JP7370529B2 - 多能性幹細胞製造システム、幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、幹細胞の浮遊培養器、人工多能性幹細胞の作製方法、及び動物細胞から特定の体細胞を作製する方法 - Google Patents

多能性幹細胞製造システム、幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、幹細胞の浮遊培養器、人工多能性幹細胞の作製方法、及び動物細胞から特定の体細胞を作製する方法 Download PDF

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Description

本発明は細胞技術に関し、多能性幹細胞製造システム、幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、幹細胞の浮遊培養器、人工多能性幹細胞の作製方法、及び動物細胞から特定の体細胞を作製する方法に関する。
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ＥＳ細胞は、由来する生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を示す。ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患を治療するための細胞移植療法に現在利用されている。しかし、ＥＳ細胞の移植に伴う欠点もある。特に、ＥＳ細胞の移植は、不成功な臓器移植に引き続いて起こる免疫拒絶反応と同様に、拒絶反応を惹起する。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用は、倫理的見地に基づく多数の批判や強い反対をもたらしている。
このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功した。これにより、彼は、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１参照。）。ｉＰＳ細胞は、免疫拒絶反応や倫理的問題のないことから、理想的な多能性細胞である。そのため、ｉＰＳ細胞は細胞移植療法への利用されることが期待されている。
（幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、及び幹細胞の浮遊培養器の背景技術）
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とは、二つの特徴的な能力を有する細胞である。一つ目は、身体の全ての体細胞を生み出せる能力である。二つ目は、半永久的な増殖能を有することである。ｉＰＳ細胞はこの二つの能力を示すため、自己の体細胞からｉＰＳ細胞を作製し、目的の体細胞へ変化させることで、拒絶反応のない移植治療に用いられることができる。そのためｉＰＳ細胞は、再生医療の分野にかなり有望である。
（人工多能性幹細胞の作製方法の背景技術）
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とは、二つの特徴的な能力を有する細胞である。一つ目は、身体の全ての体細胞を生み出せる能力である。二つ目は、半永久的な増殖能を有することである。ｉＰＳ細胞はこの二つの能力を示すため、自己の体細胞からｉＰＳ細胞を作製し、目的の体細胞へ変化させることで、拒絶反応のない移植治療に用いられることができる。そのためｉＰＳ細胞は、再生医療の分野にかなり有望である。
ｉＰＳ細胞の誕生から現在までに、いくつかのその作製方法が確立された。代表的なｉＰＳ細胞の作製方法としては、レトロウイルス又はレンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法が挙げられる。
レトロウイルス又はレンチウイルスを用いた方法について説明する。レトロウイルスやレンチウイルスは、体細胞に感染をして、初期化因子をコードしている遺伝子を細胞内に導入することができる。さらに、レトロウイルスやレンチウイルスは、体細胞のゲノムに初期化因子を挿入することができ、初期化因子の細胞内での安定的な発現を誘導する。
しかし、レトロウイルス又はレンチウイルスの使用に依存する方法には、問題点がある。第一に、体細胞のゲノムへの初期化因子の挿入は、既存の遺伝子やプロモーターを傷つけるため、細胞の癌化を引き起こし得る。第二に、ゲノム上に挿入された初期化因子は、ｉＰＳ細胞を体細胞に変化させた後に再度活性化するおそれがある。そのため、ｉＰＳ細胞由来の移植用細胞には腫瘍発生のリスクを抱えている。実際、導入された初期化因子がマウスの体細胞で再活性化され、細胞が癌化することが確認されている（例えば、非特許文献１参照。）。
さらに、レトロウイルス又はレンチウイルスを用いて作製されたｉＰＳ細胞は、残存ウイルスを保持し得る。このようなｉＰＳ細胞を患者に移植すると、残存しているウイルスが患者に感染するおそれがあるため、移植に用いることができない。参考として、Ｘ連鎖性複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）に対し、レトロウイルスベクターによりγｃ遺伝子を造血幹細胞に導入する遺伝子治療を行ったところ、ベクターの挿入によるＬＭＯ２遺伝子の活性化により、患者が白血病を発症したとの報告がある（例えば、非特許文献２、３参照。）。
したがって、レトロウイルス又はレンチウイルスを用いて作製されたｉＰＳ細胞は、臨床治療に利用するには問題がある。
次に、エピソーマルベクターを用いた方法について説明する。エピソーマルベクターを用いたｉＰＳ細胞の作製方法は、レトロウイルス又はレンチウイルスを用いた遺伝子導入方法の問題点を克服するために開発された（例えば、非特許文献４参照。）。エピソーマルベクターはプラスミドの一種である。エピソーマルベクターは、細胞分裂と同時に複製される。また、レトロウイルス又はレンチウイルスと異なり、体細胞の遺伝子に初期化因子が挿入されない。この特性により、エピソーマルベクターは、標的となる体細胞のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に遺伝子が挿入されることがなく、長期にわたって細胞内で初期化因子を発現させ、ｉＰＳ細胞を作製することが出来る。
しかし、エピソーマルベクターを用いた方法にも、問題がある。第一に、細胞への遺伝子導入にエレクトロポレーションが必要であるが、エレクトロポレーションは細胞へのダメージが大きいため、１度のエレクトロポレーションでも多くの細胞が死んでしまう。第二に、エレクトロポレーションは繰り返し実施することができない。第三に、エピソーマルベクターを用いた方法による遺伝子導入効率は、レトロウイルス又はレンチウイルスを用いた方法よりも低い。
近年の研究では、エピソーマルベクターの転移が、標的ｉＰＳ細胞の遺伝子に挿入されたベクターＤＮＡの断片化をもたらし得る。そのため、エピソーマルベクターを用いた場合においても、得られたｉＰＳ細胞が、そのゲノムに挿入されたベクターの断片を含む可能性が高い。そのようなｉＰＳ細胞を臨床応用に利用することには問題がある。
これらの理由から、エピソーマルベクターを用いて作製されたｉＰＳ細胞も、臨床に利用することは困難である。
レトロウイルス又はレンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法には、両方とも、上述した問題があるため、ＲＮＡを用いたｉＰＳ細胞の作製方法が提案された（例えば、非特許文献６参照。）。しかし、これまでのところ、成功したｉＰＳ細胞の誘導は、胎児あるいは新生児の繊維芽細胞の使用によるものであり、ＲＮＡを用いて成人由来の体細胞をｉＰＳ細胞に誘導することに成功したとの報告はない。したがって、成人由来の体細胞からｉＰＳ細胞を作製できなければ、それらを医療に応用することは困難である。
さらに、ｉＰＳ細胞を作製するために必要な繊維芽細胞を集めるためには、１ｃｍ四方の皮膚を採取する必要がある。これは、皮膚の提供者に非常に大きな負担を与える。採取の後、繊維芽細胞株は、拡大培養により樹立されなければならない。これら線維芽細胞は、拡大の過程とともに増殖するため、ゲノムにダメージが生じたり、染色体異常が生じたりする可能性が高い。
（動物細胞から特定の体細胞を作製する方法の背景技術）
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、身体のあらゆる体細胞に変化することができる。そのため、様々な種類の体細胞や組織に変化することができるｉＰＳ細胞は、細胞移植治療や創薬研究に利用されることが期待されている。また、例えば、２０１４年にはｉＰＳ細胞から作製された網膜の細胞が移植治療に応用された。世界各国で、ｉＰＳ細胞から脳の細胞（及び様々な各種臓器の細胞）を作製し、引き続き、移植治療に用いるプロジェクトが多数進んでいる。
従来、ｉＰＳ細胞を体細胞に変化させる方法は数多く開発されてきている。しかし、ｉＰＳ細胞を移植治療に利用するためには、ｉＰＳ細胞の効率の良い分化誘導方法を確立することが重要である。具体的には、ｉＰＳ細胞を体細胞へと分化誘導するときに用いる装置を確立し、分化誘導の効率及び精度を向上させることが必要である。この装置は、移植治療に耐えうる機能を有する体細胞を作製できる必要がある。
従来、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から体細胞へ分化誘導する方法は、自然発生の過程を模倣する試みにおいて、細胞の運命を操作するために、成長因子、ホルモン、及び／又は低分子の様々な組み合わせや濃度に依存している。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏで生じる自然発生をｉｎ ｖｉｔｒｏで再現することは困難であり、かなり効率が悪い。さらに、ｉＰＳ細胞のヒト体細胞への分化誘導は、マウスと比較してヒトでは時間がかかる。例えば、ヒトの成熟した神経系細胞を作製するためには少なくとも３ヶ月を要する。さらに、ＥＳ／ｉＰＳ細胞株によって分化誘導の効率が大きく異なり、誘導された体細胞の性質が不均一である等の問題がある。この現象は、由来が同じ複数のＥＳクローンで、同一の薬品で処理されたものが、異なる表現型を生じたことから裏付けられている。これらのクローンの一部は脾臓細胞に分化し、他は心臓の細胞に分化した。このことは、分化能力が、クローンの間で異なることを示している（例えば、非特許文献６参照。）。また、素早く再凝集する無血清杯様体凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢｑ法）と呼ばれる方法を用いて、大量のｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞腫を神経系細胞に分化させる試みがなされたところ、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞は神経細胞分化を阻害する化学物質を含まない無血清培地で培養されたにも関わらず、いくつかのｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞は、神経系細胞に変換することが困難であった（例えば、非特許文献７参照。）。
具体的には、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞からホルモンや化学物質を利用する方法を用いて分化誘導された細胞は、初期の段階では胎児段階の体細胞であることが確認されている。ヒトの成熟した体細胞へのＥＳ／ｉＰＳ細胞の分化誘導は極めて難しく、数か月にわたる長期の培養が必要である。しかし、発生が完了した個体を対象とする創薬や移植医療において、個体の年齢に一致する体細胞を作製することは非常に重要である。
また、神経系細胞には、様々なサブタイプの細胞が存在する。ホルモンや化学物質を利用して、ＥＳ／ｉＰＳ細胞を特定の神経系のサブタイプに分化誘導する方法は、均一な細胞集団を作製することができない。そのため、特定の神経系細胞サブタイプ特異的な創薬スクリーニングができない。したがって、創薬スクリーニングの効率が低い。また、移植医療においても、疾患治療に必要な特定の神経系細胞のサブタイプを移植のために濃縮することができない。
これに対し、ウイルスを用いて特定の体細胞の性質を生成する情報を含む遺伝子をＥＳ／ｉＰＳ細胞に直接を導入し、目的の体細胞を作製する方法が提案されている。この方法は、ホルモンや化学物質の使用に依存する上述した方法に比べて、非常に短い時間（２週間）で成熟した神経系細胞を特異的に作製可能である。また、特定の遺伝子をＥＳ／ｉＰＳ細胞に導入することにより、例えば興奮性神経を均一に得ることができる。そのため、特定の神経系細胞サブタイプ特異的な創薬スクリーニングが可能であると考えられている。同様に、移植医療においても、特定の神経系細胞のサブタイプを濃縮して疾患の治療のために移植できる。
しかし、特定の遺伝子を発現させるためにウイルスを用いて幹細胞を体細胞に分化誘導する方法においては、ＥＳ／ｉＰＳ細胞のゲノム上に遺伝子が挿入され、内在性の遺伝子の傷を付けてしまう。その結果、創薬スクリーニングは必ずしも正確ではなく、移植においては癌化のリスクを内包しているという問題がある（例えば、非特許文献８、９参照。）。
特許第４１８３７４２号公報
Nature 448, 313-317 N Eng J Med, 346:1185-1193, 2002 Science 302: 415-419, 2003 Science 324: 797-801, 2009 Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009;85(8):348-62. Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008. PNAS, 111:12426-12431, 2014 N Eng J Med, 346:1185-1193, 2002 Science 302: 415-419, 2003
ｉＰＳ細胞のような誘導幹細胞は、細胞に遺伝子等の誘導因子を導入することによって樹立され。そして、これらは、拡大培養、凍結保存される。しかし、例えば臨床用ｉＰＳ細胞（例えば、ＧＬＰ，ＧＭＰグレード）を作製し産業化するには、以下のような問題点がある。
１） コスト
臨床用ｉＰＳ細胞は完全にクリーンで無菌の「クリーンルーム」で作製、保存される必要がある。しかし、要求されるクリーン度のレベルを維持するのは非常に高額である。そのため、ｉＰＳ細胞を作るのにコストがかかり、産業化への大きな障害となっている。
２） 品質
幹細胞の樹立から保存までの一連の作業が複雑であり、多くの手作業を要する。また、幹細胞の作製は、個人の技量に負っているところがある。その為、作製者や実験バッチによって、ｉＰＳ細胞の品質のばらつきが生じうる。
３） 時間
特定のドナー以外の個々人に由来するｉＰＳ細胞とのクロスコンタミネーションを防ぐためには、一人の人間のみに由来するｉＰＳ細胞が、クリーンルーム内で、所定の期間作成される。さらに、ｉＰＳ細胞の樹立及び品質評価の両方には長時間を要する。ｉＰＳ細胞は１部屋で１回あたり一人の人間のためだけに作製されているため、多くの人間のためにｉＰＳ細胞を作製するのに非常に長い年月を要する。
４） 人材
上述したように、現状、ｉＰＳ細胞の作製は手作業によるところが大きい。一方、少数の技術者のみが、臨床用ｉＰＳ細胞を作製するために必要な技能を有している。
幹細胞の樹立から保存までの一連の作業が複雑であるという問題がある。これに対し、本発明は、幹細胞を製造可能な幹細胞製造システムを提供することを目的の一つとする。
（幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、及び幹細胞の浮遊培養器の課題）
ｉＰＳ細胞を接着培養系で培養する場合、培養皿を必要とするため非常に大きなスペースが必要であり、培養効率が悪い。また、ｉＰＳ細胞を誘導後、あるいは拡大培養するときに、ｉＰＳ細胞を培養皿から剥離する必要がある。しかし、ｉＰＳ細胞を培養皿から剥離する工程は、ｉＰＳ細胞へのダメージが大きい。また作業も煩雑で機械化に不向きである。
また、マウス由来のフィーダー細胞を用意し、培養皿上のフィーダー細胞の層上でｉＰＳ細胞を作製及び拡大培養すると、ｉＰＳ細胞に動物由来成分が混入する。そのため、フィーダー細胞と共培養されたｉＰＳ細胞を臨床に利用することは不適切である。さらに、フィーダー細胞無しで（フィーダーフリー条件で）ｉＰＳ細胞を作製及び拡大培養すると、非常に大きなストレスがｉＰＳ細胞にかかる。このストレスは、ｉＰＳ細胞に核型異常や染色体損傷を起こし得る。また、フィーダー細胞を用いない場合は、特殊なコーティングを培養皿にする必要があり、作業がより煩雑である。
またさらに、ｉＰＳ細胞を接着培養系で培養する場合、ｉＰＳ細胞は二次元的にしか増殖できないため、ｉＰＳ細胞の成長効率が悪いという問題がある。
これに対し、ｉＰＳ細胞を三次元培養（浮遊培養）系で培養することが考えられる。しかし、従来の浮遊培養系においては、ｉＰＳ細胞が沈むことを阻止するため、培養液を撹拌し続けなければならない。しかし、培養液を撹拌すると、ｉＰＳ細胞同士がぶつかり、ダメージを受ける。そのため、細胞死や核型異常を引き起こす問題がある。
また、従来の浮遊培養系では、ｉＰＳ細胞同士がランダムに凝集し、結合して、様々な大きさの細胞塊（コロニー）が形成される。そのためコロニー間で均一なサイズ分布が保てない。コロニーが大きすぎると、コロニーの中心部の細胞まで栄養や成長因子が行き渡らず、これら奥深くの細胞の分化又は細胞死を生じさせる。その一方で、コロニーが小さすぎると、継代培養には適さない。
ｉＰＳ細胞は、単一の体細胞に由来する。そのため、それぞれのｉＰＳ細胞株によって、わずかに性質が異なる場合がある。したがって、それぞれのコロニーを独立して培養して、別々のｉＰＳ細胞株として樹立する事が非常に重要である。これに関し、ｉＰＳ細胞を浮遊培養系で培養する場合、ｉＰＳ細胞のコロニーがそれぞれ独立して成長し、互いに分離している事を担保する必要がある。
接着培養系では、単一の体細胞に由来するｉＰＳ細胞がそれぞれ独立したコロニーを形成する。しかし、上述したように、従来の浮遊培養系では、ｉＰＳ細胞同士がランダムに凝集してコロニーを形成する。そのため、従来の浮遊培養システムで作製されたコロニーにおけるクローナリティが維持できない。そのため、従来の浮遊培養システムでｉＰＳ細胞を誘導及び培養する試みで、個々の細胞由来のｉＰＳコロニーを成功裏に作製した例はない。そのため、従来の浮遊培養を用いて、独立したｉＰＳ細胞株を樹立できる方法を確立した例がない。
そこで、本発明は、コロニーを分離し分けたままｉＰＳ細胞を培養することが可能な幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、及び幹細胞の浮遊培養器を提供することを他の目的とする。
（人工多能性幹細胞の作製方法の課題）
また、本発明は、臨床に利用可能な幹細胞の作製方法を提供することを他の目的とする。
（動物細胞から特定の体細胞を作製する方法の課題）
本発明は、短時間で、遺伝子を傷つけることなく、動物細胞の他のタイプから特定のタイプの体細胞を効率的に作製する方法を提供することを他の目的とする。
本発明の態様によれば、（ａ）細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路と、（ｂ）導入前細胞送液路内に多能性誘導因子を送る誘導因子送液機構と、（ｃ）導入前細胞送液路に接続され、細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、（ｄ）誘導因子導入細胞を培養して幹細胞からなる複数の細胞魂を作製する細胞塊作製装置と、（ｅ）複数の細胞塊のそれぞれを順次パッケージするパッケージ装置と、（ｆ）導入前細胞送液路、誘導因子送液機構、因子導入装置、細胞塊作製装置、及びパッケージ装置を格納する容器と、を備える、幹細胞製造システムが提供される。
上記の幹細胞製造システムが、血液から細胞を分離する分離装置をさらに備え、分離装置で分離された細胞を含む溶液が導入前細胞送液路を通過してもよい。
上記の幹細胞製造システムにおいて、細胞塊作製装置が、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を培養する初期化培養装置と、初期化培養装置で樹立された幹細胞からなる細胞塊を複数の細胞塊に分割する第１の分割機構と、第１の分割機構で分割された複数の細胞塊を拡大培養する拡大培養装置と、拡大培養装置で拡大培養された幹細胞からなる細胞塊を複数の細胞塊に分割する第２の分割機構と、複数の細胞魂をパッケージ装置に順次送る細胞魂搬送機構と、を備えていてもよい。
初期化培養装置が、誘導因子導入細胞に培養液を補給する第１の培養液補給装置を備え、拡大培養装置が、複数の細胞塊に培養液を補給する第２の培養液補給装置を備えていてもよい。
上記の幹細胞製造システムが、初期化培養装置で培養される細胞を撮影する初期化培養撮影装置と、拡大培養装置で培養される細胞を撮影する拡大培養撮影装置と、をさらに備え、初期化培養装置及び拡大培養装置で無色の培養液を使用してもよい。
上記の幹細胞製造システムにおいて、導入前細胞送液路の内壁が、細胞非接着性であってもよい。
上記の幹細胞製造システムにおいて、導入前細胞送液路と、誘導因子送液機構と、が、基板上に設けられていてもよい。
上記の幹細胞製造システムにおいて、パッケージ装置が、ペルチェ素子又は液体窒素を用いて細胞塊を凍結してもよい。あるいは、パッケージ装置が、気化圧縮又は気化吸収等の冷凍方法により、細胞塊を凍結してもよい。
上記の幹細胞製造システムが、容器内の気体を清浄にする空気清浄装置をさらに備えていてもよい。
上記の幹細胞製造システムが、容器内の気体の温度を管理する温度管理装置をさらに備えていてもよい。
上記の幹細胞製造システムが、容器内の気体の二酸化炭素濃度を管理する二酸化炭素濃度管理装置をさらに備えていてもよい。
上記の幹細胞製造システムが、容器内を乾熱滅菌又はガス滅菌する滅菌装置をさらに備えていてもよい。
上記の幹細胞製造システムにおいて、誘導因子送液機構、因子導入装置、細胞塊作製装置、及びパッケージ装置が、サーバーによって作業手順に基づいて制御され、サーバーが、誘導因子送液機構、因子導入装置、細胞塊作製装置、及びパッケージ装置が作業手順に基づいて稼働しているか否か監視し、稼働記録を作成してもよい。
上記の幹細胞製造システムが、幹細胞に誘導因子を導入し、体細胞に分化させる装置をさらに備えていてもよい。
本発明の態様によれば、ゲル培地で浮遊培養されている体細胞を幹細胞へ誘導することを含む、幹細胞の誘導方法が提供される。
上記の幹細胞の誘導方法において、ゲル培地が攪拌されなくともよい。ゲル培地が、脱アシル化ジェランガムでゲル化されていてもよい。
上記の幹細胞の誘導方法において、ゲル培地が、成長因子を含まなくともよい。あるいは、ゲル培地が、成長因子を４０重量％以下の濃度で含んでいてもよい。
上記の幹細胞の誘導方法において、ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まなくともよい。ゲル培地が、ヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を含んでいてもよい。
また、本発明の態様によれば、成長因子を含まないゲル培地で幹細胞を浮遊培養することを含む、幹細胞の浮遊培養方法が提供される。
また、本発明の態様によれば、成長因子を４０重量％以下の濃度で含むゲル培地で幹細胞を浮遊培養することを含む、幹細胞の浮遊培養方法が提供される。
また、本発明の態様によれば、ｂＦＧＦを含まないゲル培地で幹細胞を浮遊培養することを含む、幹細胞の浮遊培養方法が提供される。
また、本発明の態様によれば、ｂＦＧＦを４００μｇ／Ｌ以下の濃度で含むゲル培地で幹細胞を浮遊培養することを含む、幹細胞の浮遊培養方法が提供される。
上記の幹細胞の浮遊培養方法において、ゲル培地が攪拌されなくともよい。ゲル培地が、脱アシル化ジェランガムでゲル化されていてもよい。ゲル培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよい。ゲル培地における幹細胞の濃度が、０．１×１０5個／ｍＬ以上であってもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法が、浮遊培養することの前に、幹細胞をシングルセルに分解することと、シングルセルに分解された幹細胞を、ゲル培地に入れることと、を更に含んでいてもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法における浮遊培養することにおいて、シングルセルがクローナリティを保ったままコロニーを形成してもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法が、浮遊培養することの前に、格子プレートを用いて幹細胞を懸滴型培養してコロニーを形成させることと、形成されたコロニーをゲル培地に入れることと、を更に含んでいてもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法において、幹細胞が未分化の状態を保ったまま増殖してもよい。
また、本発明の態様によれば、幹細胞とゲル培地が入れられる透析チューブと、透析チューブが入れられ、透析チューブの周囲にゲル培地が入れられる容器と、を備える、幹細胞の浮遊培養器が提供される。
上記の幹細胞の浮遊培養器において、透析チューブの分画分子量が０．１ｋＤａ以上であってもよい。透析チューブがセルロースエステル、セルロースエステル類、再生セルロース、及びセルロースアセテートから選択される少なくとも一つからなっていてもよい。
