CN109797101B - 一种细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大方法，包括步骤101：将微载体细胞过滤收集；步骤102：培养基去除缓冲液平衡；步骤103：胰酶消化；步骤104：细胞微载体分离，只收集细胞或加入下一级微载体接种放大。本发明解决了生产规模微载体收集，细胞可控消化，以及细胞收获微载体分离，球转球放大的问题。本发明的方法适合贴壁细胞制备生产，应用于疫苗、重组蛋白及生物酶中试及生产，并且本方法简单经济。

Description

一种细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大方法

技术领域

本发明属于细胞反应器大规模微载体细胞培养放大工艺，尤其涉及的5 是一种细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大方法。

背景技术

微载体细胞反应器悬浮培养制备病毒疫苗，是WHO和CFDA推荐疫苗生产模式。国外用于细胞流感疫苗生物反应器体积已超过6000L,国内微载体悬浮培养反应器也超过300L。微载体悬浮培养虽然具有自动化便于监控稳定重复生产过程等优点，但放大过程需要将细胞从微载体上消化下来，然后将细胞和旧微载体与下一级培养新微载体共同进入下一级反应器中，形象说是细胞球转球或倒罐。生产放大方式是反应器停止搅拌，微载体自然沉降，吸出多余培养液，加入胰酶静置消化后，加入胰酶灭活剂后共同推入下一级反应器。为接种下一级微载体需要保持细胞活性状态，而微载体静置导致细胞缺氧，胰酶消化的时间控制不好损伤细胞。

目前现有的ThermoFisher公司有收集微载体细胞的商品细胞收集袋出售，主要用于几十升实验及中试规模，收集袋腔体小，微载体容易堵塞堆积，消化好的细胞不能全部透出收集，并且此收集袋不透气，细胞消化过程需要控制，防止细胞缺氧。

因此，为实现疫苗生产安全放大，提高工艺可靠性和可重复，提高细胞收率克服现有技术缺陷，发明微载体球转球消化放大方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大方法。

本发明的技术方案如下：

一种细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大方法，包括以下步骤：

步骤101：将微载体细胞过滤收集；

步骤102：培养基去除缓冲液平衡；

步骤103：胰酶消化；

步骤104：细胞微载体分离，只收集细胞或加入下一级微载体接种放大。

所述的方法，所述步骤101中，将微载体细胞过滤收集是指：把种子细胞反应器中微载体连同贴附于微载体上处于对数生长期的细胞，通过蠕动泵转移到可摇动微载体细胞分离腔体中；微载体截留滤网,阻挡微载体和细胞，培养基及细胞碎片透过微载体截留滤网，无菌空气吹干。

所述的方法，所述步骤102中，所述培养基去除缓冲液平衡是指：在摇动状态下用无钙镁离子缓冲液冲洗微载体中残存的血清和胰酶抑制剂。

所述的方法，所述步骤103中，胰酶消化是指：加入胰酶消化随后摇动滤器使细胞与微载体分离，随后用含血清的培养基反向冲洗同时灭活胰酶。

所述的方法，所述步骤104中，细胞微载体分离，只收集细胞或加入下一级细胞反应器接种放大是指：通过消化后细胞收获滤网只收集从出口出来的细胞；摇动状态下，微载体比重大于细胞，从下向上培养基带着细胞透出细胞收获滤网，作为种子进入下一级细胞反应器。

本发明解决生产规模微载体收集，细胞可控消化，以及细胞收获微载体分离，球转球放大的问题。本方法适合贴壁细胞制备生产，应用于疫苗、重组蛋白及生物酶中试及生产，并且本方法简单经济。

附图说明

图1为本发明实施例１中细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大装置的结构示意图。

图2为本发明的方法流程图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

如图1所示，本发明方法所使用的细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大装置包括，可摇动微载体细胞分离腔体1和可移动支架2，可移动支 架2上设置可摇动微载体细胞分离腔体1；可摇动微载体细胞分离腔体1中设置有微载体截留滤网和消化后细胞收获滤网；所述微载体截留滤网，用于阻挡截留微载体和细胞以及培养基及细胞碎片；所述消化后细胞收获滤网，用于只收集细胞。微载体细胞消化放大过程包括，将微载体细胞过滤收集；培养基去除缓冲液平衡；胰酶消化；胰酶消化终止；细胞微载体分离；只收集细胞或加入下一级微载体接种放大。可移动支架设置为360度旋转，还可以设置与电机相连接，电机还可以与曲柄摇杆机构相连接，用于按照一定频率摇动可摇动微载体细胞分离腔体。

