및 순수 1.5 ㎖ 를 넣어, 얼음 중에서 교반하면서 0.2 ％ 의 콜라겐 함유 배지를 조제했다. 마찬가지로, 최종 농도가 0.01, 0.05, 0.1, 0.2 ％ (w/v) 가 되도록 콜라겐을 첨가한 배지 조성물을 조제했다.
상기에서 조제한 배지 조성물에 대해서도 탈아실화젤란검 함유 배지와 동일하게 HeLa 세포 스피어의 부유 시험 및 점도 측정을 실시했다. 단, 1.0 ％ (w/v) 메틸셀룰로오스의 점도는 장치의 측정 범위로부터 50 rpm 으로 측정하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
[시험예］
다음으로, 본 발명의 배지 조성물의 세포 배양에 있어서의 유용성에 대해 이하의 시험예에 있어서 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에만 한정되는 것은 아니다. 또한, CO2 인큐베이터에 있어서의 CO2 의 농도 (％) 는 분위기 중의 CO2 의 체적％ 로 나타냈다. 또, PBS 는 인산 완충 생리 식염수 (시그마알드리치 재팬사 제조) 를 의미하고, FBS 는 소 태아 혈청 (Biological Industries 사 제조) 을 의미한다. 또, (w/v) 는 1 체적당 중량을 나타낸다.
(시험예 1 : 단일 세포를 분산시켰을 때의 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청 및 10 ng/㎖ 의 트롬보포이에틴 (WAKO 사 제조) 을 포함하는 IMDM 배지 (Gibco 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속해서, 인간 백혈병 세포주 UT7/TPO 를 20000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 6 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 의 웰에 1 웰당 5 ㎖ 가 되도록 분주 (分注) 했다. 마찬가지로, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 20000 세포/㎖ 가 되도록 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 EMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 6 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 의 웰에 1 웰당 5 ㎖ 되도록 분주했다. 이들 세포 현탁액을 CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 3 일간 정치 상태로 배양하였다. 그 후, 배양액의 일부를 회수해, 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, UT7/TPO 세포 및 HeLa 세포는, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 부유 상태로 균일하게 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 증식하는 것이 확인되었다. 부유 정치 배양 3 일간 후의 UT7/TPO 세포 및 HeLa 세포의 세포수를 표 4 에 나타낸다.
Figure pct00005
(시험예 2 : 세포주 유래 스피어를 배양했을 때의 세포 증식 시험)
인간 간암 세포주 HepG2 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 250000 개/㎖ 가 되도록 현탁하고, 본 현탁액 10 ㎖ 를 EZ SPHERE (아사히 글라스사 제조) 에 파종한 후, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 7 일간 배양하였다. 마찬가지로, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 EMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 250000 개/㎖ 가 되도록 현탁하고, 본 현탁액 10 ㎖ 를 EZ SPHERE (아사히 글라스사 제조) 에 파종한 후, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 7 일간 배양하였다. 여기서 얻어진 각각의 세포주의 스피어 (직경 100 ∼ 200 ㎛) 의 현탁액 2.5 ㎖ 를 원심 처리 (200 G, 5 분간) 하여 스피어를 침강시켜 상청을 제거했다. 계속해서, 본 스피어 (약 800 개) 에 상기 배지 10 ㎖ 를 첨가하고 현탁한 후, 평평한 바닥 튜브 (BM 기기사 제조) 로 옮겼다. 마찬가지로, 상기 배지에 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 첨가한 배지 조성물을 이용하여 스피어의 현탁액을 제조해, 평평한 바닥 튜브 (BM 기기사 제조) 로 옮겼다. 또한, 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물은, 먼저 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균한 후, 1/20 희석으로 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 첨가함으로써 조제했다.
37 ℃ 에서 3 일간, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 상기 스피어 현탁액을 정치 배양한 후, 2 배 용량의 배지를 첨가해 원심 처리 (200 G, 5 분간) 를 실시함으로써 스피어를 침강시켜, 상청을 제거했다. 여기서, 스피어의 일부를 분취해, 광학 현미경 (OLMPUS 사 제조, CK30-F100) 으로 그 형상을 관찰하였다. 계속하여, 회수한 스피어를 PBS 10 ㎖ 로 1 회 세정한 후, 1 ㎖ 의 트립신-EDTA (에틸렌디아민4아세트산) 용액 (WAKO 사 제조) 을 첨가해, 37 ℃ 에서 5 분간 보온하였다. 상기 배지를 9 ㎖ 첨가한 후, 원심 처리 (200 G, 5 분간) 에 의해 세포를 회수했다. 여기서 얻어진 세포 현탁액 2 ㎖ 의 일부에 대해 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포 및 사세포의 수를 측정하였다.
그 결과, HepG2 세포 및 HeLa 세포의 스피어는 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 부유 상태로 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 효율적으로 세포가 증식하는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은 기존 배지와 비교해 세포를 증식시켰을 때에 사세포의 비율이 적고, 세포 증식의 촉진 효과가 우수한 것이 확인되었다. 이때, 기존 배지로 배양한 스피어는 배양 용기의 저면에 침강되어 있었다. 또한, 배양한 스피어의 형상을 광학 현미경으로 관찰한 바, 본 발명의 배지 조성물에서는 스피어끼리의 회합이 보이지 않는 데에 반해, 기존 배지에서는 스피어끼리의 회합이 관찰되었다.
HepG2 세포 및 HeLa 세포에 관해서, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지에서 배양했을 때의 세포수를 1 로 했을 때의 상대적 세포수를 표 5 에 나타낸다. 또, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지로 배양했을 때의 사세포율 (사세포수/생세포수) 을 1 로 했을 때의 상대적 사세포율을 표 6 에 나타낸다. 또, HepG2 세포 및 HeLa 세포의 스피어를 본 발명의 배지 조성물로 배양했을 때의 부유 상태를 도 1 및 도 2 에 각각 나타낸다. 또한, 배양한 HeLa 세포의 스피어 형상을 도 3 에 나타낸다.
Figure pct00006
Figure pct00007
(시험예 3 : 인간 다능성 줄기세포의 접착 배양에 있어서의 세포 증식 시험)
인간 다능성 줄기세포 (hPSCs) 는, 통상 피더 상이나 마트리겔을 코팅한 배양 접시 상에 접착시키는 평면 배양 조건하에서 증식 유지된다. 탈아실화젤란검의 hPSCs 에 대한 독성을 평가하기 위해서, 마트리겔 (벡톤 디킨슨사 제조) 을 사용한 평면 배양 조건하에서, mTeSR 배지 (STEM CELL Technologies 사 제조) 에 0.000 ％ 내지 0.020 ％ (w/v) 의 농도가 되도록 탈아실화젤란검을 첨가해, hPSCs 의 증식에 대한 영향을 검토했다. 이때, 인간 iPS 세포로서 쿄토 대학 253G1 주, 인간 ES 세포주로서 쿄토 대학 KhES-1 주를 배양하였다. 또한, 상기 농도의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물은, 먼저 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균한 후, 소정의 농도가 되도록 mTeSR 배지에 첨가함으로써 조제했다. 그 결과, 인간 iPS 세포 및 인간 ES 세포 모두 탈아실화젤란검의 첨가 배지에 있어서도, 통상적인 mTeSR 배지와 동일한 정도의 세포수를 얻을 수 있고, 탈아실화젤란검에 의한 독성은 보이지 않았다. 그 결과를 도 4 에 나타낸다. 도 4 에 있어서의 배양 후의 세포수는, 마트리겔 코팅 배양 접시에 hPSCs 를 파종해, 탈아실화젤란검을 포함하는 mTeSR 배지로 5 일간 배양해, 얻어진 세포수를 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 mTeSR 배지에서의 세포수를 1 로 하여 상대값으로 나타냈다.
(시험예 4 : 인간 다능성 줄기세포의 스피어 배양에 있어서의 탈아실화젤란검의 침강 억제 시험)
hPSCs 는 페트리 배양 접시 등 저접착성 배양 접시로 스피어를 형성한다. 예를 들어, 그 스피어는 NATURE BIOTECHNOLOGY, VOL. 28, NO. 4, APRIL 2010, 361-366, NATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO. 5, 2011, 689-700, NATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO. 5, 2011, 572-579, Stem Cell Research, 7, 2011, 97-111, Stem Cell Rev and Rep, 6, 2010, 248-259 에 기재된 어떤 방법을 이용해도 형성할 수 있다. 피더 세포 (마우스 태아 선유아 세포) 상에서 유지한 hPSCs (쿄토 대학 253G1 주 혹은 쿄토 대학 KhES-1 주) 를 회수해, 피더 세포를 자연 침강으로 제거한 후, Rho 키나아제 저해제의 Y-27632 (10 μM) 를 첨가한 mTeSR 배지에 hPSCs 를 재현탁하였다. 계속하여, 일정한 사이즈의 hPSCs 콜로니를 페트리 배양 접시 (BD 팔콘사 제조) 에 파종해, 37 ℃ 에서 CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 배양함으로써 스피어를 형성시켰다. 배지 교환은, Y-27632 를 포함하지 않는 mTeSR 배지로 계대 후 1 일째와 3 일째에 실시하고, 계대는 5 일마다 Y-27632 를 포함하는 mTeSR 배지로 실시했다. 이와 같이 하여 조제한 hPSCs 의 스피어 (배양 4 일째) 를 mTeSR 배지에 0.000 ％ 내지 0.020 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물 (시험예 3 과 동일한 방법으로 조제) 로 현탁한 후, 큐벳으로 옮겼다. 본 큐벳을 37 ℃ 에서 CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 하룻밤 방치해, 탈아실화젤란검에 의한 스피어의 침강 억제 효과에 대해 검토했다. 그 결과를 도 5 에 나타낸다. 도 5 에 나타내는 바와 같이, 탈아실화젤란검의 첨가에 의해 모든 농도역에서 스피어를 배지 중에서 삼차원적으로 부유 상태로 유지할 수 있었다. 한편, 탈아실화젤란검을 첨가하지 않은 기존 배지에서는 스피어는 배양 용기의 저면에 침강하여, 부유 상태로 할 수 없는 것을 알 수 있었다. 또, 탈아실화젤란검의 효과는 인간 iPS 세포 및 인간 ES 세포에서 공통이었다. 이상의 결과로부터, 탈아실화젤란검은 hPSCs 의 스피어를 부유 상태로 유지할 수 있는 것이 나타났다.
(시험예 5 : 인간 다능성 줄기세포의 스피어 배양에 있어서의 세포 증식 시험)
삼차원적인 부유 상태로 hPSCs 가 튜브 배양 가능한지를 검토했다. 0.000 ％, 0.015 ％ 혹은 0.020 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함하는 mTeSR 배지에 대해, 시험예 4 와 동일한 방법으로 조제, 계대한 hPSCs 스피어 (600 내지 800 개/3 ㎖) 를 5 ㎖ 의 폴리스티렌 튜브 (BD 팔콘사 제조) 중에 각각 동일한 스피어수가 되도록 파종하여, 37 ℃ 에서 5 일간 CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 배양하였다. 배지 교환은, 3 배 용량의 DMEM/F-12 배지 (시그마사 제조) 를 배양액에 첨가한 후 원심 처리 (100 G, 3 분간) 에 의해 스피어를 침강시켜, 본 스피어에 새로운 배지를 첨가하는 형태로, 계대 후 1 일째와 3 일째에 실시했다. 5 일째에 등량의 DMEM/F-12 배지 (시그마사 제조) 를 첨가 후, 원심 처리 (100 G, 3 분간) 에 의해 스피어를 모두 회수해, 트립신-EDTA 용액 (인비트로젠사 제조) 을 이용하여 단세포로 해리한 후, 누클레오카운터 (chemometec 사 제조) 로 세포수를 측정하였다. 그 결과, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지에서는, 스피어는 튜브의 바닥에 가라앉아, 큰 세포 덩어리가 되고 증식을 나타내지 않았지만, 0.015 ％ 혹은 0.020 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함하는 배지에서는 삼차원적인 부유 상태로 스피어의 사이즈는 커지고, 파종한 세포수를 1 로 하면 5 일째에는 약 10 배의 세포수가 얻어져, 세포 증식이 보였다. 그 결과를 도 6 에 나타낸다. 도 6 은 파종한 세포수를 1 로 했을 때에 5 일째의 세포수를 상대적으로 나타내고 있다. 또, 인간 ES 세포에서는, 폴리스티렌 튜브 중에서의 배양 5 일째에 3 ㎖ 당 3,000,000 개의 세포수를 실제로 얻을 수 있었다 (배지 1000 ㎖ 의 경우에는 약 1,000,000,000 개의 세포수에 상당한다).
(시험예 6 : 인간 다능성 줄기세포의 스피어 배양에 있어서의 미분화성 유지의 확인 시험)
0.015 ％ 혹은 0.020 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함하는 mTeSR 배지로 부유 정치 배양한 hPSCs 스피어 세포에 관해서, 그 미분화능의 유지를 플로우 사이토메트리에 의한 해석으로 검토했다. 폴리스티렌 튜브 중에서 스피어 상태에서 인간 ES 세포 (KhES-1) 는 3 회 계대한 세포, 인간 iPS 세포 (253G1) 에 대해서는 4 회 계대한 세포를 회수한 후, hPSCs 의 미분화성을 나타내는 표면 마커인 SSEA4 의 항체 (＃MAB4304, 밀리포어사 제조) 와 TRA-1-60 (＃MAB4360, 밀리포어사 제조) 의 항체로 염색해, FACSCantoII (벡톤 디킨슨사 제조) 를 이용하여 세포의 항체 염색의 양성률을 평가했다. 그 결과를 도 7 에 나타낸다. 도 7 에 나타내는 바와 같이, A : 인간 iPS 세포 (253G1), B : 인간 ES 세포 (KhES-1) 모두 마트리겔 상에서 유지한 세포와 동일하게, 탈아실화젤란검을 포함하는 첨가 배지로 부유 정치 배양한 세포의 90 ％ 이상이 다능성 줄기세포 마커를 발현하고 있었다. 또한, 네거티브 컨트롤로서 2 차 항체만의 염색을 실시했다. 이상과 같이, 인간 iPS 세포 및 인간 ES 세포 모두 탈아실화젤란검을 포함하는 첨가 배지로 부유 정치 배양한 hPSCs 스피어는 미분화성을 유지하고 있는 것이 판명되었다.