また、本発明の態様によれば、透析チューブに幹細胞とゲル培地を入れることと、容器に透析チューブを入れることと、容器内の透析チューブの周囲にゲル培地を入れることと、透析チューブ内のゲル培地で幹細胞を浮遊培養することと、を含む、幹細胞の浮遊培養方法が提供される。なお、透析チューブに幹細胞とゲル培地を入れることと、容器に透析チューブを入れることと、容器内の透析チューブの周囲にゲル培地を入れることと、の順番は特に限定されない。例えば、容器に透析チューブを入れてから、透析チューブに幹細胞とゲル培地を入れてもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法において、透析チューブの分画分子量が０．１ｋＤａ以上であってもよい。透析チューブがセルロースエステル、セルロースエステル類、再生セルロース、及びセルロースアセテートから選択される少なくとも一つからなっていてもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法において、透析チューブの周囲のゲル培地にＲＯＣＫ阻害剤が添加されていてもよい。ゲル培地が攪拌されなくともよい。ゲル培地が、脱アシル化ジェランガムでゲル化されていてもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法において、ゲル培地が、成長因子を含まなくともよい。あるいは、ゲル培地が、成長因子を４０重量％以下の濃度で含んでいてもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法において、ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まなくともよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法において、ゲル培地における幹細胞の濃度が、０．１×１０5個／ｍＬ以上であってもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法が、浮遊培養することの前に、幹細胞をシングルセルに分解することと、シングルセルに分解された幹細胞を、ゲル培地に入れることと、を更に含んでいてもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法の浮遊培養することにおいて、シングルセルがクローナリティを保ったままコロニーを形成してもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法が、浮遊培養することの前に、格子プレートを用いて幹細胞を懸滴型培養してコロニーを形成させることと、形成されたコロニーをゲル培地に入れることと、を更に含んでいてもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法において、幹細胞が未分化の状態を保ったまま増殖してもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法が、容器内の透析チューブの周囲のゲル培地を新鮮なゲル培地に交換することを更に含んでいてもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法が、容器内の透析チューブの周囲のゲル培地に新鮮なゲル培地を補充することを更に含んでいてもよい。
上記の幹細胞の浮遊培養方法において、透析チューブ内のゲル培地を交換しなくともよい。ゲル培地が、ヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を含んでいてもよい。
また、本発明の態様によれば、透析チューブに体細胞とゲル培地を入れることと、容器に透析チューブを入れることと、容器内の透析チューブの周囲にゲル培地を入れることと、透析チューブ内のゲル培地で浮遊している体細胞を幹細胞に誘導することと、を含む、幹細胞の浮遊誘導方法が提供される。なお、透析チューブに体細胞とゲル培地を入れることと、容器に透析チューブを入れることと、容器内の透析チューブの周囲にゲル培地を入れることと、の順番は特に限定されない。例えば、容器に透析チューブを入れてから、透析チューブに体細胞とゲル培地を入れてもよい。
上記の幹細胞の浮遊誘導方法において、透析チューブの分画分子量が０．１ｋＤａ以上であってもよい。透析チューブが、セルロースエステル、セルロースエステル類、再生セルロース、及びセルロースアセテートから選択される少なくとも一つからなっていてもよい。
上記の幹細胞の浮遊誘導方法において、ゲル培地が攪拌されなくともよい。ゲル培地が、脱アシル化ジェランガムでゲル化されていてもよい。
上記の幹細胞の浮遊誘導方法において、ゲル培地が、成長因子を含まなくともよい。
上記の幹細胞の浮遊誘導方法において、ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まなくともよい。
上記の幹細胞の浮遊誘導方法が、浮遊培養することの前に、体細胞をシングルセルに分解することと、シングルセルに分解された体細胞を、ゲル培地に入れることと、を更に含んでいてもよい。
上記の幹細胞の浮遊誘導方法の浮遊培養することにおいて、シングルセルがクローナリティを保ったままコロニーを形成してもよい。
上記の幹細胞の浮遊誘導方法が、容器内の透析チューブの周囲のゲル培地を新鮮なゲル培地に交換することを更に含んでいてもよい。
上記の幹細胞の浮遊誘導方法が、容器内の透析チューブの周囲のゲル培地に新鮮なゲル培地を補充することを更に含んでいてもよい。
上記の幹細胞の浮遊誘導方法において、透析チューブ内のゲル培地を交換しなくともよい。ゲル培地が、ヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を含んでいてもよい。
また、本発明の態様によれば、体細胞を用意することと、体細胞に初期化因子ＲＮＡをリポフェクション法により導入することと、を含む、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、体細胞が血液細胞であってもよい。血液細胞が単核球細胞であってもよい。血液細胞が血液幹前駆細胞であってもよい。血液細胞がＣＤ３４陽性であってもよい。血液細胞がＣＤ３４陽性であることを条件に分離された血液細胞であってもよい。血液細胞がＣＤ３陽性であってもよい。血液細胞がＣＤ３陽性であることを条件に分離された血液細胞であってもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡが、Ｏｃｔ３／４のｍＲＮＡ、Ｓｏｘ２のｍＲＮＡ、Ｋｌｆ４のｍＲＮＡ、及びｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡを含んでいてもよい。初期化因子ＲＮＡが、ＧＬＩＳ１のｍＲＮＡ、ＦＯＸＨ１のｍＲＮＡ、Ｌ－ＭＹＣのｍＲＮＡ、及びｐ５３－ｄｎのｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを更に含んでいてもよい。初期化因子ＲＮＡが、ＬＩＮ２８ＡのｍＲＮＡ又はＬＩＮ２８ＢのｍＲＮＡを更に含んでいてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡのリポフェクションに、ｓｉＲＮＡのリポフェクション試薬又はｍＲＮＡのリポフェクション試薬を用いてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡのリポフェクションに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡトランスフェクション試薬、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬から選択される少なくとも一つを用いてもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡのリポフェクションの際の血液細胞数が１から１×１０8であってもよい。初期化因子ＲＮＡのリポフェクションの際の初期化因子ＲＮＡの量が１回あたり５ｎｇから５０μｇであってもよい。初期化因子ＲＮＡのリポフェクションの際のリポフェクション試薬の量が１回あたり０．１μＬから５００μＬであってもよい。初期化因子ＲＮＡのリポフェクションを１回あたり０．１時間以上２４時間以下行ってもよい。初期化因子ＲＮＡのリポフェクションを複数回行ってもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡのリポフェクションの際に用いられる培地がＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）であってもよい。
上記の人工多能性幹細胞の作製方法が、血液から、フィルターを用いて単核球細胞を分離することを更に含んでいてもよい。
また、本発明の態様によれば、動物細胞を用意することと、動物細胞に誘導因子ＲＮＡをリポフェクションにより導入し、体細胞に分化させることと、を含む、動物細胞から特定の体細胞を作製する方法が提供される。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、動物細胞が幹細胞であってもよい。幹細胞が人工多能性幹細胞であってもよい。幹細胞がｉＰＳ細胞であってもよい。幹細胞が胚性幹細胞であってもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、動物細胞がヒト繊維芽細胞であってもよい。あるいは、動物細胞が血液細胞であってもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいてもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法が、リポフェクションの後、薬剤耐性を示す細胞を選択することを含んでいてもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、誘導因子ＲＮＡが、ピューロマイシン耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいてもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法が、リポフェクションの後、ピューロマイシン耐性を示す細胞を選択することを含んでいてもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、体細胞が神経系細胞であってもよい。誘導因子ＲＮＡがＮｇｎ２のｍＲＮＡを含んでいてもよい。誘導された神経系細胞がＮｇｎ２陽性であってもよい。誘導された神経系細胞がβ－IIIＴｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、ＰｓＡ－ＮＣＡＭ、又はｖＧｌｕｔ陽性であってもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、誘導因子ＲＮＡのリポフェクションに、メッセンジャーマックス（登録商標）を用いてもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際の細胞の数が１×１０4から１×１０8であってもよい。誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際の誘導因子ＲＮＡの量が１回あたり２００ｎｇから５０００ｎｇであってもよい。誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際のリポフェクション試薬の量が１回あたり０．１μＬから１００μＬであってもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際に用いられる培地がＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）であってもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、誘導因子ＲＮＡのリポフェクションから１０日以内に動物細胞が体細胞に分化してもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、動物細胞に誘導因子ＲＮＡをリポフェクションにより導入することを複数回繰り返してもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、動物細胞が、基底膜マトリックスでコートされた基板上で培養されてもよい。
上記の動物細胞から特定の体細胞を作製する方法において、動物細胞が、Ｂ１８Ｒ含有培地で培養されてもよい。あるいは、動物細胞が、Ｂ１８Ｒ非含有培地で培養されてもよい。
本発明によれば、幹細胞を製造可能な幹細胞製造システムを提供可能である。
（幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、及び幹細胞の浮遊培養器の効果）
本発明によれば、コロニーを分離したままｉＰＳ細胞を培養することが可能な幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、及び幹細胞の浮遊培養器を提供可能である。
（人工多能性幹細胞の作製方法の効果）
本発明によれば、臨床に利用可能な人工多能性幹細胞の作製方法を提供可能である。
（動物細胞から特定の体細胞を作製する方法の効果）
本発明によれば、動物細胞の遺伝子を傷つけることなく、短期間で効率よく特定の体細胞を作製可能な、動物細胞から特定の体細胞を作製する方法を提供可能である。
本発明の実施の形態に係る幹細胞製造システムの模式図である。 本発明の実施の形態に係る幹細胞製造システムの導入細胞送液路の一例の模式的断面図である。 本発明の実施の形態に係る幹細胞製造システムの導入細胞送液路の一例の模式的断面図である。 本発明の実施の形態に係る幹細胞製造システムで用いられる培養バッグの模式図である。 本発明の第２の実施の形態に係る幹細胞の浮遊培養器を示す模式図である。 実施例１に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例１に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例１に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例１に係るｉＰＳ細胞のコロニーの分化の状態を示すグラフである。 実施例２に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例３に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例３に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例４に係るｉＰＳ細胞の写真である。 実施例４に係るｉＰＳ細胞のコロニー数を示すグラフある。 実施例４に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例５に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例５に係るｉＰＳ細胞の密度ごとのコロニー形成率を示すグラフである。 実施例５に係る培地の量ごとのコロニー形成率を示すグラフである。 実施例６に係るｉＰＳ細胞の写真である。 実施例６に係るｉＰＳ細胞のコロニー数を示すグラフ。 実施例７に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例７に係る培養条件ごとのｉＰＳ細胞のコロニー数を示したグラフである。 実施例７に係る培地ごとのｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例７に係るｉＰＳ細胞のコロニーの分化の状態を示すグラフである。 実施例８に係るｉＰＳ細胞の写真である。 実施例８に係る培地の量ごとのコロニー形成率を示すグラフである。 実施例９に係るゲル培地の写真である。 実施例９に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例１０に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例１１に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例１２に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例１２に係るｉＰＳ細胞のコロニーの大きさを示すグラフである。 実施例１２に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実施例１２に係るｉＰＳ細胞のコロニーの分化の状態を示すグラフである。 実施例１３に係る蛍光顕微鏡写真である。 実施例１３に係る蛍光活性化フローサイトメーターによる分析結果を示すグラフである。 実施例１４に係る細胞の写真である。 実施例１４に係る細胞の写真である。 実施例１４に係るトランスフェクション効率と生存率の割合を示したグラフである。 実施例１５に係る細胞の写真である。 実施例１５に係る細胞の蛍光顕微鏡下の観察により撮られた写真である。 実施例１５に係るＴＵＪ－１陽性細胞の割合を示したグラフである。 実施例１５に係る細胞の写真である。 実施例１６に係るトランスフェクションの方法の模式図である。 実施例１６に係る細胞の写真である。 実施例１６に係る細胞の写真である。
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
（第１の実施の形態）
本発明の第１の実施の形態に係る幹細胞製造システムは、図１に示すように、血液から細胞を分離する分離装置１０と、分離装置１０で分離された細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路２０と、導入前細胞送液路２０内に多能性誘導因子を送る誘導因子送液機構２１と、導入前細胞送液路２０に接続され、細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置３０と、誘導因子導入細胞を培養して幹細胞からなる複数の細胞魂を作製する細胞塊作製装置４０と、複数の細胞塊のそれぞれを順次パッケージするパッケージ装置１００と、を備える。
幹細胞製造システムは、さらに、分離装置１０、導入前細胞送液路２０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞塊作製装置４０、及びパッケージ装置１００を格納する容器２００を備える。
幹細胞製造システムは、さらに、容器２００内の気体を清浄にする空気清浄装置、容器２００内の気体の温度を管理する温度管理装置、及び容器２００内の気体の二酸化炭素（ＣＯ2）濃度を管理する二酸化炭素濃度管理装置を備えていてもよい。空気清浄装置は、容器２００内の気体の清浄度を監視する清浄度センサを備えていてもよい。空気清浄装置は、例えば、ＨＥＰＡ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ａｉｒ）フィルター等を用いて、容器２００内の空気を清浄化する。空気清浄装置は、例えば、容器２００内の空気を、ＩＳＯ基準 １４６４４－１でＩＳＯ１からＩＳＯ６の清浄度に維持する。温度管理装置は、容器２００内の気体の温度を監視する温度センサを備えていてもよい。ＣＯ2濃度管理装置は、容器２００内の気体のＣＯ2濃度を監視するＣＯ2濃度センサを備えていてもよい。
容器２００には、例えば扉等が設けられているが、扉が閉じられた状態では、内部が完全に閉鎖され、内部の空気の清浄度、温度、及びＣＯ2濃度を一定に保つことが可能である。容器２００は、外部から内部の装置の状態を観察できるよう、透明であることが好ましい。また、容器２００は、ゴム手袋等のグローブを備える、グローブボックスであってもよい。
分離装置１０は、例えばヒトの血液が入ったバイアルを受け取る。分離装置１０は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ液、テルモ株式会社）等の抗凝固剤を保存する抗凝固剤タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、抗凝固剤タンクから、ヒトの血液に、抗凝固剤を添加する。
また、分離装置１０は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（登録商標、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等の単核細胞分離用試薬を保存する分離用試薬タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、分離用試薬タンクから、例えば１５ｍＬチューブ２本に、単核細胞分離用試薬を５ｍＬずつ分注する。なお、チューブの代わりに、樹脂バッグを用いてもよい。
さらに、分離装置１０は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液を保存する緩衝液タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、緩衝液タンクから、例えばヒトの血液５ｍＬに、緩衝液５ｍＬを加えて希釈する。またさらに、分離装置１０は、ポンプ等を用いて、希釈されヒトの血液を、チューブ中の単核細胞分離用試薬上に、５ｍＬずつ加える。
分離装置１０は、温度設定可能な遠心機をさらに備える。遠心機の温度は、例えば１８℃に設定される。分離装置１０は、移動装置等を用いて、単核細胞分離用試薬及びヒトの血液等が入れられたチューブを、遠心機のホルダーに入れる。遠心機は、チューブ中の溶液を、例えば４００×ｇで３０分間遠心する。チューブの代わりに、樹脂バッグを遠心させてもよい。
遠心後、分離装置１０は、チューブ中の溶液の単核球で白く濁った中間層をポンプ等で回収する。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、回収した単核球の懸濁液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。あるいは、さらに、分離装置１０は、回収した単核球溶液２ｍＬに対し、例えばＰＢＳ１２ｍＬを加えて、チューブを遠心機のホルダーに入れる。遠心機は、チューブ中の溶液を、例えば２００×ｇで１０分間遠心する。
遠心後、分離装置１０は、ポンプ等を用いて、チューブ中の溶液の上清を吸引して除去し、Ｘ－ＶＩＶＯ １０（登録商標、ロンザジャパン株式会社）等の単核球培地３ｍＬをチューブ中の単核球溶液に加えて懸濁する。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、単核球懸濁液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。なお、分離装置１０は、透析膜を使用して、血液から単核球を分離してもよい。また、皮膚等から予め分離された繊維芽細胞等の体細胞を使用する場合は、分離装置１０は無くともよい。
また、分離装置１０は、遠心分離以外の方法で、誘導に適した細胞を分離してもよい。例えば、分離すべき細胞がＴ細胞であればＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８のいずれかが陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。分離すべき細胞が血管内皮前駆細胞であればＣＤ３４が陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。分離すべき細胞がＢ細胞であれば、ＣＤ１０，ＣＤ１９，ＣＤ２０のいずれかが陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。また、パニングに限らず、磁気細胞分離方法やフローサイトメトリー等、他の方法により分離してもよい。あるいは、分離装置１０は、後述する実施の形態で説明する方法により、誘導に適した細胞を分離してもよい。例えば、第５の実施の形態で説明するように、細胞表面マーカーに基づいて、磁気分離装置を用いて、誘導に適した細胞を分離してもよい。あるいは、フィルターを用いて、誘導に適した細胞を分離してもよい。また、誘導される細胞は、血液細胞に限定されず、繊維芽細胞等であってもよい。
誘導因子送液機構２１は、誘導因子導入試薬溶液等を保存する誘導因子導入試薬タンクを備える。遺伝子導入試薬溶液等の誘導因子導入試薬溶液は、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標、ロンザジャパン株式会社）溶液等のエレクトロポレーション溶液、サプリメント溶液、及びプラスミドセットを含む。プラスミドセットは、例えば、ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３－Ｆを０．８３μｇ、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫを０．８３μｇ、ｐＣＥ－ｈＵＬを０．８３μｇ、及びｐＣＸＷＢ－ＥＢＮＡ１を０．５μｇ含む。あるいは、誘導因子導入試薬溶液は、後述する第４及び第５の実施の形態で説明する試薬等を含んでいてもよい。例えば、第５の実施の形態で説明するように、細胞に初期化因子をコードしているＲＮＡをリポフェクション法により導入してもよい。誘導因子送液機構２１は、マイクロポンプ等を用いて、誘導因子導入試薬溶液中に単核球懸濁液が懸濁されるように、誘導因子導入試薬溶液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。
導入前細胞送液路２０の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ（ｐｏｌｙ ２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）をコーティングして、細胞非接着性であってもよい。あるいは、導入前細胞送液路２０の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、導入前細胞送液路２０の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ2透過性の材料を用いることにより、導入前細胞送液路２０内の条件が、容器２００内の管理された温度及びＣＯ2濃度と同等になる。さらに、導入前細胞送液路２０には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
導入前細胞送液路２０に接続された因子導入装置３０は、例えばエレクトロポレーターであり、誘導因子導入試薬溶液と単核球懸濁液の混合液を受け取り、単核球に対してプラスミドのエレクトロポレーションを実施する。因子導入装置３０は、エレクトロポレーションを実施後、プラスミドをエレクトロポレーションされた単核球を含む溶液に、単核球培地を加える。因子導入装置３０は、ポンプ等を用いて、プラスミドをエレクトロポレーションされた単核球（以下、「誘導因子導入細胞」という。）を含む溶液を、導入細胞送液路３１に送り出す。なお、因子導入装置３０は、エレクトロポレーターに限定されない。因子導入装置３０は、後述する第４及び第５の実施の形態で説明する方法により、細胞に誘導因子を導入してもよい。また、培地は、ゲル培地であってもよい。この場合、ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含まなくともよい。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。また、ゲル培地は、ｔｇｆ－βを含まないか、ｔｇｆ－βを６００ｎｇ／Ｌ以下、３００ｎｇ／Ｌ以下、あるいは１００ｎｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。
