JP5990256B2 - 粒子分離の方法および装置 - Google Patents
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Description
図1は、一実施形態に係る装置100の一例を概略的に示している。装置100は、流体流れ制御装置104に連通する流路102を含む。流体流れ制御装置は、流路102の第1の端部106から流路102の第2の端部108までの順方向の流動と、流路の第2の端部108から第1の端部106までの逆方向Rの流動との間で、流路102内のキャリア流体を選択的に交番させるように動作可能である。流体流れ制御装置104は、例えば、流路102内の何れかの方向にキャリア流体が流れるように促すため、1または複数の制御可能な圧力源を含むことができる。1または複数の圧力制御構造および流路102への流体の流れに影響を及ぼすための他の要素、例えば圧力減衰器、延長された微小流体流路、バルブ、流体マルチプレクサ、灌流チャンバなども具備することができる。
図4は、様々なサイズの漏斗狭窄部を通して双方向に単一細胞を変形させるために必要とされる圧力差を測定するための装置例400を示す。装置400は、図4の凡例に記されている通り垂直方向および水平方向の充填パターンによって示されている制御層と流れ層とを含む。装置400は一般に、細胞入口部分402と、漏斗鎖部分404と、圧力減衰器部分406とを含む。漏斗鎖部分404は、反対の極性で配置され漏斗鎖の中心に向かって細孔サイズが減少している複数の漏斗狭窄部(例えば10つの漏斗の2セット)を含む。細胞入口部分402は、バルブ427、428を通って漏斗鎖の何れかの端部に連通する第1と第2の細胞導入ゾーン418、419を含む。418で導入された後の細胞例430が示されており、これは矢印431により示されている通り漏斗内に移動する。圧力減衰器部分406は、端部411、412を伴う長いマイクロ流路408を含む。マイクロ流路408は、点418、414において分岐流路415、416に連通し、これらの分岐流路はそれ自体、バルブ425、426を通して漏斗鎖の何れかの端部に連結されている。端部411、412を横断して加えられる外部圧力が結果として、外部圧力の分圧である減衰された圧力を点413、414を横断して(従って、バルブ425、426が開放している場合漏斗鎖を横断して)及ぼし、この分圧は、点411、412の間の距離に対する点413、414の間の距離の比により決定される。示す実施形態では、圧力減衰器部分406は、漏斗鎖に対する印加外部圧力の1/100を提供するように構成されているが、ある実施形態では、外部圧力の異なる分圧を提供してよいということを理解されよう。同様にある実施形態では、圧力減衰器部分406を削除してもよい(例えば、充分に微調整可能な外部圧力源が提供される場合)。装置400の動作詳細および例示的実施形態について、以下で実施例4の表題の下で記述する。
粒子が細胞である場合、1または複数のタイプまたは種の細胞を、媒質、血液または他の流体中の別のものから分離することには、複数の利用分野がある。非限定的ではあるが、このような利用分野としては、白血球除去輸血、血液バンク処理、培養中の非同調細胞の分離、選択された細胞タイプ(例えば臍帯血または骨髄または脂肪組織由来の幹細胞)の富化、および希少細胞タイプ(例えば血液中の循環腫瘍細胞)の同定および/または絶対数測定が含まれる。このような循環腫瘍細胞は、癌および/または転移の発生および程度のマーカーとして診断、予後判定または臨床的に特に興味深いものである。循環腫瘍細胞(CTC)は、他の血液学的細胞との物理的な差異、すなわち大きさおよび剛性の差異を示す。これらの物理的差異は、白血球(WBC)、心臓単球、間充織幹細胞(MSC)、および多能性幹細胞などの他の細胞タイプにおいて活用可能であるかもしれない。更に、その後の分析を容易にするため、血液試料中の他の細胞から赤血球を分離することが有益であるかもしれない。例えば、分離された細胞を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術および当該技術分野において公知の他の技術によって分析することができる。RBC中のヘモグロビンはPCR反応の阻害物質であり、従ってRBCの存在は、当該技術分野において公知の通り、PCR反応において有害である。
本発明の例示的実施形態に係る粒子分離用に用いられる装置のそれぞれの構成要素については、図1、2、2Aおよび7を参照されたい。