(시험예 7 : 스피어 배양한 인간 다능성 줄기세포의 특성 해석 1)
시험예 3 과 동일한 방법으로 조제한 0.020 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 포함하는 mTeSR 배지 (STEM CELL Technologies 사 제조) 를 이용하여, 시험예 4 와 동일한 방법으로 인간 iPS 세포 (253G1) 혹은 인간 ES 세포 (KhES-1) 의 스피어를 합계 9 회 계대 배양하고, 배양 후의 각각의 세포에 대해 계대 1 일째의 스피어를 마우스 태아 선유아 세포 상에 파종하였다. 다음 날에 300 ㎍/㎖ 의 티미딘 (시그마알드리치사 제조) 처리를 하룻밤 실시했다. 계속하여, 100 ng/㎖ 의 콜세미드 (나칼라이테스크사 제조) 처리를 실시해, 트립신-EDTA 용액으로 단일 세포로 해리 후, 0.075 M 의 KCl 로 저장 처리를 실시했다. 그 후, Carnoy 고정액 (메탄올 : 아세트산 = 3 : 1) 으로 세포를 고정하였다.
본 고정 세포의 핵형 해석은 Q 밴딩법으로 분석하였다 (유한회사 크로모솜 사이언스라보로의 위탁 시험). 그 결과, 인간 iPS 세포 및 인간 ES 세포 모두 본 발명의 배지 조성물로 부유 정치 배양한 세포는 정상 핵형을 유지하고 있는 것이 판명되었다. 그 결과를 도 8 에 나타낸다.
(시험예 8 : 스피어 배양한 인간 다능성 줄기세포의 특성 해석 2)
시험예 3 과 동일한 방법으로 조제한 0.020 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 포함하는 mTeSR 배지 (STEM CELL Technologies 사 제조) 를 이용하여, 시험예 4 와 동일한 방법으로 인간 iPS 세포 (253G1) 의 스피어를 합계 21 회 내지 22 회, 5 일간마다 계대 배양하고, 배양 후의 스피어를 4 ％ (w/v) 파라포름알데히드 (나칼라이테스크사 제조) 로 고정하였다. 20 ％ 수크로오스 (w/v) 를 포함하는 PBS 로 침지한 후, 동결용 포매제 (O. C. T 콤파운드, 사쿠라파인텍 재팬 주식회사 제조) 로 포매했다. 크라이오스탯 (서모사이언티픽사 제조) 으로 두께 12 ㎛ 의 절편을 제작해, hPSCs 의 미분화성을 나타내는 NANOG (＃4903, 셀 시그날링사 제조) 와 OCT3/4 (＃sc-5279, 산타크루스사 제조), SSEA4 (＃MAB4304, 밀리포어사 제조) 의 항체로 염색했다. 그 결과, 탈아실화젤란검을 포함하는 배지 조성물로 부유 정치 배양한 세포는, 다능성 줄기세포의 미분화 마커를 발현하고 있는 것이 명확해졌다. 이상과 같이, 탈아실화젤란검을 포함하는 배지 조성물로 100 일 이상 부유 정치 배양한 인간 iPS 세포의 스피어는 미분화성을 유지하고 있는 것이 판명되었다. 그 결과를 도 9 에 나타낸다.
(시험예 9 : 마이크로캐리어 상에 부착된 세포주를 배양했을 때의 세포 증식 시험)
마이크로캐리어 Cytodex (등록상표) 1 (GE Healthcare Life Sciences 사 제조) 을 PBS 에 0.02 g/㎖ 가 되도록 현탁해 하룻밤 정치 후, 상청을 버리고 새로운 PBS 로 본 마이크로캐리어를 2 회 세정하였다. 그 후, 재차 PBS 로 0.02 g/㎖ 가 되도록 현탁하고, 121 ℃, 20 분간 오토클레이브 멸균하였다. 계속하여, 본 마이크로캐리어를 70 ％ 에탄올로 2 회, PBS 로 3 회 세정한 후, 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 로 0.02 g/㎖ 가 되도록 현탁하였다. 본 마이크로캐리어 현탁액을 이용하여, 120 ㎎ 의 Cytodex (등록상표) 1 및 4000000 개의 HepG2 세포를 포함하는 DMEM 배지 (10 ％ (v/v) 태아 소 혈청 함유) 20 ㎖ 를 조제하고, 본 세포 현탁액을 미리 실리콘 코팅제 (아사히 테크노 글래스사 제조) 로 처리한 비커 안에서 37 ℃, 6 시간, 스터러로 교반 (100 rpm) 하면서 배양하였다. 여기서, HepG2 세포가 마이크로캐리어에 접착되어 있는 것을 현미경으로 확인하였다. 계속하여, 세포가 접착된 마이크로캐리어를 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지로 2 회 세정하고, 동 배지 3 ㎖ 로 현탁하였다.
10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 20 ㎖ 혹은 본 배지에 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 첨가한 배지 조성물에, 상기 마이크로캐리어 현탁액 300 ㎕ 를 각각 첨가해, 3 일간, 37 ℃ 에서 배양하였다. 이때, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배양액은 스터러로 교반 (100 rpm) 하면서 배양하였다. 배양 후에는 현미경으로 마이크로캐리어 상의 세포의 부착 상태를 확인한 후, 원심 처리 (200 G, 5 분간) 로 마이크로캐리어를 침강시켰다. PBS 10 ㎖ 로 본 마이크로캐리어를 세정한 후, 1 ㎖ 의 트립신-EDTA (에틸렌디아민4아세트산) 용액 (WAKO 사 제조) 을 첨가해, 37 ℃ 에서 5 분간 보온하였다. 또한, 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 9 ㎖ 첨가한 후, 메시 사이즈 70 ㎛ 의 셀 스트레이너 (BD 팔콘사 제조) 를 이용하여 마이크로캐리어를 제거했다. 여기서 얻어진 여과액으로부터 원심 처리 (200 G, 5 분) 에 의해 세포를 회수했다. 본 세포를 500 ㎕ 의 배지에 현탁하고, 그 일부에 대해 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다. 그 결과, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배양액은 123,000 개의 세포를 포함하고 있었지만, 탈아실화젤란검을 포함하는 배양액은 1,320,000 개의 세포를 포함하고 있었다. 상기와 같이, 본 발명의 특정 화합물의 구조체를 포함하는 배지 조성물은 마이크로캐리어를 이용하여 세포 배양을 실시해도, 기존 배지와 비교해 세포 증식의 촉진 효과가 우수한 것이 확인되었다. 본 발명의 특정 화합물의 구조체를 포함하는 배지 조성물을 이용하여 마이크로캐리어 배양을 3 일간 실시했을 때의 HepG2 세포의 부착 상태를 도 10 에 나타낸다.
(시험예 10 : 세포주 유래 스피어를 사용한 세포 부유 시험)
크산탄검 (KELTROL CG, 산쇼 주식회사 제조) 을 1 ％ (w/v) 의 농도가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서 교반에 의해 용해했다. 본 수용액을 이용하여, 크산탄검에 대해 최종 농도가 0.1, 0.15, 0.2 ％ (w/v) 인 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. 또, 0.2 ％ (w/v) 의 κ-카라기난 (GENUGEL WR-80-J, 산쇼 주식회사 제조) 및 0.2 ％ (w/v) 의 로커스트빈검 (GENUGUM RL-200-J, 산쇼 주식회사 제조) 을 포함하는 수용액을 90 ℃ 에서 가열함으로써 조제해, 본 수용액을 이용하여 0.03, 0.04, 0.05 ％ (w/v) 의 κ-카라기난과 로커스트빈검을 포함하는 DMEM/F-12 배지 (시그마사 제조) 조성물을 조제했다.
시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 HeLa 세포의 스피어를 제조해, 상기에서 조제한 배지 1 ㎖ 에 각각 수 10 개의 스피어를 첨가한 후, 1 시간 37 ℃ 에서 정치해, 스피어 세포의 부유 상태를 육안으로 관찰하였다. 그 결과, HeLa 세포의 스피어는 상기 배지 조성물 모두에 있어서 부유 상태로 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 본 세포 현탁액에 등량의 배지를 첨가한 후, 원심 처리 (300 내지 400 G, 5 분) 에 의해 HeLa 세포의 스피어가 침강하여, 회수할 수 있는 것을 확인하였다. HeLa 세포의 스피어를 본 발명의 배지 조성물로 배양했을 때의 부유 상태를 도 11 에 각각 나타낸다. 또, 분석예 1 과 동일한 방법으로 측정한 점도를 표 7, 8 에 나타낸다.
Figure pct00008
Figure pct00009
(시험예 11 : 필터 여과한 배지 조성물을 사용한 세포 부유 시험)
시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 0.015 ％ 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 함유하는 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 본 배지 조성물 1 ㎖ 를 70 ㎛, 40 ㎛ 의 필터 (BD 팔콘사 제조), 30 ㎛, 20 ㎛ 의 필터 (애즈원사 제조), 10 ㎛ 의 필터 (Partec 사 제조), 5 ㎛, 1.2 ㎛, 0.45 ㎛, 0.2 ㎛ 의 필터 (사토리우스 스테딤 재팬사 제조) 를 이용하여 각각 여과했다. 시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 제조한 HepG2 세포의 스피어를, 상기 여과액에 대해 약 수십개 첨가한 후, 1 시간 37 ℃ 에서 정치하고, 스피어 세포의 부유 상태를 육안으로 관찰하였다. 그 결과, HepG2 세포의 스피어는 10 ㎛ 이상의 필터를 투과한 배지 조성물에 있어서는 부유 상태로 유지되지만, 5 ㎛ 이하의 필터를 투과한 배지 조성물에 있어서는 침전하는 것을 확인하였다. 또한, 여기서 부유 상태에 있는 HepG2 세포의 스피어는 실온에서 300 G, 5 분간의 원심 처리, 혹은 등량의 배지를 첨가한 후 실온에서 200 G, 5 분간의 원심 처리를 실시함으로써 침강하여, 회수할 수 있는 것을 확인하였다.
(시험예 12 : 스피어 형성 시험)
시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 0.01 ％ 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 및 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 함유하는 EMEM 배지 (WAKO 사 제조) 의 조성물을 조제했다. 계속하여, HeLa 세포를 1000 개/㎖ 의 농도가 되도록 첨가한 후, 24 웰 플레이트 (코닝사 제조) 에 분주했다. 본 플레이트를 9 일간, 37 ℃ 에서 부유 정치 배양한 후, 스피어의 형성을 현미경으로 확인하였다. 또한, 300 G, 5 분간의 원심 처리에 의해 스피어 세포를 침강시켜, PBS 5 ㎖ 로 1 회 세정한 후, 100 ㎕ 의 트립신-EDTA (에틸렌디아민4아세트산) 용액 (WAKO 사 제조) 을 첨가해, 37 ℃ 에서 5 분간 보온하였다. 여기서 얻어진 세포 현탁액 100 ㎕ 에 대해 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 EMEM 배지를 100 ㎕ 첨가하고, 그 일부의 세포 현탁액에 대해 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다. 그 결과, 170000 개/㎖ 까지 HeLa 세포가 증가하고 있는 것이 확인되었다. 본 발명의 배지 조성물로 형성한 HeLa 세포의 스피어를 도 12 에 나타낸다.
(시험예 13 : 구조체의 광학 현미경 관찰)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.4 ％ (w/v) 가 되도록 순수에 현탁시킨 후, 90 ℃ 에서 가열 교반하여 용해시켰다. 300 ㎖ 톨 비커에 2 배 농도의 DMEM/F-12 배지 (Aldrich 사 제조) 95 ㎖ 를 넣어, 실온에서 마그네틱 스터러로 교반하면서 탈아실화젤란검 수용액 5 ㎖ 를 첨가해, 그대로 5 분 교반을 계속함으로써 탈아실화젤란검 최종 농도 0.02 ％ 배지 조성물을 조제했다. 또한 당 배지 조성물을 호모믹서 (3000 rpm) 에 의해 5 분간 교반하였다. 조제한 배지 조성물을 광학 현미경 (KEYENCE 사, BIOREVO BZ-9000) 에 의해 관찰하였다. 관찰된 구조체를 도 13 에 나타낸다.
(시험예 14 : 가루 배지와 DAG 의 혼합 가열에 의한 조제)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 20 ㎎ 과, DMEM/F-12 배지 (Life Technologies 사 제조) 1.58 g 을 200 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고, 순수 100 ㎖ 를 주입하였다. 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하여, 탈아실화젤란검 농도가 0.02 ％ 인 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. 조제한 배지에, 덱스트란 비즈 Cytodex1 (Size 200 ㎛, GE Healthcare Life Sciences 사 제조) 을 첨가해, 비즈의 분산 상태를 육안으로 확인하였다. 부유 분산 상태를 ○, 일부 침강/분산 상태를 △, 침강 상태를 x 로서 평가했다. 결과를 표 9 에 나타낸다.
Figure pct00010
(시험예 15 : 다당류를 혼합한 배지 조성물의 조제)
크산탄검 (KELTROL CG, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.5 ％ (w/v) 의 농도가 되도록 순수에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해했다. 동일하게 알긴산나트륨 (덕 알긴산 NSPM, 푸드케미파 제조), 로커스트빈검 (GENUGUM RL-200-J, 산쇼 주식회사 제조), κ-카라기난 (GENUGEL WR-80-J, 산쇼 주식회사 제조), 디우탄검 (KELCO CRETE DG-F, 산쇼 주식회사 제조) 에 대해 0.5 ％ (w/v) 의 수용액을 제조했다.
본 수용액과 0.2 혹은 0.1 ％ (w/v) 탈아실화젤란검 용액과 10 배 농도의 DMEM/F-12 배지를 혼합하여, 80 ℃ 에서 30 분 가열하였다. 실온까지 방랭한 후, 7.5 ％ 탄산수소나트륨 수용액을 첨가해, 최종 농도 0.01, 0.02 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검과 최종 농도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ％ (w/v) 다른 다당을 함유하는 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. 또, 탈아실화젤란검을 포함하는 배지를 상기와 동일하게 조제한 후, 메틸셀룰로오스 (cP400, WAKO 주식회사 제조) 의 분말을 첨가했다. 빙욕에서 교반하여, 메틸셀룰로오스를 용해시켜, 최종 농도 0.01, 0.02 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검과 최종 농도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ％ (w/v) 다른 메틸셀룰로오스를 함유하는 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다.
상기에서 조제한 배지에, 폴리스티렌 비즈 (Size 500-600 ㎛, Polysciences Inc. 제조) 를 첨가해, 비즈의 분산 상태를 육안으로 확인하였다. 부유 분산 상태를 ○, 일부 침강/분산 상태를 △, 침강 상태를 x 로서 평가했다. 결과를 표 10 에 나타낸다.