導入細胞送液路３１の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングして、非接着性にしてもよい。あるいは、導入細胞送液路３１の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、導入細胞送液路３１の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ2透過性の材料を用いることにより、導入細胞送液路３１内の条件が、容器２００内の管理された温度及びＣＯ2濃度と同等になる。さらに、導入細胞送液路３１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。また、エレクトロポレーションの後は、多くの細胞が死に、死んだ細胞の細胞塊ができることがある。そのため、導入細胞送液路３１に、死細胞塊を除去するフィルターを設けてもよい。あるいは、図２に示すように、導入細胞送液路３１内部に、内径を断続的に変化させる一又は複数の襞を設けてもよい。またあるいは、図３に示すように、導入細胞送液路３１の内径を断続的に変化させてもよい。
導入細胞送液路３１に接続された細胞塊作製装置４０は、因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞を培養する初期化培養装置５０と、初期化培養装置５０で樹立された幹細胞からなる細胞塊を複数の細胞塊に分割する第１の分割機構６０と、第１の分割機構６０で分割された複数の細胞塊を拡大培養する拡大培養装置７０と、拡大培養装置７０で拡大培養された幹細胞からなる細胞塊を複数の細胞塊に分割する第２の分割機構８０と、複数の細胞魂をパッケージ装置１００に順次送る細胞魂搬送機構９０と、を備える。
初期化培養装置５０は、内部にウェルプレートを格納可能である。また、初期化培養装置５０は、ピペッティングマシンを備える。初期化培養装置５０は、導入細胞送液路３１から誘導因子導入細胞を含む溶液を受け取り、ピペッティングマシンで、溶液をウェルに分配する。初期化培養装置５０は、ウェルに誘導因子導入細胞を分配後、例えば３、５、７日目に、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標、味の素株式会社）等の幹細胞培地を加える。培地にサプリメントとして塩基性の線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ）を添加してもよい。なお、ＳｔｅｍＢｅａｄｓ ＦＧＦ２（フナコシ）のような、ＦＧＦ－２（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＦＧＦ－ｂ）を培地に供給し続ける徐放性ビーズを培地に添加してもよい。また、ＦＧＦは不安定な場合があるので、ヘパリン模倣ポリマーをＦＧＦに共役させ、ＦＧＦを安定化させてもよい。さらに、初期化培養装置５０は、ウェルに誘導因子導入細胞を分配後、例えば９日目に、培地交換を行い、以降、ｉＰＳ細胞の細胞塊（コロニー）が１ｍｍを越える程度まで、２日おきに培地交換を行う。
細胞塊が形成されると、初期化培養装置５０は、ピペッティングマシンで細胞塊を回収し、回収した細胞塊にＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標、ライフテクノロジーズ社）等のトリプシン代替組み替え酵素を添加する。さらに、初期化培養装置５０は、回収した細胞塊が入っている容器をインキュベータに入れて、３７℃、ＣＯ2５％で１０分間、細胞塊と、トリプシン代替組み替え酵素と、を反応させる。あるいは、初期化培養装置５０は、ピペッティングマシンによるピペッティングにより、細胞塊を砕く。またあるいは、初期化培養装置５０は、フィルターが設けられたパイプや、図２又は図３に示した導入細胞送液路３１と同様に、内径を断続的に変化させるパイプに細胞塊を通して、細胞塊を砕いてもよい。その後、初期化培養装置５０は、砕かれた細胞塊が入れられた溶液に、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標、味の素株式会社）等の多能性幹細胞用培地を加える。
なお、初期化培養装置５０における培養は、ウェルプレートではなく、ＣＯ2透過性のバッグの中で行ってもよい。また、培養は接着培養であってもよいし、浮遊培養であってもよい。浮遊培養である場合は、攪拌培養を行ってもよい。また、培地が寒天状であってもよい。寒天状の培地としては、ゲランガム（ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ）ポリマーが挙げられる。寒天状の培地を用いると、細胞が沈んだり、接着したりすることがないため、浮遊培養の形態でありながら、攪拌する必要がなく、一細胞由来の単一細胞塊を作製する事が出来るさらに、初期化培養装置５０における培養は、ハンギングドロップ培養であってもよい。
初期化培養装置５０は、ウェルプレートやＣＯ2透過性のバッグに培養液を補給する第１の培養液補給装置を備えていてもよい。第１の培養液補給装置は、ウェルプレートやＣＯ2透過性のバッグ内の培養液を回収し、フィルターや透析膜を用いて培養液をろ過して、浄化された培養液を再利用してもよい。この場合、再利用される培養液に成長因子等を添加してもよい。また、初期化培養装置５０は、培養液の温度を管理する温度管理装置、及び培養液近傍の湿度を管理する湿度管理装置等をさらに備えていてもよい。
初期化培養装置５０において、例えば、細胞を、図４に示すような透析膜等の培養液透過性のバッグ３０１に入れ、培養液透過性のバッグ３０１を、培養液非透過性のＣＯ2透過性のバッグ３０２に入れて、バッグ３０１、３０２に培養液を入れてもよい。初期化培養装置５０は、新鮮な培養液が入ったバッグ３０２を複数用意しておき、所定の期間ごとに、細胞が入ったバッグ３０１を入れるバッグ３０２を、新鮮な培養液が入っているバッグ３０２に交換してもよい。なお、初期化培養装置５０における培養方法は、上記の方法に限定されず、後述する第２及び第３の実施の形態で説明する方法により、培養してもよい。例えば、第２の実施の形態で説明するように、ゲル培地を用いてもよい。この場合、ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含まなくともよい。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。また、ゲル培地は、ｔｇｆ－βを含まないか、ｔｇｆ－βを６００ｎｇ／Ｌ以下、３００ｎｇ／Ｌ以下、あるいは１００ｎｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。また、第３の実施の形態で説明するように、幹細胞とゲル培地が入れられる透析チューブと、透析チューブが入れられ、透析チューブの周囲にゲル培地が入れられる容器と、を備える浮遊培養器を用いてもよい。
幹細胞製造システムは、初期化培養装置５０における培養を撮影する初期化培養撮影装置をさらに備えていてもよい。ここで、初期化培養装置５０で使用される培養液に無色の培養液を用いると、有色の培養液を用いた場合に生じうる乱反射や自家蛍光を抑制することが可能となる。また、誘導された細胞と、誘導されなかった細胞とでは、細胞の形状及び大きさ等が異なるため、幹細胞製造システムは、初期化培養装置５０における細胞を撮影することにより、誘導された細胞の割合を算出する誘導状態監視装置を、さらに備えていてもよい。あるいは、誘導状態監視装置は、抗体免疫染色法又はＲＮＡ抽出法により、誘導された細胞の割合を特定してもよい。さらに、幹細胞製造システムは、磁気細胞分離方法やフローサイトメトリー等により、誘導されていない細胞を取り除く、未誘導細胞除去装置を備えていてもよい。
初期化培養装置５０には、第１細胞塊送液路５１が接続されている。初期化培養装置５０は、トリプシン代替組み替え酵素と細胞塊の含有液を、ポンプ等を用いて、第１細胞塊送液路５１に送り出す。なお、物理的に細胞塊を砕ける場合は、トリプシン代替組み替え酵素はなくともよい。また、第１細胞塊送液路５１は、所定の大きさ未満の誘導された細胞のみを通す内径を有し、所定の大きさ以上の誘導されていない細胞を除去する分岐流路に接続されていてもよい。
第１細胞塊送液路５１の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングして、細胞非接着性であってもよい。あるいは、第１細胞塊送液路５１の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、第１細胞塊送液路５１の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ2透過性の材料を用いることにより、第１細胞塊送液路５１内の条件が、容器２００内の管理された温度及びＣＯ2濃度と同等になる。さらに、第１細胞塊送液路５１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
第１細胞塊送液路５１は、第１の分割機構６０に接続されている。第１の分割機構６０は、例えば、メッシュを備える。溶液に含まれる細胞塊は、水圧によってメッシュを通過する際、メッシュの各孔の大きさの複数の細胞塊に分割される。例えば、メッシュの各孔の大きさが均一であれば、分割後の複数の細胞塊の大きさも、ほぼ均一となる。あるいは、第１の分割機構６０は、ノズルを備えていてもよい。例えば、略円錐状のノズルの内部を階段状に微細加工することにより、溶液に含まれる細胞塊がノズルを通過する際に、複数の細胞塊に分割される。第１の分割機構６０には、拡大培養装置７０が接続されている。第１の分割機構６０で分割された細胞塊を含む溶液は、拡大培養装置７０に送られる。
拡大培養装置７０は、内部にウェルプレートを格納可能である。また、拡大培養装置７０は、ピペッティングマシンを備える。拡大培養装置７０は、第１の分割機構６０から複数の細胞塊を含む溶液を受け取り、ピペッティングマシンで、溶液をウェルに分配する。拡大培養装置７０は、ウェルに細胞塊を分配後、３７℃、ＣＯ2５％で細胞塊を例えば８日前後培養する。また、拡大培養装置７０は、適宜培地交換を行う。
その後、拡大培養装置７０は、細胞塊にＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標、ライフテクノロジーズ社）等のトリプシン代替組み替え酵素を添加する。さらに、拡大培養装置７０は、細胞塊が入っている容器をインキュベータに入れて、３７℃、ＣＯ2５％で１分間、細胞塊と、トリプシン代替組み替え酵素と、を反応させる。その後、拡大培養装置７０は、細胞塊が入れられた溶液に、維持培養培地等の培地を加える。さらに、拡大培養装置７０は、自動セルスクレーパー等で容器から細胞塊を剥がし、細胞塊を含む溶液を拡大培養送液路７１を介して第１の分割機構６０に送る。
なお、拡大培養装置７０における培養は、ウェルプレートではなく、ＣＯ2透過性のバッグの中で行ってもよい。また、培養は接着培養であってもよいし、浮遊培養であってもよいし、ハンギングドロップ培養であってもよい。浮遊培養である場合は、攪拌培養を行ってもよい。また、培地が寒天状であってもよい。寒天状の培地としては、ゲランガム（ｇｅｌｌａｎ ｇｕｍ）ポリマーが挙げられる。寒天状の培地を用いると、細胞が沈んだり、接着したりすることがないため、浮遊培養の形態でありながら、攪拌する必要がない。
拡大培養装置７０は、ウェルプレートやＣＯ2透過性のバッグに培養液を補給する第２の培養液補給装置を備えていてもよい。第２の培養液補給装置は、ウェルプレートやＣＯ2透過性のバッグ内の培養液を回収し、フィルターや透析膜を用いて培養液をろ過して、浄化された培養液を再利用してもよい。また、この場合、再利用される培養液に成長因子等を添加してもよい。また、拡大培養装置７０は、培養液の温度を管理する温度管理装置、及び培養液近傍の湿度を管理する湿度管理装置等をさらに備えていてもよい。
拡大培養装置７０においても、例えば、細胞を、図４に示すような透析膜等の培養液透過性のバッグ３０１に入れ、培養液透過性のバッグ３０１を、培養液非透過性のＣＯ2透過性のバッグ３０２に入れて、バッグ３０１、３０２に培養液を入れてもよい。拡大培養装置７０は、新鮮な培養液が入ったバッグ３０２を複数用意しておき、所定の期間ごとに、細胞が入ったバッグ３０１を入れるバッグ３０２を、新鮮な培養液が入っているバッグ３０２に交換してもよい。なお、拡大培養装置７０における培養方法は、上記の方法に限定されず、後述する第２及び第３の実施の形態で説明する方法により、培養してもよい。
幹細胞製造システムは、拡大培養装置７０における培養を撮影する拡大培養撮影装置をさらに備えていてもよい。ここで、拡大培養装置７０で使用される培養液に無色の培養液を用いると、有色の培養液を用いた場合に生じうる乱反射や自家蛍光を抑制することが可能となる。また、誘導された細胞と、誘導されなかった細胞とでは、細胞の形状及び大きさ等が異なるため、幹細胞製造システムは、拡大培養装置７０における細胞を撮影することにより、誘導された細胞の割合を算出する誘導状態監視装置を、さらに備えていてもよい。あるいは、誘導状態監視装置は、抗体免疫染色法又はＲＮＡ抽出法により、誘導された細胞の割合を特定してもよい。さらに、幹細胞製造システムは、磁気細胞分離方法やフローサイトメトリー等により、誘導されていない細胞を取り除く、未誘導細胞除去装置を備えていてもよい。
第１の分割機構６０で分割された細胞塊は、再び拡大培養装置７０内で培養される。必要な細胞の量が得られるまで、第１の分割機構６０における細胞塊の分割と、拡大培養装置７０内での細胞塊の培養が繰り返される。
拡大培養装置７０には、第２細胞塊送液路７２が接続されている。拡大培養装置７０は、拡大培養され、容器から剥離された細胞塊の含有液を、ポンプ等を用いて、第２細胞塊送液路７２に送り出す。第２細胞塊送液路７２は、所定の大きさ未満の誘導された細胞のみを通す内径を有し、所定の大きさ以上の誘導されていない細胞を除去する分岐流路に接続されていてもよい。
第２細胞塊送液路７２の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングして、細胞非接着性であってもよい。あるいは、第２細胞塊送液路７２の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、第２細胞塊送液路７２の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ2透過性の材料を用いることにより、第２細胞塊送液路７２内の条件が、容器２００内の管理された温度及びＣＯ2濃度と同等になる。さらに、第２細胞塊送液路７２には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
第２細胞塊送液路７２は、第２の分割機構８０に接続されている。第２の分割機構８０は、例えば、メッシュを備える。溶液に含まれる細胞塊は、水圧によってメッシュを通過する際、メッシュの各孔の大きさの複数の細胞塊に分割される。例えば、メッシュの各孔の大きさが均一であれば、分割後の複数の細胞塊の大きさも、ほぼ均一となる。あるいは、第２の分割機構８０は、ノズルを備えていてもよい。例えば、略円錐状のノズルの内部を階段状に微細加工することにより、溶液に含まれる細胞塊がノズルを通過する際に、複数の細胞塊に分割される。
第２の分割機構８０に、複数の細胞魂をパッケージ装置１００に順次送る細胞魂搬送機構９０が接続されている。細胞魂搬送機構９０と、パッケージ装置１００と、の間には、パッケージ前細胞流路９１が接続されている。細胞魂搬送機構９０は、ポンプ等を用いて、第２の分割機構８０で分割された細胞塊のそれぞれを、パッケージ前細胞流路９１を介して、パッケージ装置１００に順次送る。
パッケージ前細胞流路９１には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングしてもよい。あるいは、パッケージ前細胞流路９１の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、パッケージ前細胞流路９１の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ2透過性の材料を用いることにより、パッケージ前細胞流路９１内の条件が、容器２００内の管理された温度及びＣＯ2濃度と同等になる。パッケージ前細胞流路９１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
パッケージ前細胞流路９１には、凍結保存液送液機構１１０が接続されている。凍結保存液送液機構１１０は、細胞凍結保存液をパッケージ前細胞流路９１に送り込む。これにより、パッケージ前細胞流路９１内で、細胞塊が細胞凍結保存液で懸濁される。
パッケージ装置１００は、パッケージ前細胞流路９１を介して送られてきた複数の細胞塊のそれぞれを順次凍結する。例えば、パッケージ装置１００は、細胞塊を受け取るたびに細胞塊をクライオチューブに入れ、細胞塊溶液を例えば－８０℃以下で瞬間的に凍結する。体積あたりの表面積が小さいクライオチューブを用いると、凍結に時間がかかる傾向にあるため、体積あたりの表面積が大きいクライオチューブを用いることが好ましい。体積あたりの表面積が大きいクライオチューブを用いることにより、解凍後の細胞の生存率を高くすることが可能となる。クライオチューブの形状としては、キャピラリー状及び球状が挙げられるが、これらに限定されない。また、必要とされる解凍後の細胞の生存率によっては、必ずしも瞬間凍結をしなくともよい。
凍結には、例えば、ガラス化（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いる。この場合、細胞凍結保存液としては、ＤＡＰ２１３（コスモバイオ株式会社）及びＦｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル株式会社）が使用可能である。凍結は、ガラス化法以外の通常の方法で行ってもよい。この場合、細胞凍結保存液としては、ＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ－Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（Ｒ＆Ｄシステム社）や、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標、日本全薬工業株式会社）等が使用可能である。凍結は、液体窒素によって行ってもよいし、ペルチェ素子によっておこなってもよい。ペルチェ素子を用いると、温度変化を管理したり、温度のムラを抑制したりすることが可能となる。パッケージ装置１００は、クライオチューブを、容器２００の外に搬出する。凍結細胞が臨床用途である場合は、クライオチューブは完全閉鎖系であることが好ましい。ただし、パッケージ装置１００は、幹細胞を凍結することなく、クライオチューブ内にパッケージしてもよい。
幹細胞製造システムは、パッケージ装置１００におけるパッケージ工程を撮影するパッケージ工程撮影装置をさらに備えていてもよい。
幹細胞製造システムは、容器２００内を滅菌する滅菌装置をさらに備えていてもよい。滅菌装置は、乾熱滅菌装置であってもよい。この場合、分離装置１０、導入前細胞送液路２０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞塊作製装置４０、及びパッケージ装置１００等の電気を使用する装置の配線は、耐熱性を有する配線であることが好ましい。あるいは、滅菌装置は、オゾンガス、過酸化水素ガス、又はホルマリンガス等の滅菌ガスを容器２００内に放出して、容器２００内を滅菌してもよい。
幹細胞製造システムは、分離装置１０、導入前細胞送液路２０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞塊作製装置４０、及びパッケージ装置１００等の動作記録、並びに撮影装置が撮影した画像を、有線又は無線により、外部のサーバーに送信してもよい。また、外部のサーバーにおいて、ニューラルネットワークにより、例えば、誘導因子導入条件、培養条件、及び凍結条件等の条件と、幹細胞の不完全な初期化、幹細胞の分化及び増殖の失敗、及び染色体異常等の結果と、の関連を分析し、結果を導く条件を抽出したり、結果を予測したりしてもよい。さらに、外部サーバーは、標準作業手順（ＳＯＰ）に基づいて、幹細胞製造システムの分離装置１０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞塊作製装置４０、及びパッケージ装置１００等を制御し、ＳＯＰに基づいて各装置が稼働しているか否かを監視し、各装置の稼働記録を自動的に生成してもよい。
以上説明した幹細胞製造システムによれば、全自動で、ｉＰＳ細胞等の幹細胞の誘導、樹立、拡大培養、及び凍結保存を一括して行うことが可能となる。
（その他の実施の形態）
なお、例えば、因子導入装置３０は、エレクトロポレーションではなく、ＲＮＡトランスフェクションにより細胞を誘導してもよい。あるいは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びセンダイウイルス等のウイルスベクターや、プラスミドにより、細胞を誘導してもよい。また、導入前細胞送液路２０、導入細胞送液路３１、細胞塊送液路５１、拡大培養送液路７１、細胞塊送液路７２、及びパッケージ前細胞流路９１はマイクロフルイディクス技術により基板上に設けられていてもよい。また、誘導された幹細胞に誘導因子リボ核酸（ＲＮＡ）をリポフェクションにより導入し、体細胞に分化させる装置が、幹細胞製造システムに接続されていてもよい。誘導された幹細胞に誘導因子リボ核酸（ＲＮＡ）をリポフェクションにより導入し、体細胞に分化させる方法は、例えば、後述する第６の実施の形態に記載の方法を用いることができる。体細胞は、例えば神経系細胞である。
（第２の実施の形態）
本発明の第２の実施の形態に係る幹細胞の浮遊培養方法は、ゲル培地で幹細胞を浮遊培養することを含む。幹細胞は、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。ゲル培地は、撹拌されない。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まない。幹細胞は、未分化の状態を保ったまま、ゲル培地中で増殖する。
例えば、幹細胞は、浮遊培養される前に、シングルセルに分解され、シングルセルに分解された幹細胞が、ゲル培地に入れられる。シングルセルは、クローナリティを保ったまま増殖し、ゲル培地中でコロニーを形成する。
ゲル培地は、例えば、幹細胞用培地に脱アシル化ジェランガムを終濃度が０．５重量％から０．００１重量％、０．１重量％から０．００５重量％、あるいは０．０５重量％から０．０１重量％となるよう添加することにより調製される。
ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくとも１種の温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
幹細胞用培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を使用可能である。
ただし、幹細胞用培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ （登録商標）ＸＦ／ＦＦ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ａｎｄ ＥＳ Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ－Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｆｅｅｄｅｒ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、及びＬ７（登録商標）ｈＰＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＬＯＮＺＡ）等を利用してもよい。
ゲル培地には、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤を終濃度が１０００μｍｏｌ／Ｌ以上０．１μｍｏｌ／Ｌ以下、１００μｍｏｌ／Ｌ以上１μｍｏｌ／Ｌ以下、あるいは５μｍｏｌ／Ｌ以上２０μｍｏｌ／Ｌ以下となるよう、毎日添加する。ＲＯＣＫ阻害剤をゲル培地に添加することにより、幹細胞によるコロニー形成が促進される。
ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含まない。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含む。ゲル培地がｂＦＧＦ等の成長因子を高濃度で含む場合と比較して、ゲル培地がｂＦＧＦ等の成長因子を含まないか、あるいはｂＦＧＦ等の成長因子を低濃度で含む方が、幹細胞によるコロニー形成が促進される傾向にある。
また、ゲル培地は、ｔｇｆ－βを含まないか、ｔｇｆ－βを６００ｎｇ／Ｌ以下、３００ｎｇ／Ｌ以下、あるいは１００ｎｇ／Ｌ以下の低濃度で含む。
ゲル培地における幹細胞の濃度は、例えば、２×１０5個／ｍＬ以上、２．２５×１０5個／ｍＬ以上、あるいは２．５×１０5個／ｍＬ以上である。ゲル培地における幹細胞の濃度が２×１０５個／ｍＬより低いと、コロニー形成率が低下する傾向にある。
本発明の第２の実施の形態に係る幹細胞の浮遊培養方法によれば、シングルセルから幹細胞のコロニーを形成することが可能である。また、培地を撹拌する必要がないため、浮遊培養法であるにも関わらず、幹細胞同士が衝突することがない。そのため、コロニーにおいてクローナリティを維持することが可能である。したがって、例えば、幹細胞がｉＰＳ細胞である場合、１つの体細胞由来のｉＰＳ細胞のクローナリティを担保することが可能である。また、幹細胞同士が衝突することがないため、幹細胞のコロニーの大きさを均質に保つことが可能である。さらに、浮遊培養法は、接着培養法と比較して、少ないスペースで多数のコロニーを培養することが可能である。なお、浮遊培養することにおいて、幹細胞の細胞塊（クランプ）を維持培養してもよい。