多層ソフトリソグラフィ(MSL)は、数百乃至数千もの微視的反応チャンバ、バルブ、ポンプ、流体論理素子および他の構成要素を有するマイクロ流体素子の容易でかつ堅牢な製造を可能にする周知の製造技術である。Xia & Whitesides, 1998(Angewandte Chemie-lnternational Edition 37:551-575、参照により本明細書に援用されている)は、MSLを含めたソフトリソグラフィ用の手順、材料および技術について記載し、精査している。
シリコンマスターを、2段階フォトリソグラフィプロセスにおいて製造した。第1に、シリコンウエハーを、SU−8ネガ型フォトレジスト(Microchem(商標))でコーティングし、50秒間1200rpmの速度で回転させた。その後、ウエハーを95℃のホットプレート上で5分間焼成し、その後、Solidworks(商標)DWG Editorを用いて設計されAdvance Reproductions(Andover, MA)によって商用に生産された光学フォトマスクを通してUV光に曝露した。曝露後、次にウエハーを65℃、95℃そして65℃でそれぞれ1分、4分および1分間焼成した。SU−8現像剤(Microchem)中でパターン化したウエハーを現像し、イソプロパノールで洗浄した。パターン化した微小構造を硬化させるために、ウエハーを次に200℃で1時間焼成した。最終的焼成温度には、12分毎に10°の割合の緩慢な傾斜により到達した。焼成後、ウエハーをホットプレートの上面で室温まで平衡化させた。600rpmで50秒間スピンコーティングすることにより、冷却済みウエハーにSPR220−7.0フォトレジスト(Microchem)を添加した。スピニングの後、エッジビードを手作業でウエハーから除去し、次に65℃、95℃および65℃でそれぞれ1分、5分および1分間ソフトベークした。第2のフォトマスク(CAD/Art Designs)を先行するパターンセットに整列させ、その後曝露し、MF319現像剤(Microchem)中で現像した。最終的に、ウエハーを95℃のホットプレート上で5分間焼成して、SPR220−7.0フォトレジスト層がリフローし放物線の断面形状を呈するようにした。プロセス全体を通して、ミクロスケールのSU−8特徴に歪みや屈曲を起こす可能性のある熱衝撃に対するウエハーの曝露を防ぐよう充分に注意する。
例えばUngerら、2000(Science 288:113)およびStuderら、2004(Journal of Applied Physics 95:393)が記述している通り、当該技術分野において公知の標準的な多層ソフトリソグラフ技術を用いてPDMSマスターを製造した。流れ層については、RTV615シリコーン(Momentive Performance Materials)5:1の基剤対硬化剤比で、また制御層については20:1の比で、2層を形成した。層を拡散により結合させ、酸素プラズマ(Herrick Plasma)中で45秒の後にガラススライドに付着させた。0.5mmのポンチ(Technical Innovation)を用いて手作業で入口および出口を打ち抜いた。作業前にPBS中の1%のBSAの溶液を使用して素子に充填を行い、10分間インキュベートして、PDMS表面上への細胞の吸着を防いだ。
ブリティッシュコロンビア大学にある血液研究センター(CBR)で健常人ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を得た。培養からL1210マウスリンパ腫細胞(MLC)を得た。湿度100%およびCO25%で37℃に維持したインキュベータ内に保たれた10%のウシ胎仔血清と1%のペニシリン/ストレプトマイシンと共にRPMI1640 (Gibco(商標), Invitrogen(商標))を用いて、懸濁状態でMLCを培養した。実験に先立ち、細胞を遠心分離を介して濃縮し、1mlあたり1×107個の細胞という濃度で0.4%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の溶液中に再懸濁させた。継代培養から3〜4日後に、細胞を実験のために使用した。細胞を染色した実験においては、L3224 LIVE/DEAD生存率/細胞毒性キット(Invitrogen)をメーカーの指示に従って使用した。健常ボランティアから得た全血から、末梢血単核細胞を調製した。全血を6mlのナトリウムヘパリンの入った管内に引き込んだ。Histopaque1077(Sigma-Aldrick)をメーカーの指示事項に従って使用してPBMCを分離し、次にAIM5培地(GIBCO-Invitrogen)中に1×107個/mlの細胞濃度で再懸濁させた。