Figure pct00011
(시험예 16 : 다당류를 혼합한 배지 조성물의 점도 측정)
시험예 15 의 다당 혼합계와 동일한 방법으로, 최종 농도가 0.005, 0.01 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검과 다른 다당을 포함하는 DMEM/F-12 배지를 조제했다. 다당은 최종 농도가 크산탄검, 알긴산나트륨, 로커스트빈검은 0.1 ％ (w/v), 메틸셀룰로오스는 0.2 ％ (w/v), κ-카라기난과 디우탄검은 0.05 ％ (w/v) 가 되도록 조제했다. 각각의 배지 조성물의 상태와 분석예 1 과 동일한 방법으로 측정한 점도를 표 11 ∼ 16 에 나타낸다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
(시험예 17 : 2 가 금속 이온 농도를 변경한 배지 조성물의 조제)
염화칼슘, 황산마그네슘, 염화마그네슘을 포함하지 않는 DMEM/F-12 (D9785, Aldrich 제) 를 사용하여, 시험예 14 의 방법과 동일하게 0.02 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함하는 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. 또, 최종 농도가 DMEM/F-12 배지의 규정량이 되도록 염화칼슘 또는 황산마그네슘, 염화마그네슘을 첨가한 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. DMEM/F-12 배지의 규정 조성으로부터, 각각의 최종 농도는 염화칼슘 0.116 g/ℓ, 황산마그네슘 0.049 g/ℓ, 염화마그네슘 0.061 g/ℓ 로 하였다.
조제한 배지 조성물에 덱스트란 비즈 Cytodex1 (GE Healthcare Life Sciences 사 제조) 을 첨가해, 2 일 후에 비즈의 분산을 육안으로 확인하였다. 부유 분산 상태를 ○, 일부 침강/분산 상태를 △, 침강 상태를 x 로서 평가했다. 결과를 표 17 에 나타낸다.
Figure pct00018
(시험예 18 : 2 가 금속 이온을 후첨가한 배지 조성물의 조제)
0.1 ％ (w/v) 탈아실화젤란검 용액과 5 배 농도의 DMEM/F-12 배지 (염화칼슘, 황산마그네슘, 염화마그네슘 불함유, D9785, Aldrich 제조), 염화칼슘 1167 ㎎, 황산마그네슘 489 ㎎, 염화마그네슘 287 ㎎ 을 순수 300 ㎖ 에 용해시킨 염 용액을 조제했다. 200 ㎖ 의 톨 비커에 탈아실화젤란검 수용액과 순수를 넣어, 갈고리형 교반 날개를 이용하여 200 rpm 으로 용액을 교반하였다. 배지액과 물을 혼합한 A 액을 첨가해, 그대로 10 분 교반하였다. 이어서 염 용액을 첨가, 추가로 7.5 ％ 탄산수소나트륨 수용액을 1.6 ㎖ 첨가해, 최종 농도 0.02 ％ 의 탈아실화젤란검을 포함하는 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. 각각의 액의 혼합량을 표에 나타낸다. 조제 4 시간 후에, 6 개의 배지 조성물에 대해 폴리스티렌 비즈와 Cytodex1 의 분산 평가를 실시했다. 결과를 표 18, 19 에 나타낸다.
Figure pct00019
Figure pct00020
(시험예 19 : 각종 배지 조성물의 조제)
0.1 ％ (w/v) 탈아실화젤란검 용액과 고농도의 배지액을 조제했다. 고농도의 배지액은 10 배 농도의 MEM (M0268, Aldrich 제조), RPMI-1640 (R6504, Aldrich 제조) 과 5 배 농도의 DMEM (고압 멸균 대응 배지, 닛스이 제조) 을 조제했다. 0.1 ％ (w/v) 탈아실화젤란검 용액과 각 고농도 배지, 농도 조정용 순수를 혼합하여, 80 ℃ 에서 30 분 과열했다. 실온까지 방랭한 후, 7.5 ％ 탄산수소나트륨 수용액을 첨가해, 최종 농도 0.01, 0.02, 0.03 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 함유하는 배지 조성물을 각각 조제했다.
조제한 9 개의 배지 조성물에 대해, 폴리스티렌 비즈와 덱스트란 비즈 Cytodex1 의 부유 분산 상태를 ○, 일부 침강/분산 상태를 △, 침강 상태를 x 로서 평가했다. 결과를 표 20, 21 에 나타낸다.
Figure pct00021
Figure pct00022
(시험예 20 : 탈아실화젤란검을 포함하는 배지 조성물의 입도 분포 측정)
분석예 1 에 따라, 0.038 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함하는 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. 배지는 호모믹서를 이용하여 3000 rpm 과 6000 rpm 으로 1 분 교반하여 조제했다. 본 배지 조성물의 입도 분포에 대해, 벡크만쿨터 (주) 제조 Multisizer4 (쿨터 원리에 의한 정밀 입도 분포 측정 장치) 를 이용하여 측정하여, 체적 기준 입도 분포의 메디안 직경 (d50) 을 구했다. 결과를 표 22 에 나타낸다.
Figure pct00023
(시험예 21 : 탈아실화젤란검의 인산화)
유리제 100 ㎖ 시험관에 탈아실젤란검 1 g 과, 순수 40 ㎖ 를 칭량해 취해, 100 ℃ 에서 30 분 가열하여, 현탁액을 조제했다. 이 현탁액에 인산 수용액 (85 ％) 1 g 을 첨가해, 5 시간 가열 환류했다. 그 후, 12 시간 교반하면서, 실온까지 방랭함으로써 얻은 백색 현탁액을, 99 ％ 에탄올 (500 ㎖) 에 주입했다. 생성된 면상 (綿狀) 의 백색 고체를 여과 채취 후, 건조시킴으로써 탈아실젤란검의 인산화물로서 담갈색 고체 (0.4 g) 를 얻었다. 인산기가 도입된 것은 푸리에 변환 적외 분광 분석 (주식회사 시마즈 제작소 제조, IR-Prestage21) 에 의해 확인하였다 (1700 ㎝-1 ; P-OH, 1296 ㎝-1, 1265 ㎝-1 ; P = O). 담갈색 고체를 마이크로파 가열 분해 장치 (ETHOS TC, 마일스톤 제너랄 제조) 에 의해 분해한 후에, 유도 결합 플라즈마 발광 분광 분석 장치 (ICP-OES) (SPS 5520, SII 나노테크놀로지사 제조) 에 의해 인 원자의 함유율을 측정한 결과, 3.5 wt ％ (n = 2) 이었다.
(시험예 22 : 인산화한 탈아실화젤란검을 포함하는 배지 조성물의 조제)
임의량의 인산화한 탈아실화젤란검 (30 ㎎) 과, DMEM/F-12 배지 (라이프 테크놀로지스사 제조) 1.56 g 을 200 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고, 순수 100 ㎖ 를 주입했다. 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하여, 탈아실화젤란검 농도가 0.03 ％ 인 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. 조제한 배지에, 덱스트란 비즈 Cytodex1 (GE 헬스케어바이오사이언스사 제조) 을 첨가해, 비즈의 분산 상태를 육안으로 확인하였다. 0.03 ％ (w/v) 의 인산화한 탈아실화젤란검 농도에 있어서, 비즈의 분산 상태가 확인되었다.
(시험예 23 : 탈아실화젤란검을 포함하는 배지 조성물의 조제)
탈아실화젤란검 수용액과 배지 용액을 하기 표에 나타내는 비율로 첨가함으로써 혼합하여, 탈아실화젤란검 농도가 0.02 ％ 인 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했을 때의 폴리스티렌 비즈 (Size 500-600 ㎛, Polysciences Inc. 제조) 의 분산 상태를 평가했다. 결과를 표 23, 24 에 나타낸다. 1 일 이상 정치함으로써, 모든 조건에서 스티렌 비즈가 분산되었다.
Figure pct00024
Figure pct00025
(시험예 24 : 필터를 사용한 배지 조성물의 조제)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 최종 농도가 0.02 혹은 0.04 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 30 분간 혹은 121 ℃ 에서 20 분간 가열함으로써 용해했다. 또한, 본 수용액 100 ㎖ 를 구멍 직경이 0.22 ㎛ 인 폴리에테르술폰제 멤브레인 필터 (코닝사 제조) 로 여과했다. 계속하여, 본 여과액을 2 내지 4 배 농도의 DMEM/F-12 배지 (시그마알드리치사 제조) 와 혼합한 후, 마일드 믹서 (SI-24, 타이텍사 제조) 로 1 시간 진탕하여, 최종 농도 0.01 혹은 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함하는 배지 조성물을 각각 조제했다 (예를 들어, 0.02 ％ (w/v) 탈아실화젤란검 수용액과 2 배 농도의 DMEM/F-12 배지를 25 ㎖ 씩 혼합하여, 0.01 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 배지 조성물을 50 ㎖ 조제했다). 시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 HepG2 세포의 스피어를 제조해, 상기에서 조제한 배지 1 ㎖ 에 각각 수십개의 스피어를 첨가한 후, 37 ℃ 에서 정치하고, 1 시간 및 하룻밤 후의 스피어 세포의 부유 상태를 육안으로 관찰하였다. 그 결과, HepG2 세포의 스피어는 상기 배지 조성물 모두에 있어서 부유 상태로 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 2 배 용량의 배지를 첨가한 후, 본 세포 현탁액을 원심 처리 (500 G, 5 분) 함으로써 HepG2 세포의 스피어가 침강하여, 세포가 회수 가능한 것을 모든 배지 조성물에 있어서 확인하였다. 하룻밤 후의 스피어의 분산 상태를 육안으로 확인했을 때, 부유 분산 상태를 ○, 일부 침강/분산 상태를 △, 침강 상태를 x 로서 평가한 결과를 표 25 에 나타낸다.
Figure pct00026
(시험예 25 : 세포주 유래 스피어를 배양했을 때의 세포 증식 시험)
인간 태아 신장 세포주 HEK293 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 을 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 EMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 250000 개/㎖ 가 되도록 현탁하여, 본 현탁액 10 ㎖ 를 EZ SPHERE (아사히 글라스사 제조) 에 파종한 후, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 2 일간 배양하였다. 여기서 얻어진 HEK293 세포의 스피어 (직경 100 ∼ 200 ㎛) 의 현탁액 10 ㎖ 를 원심 처리 (200 G, 5 분간) 해 스피어를 침강시켜 상청을 제거한 후, 1 ㎖ 에 현탁하였다. 계속하여, 본 스피어 현탁액 200 ㎕ (세포수는 약 200000 개) 에 상기 배지 10 ㎖ 를 첨가해 현탁한 후, 평평한 바닥 튜브 (BM 기기사 제조) 로 옮겼다. 마찬가지로, 상기 배지에 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 첨가한 배지 조성물을 이용하여 스피어의 현탁액을 제조해, 평평한 바닥 튜브 (BM 기기사 제조) 로 옮겼다. 또한, 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물은, 먼저 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해해, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균한 후, 1/20 희석으로 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 EMEM 배지에 첨가함으로써 조제했다.
37 ℃ 에서 5 일간, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 상기 스피어 현탁액을 정치 배양한 후, 2 배 용량의 배지를 첨가해 원심 처리 (500 G, 5 분간) 를 실시함으로써 스피어를 침강시켜, 상청을 제거했다. 계속하여, 회수한 스피어를 PBS 10 ㎖ 로 1 회 세정한 후, 1 ㎖ 의 트립신-EDTA (에틸렌디아민4아세트산) 용액 (WAKO 사 제조) 을 첨가해, 37 ℃ 에서 5 분간 보온하였다. 상기 배지를 9 ㎖ 첨가한 후, 원심 처리 (500 G, 5 분간) 에 의해 세포를 회수했다. 여기서 얻어진 세포 현탁액 2 ㎖ 의 일부에 대해 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포 및 사세포의 수를 측정하였다. 또한, 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물을 제조해, 동일한 실험을 실시했다.
그 결과, HEK293 세포의 스피어는 본 발명의 배지 조성물을 사용하는 것에 의해 부유 상태로 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 효율적으로 세포가 증식하는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물과 비교해 세포를 증식시켰을 때에 사세포의 비율이 적고, 세포 증식의 촉진 효과가 우수한 것이 확인되었다. 이때, 기존 배지로 배양한 스피어는 배양 용기의 저면에 침강하고 있었다.
HEK293 세포에 관해서, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지로 배양했을 때의 세포수를 1 로 했을 때의 상대적 세포수를 표 26 에 나타낸다. 또, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지로 배양했을 때의 사세포율 (사세포수/생세포수) 을 1 로 했을 때의 상대적 사세포율을 표 27 에 나타낸다.
Figure pct00027
Figure pct00028
(시험예 26 : 곤충 세포를 배양했을 때의 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 Sf-900 (등록상표) IIISFM 배지 (Gibco 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, Spodoptera frugiperda 유래의 Sf9 세포 (Gibco 제조) 를 100000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 24 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 의 웰에 1 웰당 1 ㎖ 가 되도록 분주했다. 이들 세포 현탁액을 인큐베이터 내에서 25 ℃ 에서 5 일간 정치 배양하였다. 그 후, 배양액의 일부를 회수해, 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다. 또한, 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물을 제조해, 동일한 실험을 실시했다.
그 결과, Sf9 세포는 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 부유 상태로 균일하게 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 증식하는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물과 비교해 세포를 증식시켰을 때에 세포 증식의 촉진 효과가 우수한 것이 확인되었다. 부유 정치 배양 5 일간 후의 Sf9 세포의 세포수를 표 28 에 나타낸다.
Figure pct00029
(시험예 27 : CD34 양성 세포를 배양했을 때의 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 StemSpan SFEM 배지 (StemCell Technologies 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검, 20 ng/㎖ 의 트롬보포이에틴 (WAKO 사 제조) 및 100 ng/㎖ 의 줄기세포 인자 (SCF, WAKO 사 제조) 를 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 제대혈 유래의 CD34 양성 세포 (론자사 제조) 를 10000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 24 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조) 의 웰에 1 웰당 1 ㎖ 가 되도록 분주했다. 이들 세포 현탁액을 37 ℃ 에서 7 일간, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 정치 배양하였다. 그 후, 배양액의 일부를 회수해, 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다. 또, 나머지의 배양액에 3 배 용량의 배지를 첨가해 원심 처리 (500 G, 5 분간) 를 실시함으로써 모든 세포를 침강시켰다. 또한, 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물을 제조해, 동일한 실험을 실시했다.
그 결과, CD34 양성 세포는, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 부유 상태로 균일하게 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 증식하는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 기존 배지와 비교해 동등 이상의 세포 증식 촉진 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또, 원심 처리에 의해 세포가 침강하여, 세포를 회수할 수 있는 것을 확인하였다. 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지로 배양했을 때의 세포수를 1 로 했을 때의, 부유 정치 배양 7 일간 후에 있어서의 CD34 양성 세포로부터 증식한 세포의 상대적 세포수를 표 29 에 나타낸다.