また、ＥＳ／ｉＰＳ細胞の発見がなされて以来、ｂＦＧＦ、及びＴｇｆ－β等の成長因子は、ＥＳ／ｉＰＳ細胞の培養に必須であると考えられてきた。しかし、ｂＦＧＦ等の成長因子は、３７℃程度の培養条件下では、急速に分解されるため、毎日ｂＦＧＦ及びＴｇｆ－β含有培養液を交換、或はｂＦＧＦ及びＴｇｆ－β等を添加する必要がある。さらに、培養に用いられるｂＦＧＦは、通常、リコンビナントタンパク質であるが、クリニカルグレードのリコンビナントタンパク質は、非常に厳格なルールに従って作製する必要がある。
また、例えばｂＦＧＦの濃度が１０ｎｇ／ｍＬのような低濃度である場合、マウス由来の線維芽細胞をフィーダー細胞として用いる必要があると考えられてきた。しかし、マウスのような動物由来のフィーダー細胞と共培養された幹細胞を、移植再生医療に用いることはできず、幹細胞の臨床利用が進まない原因となっていた。
フィーダー細胞を用いないフィーダーフリー用の幹細胞培養液も開発されてきているが、フィーダーフリー培養液は、フィーダー細胞を用いる場合の培養液と比較して、通常、２５倍近いｂＦＧＦを含有しており、１００ｎｇ／ｍＬのような非常に高濃度なｂＦＧＦを含有している。しかし、高濃度のｂＦＧＦを含有するフィーダーフリー培養液を用いて、ＥＳ／ｉＰＳ細胞を核型異常なく培養することは難しく、多くのｉＰＳ細胞が死滅する。また、高濃度のｂＦＧＦを含有するフィーダーフリー培養液で培養されたＥＳ／ｉＰＳ細胞は、特定の体細胞に分化しにくくなる傾向にある。そのため、フィーダーフリー培養液は、幹細胞から移植に必要な体細胞を作製する効率を落とす一つの原因となっている。
これに対し、本発明の第２の実施の形態に係る幹細胞の浮遊培養方法によれば、フィーダー細胞を用いずに、幹細胞を未分化の状態を保ったまま培養し、増殖させることが可能である。また、本発明の第２の実施の形態に係る幹細胞の浮遊培養方法によれば、フィーダー細胞を用いないにも関わらず、ｂＦＧＦ等の成長因子を用いずに、あるいは低濃度のｂＦＧＦ等の成長因子を用いて、幹細胞を未分化の状態を保ったまま培養し、増殖させることが可能である。
（第３の実施の形態）
本発明の第３の実施の形態に係る幹細胞の浮遊培養器は、図５に示すように、幹細胞とゲル培地が入れられる透析チューブと、透析チューブが入れられ、透析チューブの周囲にゲル培地が入れられる容器と、を備える。
透析チューブは、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤を透過させる。透析チューブの分画分子量は、０．１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、あるいは５０ｋＤａ以上である。透析チューブは、例えば、セルロースエステル、エチルセルロース、セルロースエステル類、再生セルロース、ポリスルホン、ポリアクリルニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリカーボネート、ポリアミド、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、銅アンモニウムレーヨン、鹸化セルロース、ヘモファン膜、フォスファチジルコリン膜、及びビタミンＥコーティング膜等からなる。容器としては、遠心チューブのような円錐チューブが使用可能である。容器は、例えば、ポリプロピレンからなる。
透析チューブ内に入れられる幹細胞は、第２の実施の形態と同様である。また、透析チューブ内に入れられるゲル培地も、第２の実施の形態と同様である。ただし、透析チューブ内に入れられるゲル培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいなくてもよい。容器内の透析チューブの周囲に入れられるゲル培地は、第２の実施の形態と同様である。容器内の透析チューブの周囲に入れられるゲル培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む。
透析チューブ内で幹細胞を浮遊培養する間、容器内の透析チューブの周囲のゲル培地は、新鮮なゲル培地に交換、あるいは補充される。ただし、透析チューブ内のゲル培地は交換しなくともよい。
従来の浮遊培養系においては、細胞を吸い出すことなく、培地を交換することが困難である場合がある。しかし、培地を新鮮な培地に交換しないと、老廃物が蓄積する場合がある。また、培地を新鮮な培地に交換あるいは補充しないと、培地中の培地成分が不足する場合がある。
これに対し、本発明の第３の実施の形態に係る幹細胞の浮遊培養器を用いれば、幹細胞は透析チューブの中にあるため、透析チューブの周囲の培地を新鮮な培地に交換しても、幹細胞を吸い取るおそれがない。また、透析チューブの周囲の培地を新鮮な培地に交換しても、透析チューブ内の培地の量はほぼ変わらないため、透析チューブ内の幹細胞の密度に変化が生じない。また、透析チューブ内の高濃度の老廃物は、透析チューブの外に移動する。透析チューブ内の培地の培地成分の濃度が低下すると、透析チューブの外の培地から培地成分が透析チューブ内に移動する。そのため、幹細胞の周囲の培地を新鮮に保つことが可能である。
（第４の実施の形態）
本発明の第４の実施の形態に係る幹細胞の誘導方法は、ゲル培地で浮遊培養されている体細胞を幹細胞へ誘導することを含む。体細胞は、例えば、繊維芽細胞である。幹細胞は、例えば、ｉＰＳ細胞である。ゲル培地は、撹拌されない。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まない。
ゲル培地は、例えば、幹細胞用培地に脱アシル化ジェランガムを終濃度が０．５重量％から０．００１重量％、０．１重量％から０．００５重量％、あるいは０．０５重量％から０．０１重量％となるよう添加することにより調製される。
ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくとも１種の温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
幹細胞用培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を使用可能である。
ただし、幹細胞用培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ （登録商標）ＸＦ／ＦＦ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ａｎｄ ＥＳ Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ－Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｆｅｅｄｅｒ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、及びＬ７（登録商標）ｈＰＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＬＯＮＺＡ）等を利用してもよい。ゲル培地は、例えば、チューブに入れられる。
ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含まなくともよい。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。
また、ゲル培地は、ｔｇｆ－βを含まないか、ｔｇｆ－βを６００ｎｇ／Ｌ以下、３００ｎｇ／Ｌ以下、あるいは１００ｎｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでもよい。
（実施例１）
５００ｍＬのＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)、及び０．２ｍＬの濃度が１０μｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ ＰＨＧ０２６６）を混合し、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を調製した。
また、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地に脱アシル化ジェランガム（日産化学）を濃度が０．０２重量％となるよう添加し、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地を調製した。さらに、５ｍＬの濃度が２．５重量％のトリプシン、５ｍＬの濃度が１ｍｇ／ｍＬのコラゲネースＩＶ、０．５ｍＬの濃度が０．１ｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２、１０ｍＬのＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０８２８－０２８）、及び３０ｍＬの精製水を混合して、一般にＣＴＫ溶液と呼ばれる剥離液を調製した。
フィーダー細胞上でｉＰＳ細胞を培養している６ウェルディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １２－５５６－００４）にＣＴＫ溶液を３００μＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ中で３分インキュベートした。３分後、インキュベータからディッシュを取り出し、フィーダー細胞のみが剥がれていることを確認し、アスピレータを用いてＣＴＫ溶液を取り除いた。ＣＴＫ溶液を取り除いた後、６ウェルディッシュにＰＢＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｓｃ－３６２１８３）を５００μＬ添加し、ｉＰＳ細胞を洗浄後、６ウェルディッシュからＰＢＳを取り除き、０．３ｍＬの剥離液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、登録商標）を６ウェルディッシュに添加し、ＣＯ2インキュベータに入れ、５分間インキュベートした。その後、０．７ｍＬのｂＦＧＦ含有ｉＰＳ培地を６ウェルディッシュに添加し、ｉＰＳ細胞をシングルセルになるまで懸濁した。
ｉＰＳ細胞を懸濁後、４ｍＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬの遠心チューブに添加し、遠心機を用いてｉＰＳ細胞懸濁液を２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を取り除き、１ｍＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬの遠心チューブに添加し、血球計算版を用いて細胞数を計算した。細胞計算後、５×１０5個ずつｉＰＳ細胞を１５ｍＬファルコンチューブ（登録商標、Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５２０９６）又は非接着ディッシュに播種し、以後攪拌することなく浮遊培養した。
１５ｍＬチューブにおいては、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地を２ｍＬ用いた。非接着ディッシュにおいては、ジェランガムを含有していないｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を２ｍＬ用いた。各培地にはＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｓ１０４９）が１０μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加した。その後、１５ｍＬチューブ及び非接着ディッシュに、毎日５００μＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地 を添加し、非接着ディッシュに、毎日５００μＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を添加した。また、１５ｍＬチューブ及び非接着ディッシュに、毎日、終濃度が１０μｍｏｌ／ＬとなるようＲＯＣＫ阻害剤を添加し、７日間、浮遊培養を続けた。
その結果を図６に示す。図６（ｂ）に示すように、非接着ディッシュでジェランガムを含有していないｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を用いてｉＰＳ細胞を培養した場合、ｉＰＳ細胞のコロニー同士の凝集が顕著に認められた。これに対し、図６（ａ）に示すように、１５ｍＬチューブ中でｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地を用いてｉＰＳ細胞を培養した場合、目立った凝集は認められなかった。図７（ａ）は、１５ｍＬチューブにおいて、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地を用いてｉＰＳ細胞を培養したときの１日目の写真であり、図７（ｂ）は、１５ｍＬチューブにおいて、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地を用いてｉＰＳ細胞を培養したときの９日目の写真である。図７（ａ）及び図７（ｂ）の写真から、異なる株のｉＰＳ細胞同士が凝集せずに、コロニーを形成したことが確認された。
図８（ａ）は、ゲル培地中で７日間浮遊培養したｉＰＳ細胞のコロニーをフィーダー細胞上に再播種する直前時の写真である。図８（ｂ）は、その３日後にコロニーの形態を確認した時の写真である。その結果、図９に示すように、９５％以上のコロニーが未分化であることが確認された。よって、ｉＰＳ細胞をゲル培地中で、未分化の状態を維持したまま培養することができることが示された。
（実施例２）
実施例１と同じｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地、及びｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地を調製した。フィーダー細胞上でｉＰＳ細胞を培養している６ウェルディッシュにＣＴＫ溶液を３００μＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ中で３分間インキュベートした。３分後、インキュベータからディッシュを取り出し、フィーダー細胞のみがはがれていることを確認し、アスピレータを用いてＣＴＫ溶液を取り除いた。ＣＴＫ溶液を取り除いた後、ディッシュにＰＢＳを５００μＬ添加し、ｉＰＳ細胞を洗浄後、ディッシュからＰＢＳを取り除き、０．３ｍＬのＡｃｃｕｍａｘをディッシュに添加し、ディッシュをＣＯ2インキュベータに入れ、５分間インキュベートした。その後、０．７ｍＬのｂＦＧＦ含有ｉＰＳ培地をディッシュに添加し、ｉＰＳ細胞をシングルセルになるまで懸濁した。
ｉＰＳ細胞を懸濁後、４ｍＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬ遠心チューブに添加し、遠心機を用いてｉＰＳ細胞懸濁液を２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を取り除き、１ｍＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬ遠心チューブに添加し、血球計算版を用いて細胞数を計算した。細胞計算後、５×１０5個ずつｉＰＳ細胞を、１５ｍＬチューブに播種し、以後攪拌することなく浮遊培養した。
１５ｍＬチューブにおいては、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地を２ｍＬ用いた。各培地にはＲＯＣＫ阻害剤が１０μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加した。その後、１５ｍＬチューブに、毎日５００μＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地を添加した。なお、５００μＬのゲル培地は、０．５μＬのＲＯＣＫ阻害剤を含んでいた。また、コントロールとして、ＲＯＣＫ阻害剤を添加していない以外は同じ条件で、ｉＰＳ細胞を、７日間、浮遊培養した。
図１０（ａ）に示すように、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地にＲＯＣＫ阻害剤を添加しなかった場合、ｉＰＳ細胞はコロニーを形成しなかった。これに対し、図１０（ｂ）に示すように、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地にＲＯＣＫ阻害剤を添加した場合、ｉＰＳ細胞はコロニーを形成した。この結果から、シングルセルからｉＰＳ細胞を浮遊培養する場合、ＲＯＣＫ阻害剤が有効であることが示された。
（実施例３）
実施例１と同様に、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地を用意した。また、ｂＦＧＦを含まない以外はｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地と同じであるｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を用意した。さらに、ｂＦＧＦを含まない以外はｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地と同じであるｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を用意した。またさらに、市販の血清フリー及びゼノフリーのフィーダーフリーリプログラミング用培地に脱アシル化ゲランガム（日産化学）を濃度が０．０２重量％となるよう添加し、比較用ゲル培地を調製した。
ここで、比較用ゲル培地と比較して、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地は、ｂＦＧＦを、２５分の１程度の濃度しか含まない。
フィーダー細胞上でｉＰＳ細胞を培養している６ウェルディッシュにＣＴＫ溶液を３００μＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ中で３分インキュベートした。３分後、インキュベータからディッシュを取り出し、フィーダー細胞のみが剥がれていることを確認し、アスピレータを用いてＣＴＫ溶液を取り除いた。ＣＴＫ溶液を取り除いた後、ＰＢＳで一度洗浄し、１ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を添加し、スクレーバーでｉＰＳ細胞を掻き集め、シングルセルにならないよう１５ｍＬの遠心チューブ中で１０回程度懸濁した。その後、２ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を添加し、１ｍＬずつ３等分し、遠心機を用いて２７０ｇで遠心した。
遠心後、１５ｍＬの遠心チューブから上清を取り除き、２ｍＬの比較用ゲル培地、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地、及びｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地をそれぞれ１５ｍＬの遠心チューブに添加した。翌日から、遠心チューブのそれぞれに５００μＬの最初と同じゲル培地を毎日添加し、７日間浮遊培養をした。
図１１（ａ）は、市販のフィーダーフリー培地から調製した比較用ゲル培地で７日間浮遊培養したｉＰＳ細胞のコロニーの代表例を示しており、図１１（ｂ）は、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地で７日間浮遊培養したｉＰＳ細胞のコロニーの代表例を示しており、図１１（ｃ）は、ｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地で７日間浮遊培養したｉＰＳ細胞のコロニーの代表例を示している。
ｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地、及び比較用ゲル培地と比べて２５分の１程度の濃度しかｂＦＧＦを含まないｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地でも、ｉＰＳ細胞は培養できていた。
７日間浮遊培養したｉＰＳ細胞のコロニーが未分化であるか否かを確かめるために、ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上に再播種し、コロニーの形態を観察した。図１２の上段の写真は、ゲル培地中のコロニーを示す。図１２の中段の写真は、７日間浮遊培養したｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上に再播種して２日後のコロニーを示す。いずれの場合も、未分化なコロニーが９０％以上であることが確認された。これらの結果から、ｂＦＧＦを含まないゲル培地、あるいは比較用ゲル培地と比べてｂＦＧＦ濃度が２５倍以上低いゲル培地を使用しても、ｉＰＳ細胞を未分化状態を維持させたまま浮遊培養できることが示された。
図１２の下段の写真は、７日間浮遊培養したｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上に再播種して７日後のコロニーを示す。ｉＰＳ細胞をゲル培地で浮遊培養した後、フィーダー細胞上で長期間（７日間）培養しても、分化しないことが示された。
（実施例４）
実施例３と同じｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地、及びｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を用意した。また、市販の血清フリーのフィーダーフリー培地に脱アシル化ゲランガム（日産化学）を濃度が０．０２重量％となるよう添加し、比較用ゲル培地を調製した。いずれのゲル培地にも、濃度が１０μｍｏｌ／Ｌとなるよう、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した。
フィーダー細胞上でｉＰＳ細胞を培養している６ウェルディッシュにＣＴＫ溶液を３００μＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ中で３分インキュベートした。３分後、インキュベータからディッシュを取り出し、フィーダー細胞のみが剥がれていることを確認し、アスピレータを用いてＣＴＫ溶液を取り除いた。ＣＴＫ溶液を取り除いた後、６ウェルディッシュにＰＢＳを５００μＬ添加し、ｉＰＳ細胞を洗浄後、６ウェルディッシュからＰＢＳを取り除き、０．３ｍＬのＡｃｃｕｍａｘを６ウェルディッシュに添加し、６ウェルディッシュをＣＯ2インキュベータに入れ、５分間インキュベートした。その後、０．７ｍＬのｂＦＧＦ含有ｉＰＳ培地を６ウェルディッシュに添加し、ｉＰＳ細胞をシングルセルになるまで懸濁した。
ｉＰＳ細胞を懸濁後、４ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬの遠心チューブに添加し、遠心機を用いて２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を取り除き、１ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を遠心チューブに添加し、血球計算版を用いて細胞数を計算した。
その後、１本の遠心チューブあたり、５×１０5個のｉＰＳ細胞を入れ、２ｍＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地、ｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地、及び比較用ゲル培地をそれぞれ遠心チューブに添加した。翌日から、遠心チューブのそれぞれに５００μＬの最初と同じゲル培地を毎日添加し、７日間浮遊培養をした。
その結果、図１３（ｃ）に示すように、比較用ゲル培地では、シングルセル由来のｉＰＳ細胞を培養できなかった。これに対し、図１３（ａ）及び図１３（ｂ）に示すように、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地、及びｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地では、シングルセル由来のｉＰＳ細胞を培養できた。なお、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地におけるｂＦＧＦ濃度は４μｇ／ｍＬであり、比較用ゲル培地におけるｂＦＧＦ濃度は、１００μｇ／ｍＬである。
また、コロニー数を定量したところ、図１４に示すように、ｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地で浮遊培養したほうが、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地で浮遊培養した場合よりも、２倍以上のｉＰＳ細胞のコロニーが形成されていた。よって、ゲル培地においては、ｂＦＧＦの濃度が低いか、ｂＦＧＦが含まれないことが好ましいことが示された。
また、ｉＰＳ細胞をシングルセルにし、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地、又はｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地に脱アシル化ゲランガムが０．０２重量％なるよう添加した培地に、ロックインヒビターが１０μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加した培地を用いて７日間培養した。その際、５×１０5個の細胞を１．５ｍＬの各ゲル培地に懸濁し、毎日各ゲル培地にロックインヒビターが１０μｍｏｌ／Ｌ添加してある培地を１．５ｍＬ加えていった。
７日間培養したｉＰＳ細胞に、１０倍量のＰＢＳを添加し、遠心機を用いて２７０ｇで遠心後、上清を廃棄し、アキュマックスを０．３ｍＬ添加し、ＣＯ2インキュベータに入れ、５分間インキュベートした。その後、０．７ｍＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を添加し、ｉＰＳ細胞をシングルセルになるまで懸濁した。懸濁後、１．５ｍＬのヒトｉＰＳ培地（ｂＦＧＦ含有培地で培養していた細胞にはｂＦＧＦ含有培地、ｂＦＧＦ非含有培地で培養していた細胞にはｂＦＧＦ非含有培地）を添加し、遠心機を用いてさらに７日間、前７日間と同様に培養した。培養後、一部をフィーダー細胞上にまきなおし、さらに三日後、ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ３／４に対する抗体で染色し、観察を行った。結果を図１５に示す。合計で１４日間ゲル培地で培養したｉＰＳ細胞は、未分化マーカーであるＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ３／４陽性であった。この結果から、ゲル培地において長期にわたる培養を行ったときに、ｂＦＧＦを含まない培地であっても、未分化を維持したまま培養が行えることが示された。