単一細胞を変形させるのに必要とされる圧力差を、本明細書中に開示されたマイクロ流体素子を用いて決定した。粒度を導くのに使用した装置は、図4に示されている。装置は中央マイクロ流路を含み、ここには、マイクロ流路の遠位端部からその中心まで、W0=11、10、9、8、7、6、5、4、3.5、3μmの漏斗が直列に配置され、次にマイクロ流路の中心から反対側の遠位端部まで鏡面対称に配置されている。1つのマイクロ流路内に多くの漏斗を使用することで、同じ細胞について変動する漏斗幾何形状での実験を行なうことが可能になり、一方、マイクロ流路の中心で漏斗鎖の設計を鏡面対称にすることで、バルブ流体に対する考えられる非対称な流体力学抵抗は全て無くなる。この設計は、10°、5°および0°でテーパーが付いた漏斗について複製される。マイクロ流路の高さは、およそ16μmであり、これは我々の実験で使用される細胞の典型的な直径を上回る。
12本の水平横列で分離部域の幅を横断して128つの漏斗を含む細胞分離装置を製造した。図7Cを参照すると、一部の実験で使用される装置例において、フィルタ障壁障害部間の間隙gは2μmであり、各アレイ内の通路(および障害部)の長さlは50μmであり、アレイ間の距離dは50μmであり、(第1の端部にあるフィルタ障壁750と第1のアレイ761の間の)入口流路の幅は100μmであり(こうして所与の試料濃度について1サイクルあたりより大量の粒子が選別できることになる)、離隔距離s(例えば各アレイ内の1つの通路の中心から次の通路までの水平距離)は25μmである。3〜50kPaの範囲内の圧力、順方向で0.5〜2秒の振動、1〜8秒の範囲内の逆方向振動時間で、様々な実験を実施した。全ての場合において、合計振動時間は1分であった。
微小流体細胞分離装置を用いて、赤血球の変形性を評価した。直列漏斗構成を含む装置(図4に概略的に標示)を、直列でW0=0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7μmの漏斗構成で利用した。赤血球は、移動制限の無い状態では、全体的に球形というよりもむしろトロイドまたはディスク形状を有することから、「フラット」ディスクとして(例えば横向き)または「オンエッジ」(ホイールのように実質的に直立状態)で、素子を通って進行し得る。約2〜3μm以下の高さを有する流路は、大部分の赤血球を「フラットディスク」として泳動するように限定し、一方約3〜4μmより大きい高さを有する流路は、赤血球がいずれの構成でも(つまり折重なった状態でもまたは一定の角度ででも)泳動できるようにする。従って、装置は、約3μmの流路深さを提供するように構成されており、これは、細胞が中を横断するにつれて起立したり折重なったりせずに漏斗内で平坦に移動するよう細胞を限定する。
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Claims (38)
- 第1の端部(106/206)と第2の端部(108/208)とを有する流路(102/202)と、
前記流路内のキャリア流体を、第1の端部から第2の端部までの順方向(F)への流動と、第2の端部から第1の端部までの逆方向(R)への流動との間で交番させるための流体流れ制御装置(104)と、
前記流路内に設けられた微小構造(110/110A/110B/110C/110D/210/212/214/215/216/217/218/219)とを具備し、
前記微小構造は1または複数の通路(111/111A/111B/111C/111D/211)を具備しており、
該通路は、前記流路を流通するキャリア流体中の粒子が前記微小構造中を通過する際に、該粒子を変形させる寸法にて形成され、該通路の各々は前記順方向へ先細りにテーパー状に形成され、前記微小構造中を逆方向に通過する粒子を変形させるのに必要とされる力よりも、前記微小構造中を順方向に通過する粒子を変形させるのに必要とされる力の方が小さくなるように構成された1または複数の通路を含む微小構造とを具備する装置(100、200、200A)。 - 1または複数の通路が、漏斗状の通路を含んでいる請求項1に記載の装置。
- 漏斗状の通路が0°超から30°までの半角を有する請求項2に記載の装置。