Figure pct00030
(시험예 28 : 스피어 형성 시험)
시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 0.015 ％ 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 및 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 의 조성물을 조제했다. 계속하여, HepG2 세포를 15000 개/㎖ 의 세포 농도가 되도록 첨가한 후, 24 웰 플레이트 (코닝사 제조) 에 1 ㎖ 분주했다. 본 플레이트를 7 일간, 37 ℃ 에서 부유 정치 배양한 후, 스피어의 형성을 현미경으로 확인하였다. 또한, 400 G, 5 분간의 원심 처리에 의해 스피어 세포를 침강시켜, PBS 5 ㎖ 로 1 회 세정한 후, 100 ㎕ 의 트립신-EDTA (에틸렌디아민4아세트산) 용액 (WAKO 사 제조) 을 첨가해, 37 ℃ 에서 5 분간 보온하였다. 여기서 얻어진 세포 현탁액 100 ㎕ 에 대해 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 100 ㎕ 첨가하고, 그 일부의 세포 현탁액에 대해 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다. 그 결과, HepG2 세포는 본 발명의 배지 조성물에서 스피어를 형성하고, 또 세포수도 80800 개/㎖ 까지가 증가하고 있는 것이 확인되었다. 본 발명의 배지 조성물로 형성한 HepG2 세포의 스피어를 도 14 에 나타낸다.
(시험예 29 : 세포주 유래 스피어를 사용한 세포 부유 시험)
디우탄검 (KELKO-CRETE DG, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 의 농도가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해했다. 본 수용액을 이용하여, 디우탄검에 대해 최종 농도가 0.1 ％ (w/v) 인 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. 또, 0.5 ％ (w/v) 의 네이티브형 젤란검 (켈코겔 HT, 산에이겐 에프에프아이 주식회사 제조) 을 포함하는 수용액을 90 ℃ 에서 가열함으로써 조제하고, 본 수용액을 이용하여 0.05, 0.1 ％ (w/v) 의 네이티브형 젤란검을 포함하는 DMEM/F-12 배지 (시그마사 제조) 조성물을 조제했다.
시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 HeLa 세포의 스피어를 제조하고, 상기에서 조제한 배지 1 ㎖ 에 각각 수십개의 스피어를 첨가한 후, 1 시간 37 ℃ 에서 정치해, 스피어 세포의 부유 상태를 육안으로 관찰하였다. 그 결과, HeLa 세포의 스피어는 상기 배지 조성물 모두에 있어서 부유 상태로 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 0.1 ％ (w/v) 의 디우탄검을 포함하는 본 세포 현탁액을 원심 처리 (200 G, 5 분) 함으로써 HeLa 세포의 스피어가 침강하여, 세포를 회수할 수 있는 것을 확인하였다.
(시험예 30 : 세포 접착능을 갖는 자기 (magnetic) 비즈를 사용한 세포 부유 시험 1)
라미닌 혹은 피브로넥틴으로 코팅한 GEM (등록상표, Global Eukaryotic Microcarrier, 지엘사이언스 주식회사 제조) 현탁 용액을 500 ㎕ 씩 1.5 ㎖ 용량의 마이크로 테스트 튜브 (에펜도르프사 제조) 에 분주하고, 자석 스탠드 (TA4899N12, 타마가와세이키 주식회사 제조) 를 사용하여 상기 GEM 현탁 용액으로부터 GEM 을 집적시켜 용매를 제거했다. 또한, 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 500 ㎕ 에 의해 GEM 을 2 회 세정한 후, 전술 배지 500 ㎕ 에 현탁하였다. 본 현탁액을 세포 저접착 플레이트인 스밀론 셀 타이트 플레이트 24F (스미토모 베이클라이트 주식회사 제조) 에 1 웰당 50 ㎕ 분주했다. 계속하여, 별도 조제한 HepG2 세포를 250000 세포/㎖ 가 되도록 첨가해, 전술 배지로 최종 용량을 500 ㎕/웰로 하였다. 본 세포 현탁액을 수동으로 교반한 후, 본 플레이트를 하룻밤, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 정치했다. GEM 상에서의 세포의 접착을 현미경으로 확인한 후, 세포 현탁액을 1.5 ㎖ 용량의 마이크로 테스트 튜브 (에펜도르프사 제조) 로 옮겨, 상기 자석 스탠드를 이용하여 세포 부착 GEM 을 집적시켜 상청을 제거했다.
시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 0.015 ％ 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 및 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 의 조성물을 조제했다. 본 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지 각각 1 ㎖ 를 상기에서 조제한 HepG2 세포 부착 GEM (라미닌 혹은 피브로넥틴 코팅) 에 첨가해, 현탁시킨 후, 스밀론 셀 타이트 플레이트 24F 로 옮겼다. 계속하여, 본 플레이트를 6 일간, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 정치한 후, 세포 배양액을 1.5 ㎖ 용량의 마이크로 테스트 튜브 (에펜도르프사 제조) 로 옮겨, 상기 자석 스탠드 상에서 완만하게 피펫팅하면서 세포 부착 GEM 을 집적시켜 상청을 제거했다. 본 GEM 을 PBS 1 ㎖ 로 1 회 세정하고, 200 ㎕ 의 트립신-EDTA (에틸렌디아민4아세트산) 용액 (WAKO 사 제조) 을 첨가해, 37 ℃ 에서 10 분간 보온하였다. 여기서 얻어진 세포 현탁액 200 ㎕ 에 대해 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 800 ㎕ 첨가하고, 그 일부의 세포 현탁액에 대해 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, HepG2 세포를 접착시킨 GEM 은 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 부유 상태로 배양할 수 있고, 당해 배지 조성물로 효율적으로 세포가 증식하는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 기존 배지와 비교해, 세포 증식의 촉진 효과가 우수한 것이 확인되었다. 또, 자력을 사용함으로써 본 발명의 배지 조성물로부터 HepG2 세포 부착 GEM 을 집적시킬 수 있고, 또한 본 GEM 으로부터 HepG2 세포를 회수할 수 있는 것을 확인하였다.
탈아실화젤란검 함유 혹은 비함유 배지로 HepG2 세포를 GEM 상에서 6 일간 배양했을 때의 세포수를 표 30 에 나타낸다. 또, HepG2 세포를 부착시킨 라미닌 코팅 GEM 을 본 발명의 배지 조성물로 배양했을 때의 부유 상태를 도 14 에 나타낸다.
Figure pct00031
(시험예 31 : 세포 접착능을 갖는 자기 비즈를 사용한 세포 부유 시험 2)
시험예 30 과 동일하게, 피브로넥틴으로 코팅한 GEM (등록상표, Global Eukaryotic Microcarrier, 지엘사이언스 주식회사 제조) 을 MF-Medium (등록상표) 간엽계 줄기세포 증식 배지 (토요보 주식회사 제조) 에 현탁하였다. 본 현탁액을 세포 저접착 플레이트인 스밀론 셀 타이트 플레이트 24F (스미토모 베이클라이트 주식회사 제조) 에 1 웰당 50 ㎕ 분주했다. 계속하여, 별도 조제한 인간 골수 유래의 간엽계 줄기세포 (Cell Applications 사 제조) 를 250000 세포/㎖ 가 되도록 첨가하고, 시험예 30 과 동일하게 본 플레이트를 하룻밤, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 정치시켜 간엽계 줄기세포가 접착된 GEM 을 조제했다.
시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 0.015 ％ 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 함유하는 MF-Medium (등록상표) 간엽계 줄기세포 증식 배지 (토요보 주식회사 제조) 의 조성물을 조제했다. 본 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지 각각 1 ㎖ 를 상기에서 조제한 간엽계 줄기세포 부착 GEM (피브로넥틴 코팅) 에 첨가해, 현탁시킨 후, 스밀론 셀 타이트 플레이트 24F 로 옮겼다. 계속하여, 본 플레이트를 4 일간, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 정치한 후, 세포 배양액을 1.5 ㎖ 용량의 마이크로 테스트 튜브 (에펜도르프사 제조) 로 옮겨, 상기 자석 스탠드 상에서 완만하게 피펫팅하면서 세포 부착 GEM 을 집적시켜 상청을 제거했다. 본 GEM 을 PBS 1 ㎖ 로 1 회 세정하여, 200 ㎕ 의 트립신-EDTA (에틸렌디아민4아세트산) 용액 (WAKO 사 제조) 을 첨가해, 37 ℃ 에서 10 분간 보온하였다. 여기서 얻어진 세포 현탁액 200 ㎕ 에 대해 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 800 ㎕ 첨가하고, 그 일부의 세포 현탁액에 대해 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 간엽계 줄기세포를 접착시킨 GEM 은 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 부유 상태로 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 효율적으로 세포가 증식하는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 기존 배지와 비교해, 세포 증식의 촉진 효과가 우수한 것이 확인되었다. 또, 자력을 사용함으로써 본 발명의 배지 조성물로부터 간엽계 줄기세포 부착 GEM 을 집적시키는 것이 가능하고, 또한 본 GEM 으로부터 간엽계 줄기세포를 회수할 수 있는 것을 확인하였다.
탈아실화젤란검 함유 혹은 비함유 배지로 간엽계 줄기세포를 GEM 상에서 4 일간 배양했을 때의 세포수를 표 31 에 나타낸다.
Figure pct00032
(시험예 32 : 알긴산 비즈를 사용한 세포 부유 시험)
이하의 시험은, 주식회사 PG 리서치 제조 알긴산 삼차원 배양 키트의 방법에 준해 실시했다. 별도 조제한 HepG2 세포를 400000 세포/㎖ 가 되도록 알긴산나트륨 용액 (주식회사 PG 리서치 제조) 2.5 ㎖ 에 첨가하고, 또한 인간 재조합 라미닌 511 (주식회사 베리타스 제조) 을 5 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가해, 세포 현탁액을 조제했다. 본 세포 현탁액에 대해 가비지 바늘을 장착한 5 ㎖ 시린지 (테루모 주식회사 제조) 로 회수한 후, 본 시린지에 22G 주사바늘 (테루모 주식회사 제조) 을 장착했다. 계속하여, 염화칼슘 수용액 (주식회사 PG 리서치 제조) 이 2 ㎖ 씩 첨가되어 있는 24 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (주식회사 PG 리서치 제조) 의 웰에 대해, 본 세포 현탁액을 10 방울씩 첨가했다. 10 분간, 실온에서 정치하고나서 알긴산 비즈의 형성을 확인한 후, 염화칼슘 용액을 제거하고, PBS 2 ㎖ 를 첨가해 실온에서 15 분 정치했다. 또한, PBS 를 제거한 후, 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 2 ㎖ 를 첨가해 실온에서 15 분 정치했다. 배지를 제거한 후, 시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 조제한 0.03 ％ 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 및 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 의 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지 각각 1 ㎖ 를 각 웰에 첨가해, 8 일간, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 정치 배양하였다. 또한, 배지 교환은 배양 4 일째에 실시했다.
배양한 알긴산 비즈를 1 ㎖ 용량의 팁을 이용하여 1.5 ㎖ 용량의 마이크로 테스트 튜브 (에펜도르프사 제조) 로 옮긴 후, 시트르산나트륨 용액 (주식회사 PG 리서치 제조) 1 ㎖ 를 각 튜브에 첨가해, 실온 15 분간 교반하여 알긴산 비즈를 용해시켰다. 계속하여, 300 G, 3 분간의 원심 처리에 의해 세포를 침강시켜, 상청을 제거했다. 본 세포에 대해 200 ㎕ 의 트립신-EDTA (에틸렌디아민4아세트산) 용액 (WAKO 사 제조) 을 첨가해, 37 ℃ 에서 5 분간 보온하였다. 여기서 얻어진 세포 현탁액 200 ㎕ 에 대해 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 800 ㎕ 첨가하고, 그 일부의 세포 현탁액에 대해 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, HepG2 세포를 포매한 알긴산 비즈는 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 부유 상태로 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 효율적으로 세포가 증식하는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 기존 배지와 비교해, 세포 증식의 촉진 효과가 우수한 것이 확인되었다.
탈아실화젤란검 함유 혹은 비함유 배지로 HepG2 세포를 알긴산 비즈 내에서 8 일간 배양했을 때의 세포수를 표 32 에 나타낸다. 또, HepG2 세포를 포매한 알긴산 비즈를 본 발명의 배지 조성물로 배양했을 때의 부유 상태를 도 16 에 나타낸다.
Figure pct00033
(시험예 33 : 콜라겐젤 캡슐을 사용한 세포 부유 시험)
A : 조직 배양용 콜라겐 Cellmatrix (등록상표) TypeI-A (셀 매트릭스, 닛타 젤라틴 주식회사 제조), B : 10 배 농도의 DMEM/F-12 배지 (Aldrich 사 제조), C : 재구성용 완충액 (0.05 N 수산화나트륨 용액 100 ㎖ 에 탄산수소나트륨 2.2 g, HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄 술폰산)) 4.77 g 을 첨가해 여과 멸균한 것) 의 각각을 얼음 중에서 냉각하면서 A : B : C = 8 : 1 : 1 이 되도록 혼합하였다. 또한, 인간 재조합 라미닌 511 (주식회사 베리타스 제조) 을 5 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가해, 콜라겐 혼합 용액 500 ㎕ 를 조제했다. 본 혼합 용액에 대해 별도 조제한 HepG2 세포를 200000 세포/㎖ 가 되도록 첨가하고, 25 G 주사바늘 (테루모 주식회사 제조) 을 장착한 1.5 ㎖ 시린지 (테루모 주식회사 제조) 를 이용하여 전량을 회수했다. 계속하여, 37 ℃ 에서 미리 보온한 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 10 ㎖ 를 첨가한 평평한 바닥 튜브 (BM 기기사 제조) 에 대해, 상기 시린지를 이용하여 1 방울씩 세포 현탁액을 적하했다. 37 ℃ 수욕 중에서 10 분간 보온하여, 직경 2 ㎜ 정도의 부정형의 콜라겐젤 캡슐의 형성을 확인한 후, 시험예 2 와 동일한 방법으로 최종 농도 0.04 ％ 가 되도록 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 첨가해, 가볍게 교반하여 상기 캡슐을 부유시켰다. 계속하여, 5 일간, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 본 튜브를 정치 배양하였다.
콜라겐젤 캡슐을 포함하는 배양액에 대해 PBS 25 ㎖ 를 첨가해, 400 G, 5 분간의 원심 처리에 의해 콜라겐젤 캡슐을 침강시켜, 상청을 제거했다. 재차, PBS 25 ㎖ 를 첨가해 원심 처리를 실시해, 잔량이 5 ㎖ 가 되도록 상청을 제거했다. 본 액에 대해 1 ％ (W/V)제L 콜라게나아제 L (닛타 젤라틴 주식회사 제조) 20 ㎕ 를 첨가한 후, 37 ℃ 에서 2 시간 진탕하였다. 콜라겐젤의 용해를 확인한 후, PBS 10 ㎖ 를 첨가해, 400 G, 5 분간의 원심 처리에 의해 세포를 침강시켜, 상청을 제거했다. 본 세포에 대해 1 ㎖ 의 트립신-EDTA (에틸렌디아민4아세트산) 용액 (WAKO 사 제조) 을 첨가해, 37 ℃ 에서 5 분간 보온하였다. 여기서 얻어진 세포 현탁액에 대해 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 4 ㎖ 첨가해, 400 G, 5 분간의 원심 처리에 의해 세포를 침강시켜, 상청을 제거했다. 얻어진 세포를 2 ㎖ 의 전술 배지로 현탁하고, 그 일부에 대해 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, HepG2 세포를 포매한 콜라겐젤 캡슐은 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 부유 상태로 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 효율적으로 세포가 증식하는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은, 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 기존 배지와 비교해, 세포 증식의 촉진 효과가 우수한 것이 확인되었다.