上述中，可摇动微载体细胞分离腔体1为316不锈钢制作直径为60cm，高为10cm容纳不大于20L微载体和细胞，底部设置有微载体截留滤网，顶部设置有消化后细胞收获滤网。

上述中，微载体截留滤网上的孔径为10-30um纤维素滤板，采用摇动过滤的方式，阻挡微载体和贴附细胞，滤除培养基中的血清及细胞碎片。

上述中，消化后细胞收获滤网为316不锈钢滤网100um；细胞平均粒径10um,微载体粒径100-300um；消化后的细胞可以透过细胞收获滤网，而微载体截留，在摇动混合状态下，液流向上分离状态，细胞收率高于向下过滤收获状态。

在上述内容的基础上，如图2所示，本发明使用细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大装置，进一步提供了一种细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大方法，包括以下步骤：

步骤101：将微载体细胞过滤收集；

步骤102：培养基去除缓冲液平衡；

步骤103：胰酶消化；

步骤104：细胞微载体分离，只收集细胞或加入下一级微载体接种放大。

所述步骤101中，将微载体细胞过滤收集是指：把种子细胞反应器中微载体连同贴附于微载体上处于对数生长期的细胞，通过蠕动泵转移到可摇动微载体细胞分离腔体中；微载体截留滤网,阻挡微载体和细胞，培养基及细胞碎片透过微载体截留滤网，无菌空气吹干。

所述步骤102中，所述培养基去除缓冲液平衡是指：在摇动状态下用无钙镁离子缓冲液冲洗微载体中残存的血清和胰酶抑制剂。

所述步骤103中，胰酶消化是指：加入胰酶消化随后摇动滤器使细胞与微载体分离，随后用含血清的培养基反向冲洗同时灭活胰酶。

所述步骤104中，细胞微载体分离，只收集细胞或加入下一级细胞反应器接种放大是指：通过消化后细胞收获滤网只收集从出口出来的细胞。摇动状态下，微载体比重大于细胞，从下向上培养基带着细胞透出细胞收获滤网，作为种子进入下一级细胞反应器

进一步而言，微载体细胞截留滤网由10-30um 纤维素滤板制成，由于动物细胞10um大小，Cytodex1微载体100-300um大小，10-30um滤网可截留细胞和微载体，同时培养基和死亡的细胞碎片滤除处于对数生长期的细胞从反应器中微载体转移到可摇动滤器中，微载体截留滤网上的微载体收集滤网孔径为10-30um,能阻挡微载体和细胞，而培养基及细胞碎片透过滤网，无菌空气吹干，随后摇动状态下用无钙镁离子缓冲液冲洗微载体中残存的血清和胰酶抑制剂，加入胰酶消化使细胞与微载体分离，随后用含血清的培养基反向冲洗同时灭活胰酶，同时摇动滤器，使微载体和细胞进一步分离；随后用新鲜的培养基从下向上流动，将消化好的细胞通过细胞收获滤网滤出，作为种子细胞转移到下一级放大的反应器中。100um细胞收集网专门收集细胞，旧微载体无法通过被截留回收在滤器中，清洗消毒后可重复使用。

球转球倒罐是微载体悬浮培养工艺放大的瓶颈；传统反应器微载体消化细胞时，需停止搅拌，等待微载体沉淀，然后虹吸出多余的培养基，然后用无血清培养基加满、沉淀、排出，反复3-5次置换反应器中的血清，然后加入胰酶消化微载体上的细胞。由于种子细胞需要对数生长期的细胞，这时细胞活力旺盛，但同时具有耗氧大代谢快；传统静置微载体方法，反应器越大，微载体需要沉降的时间越长，细胞容易缺氧，细胞活力下降，影响细胞传代。另外静置虹吸方法，为不丢失微载体，流速慢并不能排干，不锈钢细胞反应器看不到微载体沉淀的界面，所以每次静置时间、虹吸体积无法固定；另外，清洗需要混合均匀并排除旧的培养液，需要加强搅拌，而静置沉淀微载体不能扰动，现有静置工艺无法实现即清洗干净又排除旧培养液，所以只能多洗少排，造成培养基和时间的大量浪费，而且容易清洗不干净造成血清残留，残留的血清抑制胰酶活性，导致每次胰酶消化时间变化，细胞消化程度变化，不能保证种子细胞质量过滤、离心、沉淀三种方式收获/清洗/消化细胞微载体，过滤做到全封闭管道化无菌操作，保证了生产安全性；过滤的速度最快，清洗培养基最少，摇动过滤清洗效果最好，并且过滤的同时不断流洗含氧新鲜的无血清培养基，保证了细胞的活性。细胞胰酶消化过程；无菌空气压干过滤微载体滤饼，胰酶不被稀释可精确控制胰酶使用量和时间，保证了消化工艺25 的可控性和重复性，提高了消化后细胞均一程度和活性，提高了生产质量。消化后加入含血清的培养基灭活胰酶活性，摇动方式进一步物理方式分离细胞和微载体，利用细胞和微载体比重差别，向上液升加摇动分离提高了细胞收率由于Cytodex1微载体溶胀体积确定1g相当于20ml体积，这样我们知道50升种子罐中，微载体体积10-20升。这就确定了过滤器腔体体积，微载体截留滤网上的孔径采用10-30um滤板微载体细胞摇动过滤方式，快速滤除培养基的同时去除细胞碎片，随后用气排干液体，无钙镁缓冲液冲洗残留血清，提高胰酶消化效率，节省胰酶用量，准确控制消化时间，保证消化过程重复可控。