- 漏斗状通路が、10°の半角を有する請求項3に記載の装置。
- 流路が、第1の端部から第2の端部まで延在する対向する側壁(203)を有する分離チャンバ(202)を含み、微小構造が分離チャンバの側壁の間に延在する複数の障害部(211)から成るアレイ(210/214/215/216/217/218/219)を含み、障害部のアレイは、隣接する障害部対の間に通路を提供するように配置されており、障害部は、通路に順方向に先細りとなるテーパーを付けるような形状を有する請求項1〜4の何れか1項に記載の装置。
- 第1の端部とアレイとの間に設けられ分離チャンバ内に粒子を導入するための試料入口(220/221/222/223/224/225)と、
第1の端部とアレイとの間に設けられ分離チャンバから粒子を取出すための第1の試料出口(231/232/233/234/235/236)と、
アレイと第2の端部との間に設けられ分離チャンバから粒子を取出すための第2の試料出口(232/233/234/235/236/237)とを具備する請求項5に記載の装置。 - 微小構造が、分離チャンバの側壁間に延在する複数の障害部から成る複数のアレイ(214/215/216/217/218/219)を含む請求項5に記載の装置。
- 障害部のアレイの各々が、隣接する障害部対間に対応する通路セットを提供するように構成されており、障害部は、通路に順方向に先細りとなるテーパーを付けるような、かつ各々の連続するアレイ内で通路のサイズが第1の端部から第2の端部に向かって減少するような形状を有する請求項7に記載の装置。
- 複数のアレイが、障害部間に異なる間隔を伴うアレイを含む請求項7に記載の装置。
- 複数のアレイの各々の中の障害部間の間隔が、第1の端部に最も近いアレイ内で最大であり、第2の端部に最も近いアレイ内で最小である請求項9に記載の装置。
- 流路の第1の端部に第1のフィルター障壁(240)を含む請求項1〜10の何れか1項に記載の装置。
- 流路の第2の端部に第2のフィルター障壁(240)を含む請求項1〜11の何れか1項に記載の装置。
- 第1のフィルター障壁が、間に間隙を有する複数のフィルター障害部を含む請求項11または12に記載の装置。
- フィルター障害部間の間隙が微小構造の通路と整列されている請求項13に記載の装置。
- 第1の端部でキャリア流体を導入するための第1の分配ネットワークを含み、第1の分配ネットワークが、微小構造の通路と整列した複数のサブ流路を含む請求項1〜14の何れか1項に記載の装置。
- 第2の端部でキャリア流体を導入するための第2の分配ネットワークを含み、第2の分配ネットワークが、微小構造の通路と整列した複数のサブ流路を含む請求項15に記載の装置。
- 1または複数の通路が、白血球、胚細胞、幹細胞、前躯細胞、転移細胞、癌細胞および死細胞のうちの1または複数の通過を排除するように構成されている請求項1〜16の何れかに記載の装置。
- 対向する第1と第2の端部を有し、第1と第2の端部の各々が分離チャンバ内部でキャリア流体を分配するための1または複数の流体流路(205/207)を有している、分離チャンバ(202)と、
分離チャンバの側壁の間に延在し、隣り合って対をなす障害部の間に第1の間隔を提供するように配置された複数の障害部から成る第1のアレイであって、前記第1の間隔が分離チャンバの第1の端部に向かって比較的大きく、分離チャンバの第2の端部に向かって比較的小さくなるように設けられた複数の障害部(212)から成る第1のアレイ(210/214/215/216/217/218/219)と、
第1の端部と第1のアレイの間で分離チャンバ内に粒子を導入するための試料入口(220/221/222/223/224/225)と、
第1の端部と第1のアレイの間で分離チャンバから粒子を取出すための第1の試料出口(231/232/233/234/235/236)と、
第1のアレイと第2の端部の間で分離チャンバから粒子を取出すための第2の試料出口(231/232/233/234/235/236)とを具備する粒子分離用装置(200、200A)。 - 微小構造(110/110A/110B/110C/110D/210/212/214/215/216/217/218/219)を流路(111/211)内に準備するステップであって、前記微小構造は流路の第1の端部により近い第1の側と流路の第2の端部により近い第2の側とを有し、該通路の各々は前記順方向へ先細りにテーパー状に形成され、流路内キャリア流体中の粒子が微小構造を通過するにつれて粒子を変形させる寸法にて形成され、該微小構造の第2の側から該微小構造の第1の側へと通過する粒子を変形させるのに必要とされる力よりも該微小構造の第1の側から該微小構造の第2の側へと通過する粒子を変形させるのに必要とされる力の方が小さくなるように構成された1または複数の通路を内部に含む微小構造を流路内に準備するステップと、