탈아실화젤란검 함유 혹은 비함유 배지로 HepG2 세포를 콜라겐젤 캡슐 내에서 5 일간 배양했을 때의 세포수를 표 33 에 나타낸다. 또, HepG2 세포를 포매한 콜라겐젤 캡슐을 본 발명의 배지 조성물로 배양했을 때의 부유 상태를 도 17 에 나타낸다.
Figure pct00034
(시험예 34 : 필터를 사용한 스피어의 회수 시험)
시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 0.015 ％ 의 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 및 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 의 조성물을 조제했다. 또, 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지를 조제했다. 시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 HepG2 세포의 스피어를 제조해, 상기에서 조제한 배지 1 ㎖ 에 각각 86000 개의 세포수가 되도록 스피어를 첨가한 후, 1 시간 37 ℃ 에서 정치하고, 스피어 세포의 부유 상태를 육안으로 관찰하였다. 또한, 메시 사이즈가 40 ㎛ 인 셀 스트레이너 (벡톤 디킨슨사 제조) 상에 본 세포 현탁액을 첨가해, 스피어를 필터 상에 포착했다. 계속하여, 필터의 이면으로부터 PBS 10 ㎖ 를 흘려 넣음으로써 스피어를 15 ㎖ 튜브에 회수하고, 300 G, 5 분간의 원심 처리에 의해 스피어를 침강시켰다. 상청을 제거한 후, 스피어에 대해 500 ㎕ 의 트립신-EDTA (에틸렌디아민4아세트산) 용액 (WAKO 사 제조) 을 첨가해, 37 ℃ 에서 5 분간 보온하였다. 여기서 얻어진 세포 현탁액에 대해 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 1 ㎖ 첨가하고, 그 일부에 대해 트리판블루 염색액 (인비트로젠사 제조) 을 동량 첨가한 후, 혈구 계산판 (ERMA Inc. 제조) 으로 생세포의 수를 측정하였다. 그 결과, HepG2 세포의 스피어는, 상기 배지 조성물에 있어서 부유 상태로 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 0.015 ％ 의 탈아실화젤란검을 포함하는 본 스피어 현탁액을 필터 처리함으로써, HepG2 세포의 스피어를 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지와 동등한 회수율로 세포를 회수할 수 있는 것을 확인하였다. 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지를 이용하여 필터로 회수된 HepG2 세포수를 1 로 했을 때의, 탈아실화젤란검을 포함하는 배지로부터 회수된 상대적 세포수를 표 34 에 나타낸다.
Figure pct00035
(시험예 35 : 각종 다당류의 혼합제를 사용한 스피어의 세포 부유 시험)
시험예 15 와 동일한 방법을 이용하여, 크산탄검 (KELTROL CG, 산쇼 주식회사 제조), 알긴산나트륨 (덕 알긴산 NSPM, 푸드케미파 제조), 로커스트빈검 (GENUGUM RL-200-J, 산쇼 주식회사 제조), 메틸셀룰로오스 (cP400, WAKO 주식회사 제조), κ-카라기난 (GENUGEL WR-80-J, 산쇼 주식회사 제조), 펙틴 (GENU pectin LM-102AS, 산쇼 주식회사 제조) 혹은 디우탄검 (KELCO CRETE DG-F, 산쇼 주식회사 제조) 과 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 조합하여 혼합한 DMEM/F-12 배지 조성물을 조제했다. 시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 HepG2 세포의 스피어를 조제하고, 상기에서 조제한 배지 1 ㎖ 에 각각 수십개의 스피어를 첨가한 후, 37 ℃ 에서 정치하고, 1 시간 및 하룻밤 후의 스피어 세포의 부유 상태를 육안으로 관찰하였다. 그 결과, HepG2 세포의 스피어는 상기 배지 조성물 모두에 있어서 부유 상태로 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 2 배 용량의 배지를 첨가한 후, 본 세포 현탁액을 원심 처리 (500 G, 5 분) 함으로써 HepG2 세포의 스피어가 침강하여, 세포를 회수할 수 있는 것을 모든 배지 조성물에 있어서 확인하였다. 하룻밤 후의 스피어 분산 상태를 육안으로 확인했을 때, 부유 분산 상태를 ○, 일부 침강/분산 상태를 △, 침강 상태를 x 로서 평가한 결과를 표 35 및 표 36 에 나타낸다. 또한, 표 중의 - 는 미실시를 나타낸다.
Figure pct00036
Figure pct00037
비즈와 세포의 분산성 비교 1
상기 (비교예) 에서 조제한 탈아실젤란검 함유 배지와 메틸셀룰로오스 함유 배지에 대해, 덱스트란 비즈 Cytodex (등록상표) 1 (GE Healthcare Life Sciences 사 제조) 와 HeLa 세포 스피어의 분산 상태를 비교했다. 결과를 표에 나타낸다. Cytodex1 과 HeLa 세포 스피어의 분산 상태는 충분히 관련되어 있으므로, Cytodex1 을 세포 스피어 모델로서 사용할 수 있다.
Figure pct00038
Figure pct00039
비즈와 세포의 분산성 비교 2
시험예 15 에서 조제한 다당 및 탈아실젤란검 함유 배지에 대해, 폴리스티렌 비즈 (Size 500-600 ㎛, Polysciences Inc.제) 와 HepG2 세포 스피어의 분산 상태를 비교했다. 부유 분산 상태를 ○, 일부 침강/분산 상태를 △, 침강 상태를 x 로서 평가했다. 결과를 표에 나타낸다. 폴리스티렌 비즈와 HepG2 세포 스피어의 분산 상태는 충분히 관련되어 있으므로, 폴리스티렌 비즈를 세포 스피어 모델로서 사용할 수 있다.
Figure pct00040
(시험예 36 : 벼 유래 식물 캘러스의 부유 배양 시험)
염수선으로 정선된 벼 니혼바레의 완숙 종자 (코토 농업협동조합에서 구입) 50 립을 50 ㎖ 폴리스티렌 튜브 (BD 팔콘사 제조) 로 옮겨, 멸균수 50 ㎖ 로 세정한 후, 70 ％ 에탄올 물 30 ㎖ 중에서 1 분간 교반하였다. 에탄올 물을 제거한 후, 키친 하이터 (카오 주식회사 제조) 30 ㎖ 를 첨가해, 1 시간 교반하였다. 키친 하이터를 제거한 후, 멸균수 50 ㎖ 로 4 회 세정하였다. 여기서 멸균한 종자를 2 ㎍/㎖ 의 2,4-디클로로페녹시아세트산 (시그마알드리치사 제조) 및 한천을 포함하는 무라시게 스쿠그 기초 배지 (M9274, 시그마알드리치사 제조) 1.5 ㎖/웰 (24 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조)) 상에 치상 (置床) 하였다. 30 ℃, 16 시간 암소/8 시간 암소의 조건으로 3 주간 배양해, 종자의 배반 상에서 증식한 크림색의 캘러스 (1 ∼ 2 ㎜) 를 채취했다.
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여, 2 ㎍/㎖ 의 2,4-디클로로페녹시아세트산 (시그마알드리치사 제조) 을 포함하는 무라시게 스쿠그 기초 배지 (M9274, 시그마알드리치사 제조) 에 최종 농도 0.03 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 상기에서 조제한 캘러스 15 개를 본 배지 조성물 10 ㎖/평평한 바닥 튜브 (BM 기기사 제조) 에 첨가해, 7 일간, 25 ℃ 에서 진탕 배양을 실시했다. 그 결과, 벼 유래 캘러스는 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 부유 상태로 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물에서 캘러스가 유지되는 것이 확인되었다. 벼 유래 캘러스를 본 발명의 배지 조성물로 배양했을 때의 부유 상태를 도 18 에 나타낸다.
(시험예 37 : HeLa 세포를 분산시켰을 때의 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 혹은 0.030 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 50000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 HeLa 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 8 일간 정치 상태로 배양하였다. 3, 8 일간 배양 후의 배양액에 대해 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다. 세포 밀도는, 8 일간 배양 후의 세포를 포함한 배양액을 피펫으로 교반을 실시하고, 얻어진 교반액 20 ㎕ 와 Trypan Blue stain 0.4 ％ (Invitrogen 사 제조) 20 ㎕ 를 혼합한 후, 현미경하에서 계측하였다.
그 결과, HeLa 세포는 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 세포 응집 덩어리의 크기가 과잉이 되지 않고, 균일하게 분산된 상태로 배양할 수 있고, 당해 배지 조성물로 효율적으로 증식하는 것이 확인되었다. 8 일간 배양 후의 HeLa 세포의 응집 덩어리의 현미경 관찰 결과를 도 19 에 나타낸다. 또, 정치 배양 3, 8 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (HeLa 세포의 세포수에 상당한다) 를 표 40 에 나타낸다. 8 일간 배양 후의 HeLa 세포의 세포 밀도를 표 41 에 나타낸다.
Figure pct00041
Figure pct00042
(시험예 38 : A549 세포 및 HCT116 세포를 분산시켰을 때의 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 혹은 McCoy's 5a 배지 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 폐암 세포주 A549 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 혹은 인간 대장암 세포주 HCT116 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 을, 50000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 A549 세포 및 HCT116 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 7 일간 정치 상태로 배양하였다. 3, 5, 7 일간 배양 후의 배양액에 대해 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, A549 세포 및 HCT116 세포는, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 세포 응집 덩어리의 크기가 과잉이 되지 않고, 균일하게 분산된 상태로 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 효율적으로 증식하는 것이 확인되었다. 5 일간 배양 후의 A549 세포 및 HCT116 세포의 응집 덩어리의 현미경 관찰 결과를 도 20 에 나타낸다. 또, 정치 배양 3, 5, 7 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (A549 세포의 세포수에 상당한다) 를 표 42 에, 450 ㎚ 의 흡광도 (HCT116 세포의 세포수에 상당한다) 를 표 43 에 나타낸다.
Figure pct00043
Figure pct00044
(시험예 39 : U 저 (底) 의 저접착 표면 플레이트를 사용했을 때의 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를, 50000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 U 저 저접착 표면 마이크로 플레이트 (스미토모 베이클라이트제, ＃MS-9096U) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 HeLa 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 7 일간 정치 상태로 배양하였다. 2, 5, 7 일간 배양 후의 배양액에 대해, WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 다른 저접착 플레이트에서도 당해 배지 조성물로 효율적으로 증식하는 것이 확인되었다. 정치 배양 2, 5, 7 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (HeLa 세포의 세포수에 상당한다) 를 표 44 에 나타낸다.
Figure pct00045
(시험예 40 : 타사의 저접착 표면 플레이트를 사용했을 때의 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.005 ％ 및 0.030 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를, 50000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 저접착 표면 마이크로 플레이트 (IWAKI 제조, ＃Ez-BindShut) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 HeLa 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 7 일간 정치 상태로 배양하였다. 3 일간 배양 후의 배양액에 대해, WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써, 다른 저접착 플레이트에서도 당해 배지 조성물로 효율적으로 증식하는 것이 확인되었다. 정치 배양 3 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (HeLa 세포의 세포수에 상당한다) 를 표 45 에 나타낸다.
Figure pct00046
(시험예 41 : Happy Cell ASM 배지와의 세포 증식 비교 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. Happy Cell ASM 배지 (biocroi 사 제조) 는 미리 지정한 농도 (1 : 1 로 혼합) 가 되도록 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 로 조제했다. 계속하여, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 혹은 인간 폐암 세포주 A549 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를, 50000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물 혹은 Happy Cell ASM 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 HeLa 세포 및 A549 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 5 일간 정치 상태로 배양하였다. 3, 5 일간 배양 후의 배양액에 대해, WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써, Happy Cell ASM 과 비교해 당해 배지 조성물로 효율적으로 증식하는 것이 확인되었다. 정치 배양 3, 5 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (HeLa 세포의 세포수에 상당한다) 를 표 46 에, 450 ㎚ 의 흡광도 (A549 세포의 세포수에 상당한다) 를 표 47 에 나타낸다.
Figure pct00047
Figure pct00048
(시험예 42 : 다른 다당류를 사용했을 때의 세포 증식 시험)
디우탄검 (KELCO CRETE DG-F, 산쇼 주식회사 제조) 을 1.5 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (닛스이 제약사 제조) 에 최종 농도 0.2 ％ 및 0.3 ％ (w/v) 의 디우탄검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 폐암 세포주 A549 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 50000 세포/㎖ 가 되도록 상기 디우탄검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 디우탄검을 포함하지 않는 전술 배지에 A549 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 3 일간 정치 상태로 배양하였다. 3 일간 배양 후의 배양액에 대해 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써, 다른 다당류를 포함하는 당해 배지 조성물로 효율적으로 증식하는 것이 확인되었다. 정치 배양 3 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (A549 세포의 세포수에 상당한다) 를 표 48 에 나타낸다.
Figure pct00049
(시험예 43 : 각종 항암제를 사용한 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.030 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검과 최종 농도 0.001, 0.01, 0.1, 1 μM 의 각종 항암제를 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 항암제는 Adriamycin (WAKO 사 제조), Paclitaxel (WAKO 사 제조) 혹은 Mitomycin C (WAKO 사 제조) 를 사용하였다. 계속하여, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 50000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다.
또한, 무첨가로서, 최종 농도 0.030 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검만을 포함하는 전술 배지에 HeLa 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 7 일간 정치 상태로 배양하였다. 3, 5, 7 일간 배양 후의 배양액에 대해 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다. 세포 밀도는, 5 일간 배양 후의 세포를 포함한 배양액을 피펫으로 교반을 실시해, 교반액 20 ㎕ 와 Trypan Blue stain 0.4 ％ (Invitrogen 사 제조) 20 ㎕ 를 혼합하여 현미경하에서 계측하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용한 세포 증식 시험법에 의해, 항암제를 효율적으로 평가할 수 있는 것이 확인되었다. 또, 정치 배양 3, 5, 7 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (HeLa 세포의 세포수에 상당한다) 를 표 49 에 나타낸다. 5 일간 후의 HeLa 세포의 세포 밀도를 표 50 에 나타낸다.
Figure pct00051
(시험예 44 : 인간 초대 간세포의 유지 및 기능 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 첨가제 (HCMsingleQuots (등록상표), BSA-Fatty acid free, EGF, Ascorbic acid, Transferrin, Insulin, GA-1000, Hydrocortisone 21 hemisuccinate ; 론자 재팬 주식회사 제조) 를 첨가한 HBM 배지 (론자 재팬 주식회사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ 혹은 0.030 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 동결되어 있던 인간 초대 간세포 (Xenotech 사 제조) 를 250000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 U 저 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (스미토모 베이클라이트 주식회사 제조, PrimeSurface, MS-9096U) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 인간 초대 간세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 3 일간 배양하였다.