（実施例５）
実施例３と同じｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地、及びｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を用意した。ゲル培地には、濃度が１０μｍｏｌ／Ｌとなるよう、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した。
フィーダー細胞上でｉＰＳ細胞を培養している６ウェルディッシュにＣＴＫ溶液を３００μＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ中で３分インキュベートした。３分後、インキュベータからディッシュを取り出し、フィーダー細胞のみが剥がれていることを確認し、アスピレータを用いてＣＴＫ溶液を取り除いた。ＣＴＫ溶液を取り除いた後、６ウェルディッシュにＰＢＳを５００μＬ添加し、細胞を洗浄後、ＰＢＳを取り除き、０．３ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅを６ウェルディッシュに添加し、６ウェルディッシュをＣＯ2インキュベータに入れ、５分間インキュベートした。その後、０．７ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を６ウェルディッシュに添加し、ｉＰＳ細胞をシングルセルになるまで懸濁した。
ｉＰＳ細胞を懸濁後、４ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を遠心チューブに添加し、遠心機を用いてｉＰＳ細胞懸濁液を２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を取り除き、１ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を遠心チューブに添加し、血球計算版を用いて細胞数を計算した。
その後、１本の遠心チューブあたり、１×１０5個、２．５×１０5個、あるいは５×１０5個のｉＰＳ細胞を入れ、２ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を添加した。翌日から、遠心チューブのそれぞれに５００μＬのゲル培地を毎日添加し、７日間浮遊培養をした。
各播種細胞数におけるコロニーの写真を図１６に示す。また、播種したｉＰＳ細胞に対してコロニーを形成したｉＰＳ細胞数の割合を定量化した結果を図１７に示す。１×１０5個又は２．５×１０5個のｉＰＳ細胞を播種した場合と比較して、５×１０5個のｉＰＳ細胞を播種した場合、１０倍以上のｉＰＳ細胞のコロニーが形成された。したがって、ｉＰＳ細胞の播種濃度が低いと、ｉＰＳ細胞のコロニーが形成されないことが示された。
また、１本の遠心チューブあたり１×１０5個のｉＰＳ細胞を入れ、遠心チューブに、２００μＬ、４００μＬ、１０００μＬ、及び２０００μＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地をそれぞれ添加した。翌日から、遠心チューブに、１００μＬ、２００μＬ、５００μＬ、及び１０００μＬのゲル培地をそれぞれ毎日添加し、７日間浮遊培養をした。
播種したｉＰＳ細胞に対してコロニーを形成したｉＰＳ細胞数の割合を定量化した結果を図１８に示す。ゲル培地の量が増えるほど、換言すれば、ｉＰＳ細胞の播種濃度が低くなるほど、ｉＰＳ細胞のコロニーが形成されないことが示された。
（実施例６）
実施例３と同じｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地、及びｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を用意した。
フィーダー細胞上でｉＰＳ細胞を培養している６ウェルディッシュにＣＴＫ溶液を３００μＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ中で３分インキュベートした。３分後、インキュベータからディッシュを取り出し、フィーダー細胞のみが剥がれていることを確認し、アスピレータを用いてＣＴＫ溶液を取り除いた。ＣＴＫ溶液を取り除いた後、６ウェルディッシュにＰＢＳを５００μＬ添加し、細胞を洗浄後、ＰＢＳを取り除き、０．３ｍＬのＡｃｃｕｍａｘを６ウェルディッシュに添加し、６ウェルディッシュをＣＯ2インキュベータに入れ、５分間インキュベートした。その後、０．７ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を６ウェルディッシュに添加し、ｉＰＳ細胞をシングルセルになるまで懸濁した。
ｉＰＳ細胞を懸濁後、４ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬの遠心チューブに添加し、遠心機を用いてｉＰＳ細胞懸濁液を２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を取り除き、１ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬの遠心チューブに添加し、血球計算版を用いて細胞数を計算した。
その後、５×１０5個のｉＰＳ細胞を含有する２ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を分画分子量が１００ｋＤａの透析チューブを備える透析モジュール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇ２３５０３５）に入れた。透析チューブ内には、ＲＯＣＫ阻害剤を入れなかった。さらに、図５に示すように、透析モジュールを５０ｍＬ遠心チューブに入れ、遠心チューブ内の透析チューブの周囲に２０ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を入れた。さらに、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地に終濃度が１０μｍｏｌ／ＬとなるようＲＯＣＫ阻害剤を添加した。一部の遠心チューブには、コントロールとしてＲＯＣＫ阻害剤を添加しなかった。その後、２日に１回、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を１０ｍＬ交換し、７日間浮遊培養を続けた。なお、交換の際に新たに入れられるｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地は１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤を含んでいた。
図１９（ａ）に示すように、透析チューブの周囲にＲＯＣＫ阻害剤を添加していないｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を入れて培養した場合と比較して、図１９（ｂ）に示すように、透析チューブの周囲にＲＯＣＫ阻害剤を添加したｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を入れて培養した場合、図２０に示すようにｉＰＳ細胞はコロニーを優位に形成していた。
これらの結果から、ＲＯＣＫ阻害剤等の低分子が透析チューブの膜を透過することが示された。また、透析チューブ中の培地成分の濃度を維持したまま、ｉＰＳ細胞を培養できることが示された。
（実施例７）
実施例３と同じｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地、及びｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を用意した。
フィーダー細胞上でｉＰＳ細胞を培養している６ウェルディッシュにＣＴＫ溶液を３００μＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ中で３分インキュベートした。３分後、インキュベータからディッシュを取り出し、フィーダー細胞のみが剥がれていることを確認し、アスピレータを用いてＣＴＫ溶液を取り除いた。ＣＴＫ溶液を取り除いた後、６ウェルディッシュにＰＢＳを５００μＬ添加し、細胞を洗浄後、６ウェルディッシュからＰＢＳを取り除き、０．３ｍＬのＡｃｃｕｍａｘを６ウェルディッシュに添加し、６ウェルディッシュをＣＯ2インキュベータに入れ、５分間インキュベートした。その後、０．７ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を６ウェルディッシュに添加し、ｉＰＳ細胞をシングルセルになるまで懸濁した。
ｉＰＳ細胞を懸濁後、４ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬの遠心チューブに添加し、遠心機を用いてｉＰＳ細胞懸濁液を２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を取り除き、１ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を遠心チューブに添加し、血球計算版を用いて細胞数を計算した。
その後、５×１０5個のｉＰＳ細胞を含有する２ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を透析モジュールの透析チューブに入れた。さらに、透析モジュールを５０ｍＬ遠心チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５２０７０）に入れ、遠心チューブ内の透析チューブの周囲に２０ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を入れた。さらに、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地に１０μｍｏｌ／ＬのＲＯＣＫ阻害剤を添加した。その後、２日に１回、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を新鮮なゲル培地に１０ｍＬ交換し、７日間浮遊培養を続けた。なお、交換の際に新たに入れられるｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地は１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤を含んでいた。また、一部の遠心チューブにおいては、コントロールとして、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を交換することなく、７日間浮遊培養を続けた。
図２１（ｂ）に示すように、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を新鮮なゲル培地に交換しなかった場合と比較して、図２１（ａ）に示すように、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を交換した場合、図２２に示すように、ｉＰＳ細胞が形成する個々のコロニーが大きいことが示された。これらの結果から、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地の交換が、ｉＰＳ細胞の増殖能を促進することが示された。
さらに、７日間浮遊培養したｉＰＳ細胞のコロニーをフィーダー細胞上に再播種し、コロニーの形態からｉＰＳ細胞の未分化性維持を確認した。図２３及び図２４に示すように、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を交換した場合も、交換しなかった場合も、８０％以上のコロニーが未分化の状態を維持していた。
（実施例８）
実施例３と同じｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地、及びｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を用意した。
フィーダー細胞上でｉＰＳ細胞を培養している６ウェルディッシュにＣＴＫ溶液を３００μＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ中で３分インキュベートした。３分後、インキュベータからディッシュを取り出し、フィーダー細胞のみが剥がれていることを確認し、アスピレータを用いてＣＴＫ溶液を取り除いた。ＣＴＫ溶液を取り除いた後、６ウェルディッシュにＰＢＳを５００μＬ添加し、細胞を洗浄後、ＰＢＳを取り除き、０．３ｍＬのＡｃｃｕｍａｘを６ウェルディッシュに添加し、６ウェルディッシュをＣＯ2インキュベータに入れ、５分間インキュベートした。その後、０．７ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を６ウェルディッシュに添加し、ｉＰＳ細胞をシングルセルになるまで懸濁した。
ｉＰＳ細胞を懸濁後、４ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬの遠心チューブに添加し、遠心機を用いてｉＰＳ細胞懸濁液を２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を取り除き、１ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を遠心チューブに添加し、血球計算版を用いて細胞数を計算した。
その後、５×１０5個のｉＰＳ細胞を含有する２ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を透析モジュールの透析チューブに入れた。さらに、透析モジュールを５０ｍＬ遠心チューブに入れ、遠心チューブ内の透析チューブの周囲に２０ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を入れた。さらに、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地に１０μｍｏｌ／ＬのＲＯＣＫ阻害剤を添加した。その後、２日に１回、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を新鮮なゲル培地に１０ｍＬ交換し、７日間浮遊培養を続けた。なお、交換の際に新たに入れられるｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地は１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤を含んでいた。
また、第１のコントロールとして、５×１０5個のｉＰＳ細胞を含有する２ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を透析モジュールの透析チューブに入れた。さらに、透析チューブを５０ｍＬ遠心チューブに入れ、遠心チューブ内の透析チューブの周囲に２０ｍＬのジェランガム及びｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を入れた。さらに、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ及びジェランガム非含有ヒトｉＰＳ培地に１０μｍｏｌ／ＬのＲＯＣＫ阻害剤を添加した。その後、２日に１回、透析チューブの周囲のｂＦＧＦ及びジェランガム非含有ヒトｉＰＳ培地を新鮮な培地に１０ｍＬ交換し、７日間浮遊培養を続けた。
さらに、第２のコントロールとして、透析チューブを用いることなく、５×１０5個のｉＰＳ細胞を含有する２ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を５０ｍＬ遠心チューブに入れた。その後、毎日１回、５０ｍＬ遠心チューブに５００μＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を追加し、７日間浮遊培養を続けた。
その結果、図２５及び図２６に示すように、透析チューブを用いなかった場合と比較して、透析チューブを用いた場合のほうが、ｉＰＳ細胞のコロニー数が増えていた。さらに、透析チューブの周囲にｂＦＧＦ及びジェランガム非含有ヒトｉＰＳ培地を用いた場合と比較して、透析チューブの周囲にｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を用いたほうが、ｉＰＳ細胞のコロニー数が増えていた。
（実施例９：ポリマー培地におけるｉＰＳ細胞の誘導）
５００ｍＬのＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ) 及び０．２ｍＬの濃度が１０μｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ ＰＨＧ０２６６）を混合し、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を調製した。また、５００ｍＬのＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ)にｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ ＰＨＧ０２６６）を混合しなかったｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を調製した。さらに、市販の血清フリーのフィーダーフリー培地を用意した。
また、ｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地、市販の血清フリーのフィーダーフリー培地に脱アシル化ジェランガム（日産化学）を濃度が０．０２重量％となるよう添加し、ｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地、比較用ゲル培地を調製した。
レトロウイルスを用いてＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣをヒト繊維芽細胞に導入し、７日間浮遊培養後、１×１０5個の細胞をｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地に懸濁し、ｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地、比較用ゲル培地中で培養した。その結果、ｉＰＳ細胞が作製された。その図を図２７に示す。そこで、ｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地中で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、二日後にコロニーの形態を確認したところ、図２８（ａ）に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーであった。さらにＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧの抗体で染色をしたところ、図２８（ｂ）及び図２８（ｃ）に示すように、陽性であった。このことから、ｉＰＳ細胞をポリマー培地中で誘導できることが示された。
（実施例１０：ポリマー培地で誘導されたｉＰＳ細胞のクローナリティ）
ポリマー培地で誘導されたｉＰＳ細胞を培養している６ｃｍディッシュにＣＴＫ溶液を３００μＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ中で３分インキュベートした。３分後、インキュベータからディッシュを取り出し、フィーダー細胞のみがはがれていることを確認し、アスピレータを用いてＣＴＫ溶液を取り除いた。ＣＴＫ溶液を取り除いた後、ディッシュにＰＢＳを５００μL添加し、ｉＰＳ細胞を洗浄後、ＰＢＳを取り除き、０．３ｍＬの剥離液（Ａｃｃｕｍａｘ）をディッシュに添加し、ＣＯ2インキュベータに入れ、５分間インキュベートした。その後、０．７ｍＬのｂＦＧＦ非含有ｉＰＳ培地をディッシュに添加し、ｉＰＳ細胞をシングルセルになるまで懸濁した。
ｉＰＳ細胞を懸濁後、４ｍＬのｂＦＧＦ非含有ｉＰＳ培地を遠心チューブに添加し、遠心機を用いて２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を取り除き、１ｍＬのｂＦＧＦ非含有ｉＰＳ培地を添加し、血球計算版を用いて細胞数を計算した。細胞計算後、２．５×１０5個ずつｉＰＳ細胞をＣｅｌｌ ｅｘｐｌｏrｅｒ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ Ｒｅｄ及びｃｅｌｌ ｅｘｐｌｏｌｅｒ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ Ｇｒｅｅｎ（ＡＡＴ ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を用いて染色した。染色後、各染色した細胞を混合し、５×１０5個ずつｉＰＳ細胞を非接着ディッシュ又は１５ｍＬチューブに播種し、以後攪拌することなく浮遊培養した。１５ｍＬチューブにおいては、ｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を２ｍＬ用いた。非接着ディッシュにおいては、ゲル化していないｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を２ｍＬ用いた。各培地にはＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｓ１０４９）を濃度が１０μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加した。その後、１５ｍＬチューブ及び非接着ディッシュに、毎日５００μＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を添加した。なお、交換の際に新たに入れられるｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地は１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤を含んでいた。また、１５ｍＬチューブ及び非接着ディッシュに、毎日、終濃度が１０μｍｏｌ／ＬとなるようＲＯＣＫ阻害剤を添加し、７日間、浮遊培養を続けた。
その結果、図２９（ａ）に示すように、非接着ディッシュにおいてジェランガムを含まない培地を用いてｉＰＳ細胞を培養した場合、異なる染色をされたｉＰＳ細胞コロニー同士の凝集が顕著に認められた。定量したところ、４０％以上の細胞が凝集していた。これに対し、１５ｍＬチューブ中において、ｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を用いてｉＰＳ細胞を培養した場合、図２９（ｂ）に示すように、凝集は認められなかった。
（実施例１１）
ｉＰＳ細胞を懸濁後、４ｍＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬの遠心チューブに添加し、遠心機を用いてｉＰＳ細胞懸濁液を２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を取り除き、１ｍＬのｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬの遠心チューブに添加し、血球計算版を用いて細胞数を計算した。細胞計算後、５×１０5個ずつｉＰＳ細胞を１５ｍＬファルコンチューブ（登録商標、Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５２０９６）又は非接着ディッシュに播種し、以後攪拌することなく浮遊培養した。
培地は、ｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳゲル培地またはジェランガムを含有しないｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を２ｍＬ用いて、チューブまたは非接着ディッシュで５日から７日間培養した。各培地にはＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｓ１０４９）が１０μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加した。その後、１５ｍＬチューブ及び非接着ディッシュに、毎日５００μＬのジェランガムを含むｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地または、ジェランガムを含まないｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地を添加した。また、１５ｍＬチューブ及び非接着ディッシュに、毎日、終濃度が１０μｍｏｌ／ＬとなるようＲＯＣＫ阻害剤を添加し、５日から７日間、浮遊培養を続けた。
図３０（ａ）は、ｉＰＳ細胞をチューブで、ジェランガムを含まないｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地で培養した写真である。この場合、ｉＰＳ細胞が沈殿して培養は不可能であった。図３０（ｂ）は、ｉＰＳ細胞をチューブで、ジェランガムを含むｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地で培養した写真である。この場合、ｉＰＳ細胞の沈殿や凝集は起きなかった。図３０（ｃ）は、ｉＰＳ細胞をディッシュで、ジェランガムを含まないｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地で培養した写真である。この場合、ｉＰＳ細胞が凝集して培養は不可能であった。図３０（ｄ）は、ｉＰＳ細胞をディッシュで、ジェランガムを含むｂＦＧＦ含有ヒトｉＰＳ培地で培養した写真である。この場合、ｉＰＳ細胞が凝集して培養は不可能であった。
（実施例１２）