順方向への流動と逆方向への流動との間で交番するようにキャリア流体を強制するステップとを具備する方法。 - 1または複数の通路が、漏斗状の通路を含んでいる請求項19に記載の方法。
- 漏斗状の通路が、1°から30°までの半角を有する請求項20に記載の方法。
- 漏斗状通路が、10°の半角を有する請求項21に記載の方法。
- 流路が、第1の端部から第2の端部まで延在する対向する側壁(203)を有する分離チャンバ(202)を含み、微小構造が分離チャンバの側壁の間に延在する複数の障害部(211)から成るアレイ(210/214/215/216/217/218/219)を含み、障害部のアレイは、隣接する障害部対の間に通路を提供するように配置されており、障害部は、通路に順方向に先細りとなるような形状を有する請求項19〜22の何れか1項に記載の方法。
- 第1の端部と第1のアレイ間で試料入口(220/221/222/223/224/225)を通って分離チャンバ内に粒子を導入するステップと、
第1の端部と第1のアレイ間で第1の試料出口(231/232/233/234/235/236)を通って分離チャンバから粒子を取出すステップと、
第1のアレイと第2の端部間で第2の試料出口(232/233/234/235/236/237)を通って分離チャンバから粒子を取出すステップとを具備する請求項23に記載の方法。 - 微小構造が、分離チャンバの側壁間に延在する複数の障害部から成る複数のアレイ(214/215/216/217/218/219)を含む請求項19に記載の方法。
- 障害部のアレイの各々が、隣接する障害部対間に対応する通路セットを提供するように構成されており、障害部は、通路に順方向に先細りとなるテーパーを付けるような、および各々の連続するアレイ内で通路のサイズが第1の端部から第2の端部まで減少するような形状を有する請求項25に記載の方法。
- 複数のアレイが、障害部間に異なる間隔を伴うアレイを含む請求項25に記載の方法。
- 複数のアレイの各々に設けられた障害部間の間隔が、第1の端部に最も近いアレイ内で最大であり、第2の端部に最も近いアレイ内で最小である請求項27に記載の方法。
- 流路の第1の端部に第1のフィルター障壁(240)を含む請求項19〜28の何れか1項に記載の方法。
- 流路の第2の端部に第2のフィルター障壁(240)を含む請求項19〜29の何れか1項に記載の方法。
- 第1のフィルター障壁が、間に間隙を有する複数のフィルター障害部を含む請求項29または30に記載の方法。
- フィルター障害部間の間隙が微小構造の通路と整列されている請求項31に記載の方法。
- 微小構造の通路と整列した複数のサブ流路(242)を含む第1の分配ネットワークを通して第1の端部でキャリア流体を導入するステップを含む請求項18〜30の何れか1項に記載の方法。
- 微小構造の通路と整列した複数のサブ流路(242)を含む第2の分配ネットワークを通して第2の端部でキャリア流体を導入するステップを含む請求項33に記載の方法。
- 1または複数の通路が、白血球、胚細胞、幹細胞、前躯細胞、転移細胞、癌細胞および死細胞のうちの1または複数の通過を排除するように構成されている請求項19〜34の何れかに記載の方法。
- 粒子変形性に応じてフローチャンバ内部の振動する流体流中の粒子を選別するための微小構造の使用において、微小構造が複数の障害部から成る複数のアレイを含み、障害部のアレイの各々が内部に1または複数の通路を含み、該通路の各々が順方向に先細りのテーパ状に形成されており、連続する各アレイが先行アレイに比べて小さい通路を有している状態で、アレイが順番に配置されている、微小構造の使用。
- 粒子が細胞である請求項36に記載の使用。
- 細胞集団がフローチャンバ内に注入され、細胞が変形性に応じて選別され、かつ細胞がその変形性に応じて複数の異なる出口から取出され、こうして複数の出口の各々から取出された細胞の数に基づいて特徴的変形性分布が決定される請求項37に記載の使用。
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