1. 생세포수 측정
4 시간, 8 시간, 1 일간 배양 후의 배양액에 대해 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정함으로써 생세포의 수를 측정하였다.
2. 알부민 분비량의 해석
3 일간 배양 후의, 간세포를 포함하는 배양액을 회수해, 원심분리 (400 g, 3 분간) 함으로써 배양 상청을 회수했다. 배지 중의 인간 알부민 농도는 Albumin ELISA Quantitation kit (Bethyl Laboratories 사 제조) 를 이용하여 측정하였다.
3. 리얼타임 PCR 법에 의한 mRNA 의 발현 해석
8 시간 배양 후의, 간세포를 포함하는 배양액을 회수해, 원심분리 (400 g, 3 분간) 함으로써 세포를 회수했다. 세포로부터 RNeasy Mini kit (QIAGEN 사 제조) 를 이용하여 총 RNA 를 추출하였다. 총 RNA 와 PrimeScript (등록상표) RT Master Mix (타카라바이오사 제조) 를 사용하고, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems 사 제조) 을 이용하여 역전사 반응을 실시해, cDNA 를 합성하였다. PCR 반응에 사용한 각 cDNA 샘플은, 분주해 멸균수로 1/10 로 희석한 것을 사용하였다. 또 검량선에 사용하는 샘플은, 분주해 혼합시킨 cDNA 를 사용하여, 3 배 공비로 1/3 에서부터 1/243 의 희석까지의 정량 범위에서 설정하였다. PCR 반응은 각 cDNA 샘플, 검량 샘플, Premix Ex Taq (등록상표) (타카라바이오사 제조) 와 각종 Taqman 프로브 (Applied Biosystems 사 제조) 를 사용하여, 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems 사 제조) 을 이용하여 실시했다. 특이성은 GAPDH 의 mRNA 를 내재성 컨트롤로 하여, 각 mRNA 의 발현은 GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 의 값으로 보정하고, 음성 대조를 100 ％ 로 하여 산출하였다.
사용한 각 프로브 (Applied Biosystems 사 제조) 를 이하에 나타낸다.
GAPDH : HS99999905
Albumin : HS99999922
Cyp3A4 : HS00604506
Cyp2C9 : HS02383631
PXR (Pregnane X receptor) : HS01114267
ApoA1 (Apolipoprotein A1) : HS00163641
그 결과, 본 발명의 배지 조성물은, 인간 초대 간세포를 분산시킨 상태로 유지하고, 보호함으로써 생세포수의 감소를 억제하는 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또 당해 배지 조성물에서 알부민 산생능과 약물 동태에 관련된 mRNA 군 발현능이 음성 대조에 비해 높은 것이 확인되었다. 정치 배양 4 시간, 8 시간, 1 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (인간 초대 간세포의 세포수에 상당한다) 를 표 51 에 나타낸다. 정치 배양 3 일간 후의 배양 상청 중의 알부민값을 표 52 에 나타낸다. 또 정치 배양 8 시간 후의 음성 대조를 100 ％ 로 했을 때의 각 mRNA 발현값을 표 53 에 나타낸다. 인간 초대 간세포를 4 시간 배양했을 때의 세포 상태를 도 21 에 나타낸다.
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
(시험예 45 : 필리핀 원숭이 초대 간세포의 유지 및 기능 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 첨가제 (HCMsingleQuots (등록상표), BSA-Fatty acid free, EGF, Ascorbic acid, Transferrin, Insulin, GA-1000, Hydrocortisone 21 hemisuccinate ; 론자 재팬 주식회사 제조) 를 첨가한 HBM 배지 (론자 재팬 주식회사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ 혹은 0.030 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 동결되어 있던 필리핀 원숭이 초대 간세포 (주식회사 이나 리서치사 제조) 를, 250000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 U 저 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (스미토모 베이클라이트 주식회사 제조, PrimeSurface, MS-9096U) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 필리핀 원숭이 초대 간세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 3 일간 정치 상태로 배양하였다.
1. 생세포수 측정
4 시간, 8 시간, 1 일, 3 일간 배양 후의 배양액에 대해 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정함으로써 생세포의 수를 측정하였다.
2. 알부민 분비량의 해석
3 일간 배양 후의, 간세포를 포함하는 배양액을 회수해, 원심분리 (400 g, 3 분간) 함으로써 배양 상청을 회수했다. 배지 중의 인간 알부민 농도는 Albumin ELISA Quantitation kit (Bethyl Laboratories 사 제조) 를 이용하여 측정하였다.
3. 리얼타임 PCR 법에 의한 mRNA 의 발현 해석
1, 2, 3 일간 배양 후의, 간세포를 포함하는 배양액을 회수해, 원심분리 (400 g, 3 분간) 함으로써 세포를 회수했다. 세포로부터 RNeasy Mini kit (QIAGEN 사 제조) 를 이용하여 총 RNA 를 추출하였다. 총 RNA 와 PrimeScript (등록상표) RT Master Mix (타카라바이오사 제조) 를 사용하고, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems 사 제조) 을 이용하여 역전사 반응을 실시해, cDNA 를 합성하였다. PCR 반응에 사용한 각 cDNA 샘플은, 분주해 멸균수로 1/10 로 희석한 것을 사용하였다. 또 검량선에 사용하는 샘플은, 분주해 혼합시킨 cDNA 를 사용하여, 3 배 공비로 1/3 에서부터 1/243 의 희석까지의 정량 범위에서 설정했다. PCR 반응은 각 cDNA 샘플, 검량 샘플, Premix Ex Taq (등록상표) (타카라바이오사 제조) 와 각종 Taqman 프로브 (Applied Biosystems 사 제조) 를 사용하여, 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems 사 제조) 을 이용하여 실시했다. 특이성은 GAPDH 의 mRNA 를 내재성 컨트롤로 하여, 각 mRNA 의 발현은 GAPDH 의 값으로 보정해 산출하였다.
사용한 각 프로브 (Applied Biosystems 사 제조) 를 이하에 나타낸다.
GAPDH : Rh02621745
Albumin : Rh02789672
ApoA1 (Apolipoprotein A1) : Rh02794272
그 결과, 본 발명의 배지 조성물은, 필리핀 원숭이 초대 간세포를 보호함으로써 생세포수의 감소를 억제하는 효과를 갖는 것이 확인되었다. 또 당해 배지 조성물로 배양한 간세포는, 알부민 산생능과 Albumin 및 ApoA1 의 mRNA 군 발현능이 음성 대조에 비해 높은 것이 확인되었다. 정치 배양 4 시간, 8 시간, 1 일간, 3 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (필리핀 원숭이 초대 간세포의 세포수에 상당한다) 를 표 54 에 나타낸다. 정치 배양 3 일간 후의 배양 상청 중의 알부민값을 표 55 에 나타낸다. 또 정치 배양 2, 3 일 후에 있어서의, 음성 대조를 100 ％ 로 했을 때의 Albumin 의 mRNA 발현값을 표 56 에, ApoA1 의 mRNA 발현값을 표 57 에 나타낸다. 필리핀 원숭이 초대 간세포를 4 시간 배양했을 때의 세포 상태를 도 22 에 나타낸다.
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
(시험예 46 : 콜라겐 코팅 마이크로 플레이트에 있어서의 간세포의 유지 및 기능 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 첨가제 (HCMsingleQuots (등록상표), BSA-Fatty acid free, EGF, Ascorbic acid, Transferrin, Insulin, GA-1000, Hydrocortisone 21 hemisuccinate ; 론자 재팬 주식회사 제조) 를 첨가한 HBM 배지 (론자 재팬 주식회사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ 혹은 0.030 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 동결되어 있던 필리핀 원숭이 초대 간세포 (주식회사 이나 리서치사 제조) 를, 100000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 콜라겐 코팅 마이크로 플레이트 (IWAKI 사 제조, 4860-010) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 필리핀 원숭이 초대 간세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 3 일간 정치 상태로 배양하였다.
1. 생세포수 측정
1 일간 배양 후의 배양액에 대해 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정함으로써 생세포의 수를 측정하였다.
2. 알부민 분비량의 해석
3 일간 배양 후의, 간세포를 포함하는 배양액을 회수해, 원심분리 (400 g, 3 분간) 함으로써 배양 상청을 회수했다. 배지 중의 인간 알부민 농도는 Albumin ELISA Quantitation kit (Bethyl Laboratories 사 제조) 를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써, 콜라겐을 코팅한 플레이트를 이용해도 당해 배지 조성물로 초대 간세포를 보호함으로써 생세포수의 감소를 억제하는 것이 확인되었다. 또 당해 배지 조성물에서 알부민 산생능이 음성 대조에 비해 높은 것이 확인되었다. 정치 배양 1 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (필리핀 원숭이 초대 간세포의 세포수에 상당한다) 를 표 58 에 나타낸다. 또 정치 배양 3 일간 후의 배양 상청 중의 알부민값을 표 59 에 나타낸다.
Figure pct00059
Figure pct00060
(시험예 47 : Happy Cell ASM 배지와의 비교 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 첨가제 (HCMsingleQuots (등록상표), BSA-Fatty acid free, EGF, Ascorbic acid, Transferrin, Insulin, GA-1000, Hydrocortisone 21 hemisuccinate ; 론자 재팬 주식회사 제조) 를 첨가한 HBM 배지 (론자 재팬 주식회사 제조) 를 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 1 : 1 로 혼합하여, 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. Happy Cell ASM 배지 (biocroi 사 제조) 는 미리 지정한 농도 (1 : 1 로 혼합) 가 되도록 DMEM 배지로 조제했다. 계속하여, 동결되어 있던 인간 초대 간세포 (Xenotech 사 제조) 를, 250000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물 혹은 Happy Cell ASM 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 U 저 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (스미토모 베이클라이트 주식회사 제조) 의 웰에 1 웰당 200 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 인간 초대 간세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 6 일간 정치 상태로 배양하였다.
1. 생세포수 측정
2 시간, 4 시간, 8 시간, 1 일간, 4 일간, 6 일간 배양 후의 배양액에 대해 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 20 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정함으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써, Happy Cell ASM 과 비교해 초대 간세포를 보호함으로써 생세포수의 감소를 억제하는 효과가 우수한 것이 확인되었다. 정치 배양 2 시간, 4 시간, 8 시간, 1 일간, 4 일간, 6 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (인간 초대 간세포의 세포수에 상당한다) 를 표 60 에 나타낸다.
Figure pct00061
(시험예 48 : 간세포에 대한 화합물의 독성 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 한편, DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 대해 HepG2 세포를 100000 세포/㎖ 가 되도록 혼합하여, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 100 ㎕ 가 되도록 세포 현탁액을 분주했다. 상기 탈아실화젤란검 수용액에 대해 각 농도의 Troglitazone (WAKO 사 제조, ＃71750) 을 첨가하고, 본 용액을 상기 세포 현탁액 100 ㎕ 에 대해 10 ㎕ 첨가했다. 이상의 처리에 의해, DMSO 농도가 0.18 ％ (v/v), Troglitazone 농도가 20.0, 40.0, 60.0, 100 (㎛ol/ℓ), 탈아실화젤란검 농도 0.015 ％ (w/v) 가 되는 세포 현탁액을 조제했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 1 일간 정치 상태로 배양하였다.
1. 생세포수 측정
1 일간 배양 후의 배양액 50 ㎕ 를 96 웰 타이터 플레이트 (코닝사 제조) 에 분주하고, 본 배양액에 대해 CellTiter-Glo (등록상표) 시약 (프로메가사 제조) 을 50 ㎕ 첨가한 후, 10 분간 실온에서 인큐베이션하고, 멀티 플레이트 리더 (Molecular Devices 사 제조, FlexStation3) 로 발광 강도를 측정함으로써 생세포의 수를 측정하였다.
2. 락트산 탈수소 효소 (LDH) 활성 측정
1 일간 배양 후의 배양액 100 ㎕ 에 대해 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 100 ㎕ 를 첨가해, 440 G 로 플레이트마다 15 분간 원심하였다. 상청 100 ㎕ 를 96 웰 타이터 플레이트 (코닝사 제조) 에 분주하고, 세포 독성 검출 키트 (Roche Applied Science 사 제조) 의 반응 혼합액 100 ㎕ 를 첨가해, 실온에서 차광하 30 분간 정치했다. 계속하여, 상기 키트의 프로토콜에 따라, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 490 ㎚ 의 흡광도 (레퍼런스 ; 600 ㎚) 를 측정함으로써 장애를 입은 세포의 비율, 즉 세포 장애율 (％) 을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 이용하여, Troglitazone 이 간세포의 세포독성을 갖는 것이 확인되었다. 1 일간 배양 후에 있어서의 무첨가 조건을 1 로 했을 때의 상대적 세포수 그리고 세포 장애율 (％) 을 표 61 에 나타낸다.
Figure pct00062
(시험예 49 : A549 세포를 사용한 ATP 정량법에 의한 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.005 ％ (w/v), 0.015 ％ (w/v) 혹은 0.030 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 폐암 세포주 A549 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를, 100000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 100 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 A549 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 5 일간 정치 상태로 배양하였다. 1, 3, 5 일간 배양 후의 배양액에 대해, ATP 시약 100 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다. WST-8 측정은, 3 일간 배양 후의 세포에 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 10 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, A549 세포는 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 효율적으로 증식하는 것이 ATP 측정법에 있어서도 확인되었다. 정치 배양 1, 3, 5 일간 후의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 을 표 62 에 나타낸다. 3 일간 배양 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (WST-8) 와 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 을 표 63 에 나타낸다.
Figure pct00063
Figure pct00064
(시험예 50 : 항암제를 사용한 세포 증식 시험에 있어서의 단층 배양법과의 비교)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 단층 배양법은, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3585) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에 최종 농도 0.001 에서 1 μM 이 되도록, 10 배 농도의 각종 항암제와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 및 10 배 농도의 각종 항암제만의 배지 조성물 (단층 배양군) 을 각각 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 3 일간 배양을 계속했다. 항암제는 Adriamycin (WAKO 사 제조), Paclitaxel (WAKO 사 제조) 혹은 Mitomycin C (WAKO 사 제조) 를 사용하였다. 4 일째의 배양액에 대해 ATP 시약 150 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다. WST-8 측정은, WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 15 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용한 세포 증식 시험법에 의해, 단층 배양법에 비해 Mitomycin C 의 약효가 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 정치 배양 4 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 64 에 나타낸다. 정치 배양 4 일째의 450 ㎚ 의 흡광도 (WST-8 측정) 의 ％Control 값을 표 65 에 나타낸다.