実施例３と同じｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地、及びｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を用意した。また、市販の血清フリーのフィーダーフリー培地を用意した。
さらに、上部開口の直径が０．８ｍｍで、下部開口の直径が０．５ｍｍである貫通孔が格子状に複数設けられた格子プレート（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ＭＰｓ ５００及びＭＰｃ５００、クラレ）を用意した。
フィーダー細胞上でｉＰＳ細胞を培養している６ウェルディッシュにＣＴＫ溶液を３００μＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ中で３分インキュベートした。３分後、インキュベータからディッシュを取り出し、フィーダー細胞のみが剥がれていることを確認し、アスピレータを用いてＣＴＫ溶液を取り除いた。ＣＴＫ溶液を取り除いた後、ディッシュにＰＢＳを５００μＬ添加し、細胞を洗浄後、ＰＢＳを取り除き、０．３ｍＬのＡｃｃｕｍａｘをディッシュに添加し、ディッシュをＣＯ2インキュベータに入れ、５分間インキュベートした。その後、０．７ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地をディッシュに添加し、ｉＰＳ細胞をシングルセルになるまで懸濁した。
その後、４ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を１５ｍＬの遠心チューブに添加し、遠心機を用いてｉＰＳ細胞懸濁液を２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を取り除き、１ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳ培地を遠心チューブに添加し、血球計算版を用いて細胞数を計算した。
その後、２．５×１０5個ずつｉＰＳ細胞を格子プレートにまき、２日間、格子プレートの各貫通孔を用いて懸滴型（ハンギングドロップ型）の培養して、図３１（ａ）に示すような均一な大きさのコロニーを形成させた。次に、均一な大きさのコロニーを２ｍＬのｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地に入れ、コロニーを含むｂＦＧＦ非含有ヒトｉＰＳゲル培地を透析モジュールの透析チューブに入れた。さらに、透析モジュールを５０ｍＬ遠心チューブに入れ、遠心チューブ内の透析チューブの周囲に２０ｍＬのジェランガムを含まない市販の血清フリーのフィーダーフリー培地を入れた。その後、２日に１回、透析チューブの周囲のジェランガムを含まない市販の血清フリーのフィーダーフリー培地を新鮮な培地に１０ｍＬ交換し、７日間浮遊培養を続けた。なお、交換の際に入れられる培地は、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤を含んでいた。
７日間の浮遊培養の後、図３１（ｂ）及び図３２に示すように、ｉＰＳ細胞のコロニーが大きくなっていることが観察された。これらの結果から、コロニーにおいてｉＰＳ細胞が増殖していることが示された。
さらに、浮遊培養したｉＰＳ細胞コロニーをフィーダー細胞上に再播種し、３日後、コロニーの形態からｉＰＳ細胞の未分化性維持を確認した。その結果、図３３及び図３４に示すように全てのコロニーが未分化であった。したがって、格子プレートでｉＰＳ細胞のコロニーを均一な大きさにし、その後、ｉＰＳ細胞の未分化の状態を維持したままポリマー培地中で培養できることが示された。
（第５の実施の形態）
本発明の実施の形態に係る人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の作製方法は、体細胞を用意することと、体細胞に初期化因子をコードしているＲＮＡをリポフェクション法により導入することと、を含む。
体細胞は、例えば血液細胞である。血液細胞は、血液から分離される。血液は、例えば末梢血及び臍帯血であるが、これらに限定されない。血液は、成年から採取されてもよいし、未成年から採取されてもよい。採血の際には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ）液等の抗凝固剤を用いる。
血液細胞は、例えば、単核球細胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、好中球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球等の有核細胞であり、赤血球、顆粒球、及び血小板を含まない。血液細胞は、例えば血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞である。
単核球細胞は、血液細胞の分離用媒体、及び遠心分離装置等を用いて、血液から分離される。血液細胞の分離用媒体としてＦｉｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから１０μＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液が固まらないように血液にＥＤＴＡを含むキレート剤を加えて優しく混ぜる。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注する。５ｍＬの血液に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層する。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加える。
チューブ中の溶液を、１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは４００×ｇで、４℃から４２℃好ましくは１８℃で５分から２時間、好ましくは３０分間遠心する。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れる。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移す。この際、下層は吸い取らないようにする。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できる。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移す。
回収した単核球細胞に対し、１ｍＬから４８ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは２００×ｇ、４℃から４２℃、好ましくは１８℃で１分から６０分、好ましくは１０分間遠心する。その後、アスピレータを用いて溶液の上清を吸引して除去し、１ｍＬから１２ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
採血管としてバキュテイナ（登録商標、ＢＤ）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃、好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから、採血管（バキュテイナ（登録商標）、ＢＤ）を用いて８ｍＬ採血し、転倒混和して抗凝固剤と混和する。その後、バランスを調整し、溶液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは１５００×ｇから１８００×ｇでスイングロータで１分から６０分、好ましくは２０分間遠心する。遠心後、血漿層である上層を取り除き、ピペッティングして単核球層とゲルに張り付いている血球を懸濁して懸濁液を得る。得られた懸濁液を、別の１５ｍＬチューブに移す。
１５ｍＬチューブの懸濁液に１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、懸濁液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、好ましくは５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去する。また、溶血剤（ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（登録商標）、１０倍濃度、ＢＤ）を滅菌水で１倍濃度に希釈する。１５ｍＬチューブ中のペレットをタッピングでほぐし、１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１ｍＬの溶血剤を加える。その後、室温で遮光し、１分間から６０分間、好ましくは１分間溶液を静置する。
次に、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、４℃から４２℃、好ましくは室温で、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、好ましくは５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去し、１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
血液から単核球細胞を分離する方法は、上記の方法に限られず、例えば、透析膜を使用して、血液から単核球を分離してもよい。また、全血単核球濃縮用ピュアセルセレクトシステム（登録商標、ＰＡＬＬ）、血球細胞除去用浄化器（セルソーバＥ、登録商標、旭化成）、及び血小板製剤用白血球除去フィルター（セパセルＰＬ、登録商標、ＰＬＸ－５Ｂ－ＳＣＤ、旭化成）等も使用可能である。
また、単核球細胞としては、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社から販売されているＣＴＬ－ＵＰ１や、Ｓａｎｇｕｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＢＭＣ－００１等を使用してもよい。
あるいは、血液細胞としては、セルバンカー１、ステムセルバンカー ＧＭＰグレード、及びステムセルバンカー ＤＭＳＯフリー ＧＭＰグレード（ゼノアック）等の細胞凍結保存液を用いて凍結保存された血液細胞を解凍して用いてもよい。
単核球細胞を解凍する際には、まず、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは８ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を入れておき、凍結した単核球細胞の入ったチューブを４℃から４２℃、好ましくは３７℃の温浴槽にいれて、単核球細胞を溶かし始める。その後、少し氷が残っている状態で、単核球細胞の入ったチューブを温浴槽から引きあげ、単核球細胞を既知組成無血清造血細胞培地の入ったチューブに移す。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
血液細胞は、細胞表面マーカーに基づいて分離されてもよい。血液幹・前駆細胞は、ＣＤ３４が陽性である。Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８のいずれかが陽性である。Ｂ細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０のいずれかが陽性である。血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞は、例えば、自動磁気細胞分離装置を用いて、血液細胞から分離される。あるいは、予め分離された単核球細胞を用意してもよい。ただし、細胞表面マーカーに基づいて分離されていない血液細胞に、初期化因子ＲＮＡを導入してもよい。
ＣＤ３４陽性細胞は、幹・前駆細胞であり、リプログラミングされやすい傾向にある。また、ＣＤ３陽性細胞であるＴ細胞を用いてｉＰＳ細胞を作製すると、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞はＴＣＲリコンビネーションの型を保持しているので、Ｔ細胞に効率的に分化誘導できる傾向にある。
ＣＤ３４陽性細胞の分離方法は、以下のとおりである。
１０ｍＬの無血清培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１０μＬのＩＬ－６（１００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＳＣＦ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＴＰＯ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＦｌｔ３リガンド（３００μｇ／ｍＬ）、及び１０μＬのＩＬ－３（１０μｇ／ｍＬ）を加えて血球培地（血液幹・前駆細胞培地）を調製する。
６ウェルプレートの１ウェルに１ｍＬから６ｍＬ、好ましくは２ｍＬの血球培地を入れる。また、培地の蒸発を防ぐために、他の５ウェルのそれぞれに１ｍＬから６ｍＬ、２ｍＬのＰＢＳを入れる。その後、６ウェルプレートを４℃から４２℃、好ましくは３７℃のインキュベータに入れて温める。
２０ｍＬのＰＢＳに対し、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは８０μＬのＥＤＴＡ（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは２００μＬのＦＢＳを加えたカラムバッファを用意する。１×１０4から１×１０9個、好ましくは２×１０7個の単核球細胞を含有する単核球細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに分注し、単核球細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１０分間遠心する。遠心後、上清を除き、単核球細胞を１００μＬから１ｍＬ、好ましくは３００μＬのカラムバッファで懸濁する。
１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＣＤ３４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加える。ＦｃＲブロッキング試薬は、マイクロビーズ標識の特異性を高めるために用いられる。その後、単核球細胞懸濁液を混和して、４℃から４２℃、好ましくは４℃で１分から２時間、好ましくは３０分間静置する。
次に、１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬのカラムバッファを加えて希釈し、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、１５ｍＬチューブ中の上清をアスピレータで除き、１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを加えて再懸濁する。
自動磁気細胞分離装置用のカラム（ＭＳカラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を自動磁気細胞分離装置（ＭｉｎｉＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に取り付け、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて洗浄する。次に、単核球細胞をカラムに入れる。さらに、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて、カラムを１回から１０回、好ましくは３回洗浄する。その後、カラムを自動磁気細胞分離装置から外し、１５ｍＬチューブに入れる。次に、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは１０００μＬのカラムバッファを入れ、速やかにシリンジを押してＣＤ３４陽性細胞を１５ｍＬチューブに流出させる。
１０μＬのＣＤ３４陽性細胞懸濁液をトリパンブルーで染めて、細胞数を血球計算版でカウントする。また、１５ｍＬチューブ中のＣＤ３４陽性細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除く。さらに、温めておいた血球培地でＣＤ３４陽性細胞を再懸濁し、ＣＤ３４陽性細胞を培養プレートにまく。その後、４℃から４２℃、好ましくは３７℃、１％から２０％、好ましくは５％ＣＯ2でＣＤ３４陽性細胞を６日間培養する。この間、培地交換はしなくてもよい。
ＣＤ３４以外のマーカーで細胞を単離する方法は、ＣＤ３４陽性細胞を単離する方法と同様である。
初期化因子ＲＮＡを導入される血液細胞は、例えばＴ細胞培地又は血液幹・前駆細胞培地で培養される。Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞を作製する場合は、Ｔ細胞培地を用い、ＣＤ３４陽性細胞からｉＰＳ細胞を作製する場合は、血液幹・前駆細胞培地を用いる。培養条件は、例えば、ＣＯ2濃度が５％、酸素濃度が２５％以下、及び温度が３７℃以下である。
初期化因子ＲＮＡを導入される血液細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、あるいはＬａｍｉｎｉｎ５１１ （ｎｉｐｐｉ）等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養する。
培養液としては、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ （登録商標）ＸＦ／ＦＦ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ａｎｄ ＥＳ Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ－Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｆｅｅｄｅｒ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、及びＬ７（登録商標）ｈＰＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＬＯＮＺＡ）等を利用してもよい。
浮遊培養で行なう場合は、血液細胞をスピナーフラスコに入れて攪拌培養する。あるいは、血液細胞を０．００１％から１０％のジェランガム溶液、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、及びラムナン硫酸、並びにそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物、又は温度感受性ゲルに入れて培養してもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
温度感受性ゲルは、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、ポリイソプロピルアクリルアミド、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくとも１種を含んでいてもよい。
培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
血液細胞には、初期化因子ＲＮＡが導入される。初期化因子ＲＮＡは、例えば、Ｏｃｔ３／４のｍＲＮＡ、Ｓｏｘ２のｍＲＮＡ、Ｋｌｆ４のｍＲＮＡ、及びｃ－ＭｙｃのｍＲＮＡを含む。また、初期化因子ＲＮＡは、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＦＯＸＨ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、E－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、及びＴＨ２Ｂからなる群から選択される少なくとも一つの因子のｍＲＮＡをさらに含んでいてもよい。これらのｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。
ｍＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）、５－メチルウリジン（５ｍｅＵ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５－フォーミルウリジン（５ｆＵ）、５－カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、チエノグアノシン（ｔｈＧ）、Ｎ４－メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－メトキシチジン（５ｍｏＣ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５－ヒドロキシシチジン（５ｈｏＣ）、５－フォルムシチジン（５ｆＣ）、５－カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、Ｎ６－メチル－２－アミノアデノシン（ｍ６ＤＡＰ）、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’－ＯＵ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、及びＮ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つで修飾されていてもよい。
ｍＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。
ｍＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製されてもよい。ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、ＩＶＴの間にポリアデニル化されてもよい。ｍＲＮＡがキャッピングされてもよい。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のｍＲＮＡ分子がキャップを含有することが好ましい。ｍＲＮＡは５’ｃａｐ［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］構造を有していてもよい。当該配列はｍＲＮＡを安定化させ、ｍＲＮＡ転写を促進させる。５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅをもつｍＲＮＡからは、脱リン酸化処理により５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを取り除いてもよい。ｍＲＮＡはＡｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）として［３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］を有していてもよい。ＡＲＣＡは転写開始点より前に挿入される配列であり、転写されるｍＲＮＡの効率は二倍となる。ｍＲＮＡはＰｏｌｙＡテールを有していてもよい。
また、ｍＲＮＡは、自己増殖能を持つリプリケイティブＲＮＡであってもよい。リプリケイティブＲＮＡとは、自己増殖能を持つＲＮＡであり、通常のＲＮＡと異なり、ＲＮＡの複製に必要なタンパク質を発現させる能力を併せ持っている。リプリケイティブＲＮＡはアルファウイルスであるベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス由来である。リプリケイティブＲＮＡを細胞にリポフェクションすると、リプログラミング因子を作り続けるＲＮＡを細胞に発現させることができるため、毎日ＲＮＡを添加する必要を省くことが可能となる。
リプリケイティブＲＮＡの配列は、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、エバーグレーズ（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ）ウイルス、ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、及び西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）からなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
また、リプリケイティブＲＮＡは、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）ウイルス、チクングニア（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、オニョンニョン（Ｏ’ｎｙｏｎｇ－ｎｙｏｎｇ）ウイルス、ロスリバー（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、バーマフォレスト（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ゲタ（Ｇｅｔａｈ）ウイルス、サギヤマ（Ｓａｇｉｙａｍａ）ウイルス、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス、ウナ（Ｕｎａ）ウイルス、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス、ババンキ（Ｂａｂａｎｋｉ）ウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、ハイランドＪ（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ）ウイルス、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、及びバギークリーク（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ）ウイルスからなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