Figure pct00065
Figure pct00066
(시험예 51 : 아포토시스 유도제를 사용한 세포 증식 시험에 있어서의 단층 배양법과의 비교)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 단층 배양법은, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3585) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에, 최종 농도 0.2 에서 10 μM 이 되도록, 10 배 농도의 각종 아포토시스 유도제와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 및 10 배 농도의 각종 아포토시스 유도제만의 배지 조성물 (단층 배양군) 을 각각 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 배양을 3 일간 계속했다. 아포토시스 유도제는 Apoptosis Inducer set (Merck Millipore 사 제조, APT800 : Actinomycin D, Camptothecin, Cycloheximide, Dexamethasone, Etoposide) 를 사용하였다. 4 일째의 배양액에 대해 ATP 시약 150 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다. WST-8 측정은, WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 15 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용한 세포 증식 시험법에 의해, 단층 배양법에 비해 Camptothecin 과 Etoposide 의 약효가 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 정치 배양 4 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 66 에 나타낸다. 정치 배양 4 일째의 450 ㎚ 의 흡광도 (WST-8 측정) 의 ％Control 값을 표 67 에 나타낸다.
Figure pct00067
Figure pct00068
(시험예 52 : Trametinib 및 MK-2206 을 사용한 HeLa 세포 증식 시험에 있어서의 단층 배양법과의 비교)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 단층 배양법은, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa 를 7400 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3585) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에, 최종 농도 0.001 에서 30 μM 이 되도록 10 배 농도의 각 항암제와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 및 10 배 농도의 각 항암제만의 배지 조성물 (단층 배양군) 을 각각 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 배양을 5 일간 계속하였다. 항암제는 Trametinib (Santa Cruz 사 제조, MEK 저해제) 및 MK-2206 (Santa Cruz 사 제조, Akt 저해제) 을 사용하였다. 6 일째의 배양액에 대해 ATP 시약 150 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용한 세포 증식 시험법에 의해, 단층 배양법에 비해 MK-2206 과 Trametinib 의 약효가 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 정치 배양 4 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 68 에 나타낸다.
Figure pct00069
(시험예 53 : Trametinib 및 MK-2206 을 사용한 A549 세포 증식 시험에 있어서의 단층 배양법과의 비교)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 폐암 세포주 A549 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 14800 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 단층 배양법은, 인간 폐암 세포주 A549 를 14800 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3585) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에, 최종 농도 0.001 에서 30 μM 이 되도록 10 배 농도의 각 항암제와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 및 10 배 농도의 각 항암제만의 배지 조성물 (단층 배양군) 을 각각 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 배양을 5 일간 계속하였다. 항암제는 Trametinib (Santa Cruz 사 제조, MEK 저해제) 및 MK-2206 (Santa Cruz 사 제조, Akt 저해제) 을 사용하였다. 6 일째의 배양액에 대해 ATP 시약 150 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용한 세포 증식 시험법에 의해, 단층 배양법에 비해 MK-2206 의 약효가 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 정치 배양 4 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 69 에 나타낸다.
Figure pct00070
(시험예 54 : 인간 HB-EGF 로 자극한 HeLa 세포의 증식 작용에 있어서의 단층 배양법과의 비교)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 단층 배양법은, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3585) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에, 최종 농도 10, 30, 100 ng/㎖ 가 되도록 10 배 농도의 인간 HB-EGF (헤파린 결합성 상피 성장 인자 유사 증식 인자, PEPROTECH 사 제조) 와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 및 10 배 농도의 인간 HB-EGF 만의 배지 조성물 (단층 배양군) 을 각각 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 배양을 7 일간 계속하였다. 6 일째 및 8 일째의 배양액에 대해 ATP 시약 150 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용한 HeLa 세포 증식 시험법에 의해, 단층 배양법에 비해 인간 HB-EGF 의 세포 증식 촉진 효과가 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 정치 배양 6 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 70 에 나타낸다. 정치 배양 8 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 71 에 나타낸다.
Figure pct00071
Figure pct00072
(시험예 55 : 인간 HB-EGF 로 자극한 A549 세포의 증식 작용에 있어서의 단층 배양법과의 비교)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 폐암 세포주 A549 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 14800 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 단층 배양법은, 인간 폐암 세포주 A549 를 14800 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3585) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에, 최종 농도 10, 30, 100 ng/㎖ 가 되도록 10 배 농도의 인간 HB-EGF (PEPROTECH 사 제조) 와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 및 10 배 농도의 인간 HB-EGF 만의 배지 조성물 (단층 배양군) 을 각각 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 배양을 7 일간 계속하였다. 6 일째 및 8 일째의 배양액에 대해 ATP 시약 150 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용한 A549 세포 증식 시험법에 의해, 단층 배양법에 비해 인간 HB-EGF 의 세포 증식 촉진 효과가 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 정치 배양 6 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 72 에 나타낸다. 정치 배양 8 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 73 에 나타낸다.
Figure pct00073
Figure pct00074
(시험예 56 : 인간 HB-EGF 로 자극한 A431 세포의 증식 작용에 있어서의 단층 배양법과의 비교)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 EMEM 배지 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 편평상피암 세포주 A431 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 단층 배양법은, 인간 편평상피암 세포주 A431 을 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3585) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에, 최종 농도 10, 30, 100 ng/㎖ 가 되도록 10 배 농도의 인간 HB-EGF (PEPROTECH 사 제조) 와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 및 10 배 농도의 인간 HB-EGF 만의 배지 조성물 (단층 배양군) 을 각각 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 배양을 7 일간 계속하였다. 6 일째 및 8 일째의 배양액에 대해 ATP 시약 150 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용한 A431 세포 증식 시험법에 의해, 단층 배양법에 비해 인간 HB-EGF 의 세포 증식 촉진 효과가 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 정치 배양 6 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 74 에 나타낸다. 정치 배양 8 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 75 에 나타낸다.
Figure pct00075
Figure pct00076
(시험예 57 : 인간 HB-EGF 로 자극한 SKOV3 세포의 증식 작용에 있어서의 단층 배양법과의 비교)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 15 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 McCoy's 5a 배지 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 난소암 세포주 SKOV3 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 단층 배양법은, 인간 난소암 세포주 SKOV3 을 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3585) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에, 최종 농도 10, 30, 100 ng/㎖ 가 되도록 10 배 농도의 인간 HB-EGF (PEPROTECH 사 제조) 와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 및 10 배 농도의 인간 HB-EGF 만의 배지 조성물 (단층 배양군) 을 각각 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 배양을 8 일간 계속하였다. 6 일째 및 9 일째의 배양액에 대해 ATP 시약 150 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 사용한 SKOV3 세포 증식 시험법에 의해, 단층 배양법에 비해 인간 HB-EGF 의 세포 증식 촉진 효과가 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 정치 배양 6 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 76 에 나타낸다. 정치 배양 9 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 77 에 나타낸다.
Figure pct00077
Figure pct00078
(시험예 58 : 인간 HB-EGF 로 자극한 HeLa 세포에 있어서의 VEGF의 mRNA 발현에 있어서의 단층 배양법과의 비교)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 단층 배양법은, 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa 를 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3585) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에, 최종 농도 10, 30, 100 ng/㎖ 가 되도록 10 배 농도의 인간 HB-EGF (PEPROTECH 사 제조) 와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 및 10 배 농도의 인간 HB-EGF 만의 배지 조성물 (단층 배양군) 을 각각 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 배양을 6 일간 계속하였다. 7 일째의 암세포를 포함하는 배양액을 회수해, 원심분리 (400 g, 3 분간) 함으로써 세포를 회수했다. 세포로부터 RNeasy Mini kit (QIAGEN 사 제조) 를 이용하여 총 RNA 를 추출하였다. 총 RNA 와 PrimeScript (등록상표) RT Master Mix (타카라바이오사 제조) 를 사용하여, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems 사 제조) 을 이용하여 역전사 반응을 실시해, cDNA 를 합성하였다. PCR 반응에 사용한 각 cDNA 샘플은 분주해 멸균수로 1/10 로 희석한 것을 사용하였다. 또 검량선에 사용하는 샘플은 분주해 혼합시킨 cDNA 를 사용하여, 3 배 공비로 1/3 에서부터 1/243 의 희석까지의 정량 범위에서 설정하였다. PCR 반응은, 각 cDNA 샘플, 검량 샘플, Premix Ex Taq (등록상표) (타카라바이오사 제조) 와 각종 Taqman 프로브 (Applied Biosystems 사 제조) 를 사용하여, 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems 사 제조) 을 이용하여 실시했다. 특이성은 GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 의 mRNA 를 내재성 컨트롤로 하여, VEGF (Vascular endothelial growth factor) mRNA 의 발현은 GAPDH 의 값으로 보정하고, 음성 대조를 100 ％ 로 하여 산출하였다. 사용한 각 프로브 (Applied Biosystems 사 제조) 를 이하에 나타낸다.
GAPDH : HS99999905
VEGF : HS00173626
그 결과, 본 발명의 배지 조성물을 이용하여 배양한 HeLa 세포는, 단층 배양법에 비해 인간 HB-EGF 에 의한 VEGF 의 mRNA 발현 촉진 효과가 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 또, 정치 배양 7 일째의 음성 대조를 100 ％ 로 했을 때의 VEGFmRNA 발현값을 표 78 에 나타낸다.
Figure pct00079
(시험예 59 : 인간 HB-EGF 로 자극한 A549 세포의 증식에 대한 Gefinitib 의 효과)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 폐암 세포주 A549 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 14800 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에, 각 항암제는 최종 농도 0.1 에서 30 μM 이 되도록, 인간 HB-EGF 는 최종 농도 0 ng/㎖ 혹은 100 ng/㎖ 가 되도록 10 배 농도의 각 항암제 및 인간 HB-EGF (PEPROTECH 사 제조) 와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 을 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 배양을 5 일간 계속하였다. 항암제는 Gefitinib (Santa Cruz 사 제조, EGF 수용체 저해제) 를 사용하였다. 6 일째의 배양액에 대해 ATP 시약 150 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물과 인간 HB-EGF 를 사용한 A549 세포 증식 시험법에 의해, HB-EGF 를 첨가한 배양 조건 쪽이 Gefitinib 의 억제 효과는 강했다. 정치 배양 6 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 79 에 나타낸다.
Figure pct00080
(시험예 60 : 인간 HB-EGF 로 자극한 A431 세포의 증식 작용에 있어서의 Gefinitib, Elrotinib 의 효과)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 EMEM 배지 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 에 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검 첨가한 배지 조성물 혹은 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 편평상피암 세포주 A431 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 을 37000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 135 ㎕ 가 되도록 분주했다. 각 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 정치 상태로 배양하였다. 배양 1 일째에, 각 항암제는 최종 농도 0.1 에서 30 μM 이 되도록, 인간 HB-EGF 는 최종 농도 0 ng/㎖ 혹은 100 ng/㎖ 가 되도록 10 배 농도의 각 항암제 및 인간 HB-EGF (PEPROTECH 사 제조) 와 최종 농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 포함한 배지 조성물 (탈아실화젤란검 첨가군) 을 15 ㎕ 씩 첨가해, 계속 배양을 7 일간 계속하였다. 항암제는 Gefitinib (Santa Cruz 사 제조, EGF 수용체 저해제), Elrotinib (Santa Cruz 사 제조, EGF 수용체 저해제) 를 사용하였다. 4 일째, 6 일째 및 8 일째의 배양액에 대해 ATP 시약 150 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성물과 인간 HB-EGF 를 조합한 배양법으로, 저접착 배양 조건에서의 A431 세포 증식을 확인했다. 또한 본 발명의 배지 조성물과 인간 HB-EGF 를 조합한 A431 세포 증식 시험법에 의해, HB-EGF 증식 항진 작용에 대한 Gefitinib 및 Elrotinib 의 억제 효과를 판단할 수 있었다. 인간 HB-EGF 의 증식 촉진 작용에 관해서는, 정치 배양 4 일째, 6 일째, 8 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 을 표 80 에 나타낸다. 또한 인간 HB-EGF 증식 촉진 작용에 대한 각 항암제의 작용에 관해서는, 정치 배양 4 일째, 8 일째의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 의 ％Control 값을 표 81 에 나타낸다.
Figure pct00081
Figure pct00082
(시험예 61 : MCF-7 세포를 분산시켰을 때의 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 EMEM 배지 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 에 최종 농도 0.005 ％ (w/v) 혹은 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 유암 세포주 MCF-7 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 을, 50000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 100 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 MCF-7 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 5 일간 정치 상태로 배양하였다. 2, 5 일간 배양 후의 배양액에 대해, ATP 시약 100 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다. WST-8 측정은, 2, 5 일간 배양 후의 세포에 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 10 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, MCF-7 세포는, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 효율적으로 증식하는 것이 ATP 측정법 및 WST-8 측정법으로 확인되었다. 정치 배양 2, 5 일간 후의 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 을 표 82 에 나타낸다. 2, 5 일간 배양 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (WST-8)) 를 표 83 에 나타낸다. 5 일간 배양 후의 MCF-7 세포의 응집 덩어리의 현미경 관찰 결과를 도 23 에 나타낸다.
Figure pct00083
Figure pct00084
(시험예 62 : A375 세포 및 MNNG/HOS 세포를 분산시켰을 때의 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 혹은 EMEM 배지 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 에 최종 농도 0.005 ％ (w/v) 혹은 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 멜라노마 세포주 A375 (ATCC 제조) 혹은 인간 골육종 세포주 MNNG/HOS (ATCC 제조) 를 50000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 100 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 A375 세포 및 MNNG/HOS 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 4 일간 정치 상태로 배양하였다. 4 일간 배양 후의 배양액에 대해, ATP 시약 100 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다. 4 일간 배양 후의, 배양액에 대해 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 10 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, A375 세포 및 MNNG/HOS 세포는, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 세포 응집 덩어리의 크기가 과잉이 되지 않고, 균일하게 분산된 상태로 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 효율적으로 증식하는 것이 확인되었다. 4 일간 배양 후의 A375 세포 및 MNNG/HOS 세포의 응집 덩어리의 현미경 관찰 결과를 도 24 에 나타낸다. 또, A375 세포에 있어서, 정치 배양 4 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (WST-8) 와 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 을 표 84 에 나타낸다. MNNG/HOS 세포에 있어서, 정치 배양 4 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (WST-8) 와 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 을 표 85 에 나타낸다.
Figure pct00085
Figure pct00086
(시험예 63 : MIAPaCa-2 세포를 분산시켰을 때의 세포 증식 시험)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 수용액을 이용하여 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 최종 농도 0.005 ％ (w/v) 혹은 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물을 조제했다. 계속하여, 인간 췌장암 세포주 MIAPaCa-2 (ATCC제) 를 50000 세포/㎖ 가 되도록 상기 탈아실화젤란검을 첨가한 배지 조성물에 파종한 후, 96 웰 평평한 바닥 초저접착 표면 마이크로 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 의 웰에 1 웰당 100 ㎕ 가 되도록 분주했다. 또한, 음성 대조로서 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 전술 배지에 MIAPaCa-2 세포를 현탁한 것을 분주했다. 계속하여, 본 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37 ℃, 5 ％ CO2) 내에서 6 일간 정치 상태로 배양하였다. 6 일간 배양 후의 배양액에 대해 ATP 시약 100 ㎕ (CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Promega 사 제조) 를 첨가해 현탁시켜, 약 10 분간 실온에서 정치한 후, FlexStation3 (Molecular Devices 사 제조) 으로 발광 강도 (RLU 값) 를 측정하여, 배지만의 발광값을 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다. 6 일간 배양 후의, 배양액에 대해 WST-8 용액 (주식회사 도진도 화학 연구소사 제조) 을 10 ㎕ 첨가한 후, 100 분간 37 ℃ 에서 인큐베이션하고, 흡광도계 (Molecular Devices 사 제조, SPECTRA MAX 190) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 배지만의 흡광도를 뺌으로써 생세포의 수를 측정하였다.
그 결과, MIAPaCa-2 세포는, 본 발명의 배지 조성물을 사용함으로써 세포 응집 덩어리의 크기가 과잉이 되지 않고, 균일하게 분산된 상태에서 배양하는 것이 가능하고, 당해 배지 조성물로 효율적으로 증식하는 것이 확인되었다. 6 일간 배양 후의 MIAPaCa-2 세포의 응집 덩어리의 현미경 관찰 결과를 도 25 에 나타낸다. 또, MIAPaCa-2 세포에 있어서, 정치 배양 4 일간 후의 450 ㎚ 의 흡광도 (WST-8) 와 RLU 값 (ATP 측정, 발광 강도) 을 표 86 에 나타낸다.
Figure pct00087
(시험예 64 : 탈아실화젤란검을 포함하는 배지의 농축 및 희석)
시험예 2 와 동일한 방법을 이용하여 조제한 0.015 ％ (w/v) 탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 를 15 ㎖ 원심 튜브 (VIOLAMO 사 제조) 에 10 ㎖ 씩 분주해, 스윙 로터 LC-200 (토미 정공사 제조) 으로 원심 (700 G, 5 분간) 함으로써 탈아실화젤란검을 침강시킨 후, 상청 8 ㎖ 를 아스피레이터로 제거해, 이것에 의해 탈아실화젤란검 함유 배지의 농축을 실시했다. 또한, 본 농축 배지에 탈아실화젤란검을 포함하지 않는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 를 첨가해 피펫팅에 의해 혼합하여, 임의의 농축률의 배지를 각각 제조했다.
한편, 인간 간암 세포 HepG2 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 10 ％ (v/v) 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 500000 개/㎖ 가 되도록 현탁하고, 본 현탁액 10 ㎖ 를 EZ SPHERE (아사히 글라스사 제조) 에 파종한 후, 37 ℃, CO2 인큐베이터 (5 ％ CO2) 내에서 7 일간 배양하였다. 여기서 얻어진 스피어 (직경 100 ∼ 200 ㎛) 의 현탁액 10 ㎖ 를 원심 처리 (200 G, 5 분간) 에 의해 침강시켜, 상청을 제거함으로써 스피어 현탁액 1.0 ㎖ 를 조제했다. 상기 임의 농도로 제조한 배지에 본 스피어 현탁액을 100 ㎕ 씩 첨가해 피펫팅에 의해 스피어를 분산시키고, 37 ℃ 에서 인큐베이션해, 1 시간 후의 스피어의 분산 상태를 육안으로 관찰하였다. 그 결과를 표 87 에 나타낸다.
표 87 에 나타낸 바와 같이, 탈아실화젤란검은 배지 조성물로서 조제 후에 임의 농도로 농축 및 희석할 수 있고, 이와 같이 하여 농축 및 희석한 배지 조성물은 스피어의 부유 효과를 갖는 것이 확인되었다.
Figure pct00088
(시험예 65 : 탈아실젤란검 함유 DMEM/Ham's F12 배지의 제작)
탈아실화젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 120 ㎎ 을 순수 72 ㎖ 에 현탁시켜, 90 ℃ 에서 가열 교반하여 용해시켰다. 이것에, 순수를 첨가해, 탈아실젤란검이 0.017 ％ (w/v) 인 용액 720 ㎖ 를 조제한 후, 멸균 필터 (포어 사이즈 0.22 ㎛) 를 이용하여 멸균하였다. 한편, DMEM/Ham's F12 등량 혼합의 분말 배지 (라이프 테크놀로지사) 와 탄산수소나트륨에 배지 조제시의 추천값의 10 분의 1 양에 해당되는 순수를 첨가해 10 배의 농도로 80 ㎖ 수용액을 조제한 후, 멸균 필터 (포어 사이즈 0.22 ㎛) 를 이용하여 멸균하였다. 이들을, 멸균 조건하, 25 ℃ 에서 교반하면서 혼합함으로써, 탈아실젤란검 농도가 0.015 ％ (w/v) 인 목적하는 배지 800 ㎖ 를 조제했다.
산업상 이용가능성
본 발명에 관련된 배지 조성물은, 우수한 세포 및/또는 조직 부유 효과를 나타내고, 동식물 유래의 세포 및/또는 조직을 그 기능을 유지하면서 대량으로 배양할 때에 매우 유용하다. 또, 본 발명 방법에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은, 화학 물질, 의약품 등의 약효 및 독성 평가나, 효소, 세포 증식 인자, 항체 등의 유용 물질의 대량 생산, 질환이나 결손에 의해 상실된 기관, 조직, 세포를 보충하는 재생 의료 등의 분야에 있어서 매우 유용하다.
본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허출원 2012-164227 (출원일 : 2012년 7월 24일), 일본 특허출원 2012-263801 (출원일 : 2012년 11월 30일), 일본 특허출원 2013-017836 (출원일 : 2013년 1월 31일) 을 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

Claims (71)

  1. 세포 또는 조직을 부유시켜 배양할 수 있는 구조체를 포함하는 배지 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 배양시의 배지 조성물의 교환 처리 및 배양 종료 후에 있어서 세포 또는 조직의 회수가 가능한 배지 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 배지 조성물로부터의 세포 또는 조직의 회수시에, 온도 변화, 화학 처리, 효소 처리, 전단력 중 어느 것도 필요로 하지 않는 배지 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 점도가 8 mPa·s 이하인 배지 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 구조체의 크기가, 필터로 여과했을 경우 구멍 직경이 0.2 ㎛ 내지 200 ㎛ 인 필터를 통과하는 배지 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 구조체가 고분자 화합물을 함유하는 배지 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 고분자 화합물이, 음이온성 관능기를 갖는 고분자 화합물을 함유하는 배지 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 고분자 화합물이, 다당류인 배지 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 음이온성 관능기가, 카르복실기, 술포기 및 인산기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 배지 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 다당류가, 히알루론산, 젤란검, 탈아실화젤란검, 람산검, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난, 후코이단, 펙틴, 펙트산, 펙틴산, 헤파란황산, 헤파린, 헤파리틴황산, 케라토황산, 콘드로이틴황산, 데르마탄황산, 람난황산 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 배지 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 다당류가, 히알루론산, 탈아실화젤란검, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 배지 조성물.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 다당류가, 탈아실화젤란검 또는 그 염인 배지 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 탈아실화젤란검 또는 그 염의 배지 조성물 중 최종 농도가 0.001 ∼ 1.0 ％ (중량/용량) 인 배지 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 추가로, 탈아실화젤란검 또는 그 염 이외의 다당류를 포함하는 배지 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 다당류가, 크산탄검, 알긴산, 카라기난, 디우탄검 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 배지 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 다당류가, 메틸셀룰로오스, 로커스트빈검 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 배지 조성물.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로, 금속 이온을 포함하는 배지 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 금속 이온이, 2 가의 금속 이온인 배지 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 금속 이온이, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온 및 구리 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 배지 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 금속 이온이, 칼슘 이온인 배지 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 추가로, 칼슘 이온 이외의 금속 이온을 포함하는 배지 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 금속 이온이, 마그네슘 이온, 나트륨 이온 및 칼륨 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 배지 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로, 세포 외 매트릭스 및/또는 세포 접착 분자를 포함하는 배지 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 세포 외 매트릭스가, 콜라겐, 히알루론산 및 프로테오글리칸으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 배지 조성물.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 세포 접착 분자가, 카드헤린, 라미닌, 피브로넥틴 및 비트로넥틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 배지 조성물.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양용인, 배지 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 세포가, 접착 세포 또는 비접착 세포인 배지 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 접착 세포가, 마이크로캐리어에 부착된 상태인 배지 조성물.
  29. 제 27 항에 있어서, 상기 접착 세포가, 담체에 포매된 상태인 배지 조성물.
  30. 제 27 항에 있어서, 상기 접착 세포가, 스피어인 배지 조성물.
  31. 제 27 항에 있어서, 상기 접착 세포가, 다능성 줄기세포, 암세포 및 간세포로 이루어지는 군에서 선택되는 배지 조성물.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물과, 세포 또는 조직을 포함하는, 세포 또는 조직 배양물.
  33. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물 중에서 세포 또는 조직을 배양하는 것을 포함하는 세포 또는 조직의 배양 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 세포가, 다능성 줄기세포, 암세포, 간세포로 이루어지는 군에서 선택되는 배양 방법.
  35. 제 32 항의 배양물로부터 세포 또는 조직을 분리하는 것을 포함하는 세포 또는 조직의 회수 방법.
  36. 제 34 항에 있어서, 상기 분리가, 여과, 원심 분리 또는 자성 분리로 실시되는 회수 방법.
  37. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물 중에서 접착 세포를 배양하는 것을 포함하는 스피어의 제조 방법.
  38. 항암제의 스크리닝 방법으로서,
    (a) 피험 물질의 존재하 및 비존재하, 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물 중에서 암세포를 배양하는 공정, 및
    (b) 암세포 증식의 변화를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 추가로, 피험 물질 비존재하의 경우와 비교해, 암세포의 증식을 억제하는 물질을 후보 물질로서 선택하는 공정을 포함하는 방법.
  40. 간세포에 작용하는 의약품 후보 물질의 활성을 평가하는 방법으로서,
    (a) 피험 물질의 존재하 및 비존재하, 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물 중에서 간세포를 배양하는 공정, 및
    (b) 간세포의 생리학적 기능의 변화를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 추가로, 피험 물질 비존재하의 경우와 비교해, 간세포의 생리학적 기능을 억제 또는 증가시키는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 방법.
  42. 간세포에 작용하는 의약품 후보 물질의 약효 또는 독성을 평가하는 방법으로서,
    (a) 피험 물질의 존재하 및 비존재하, 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물 중에서 간세포를 배양하는 공정, 및
    (b) 간세포의 생리학적 기능의 변화를 해석하는 공정을 포함하는 방법.
  43. 세포 또는 조직을 부유시켜 배양할 수 있는 배지 조성물을 조제하기 위한 배지 첨가제로서, 고분자 화합물이 용매 중에 용해 또는 분산되어 있는 배지 첨가제.
  44. 제 43 항에 있어서, 멸균된 상태인 배지 첨가제.
  45. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서, 상기 고분자 화합물이 음이온성 관능기를 갖는 고분자 화합물인, 배지 첨가제.
  46. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서, 상기 고분자 화합물이 탈아실화젤란검 또는 그 염인, 배지 첨가제.
  47. 세포 또는 조직을 부유시켜 배양할 수 있는 배지 조성물의 제조 방법으로서, 고분자 화합물과 배지를 혼합하는 것을 포함하는 배지 조성물의 제조 방법.
  48. 제 41 항에 있어서, 제 43 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 첨가제와 배지를 혼합하는 것을 포함하는 배지 조성물의 제조 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 배지가 용매 중에 용해 또는 분산되어 있는 배지 조성물의 제조 방법.
  50. 제 47 항에 있어서, 상기 고분자 화합물이 음이온성 관능기를 갖는 고분자 화합물인, 배지 조성물의 제조 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 고분자 화합물이 탈아실화젤란검 또는 그 염인, 배지 조성물의 제조 방법.
  52. 제 47 항에 있어서, 상기 고분자 화합물과 배지를, 물과 혼합하는 배지 조성물의 제조 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 물과 혼합한 후, 80 ∼ 130 ℃ 에서 가열하는 것을 포함하는 배지 조성물의 제조 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 100 ∼ 125 ℃ 에서 가열하는 것을 포함하는 배지 조성물의 제조 방법.
  55. 제 47 항에 있어서, 여과 멸균하는 것을 포함하는 배지 조성물의 제조 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 여과 멸균이 0.1 ∼ 0.5 ㎛ 의 필터를 통과시키는 것을 포함하는 배지 조성물의 제조 방법.
  57. 탈아실화젤란검 혹은 그 염, 또는 디우탄검 혹은 그 염을 포함하는 암세포용 배지 첨가제.
  58. 제 57 항에 있어서, 암세포의 배양에 있어서, 암세포의 증식을 촉진하는, 첨가제.
  59. 제 57 항에 있어서, 항암제의 항암 활성을 평가하기 위해서 사용되는, 첨가제.
  60. 제 57 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 기재된 첨가제를 포함하는 암세포용 배지 조성물.
  61. 암세포의 배양 방법으로서, 제 57 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 기재된 첨가제의 존재하 또는 제 60 항에 기재된 배지 조성물 중에서, 그 암세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  62. 암세포에 대한 항암제의 활성 평가 방법으로서, 제 57 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 기재된 첨가제의 존재하 또는 제 60 항에 기재된 배지 조성물 중에서, 그 암세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  63. 제 61 항 또는 제 62 항에 있어서, 그 암세포가 그 암세포용 배지 조성물 중에 있어서 세포 응집 덩어리를 형성하고 있는 방법.
  64. 제 61 항 또는 제 62 항에 있어서, 그 암세포를 배양할 때의 배양 용기가 암세포의 부착을 억제하는 방법.
  65. 탈아실화젤란검 혹은 그 염, 또는 디우탄검 혹은 그 염을 포함하는 간세포용 배지 첨가제.
  66. 제 65 항에 있어서, 간세포의 배양에 있어서, 간세포수의 감소를 억제하는, 첨가제.
  67. 제 65 항에 있어서, 의약품 및 의약품 후보제의 간세포에 대한 효과를 평가하기 위해서 사용되는, 첨가제.
  68. 제 65 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 기재된 첨가제를 포함하는 간세포용 배지 조성물.
  69. 간세포에 대한 의약품 및 의약품 후보제의 활성 평가 방법으로서, 제 65 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 기재된 첨가제의 존재하 또는 제 68 항에 기재된 배지 조성물 중에서, 그 간세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  70. 제 69 항에 있어서, 그 간세포가 그 간세포용 배지 조성물 중에 있어서 세포 응집 덩어리를 형성하고 있는 방법.
  71. 제 69 항에 있어서, 그 간세포를 배양할 때의 배양 용기가 간세포의 부착을 억제하는 방법.
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