リプリケイティブＲＮＡは、５’から３’に向かって、（ＶＥＥ ＲＮＡレプリカーゼ）－（プロモーター）－（ＲＦ１）－（自己切断型ペプチド）－（ＲＦ２）－（自己切断型ペプチド）－（ＲＦ３）－（ＩＲＥＳもしくはコアプロモーター）－（ＲＦ４）－（ＩＲＥＳもしくは任意のプロモーター）－（任意に選択可能なマーカー）－（ＶＥＥ ３’ＵＴＲ及びポリＡテール）－（任意に選択可能なマーカー）－プロモーターを含んでおり、上記のＲＦ１－４は、多能性細胞への体細胞の脱分化を誘導する因子であって、上記のＲＦ２－３、ＲＦ３－４、ＲＦ４は任意であり、上記のＲＦ１－４は、Ｏｃｔ－４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ－２、ｃ－Ｍｙｃ、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＦＯＸＨ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、及びＴＨ２Ｂからなる群から選択されてもよい。
初期化因子ＲＮＡは、例えばリポフェクション法により血液細胞に導入される。リポフェクション法とは、陰性荷電物質である核酸と、陽性荷電脂質と、の複合体を、電気的な相互作用により形成し、複合体をエンドサイトーシスや膜融合により細胞内に取り込ませる方法である。リポフェクション法は、細胞へのダメージが少なく、導入効率に優れており、操作が簡便であり、時間がかからない等の利点を有する。
初期化因子ＲＮＡのリポフェクションには、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）或いはリポフェクション試薬が用いられる。ＲＮＡのリポフェクション試薬としては、ｓｉＲＮＡのリポフェクション試薬及びｍＲＮＡのリポフェクション試薬が使用可能である。より具体的には、ＲＮＡのリポフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等が使用可能である。
初期化因子ＲＮＡのリポフェクションの際の血液細胞数は、例えば、１個から１×１０8個、１×１０4個から５×１０6個、あるいは５×１０5個から５×１０6個である。１ｍＬの培養液あたり、リポフェクションの際の初期化因子ＲＮＡの量は、例えば、１回あたり５ｎｇから５０μｇ、５０ｎｇから１０μｇ、あるいは６００ｎｇから３μｇである。また、リポフェクションの際のリポフェクション試薬の量は、例えば、１回あたり０．１μＬから５００μＬ、１μＬから１００μＬ、あるいは１μＬから４０μＬである。初期化因子のリポフェクションは、１回あたり０．１時間以上２４時間以下、２時間以上２１時間以下、１２時間３０分以上１８時間３０分以下、あるいは１８時間行う。例えば、１２ウェルプレートを用い、細胞数が４×１０5個である場合、６μＬのＲＮＡｉＭＡＸ又は３μＬのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを用いる。
初期化のリポフェクションは、例えば、２日に１回、あるいは１日に１回、５日間以上９日間以内、６日間以上８日間以内、あるいは７日間繰り返して行う。ただし、ｍＲＮＡがリプリケイティブＲＮＡである場合、リポフェクションは１回でもよい。初期化因子ＲＮＡのリポフェクションの際に用いられる培地は、例えばＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標、Ｇｉｂｃｏ）等の低血清培地である。
血液細胞が人工多能性幹細胞に誘導（リプログラミング）されたか否かは、例えば、サイトフローメータで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＳＥＡ－１、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行う。ＴＲＡ－１－６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原であり、体細胞では検出されない。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ－１－６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞はｉＰＳ細胞の種と考えられる。
以上説明した本発明の実施の形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法においては、初期化因子を発現させることができるＲＮＡを血液細胞等の体細胞に導入して、初期化因子を発現させ、人工多能性幹細胞を作製している。そのため、体細胞のＤＮＡに初期化因子が取り込まれることなく、人工多能性幹細胞を作製することが可能である。
従来の人工多能性幹細胞の作製方法においては、体細胞ＤＮＡへ初期化因子を挿入しているため、ゲノムに傷がつき、細胞の癌化の原因となっている。これに対し、本発明の実施の形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法においては、初期化因子をコードしているＲＮＡを用いているため、ゲノムへ遺伝子が挿入することなく、人工多能性幹細胞を作製することが可能であり、これに伴う癌化の可能性がない。そのため、本発明の実施の形態に係る作製方法で作製された人工多能性幹細胞は、臨床利用可能な細胞の適正製造基準を満たし得る。
また、従来のレトロウイルス又はレンチウイルスを用いる人工多能性幹細胞の作製方法においては、作製された人工多能性幹細胞にウイルスが残存する。これに対し、本発明の実施の形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法においては、初期化因子ＲＮＡをリポフェクションにより導入するため、ウイルスを必要としない。そのため、作製される人工多能性幹細胞にウイルスが残存しない。この点においても、本発明の実施の形態に係る作製方法で作製された人工多能性幹細胞は、臨床利用可能な細胞の適正製造基準を満たし得る。
さらに、従来のエレクトロポレーションを用いる人工多能性幹細胞の作製方法は、細胞へのダメージが大きく、多数の細胞を誘導前に破壊する。これに対し、本発明の実施の形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法が用いるリポフェクションは、細胞へのダメージが少なく、多数の細胞を誘導前に破壊することがない。また、リポフェクションは、高価な機器を必要とせず、工程が簡便である。
また、繊維芽細胞から人工多能性幹細胞を作製する場合、高侵襲なバイオプシーを行って皮膚の細胞を採取する必要がある。これに対し、本発明の実施の形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法においては、血液細胞は低侵襲な採血によって採取することが可能である。また、一般に、採血からは、人工多能性幹細胞の作製に必要な十分な数の血液細胞が得られる。そのため、繊維芽細胞のように、血液細胞を人工多能性幹細胞に誘導する前に増殖させる必要がない。さらに、増殖培養時に生じうるＤＮＡに傷が入るリスクも、血液細胞では生じない。またさらに、血液細胞は、皮膚細胞と異なり、外気に触れずに採取することが可能である。そのため、採血の段階からクリーンな閉鎖系の中で、血液細胞を人工多能性幹細胞に誘導することが可能である。この点においても、血液細胞は、臨床利用に適している。
（実施例１３）
（準備）
ヒト血液細胞は健康な成人男性から入手した。また、修飾化ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ社）、非接着ディッシュ、１５ｍＬチューブ、５０ｍＬチューブ、フィコール、サイトフローメータ（ＢＤ）、ＣＤ３４に対する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ３に対する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＭＡＣＳ（登録商標）バッファ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、Ｔ細胞培地、低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）、ｓｉＲＮＡ導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｃｅ）、及びＴＲＡ－１－６０に対する抗体（ＢＤ）を用意した。
Ｔ細胞（ＣＤ３陽性細胞）培地は、以下Ａ培地とＢ培地の混合液であった。Ａ培地は、１５ｍＬのＸ ｖｉｖｏ－１０（Ｌｏｎｚａ社、０４－７４３Ｑ）及びＩＬ－２（１０μｇ／ｍＬ）の混合液であった。Ｂ培地は１．５ｍＬチューブにＸ ｖｉｖｏ－１０及びＤｙｎａｂｅａｄｓＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社， １１１－３１Ｄ）５０μＬを混合し、５秒間ボルテックス後、スピンダウンし、ＤｙｎａＭａｇ－２（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に静置し、一分静置後、上清を取り除いたものであった。
また、１０ｍＬの無血清培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１０μＬのＩＬ－６（１００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＳＣＦ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＴＰＯ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＦｌｔ３リガンド（３００μｇ／ｍＬ）、及び１０μＬのＩＬ－３（１０μｇ／ｍＬ）を加えて血球培地（血液幹・前駆細胞培地）を調製した。
また、それぞれ濃度が１００ｎｇ／μＬのＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ含有液、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ含有液、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ含有液、ｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡ含有液、ＬＩＮ２８ＡのｍＲＮＡ含有液、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｍＲＮＡ含有液を用意した。次に、３８５μＬのＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ含有液、１１９μＬのＳＯＸ２のｍＲＮＡ含有液、１５６μＬのＫＬＦ４のｍＲＮＡ含有液、１４８μＬのｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡ含有液、８３μＬのＬＩＮ２８ＡのｍＲＮＡ含有液、及び１１０μＬのＧＦＰのｍＲＮＡ含有液を混合し、初期化因子混合液を得た。得られた初期化因子混合液を５０μＬずつ容量１．５ｍＬのＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅのチューブ（エッペンドルフチューブ（登録商標）、エッペンドルフ）に分注し、－８０℃の冷凍庫に保存した。
（単核球細胞の調製）
遠心機を１８℃に設定した。５ｍＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液にＥＤＴＡを加えて優しく混ぜた。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注した。５ｍＬのＰＢＳを血液に加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層した。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加えた。
チューブ中の溶液を、４００×ｇ、１８℃で３０分間遠心した。この際、加速、減速ともゆっくり行った。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れた。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移した。この際、下層は吸い取らないようにした。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できた。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移した。
回収した単核球細胞に対し、１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに２００×ｇ、１８℃で１０分間遠心した。その後、アスピレータを用いて溶液の上清を吸引して除去し、３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得た。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントした。
（ＣＤ３４又はＣＤ３陽性細胞の分離）
１×１０7個の単核球細胞と、ＣＤ３４抗体又はＣＤ３抗体と、を、４℃の溶液１００μＬ中で１５分反応させた。反応後、溶液に５ｍＬのＭＡＣＳ（登録商標）バッファ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を除去し、１ｍＬのＭＡＣＳバッファを添加した。その後、自動磁気細胞分離装置（ａｕｔｏＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の分離プログラムを利用して、単核球細胞のうち、ＣＤ３４陽性細胞又はＣＤ３陽性細胞を分離した。
（分離した細胞の培養）
分離した５×１０6個の単核球細胞を１ｍＬのＴ細胞培地、又は血液幹・前駆細胞培地に懸濁し、１２ウェルプレートに播種し、培養した。培養条件は、ＣＯ2濃度が５％、酸素濃度が１９％、及び温度が３７℃であった。
（初期化因子のリポフェクション）
１００μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）と２５μＬの初期化因子混合液を混合し、第１の混合液とした。また、１１２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）と１２．５μＬのｓｉＲＮＡ導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｃｅ）を混合し、第２の混合液とした。その後、第１の混合液と、第２の混合液と、を混合し、１５分室温で静置してリポフェクション反応液とした。
得られたリポフェクション反応液のうち６０μＬを単核球細胞を培養している１２ウェルプレートに穏やかに添加し、引き続き、３７℃で１８時間、単核球細胞をフィーダーフリーで培養した。培養条件は、ＣＯ2濃度が５％、酸素濃度が１９％、及び温度が３７℃であった。リポフェクション反応液を添加した時の単核球細胞の密度は３×１０6であった。１８時間後、単核球細胞を１５ｍＬチューブに回収し、３００ｇで遠心し、上清を除去した。その後、１．２５ｍＬのＣＤ３４用血球培地を１５ｍＬチューブに添加して、単核球細胞懸濁液を同じ１２ウェルプレートに戻し、一晩３７度で単核球細胞をフィーダーフリーで培養した。培養条件は、ＣＯ2濃度が５％、及び酸素濃度が１９％であった。上記工程を２日に１回、７日間繰り返した。
（ＧＦＰの発現の確認）
リポフェクションを開始してから７日目に、リポフェクションを合計４回した細胞の密度は、３×１０6であった。細胞の一部を１２ウェルプレートから取り出し、蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現を確認したところ、図３５に示すように、ＧＦＰの発現が確認された。これにより、単核球細胞にｍＲＮＡがトランスフェクションし、トランスフェクトされたｍＲＮＡからタンパク質が合成されていることが確認された。
（ＴＲＡ－１－６０の発現の確認）
リポフェクションを開始してから７日目に、細胞の一部を１２ウェルプレートから取り出し、取り出した細胞を初期化され始めた細胞で特異的に発現する表面抗原であるＴＲＡ－１－６０対する抗体であって、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）蛍光色素で標識された抗体で染色した。その後、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ（登録商標）、ＢＤ）で、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞の割合を確認することによって、細胞においてリプログラミングが開始され、ｉＰＳ細胞遺伝子が発現し、ｉＰＳ細胞ができてくる事を確認した。
図３６に示すように、自家蛍光の強度をｘ軸に、蛍光標識抗ＴＲＡ－１－６０抗体の蛍光強度をｙ軸にとったドットプロットを作成した。遺伝子を導入しなかったネガティブコントロールでは、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞は検出されなかった。これに対し、実験１，２及び３において、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞が検出された。なお、実験１では、マーカーによる分離をしていない単核球全体から誘導した結果であり、実験２は、ＣＤ３陽性で分離した細胞から誘導した結果であり、実験３は、ＣＤ３４陽性で分離した細胞から誘導した結果である。したがって、初期化因子ＲＮＡのリポフェクションを用いて、血液由来の細胞に初期化因子を導入し、ｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。
（第６の実施の形態）
本発明の実施の形態に係る動物細胞から体細胞を作製する方法は、動物細胞を用意することと、動物細胞に誘導因子リボ核酸（ＲＮＡ）をリポフェクションにより導入し、体細胞に分化させることと、を含む。
動物細胞は、幹細胞を含む。幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の両方が使用可能である。動物細胞は、ヒト繊維芽細胞又はヒト血液細胞であってもよい。
幹細胞を培養する培養液には、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、及びＴｅＳＲＥ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等を利用してもよい。
また、幹細胞を培養する培地はゲルを含んでいてもよい。ゲルは、脱アシル化ジェランガム、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、及びラムナン硫酸、並びに及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
ゲルは、温度感受性ゲルであってもよい。温度感受性ゲルは、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくとも１種であってもよい。
幹細胞を培養する培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
動物細胞から作製される体細胞は、例えば、神経系細胞であるが、これに限定されない、例えば、心筋、肝細胞、網膜、角膜細胞、及び血液細胞等の体細胞も作製可能である。神経系細胞を作製する場合、動物細胞に導入される誘導因子ＲＮＡは、例えば、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）のｍＲＮＡを含む。Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２）は、神経系細胞分化に必要なスイッチタンパク質である。誘導因子ＲＮＡは、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいてもよい。薬剤とは、例えばピューロマイシン、ネオマイシン、ブラストサイジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びゼオシン等の抗生物質である。誘導因子ＲＮＡが導入された細胞は、薬剤耐性を示す。
誘導因子ＲＮＡに含まれるｍＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）、５－メチルウリジン（５ｍｅＵ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５－フォーミルウリジン（５ｆＵ）、５－カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、チエノグアノシン（ｔｈＧ）、Ｎ４－メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－メトキシチジン（５ｍｏＣ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５－ヒドロキシシチジン（５ｈｏＣ）、５－フォルムシチジン（５ｆＣ）、５－カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、Ｎ６－メチル－２－アミノアデノシン（ｍ６ＤＡＰ）、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ又はｍ２’－ＯＵ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、及びＮ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つで修飾されていてもよい。
ｍＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。ｍＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製されてもよい。ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、ＩＶＴの間にポリアデニル化されてもよい。ｍＲＮＡがキャッピングされてもよい。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のｍＲＮＡ分子がキャップを含有してもよい。
ｍＲＮＡは５’ｃａｐ［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］構造を有していてもよい。当該配列はｍＲＮＡを安定化させ、転写を促進させる配列である。５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅをもつｍＲＮＡからは、脱リン酸化処理により５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを取り除いてもよい。ｍＲＮＡはＡｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）として［３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］を有していてもよい。ＡＲＣＡは転写開始点より前に挿入される配列であり、転写されるｍＲＮＡの効率は二倍となる。ｍＲＮＡはＰｏｌｙＡテールを有していてもよい。
誘導因子ＲＮＡは、例えば、Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（ＴｒｉLｉｎｋ、配列番号１に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡ）を含む。Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）をトランスフェクトされた細胞は、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）を産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていてもよい。５－メチルシチジン及びプソイドウリジンは、抗体によるｍＲＮＡの認識力を低下させる。また、配列番号２に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡを用いてもよい。配列番号２に記載のＤＮＡは、配列番号１のＤＮＡからｘｂａ１制限部位を除去したＤＮＡである。
誘導因子ＲＮＡは、リポフェクション法により動物細胞に導入される。リポフェクション法とは、陰性荷電物質である核酸と、陽性荷電脂質と、の複合体を、電気的な相互作用により形成し、複合体をエンドサイトーシスや膜融合により細胞内に取り込ませる方法である。リポフェクション法は、細胞へのダメージが少なく、導入効率に優れており、操作が簡便であり、時間がかからない等の利点を有する。
誘導因子ＲＮＡのリポフェクションには、リポフェクション試薬として、例えば、リポフェクタミン メッセンジャーマックス（登録商標）が用いられる。さらに、リポフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等を利用してもよい。
誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際の細胞の数は、例えば、１２ウェルプレートを利用する場合、１ウェルあたり１×１０4個から１×１０8個、５×１０4個から１×１０6個、あるいは１×１０5個から５×１０5個である。なお、１ウェルの底面積は４ｃｍ2である。誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際の誘導因子ＲＮＡの量は、１回あたり２００ｎｇから５０００ｎｇ、４００ｎｇから２０００ｎｇ、あるいは５００ｎｇから１０００ｎｇである。誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際のリポフェクション試薬の量は、０．１μＬから１００μＬ、１μＬから５０μＬ、あるいは１．５μＬから１０μＬである。
誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際に用いられる培地は、例えばＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標、Ｇｉｂｃｏ）等の低血清培地である。誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際、及びその前後に用いられる培地は、Ｂ１８Ｒタンパク質を含んでいてもよい。Ｂ１８Ｒタンパク質は、細胞の先天性抗ウイルス反応を緩和する。Ｂ１８Ｒタンパク質は、細胞へのＲＮＡの挿入時に伴う免疫反応に伴う細胞死を抑制するために使用されることがある。ただし、実施の形態に係る動物細胞から体細胞を作製する方法は、短期間で動物細胞を体細胞に分化させるため、培地はＢ１８Ｒタンパク質を含まなくともよく、あるいは、Ｂ１８Ｒタンパク質を０．０１％から１％のような薄い濃度で含有してもよい。
誘導因子ＲＮＡのリポフェクションから１０日以内、９日以内、８日以内、あるいは７日以内に動物細胞が体細胞に分化する。作製される体細胞が神経系細胞である場合、神経系細胞に分化したか否かは、Ｎｇｎ２、β－IIIＴｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、ＰｓＡ－ＮＣＡＭ、又はｖＧｌｕが陽性であるか否かによって確認される。Ｎｇｎ２は、神経系細胞分化に必要なスイッチタンパク質である。β－IIIＴｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、ＰｓＡ－ＮＣＡＭ、及びｖＧｌｕは、神経系細胞を標識するマーカーであり、神経細胞突起中の微小管の構成タンパク質である。
誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいた場合、リポフェクションの後、薬剤耐性を示す細胞を選択してもよい。例えば、誘導因子ＲＮＡが、ピューロマイシン耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいた場合、リポフェクションの後の細胞をピューロマイシンに曝すことにより、誘導因子ＲＮＡが導入された細胞以外を死滅させ、誘導因子ＲＮＡが導入された細胞を選別することが可能である。誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡとして、ネオマイシン、ブラストサイジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びゼオシン等から選択されるいずれかを含んでいてもよい。
以上説明した本発明の実施の形態に係る動物細胞から体細胞を作製する方法によれば、ｉＰＳ／ＥＳ細胞等を含む動物細胞に特定の遺伝子をコードするＲＮＡを発現させることで、ｉＰＳ／ＥＳ細胞等を含む動物細胞の遺伝子に傷をつけることなく、神経系細胞等の体細胞を効率よく作製することが可能である。
ホルモンや化学物質を利用してｉＰＳ／ＥＳ細胞等から体細胞を作製する方法では、体細胞が作製されるまで非常に長い時間が必要である。これに対し、本発明の実施の形態に係る動物細胞から体細胞を作製する方法によれば、非常に短い時間で体細胞を作製することが可能である。
また、ホルモンや化学物質を利用してｉＰＳ／ＥＳ細胞等を含む動物細胞から体細胞を作製する方法においては、ｉＰＳ／ＥＳ細胞等を含む動物細胞のうちの一部のみが目的の体細胞になる。これに対し、本発明の実施の形態に係る動物細胞から体細胞を作製する方法によれば、ＲＮＡを導入する細胞の９０％以上が目的の体細胞となる。
さらに、ホルモンや化学物質を利用してｉＰＳ／ＥＳ細胞等から体細胞を作製する方法においては、同じプロトコールに従っても、目的の体細胞になるクローンと、ならないクローンがあり、クローン間にばらつきが生じる。これに対し、本発明の実施の形態に係る動物細胞から体細胞を作製する方法によれば、複数のクローンで高い分化誘導効率を得ることが可能である。
また、ＥＳ／ｉＰＳ細胞などの未分化な細胞集団からサイトカイン等を用いて分化誘導を行って移植用細胞を作製する場合、移植用細胞の中に未分化細胞が残存する可能性がある。この残存未分化細胞は移植位置で独自に細胞分裂、増殖をし、テラトーマ等を形成する危険性がある。これに対し、本発明の実施の形態に係る動物細胞から体細胞を作製する方法によれば、薬剤耐性遺伝子も同時に発現させることができるため、誘導因子ＲＮＡが導入された細胞の薬剤選択が可能である。そのため未分化細胞の混入やテラトーマ形成などの危険性を回避することが可能であり、移植医療に適している。
さらに、本発明の実施の形態に係る動物細胞から体細胞を作製する方法において、リポフェクション法を用いる場合、ウイルスを利用しない。そのため、幹細胞の遺伝子に傷がつかず、作製される体細胞に癌化のリスクがないため、臨床への利用が可能である。
また、ウイルスを使用して幹細胞から体細胞を作製する方法では、ウイルスベクターを作製及び増殖させるには大腸菌が必要である。しかし、ヒト以外の生物を利用して作製した物質が導入されて作製された細胞は、臨床応用に適していない。これに対し、本発明の実施の形態に係る動物細胞から体細胞を作製する方法において、リポフェクション法を利用してＲＮＡをｉＰＳ／ＥＳ細胞等を含む動物細胞に導入する場合がある。ＲＮＡは化学物資であり人工的に合成できるため、大腸菌等の生物を利用せず作製することが可能であり、臨床応用に適している。
またさらに、例えば血液の細胞からｉＰＳ細胞を完全閉鎖系のクリーンな環境下で作製し、引き続き、ｉＰＳ細胞から体細胞を完全閉鎖系のクリーンな環境下で作製すれば、より清潔で安全な体細胞を作製することが可能である。
加えて、本発明の実施の形態に係る動物細胞から体細胞を作製する方法によれば、短期間で体細胞を作製することが可能であるため、ｍＲＮＡの挿入時に伴う免疫反応に伴う細胞死を抑制するＢ１８Ｒ等を使用しなくてもよく、また、使用する場合も、非常に薄い濃度にすることが可能である。
（実施例１４）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０ｕｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞死を抑制する。
ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。トランスフェクトされる細胞は、１ウェルあたり、４×１０5個の密度でまかれた。なお、１ウェルの底面積は４ｃｍ2であった。トランスフェクトされないコントロール細胞は、１ウェルあたり、２×１０5個の密度でまかれた。その後、細胞を、フィーダーフリー培地中で２４時間培養した。この際、温度は３７℃、ＣＯ2濃度は５％、酸素濃度は２５％以下であった。
１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、２μＬの濃度が１００ｎｇ／μＬのＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を混合し、トランスフェクション培地を用意した。トランスフェクションの前に各ウェルのフィーダーフリー培地をトランスフェクション培地に交換し、３７℃で２時間、細胞を培養した。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡ（ＴｒｉLｉｎｋ）と、を用意した。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていた。
さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、をそれぞれウェルの数だけ用意した。
チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。その後、室温で１０分間、第１の反応液が混合するよう、チューブＡを軽くたたいた。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、５００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ （Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で５分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をそれぞれのウェルに加え、３７℃で一晩静置した。これにより、それぞれのウェルに、５００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡが加えられた。
その翌日に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察したところ、図３７及び図３８に示すように、メッセンジャーマックスを利用してトランスフェクションした細胞が最も強く発色していた。さらに、図３９に示すように、生存率もメッセンジャーマックスを利用したものが一番高かった。このことから、メッセンジャーマックスがｍＲＮＡを導入するうえで一番適していることを明らかにした。さらに、リポフェクション試薬とＲＮＡを用いてｉＰＳ細胞にｍＲＮＡを導入し、タンパク質を発現させることが可能である事が示された。
（実施例１５）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞死を抑制する。
ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。トランスフェクトされる細胞は、１ウェルあたり、４×１０5個の密度でまかれた。トランスフェクトされないコントロール細胞は、１ウェルあたり、２×１０5個の密度でまかれた。その後、細胞を、フィーダーフリー培地中で２４時間培養した。
１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、２μＬの濃度が１００ｎｇ／μＬのＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を混合し、トランスフェクション培地を用意した。トランスフェクションの前に各ウェルのフィーダーフリー培地をトランスフェクション培地に交換し、３７℃で２時間、細胞を培養した。
Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ） ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、を用意した。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていた。また、ｍＲＮＡは、シリカ膜で精製されており、ｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ｐＨ６の１ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを溶媒とする溶液によってされる。さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を、それぞれウェルの数だけ用意した。
チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。その後、室温で１０分間、第１の反応液が混合するよう、チューブＡを軽くたたいた。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに５００ｎｇのＮｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と１５００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で５分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をそれぞれのウェルに加え、３７℃で一晩静置した。これにより、それぞれのウェルに、５００ｎｇのＮｇｎ２ｍＲＮＡと、１００ｎｇのＧＦＰｍＲＮＡが加えられた。
ｍＲＮＡ導入後、一日目に観察したところ、図４０に示すように、メッセンジャーマックスを利用してトランスフェクションした細胞が最も強く発色していた。
その後の２日間、１日ごとに、培地を、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）と、１ｍｇ／Ｌの濃度で抗生物質（ピューロマイシン）を含む、神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で完全に交換し、ｍＲＮＡがトランスフェクトされた細胞をセレクションした。３日目に、培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置き換えた。その後、７日目までに、同じ培地で半量ずつ培地交換した。
７日目にウェルから培地を除き、１ｍＬのＰＢＳで洗った。その後、４％ＰＦＡを入れ１５ｍｉｎ４℃で反応させ、固定した。その後ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＣＣＳ，０．１％トライトン ｉｎ ＰＢＳ培地で一次抗体を希釈し、５００μＬ添加した。一次抗体としては、ウサギ抗ヒトＴｕｊ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ８４５５０１）及びマウス抗ラット及びヒトＮｇｎ２抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用し、ウサギ抗ヒトＴｕｊ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ８４５５０１）をバッファで１／１０００希釈、又はマウス抗ラット及びヒトＮｇｎ２抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をバッファで１／７５希釈し、さらにＤＡＰＩをバッファで１／１００００希釈したものを各ウェルに添加し、室温で一時間反応させた。Ｔｕｊ１抗体は、β－IIIＴｕｂｕｌｉｎに対する抗体である。
室温で一時間反応後、各ウェルに１ｍＬのＰＢＳを添加し、ウェルによくなじませた後、ＰＢＳを廃棄した。再度、ＰＢＳを添加、廃棄し、透過バッファ中に、１／１０００希釈のロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を１／１０００希釈のロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を含む、二次抗体含有透過バッファを５００μＬずつ添加し、室温で３０分間反応させた。
室温で３０分反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察し、蛍光を発している細胞をカウントした。
図４１は、Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡをリポフェクションを用いて導入し、その後、ピューロマイシンを添加し２日間培養後、さらにピューロマイシンを添加せず５日間培養して、Ｔｕｊ１で染色して蛍光顕微鏡で観察した写真である。図４２は上記の手順によって各トランスフェクション試薬を利用して、Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡをトランスフェクションし、７日目にＴＵＪ－１陽性細胞の割合を示したものである。ＲＮＡｉＭＡＸ， ＳｔｅｍｆｅｃｔにくらべてＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸは４倍以上、ｉＰＳ細胞を神経系細胞へ変化させる能力が高いことが示された。
図４３は、Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡを３回のリポフェクションを用いて導入し、その後、ピューロマイシンを添加し６日間培養後、さらにピューロマイシンを添加せず１６日間培養して、ＭＡＰ２（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ｍ４４０３）及びｖＧｌｕｔ（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃１３５ ３０２）で染色して、蛍光顕微鏡で観察した細胞の写真である。
（実施例１６）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。
ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。トランスフェクトされる細胞は、１ウェルあたり、４×１０5個の密度でまかれた。トランスフェクトされないコントロール細胞は、１ウェルあたり、１×１０5個の密度でまかれた。その後、細胞を、フィーダーフリー培地中で２４時間培養した。この際、温度は３７℃、ＣＯ2濃度は５％、酸素濃度は２５％以下あった。
１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、２μＬの濃度が１００ｎｇ／μＬのＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を混合し、Ｂ１８Ｒ含有トランスフェクション培地を用意した。また、１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、を混合し、Ｂ１８Ｒ非含有トランスフェクション培地を用意した。
トランスフェクションの前に各ウェルのフィーダーフリー培地をＢ１８Ｒ含有トランスフェクション培地又はＢ１８Ｒ非含有トランスフェクション培地に交換し、３７℃で２時間、細胞を培養した。
Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、ＧＦＰ ｍＲＮＡ （Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、を用意した。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていた。
さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を、それぞれウェルの数だけ用意した。
チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。その後、室温で１０分間、第１の反応液が混合するよう、チューブＡを軽くたたいた。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに５００ｎｇのＮｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ （Ｔｒｉｌｉｎｋ） を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で５分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をそれぞれのウェルに加え、３７℃で一晩静置した。これにより、それぞれのウェルに、５００ｎｇのＮｇｎ２ ｍＲＮＡと、１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡが加えられた。また、図４４に示すように、１回トランスフェクションを行ったサンプル、２回トランスフェクションを行ったサンプル、及び３回トランスフェクションを行ったサンプルを用意した。
その後の２日間、１日ごとに、培地を、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）と、１ｍｇ／Ｌの濃度で抗生物質（ピューロマイシン）を含む、神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で完全に交換し、ｍＲＮＡがトランスフェクトされた細胞をセレクションした。３日目に、培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置き換えた。その後、７日目までに、同じ培地で半量ずつ培地交換した。
７日目にウェルから培地を除き、１ｍＬのＰＢＳで洗った。その後、４％ＰＦＡを入れ１５ｍｉｎ４℃で反応させ、固定した。その後ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳ中に５％のＣＣＳ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸを含む透過バッファで希釈した一次抗体を各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で１時間反応させた。一次抗体は、マウス抗ヒトＴｕｊ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ８４５５０１）を１：１０００で、マウス抗ヒトＮｇｎ２抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＭＡＢ３３１４－ＳＰ）を１：１５０となるよう透過バッファで希釈したものであり、さらにＤＡＰＩが１：１０，０００になるよう添加した。
一時間後、各ウェルに１ｍＬのＰＢＳを添加し、ウェルによくなじませた後、ＰＢＳを廃棄した。再度、ＰＢＳを添加、廃棄し、透過バッファ中にロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ－２１４２８）を１：１０００で、ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ３１５７３）を１：１０００で含む、二次抗体含有透過バッファを５００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察し、蛍光を発している細胞をカウントした。その結果、図４５に示すように、ｍＲＮＡを一回だけトランスフェクションしたものは、９日目にはＧＦＰはほとんど発現していなかった。その一方で、ｍＲＮＡを３回トランスフェクションしたものは、９日目においてもＧＦＰが発現していた。このことから、ｍＲＮＡは細胞内で分解され、タンパク質の発現は一過性であることが明らかとなった。図４６は、ｍＲＮＡを３回トランスフェクトし、７日目においてＧＦＰを発現していた細胞の拡大画像である。
以上示したように、ｉＰＳ細胞を播種後、ＲＮＡをトランスフェクションして数日で神経系細胞に誘導できることが示された。また、短期間で神経系細胞に誘導できることから、細胞へのＲＮＡの挿入時に伴う免疫反応に伴う細胞死を抑制するために通常使用されるＢ１８Ｒタンパク質を培地に含めなくともよいことが示された。
１０ 分離装置
２０ 導入前細胞送液路
２１ 誘導因子送液機構
３０ 因子導入装置
３１ 導入細胞送液路
４０ 細胞塊作製装置
５０ 初期化培養装置
５１ 細胞塊送液路
６０ 分割機構
７０ 拡大培養装置
７１ 拡大培養送液路
７２ 細胞塊送液路
８０ 分割機構
９０ 細胞魂搬送機構
９１ パッケージ前細胞流路
１００ パッケージ装置
１１０ 凍結保存液送液機構
２００ 容器

Claims (20)

  1. 体細胞に多能性誘導因子を導入した後、前記多能性誘導因子を導入された前記体細胞を沈まないように少なくとも７日間浮遊培養して前記体細胞を幹細胞へ誘導し、前記幹細胞のコロニーを形成することを含み、
    前記誘導することにおける培地がゲル化されており、
    前記コロニーを形成することにおける培地がゲル化されている、
    幹細胞の誘導方法。
  2. 前記誘導することにおける培地が攪拌されない、請求項１に記載の幹細胞の誘導方法。
  3. 前記誘導することにおける培地が、脱アシル化ジェランガムでゲル化されている、請求項１又は２に記載の幹細胞の誘導方法。
  4. 前記誘導することにおける培地が、成長因子を含まない、請求項１から３のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  5. 前記誘導することにおける培地が、成長因子を４０重量％以下の濃度で含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  6. 前記誘導することにおける培地が、ｂＦＧＦを含まない、請求項１から３のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  7. 前記誘導することにおける培地が、ｂＦＧＦを４００μｇ／Ｌ以下の濃度で含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  8. 前記誘導することにおける培地が、Ｔｇｆ－βを含まない、請求項１から３のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  9. 前記誘導することにおける培地が、Ｔｇｆ－βを６００ｎｇ／Ｌ以下の濃度で含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  10. 前記誘導することにおける培地が、ヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  11. 前記コロニーを形成することにおける培地が攪拌されない、請求項１に記載の幹細胞の誘導方法。
  12. 前記コロニーを形成することにおける培地が、脱アシル化ジェランガムでゲル化されている、請求項１から１１のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  13. 前記コロニーを形成することにおける培地が、成長因子を含まない、請求項１から１２のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  14. 前記コロニーを形成することにおける培地が、成長因子を４０重量％以下の濃度で含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  15. 前記コロニーを形成することにおける培地が、ｂＦＧＦを含まない、請求項１から１２のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  16. 前記コロニーを形成することにおける培地が、ｂＦＧＦを４００μｇ／Ｌ以下の濃度で含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  17. 前記コロニーを形成することにおける培地が、Ｔｇｆ－βを含まない、請求項１から１２のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  18. 前記コロニーを形成することにおける培地が、Ｔｇｆ－βを６００ｎｇ／Ｌ以下の濃度で含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  19. 前記コロニーを形成することにおける培地が、ヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
  20. 前記体細胞がヒト体細胞である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の幹細胞の誘導方法。
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