过滤排干微载体体积比沉淀微载体体积小很多，同样浓度胰酶需要使用的量少，可精确控制胰酶用量，和消化时间，保证细胞消化工艺重复性，和细胞活性。

摇动滤器在冲洗微载体过程中，提高了清洗效果和效率，摇动混合滤器中残留的空气保证细胞溶氧；在胰酶消化后加血清培养基摇动，保证了胰酶终止一致，摇动过程使细胞更容易脱离微载体；而直接过滤过程中细胞与微载体堆积不能彻底分离，而液升冲洗同时摇动，细胞收率>90%。

消化后细胞收获滤网4孔径为100um细胞滤网可以截留微载体而细胞通透过去（细胞10um, 微载体100-300um）。

滤器准备：可摇动微载体细胞分离腔体设置60cm直径10cm高可容纳不大于20L微载体和细胞，底部设置有微载体截留滤网3，孔径为10-30um滤网过滤截留微载体，顶部设置有消化后细胞收获滤网4，孔径为100um滤网用于透过收集细胞。用100L无钙镁PBS缓冲液冲洗滤器，空气排干后，与50L种子罐、200L生产反应器在线蒸汽消毒备用。

种子细胞微载体收集、清洗：50L种子罐中Cytodex1微载体3-5g/L, 共250g微载体约50L微载体细胞培养液泵入微载体过滤器并排干，微载体细胞滤后体积为5-6升；30L无菌含EDTA(0.2%w/v)的无钙镁离子缓冲液（PBS）摇动过滤洗涤，排干；过滤清洗原培养基中的血清，防止抑制胰酶活性。

胰酶消化：泵入10L0.25%w/v胰酶缓冲液pH7.4-8.0, 缓和摇动滤器消化10分钟（根据预实验确定胰酶消化时间）；随后从底部滤板向上泵入20L含血清培养基，并摇动滤器终止胰酶消化反应。泵入胰酶消化时可取样微载体，在显微镜下观察细胞消化状态，细胞圆缩，三五成群脱落即可终止胰酶消化。摇动混合效率远远高于搅拌混合，所以摇动方式既有利于胰酶混合均匀，加入血清培养基也能迅速终止反应，摇动还有利于细胞脱离微载体，同时细胞不会缺氧。

细胞收集球转球再接种放大：如使用相同微载体接种放大，只需要将终止胰酶消化的旧微载体/细胞与新微载体共同泵入200L生产细胞罐。

如果生产使用不同种大孔微载体，要细胞不要旧微载体情况下，继续从底部向上泵入含血清培养基，同时摇动滤器，细胞比微载体密度小，直接从100um滤网中透过进入200L生产罐，微载体拦截在滤器中。

本发明解决了生产规模微载体收集，细胞可控消化，以及细胞收获微载体分离，球转球放大的问题。本方法适合贴壁细胞制备生产，应用于疫苗、重组蛋白及生物酶中试及生产，并且本方法简单经济。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护。

Claims (1)

1.一种细胞反应器微载体细胞收获及再接种放大方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤101：将微载体细胞过滤收集；

步骤102：培养基去除缓冲液平衡；

步骤103：胰酶消化；

步骤104：细胞微载体分离，只收集细胞或加入下一级微载体接种放大；

所述步骤101中，将微载体细胞过滤收集是指：把种子细胞反应器中微载体连同贴附于微载体上处于对数生长期的细胞，通过蠕动泵转移到可摇动微载体细胞分离腔体中；可摇动微载体细胞分离腔体中，设置有微载体截留滤网和消化后细胞收获滤网；所述微载体截留滤网，用于阻挡截留微载体和细胞以及培养基及细胞碎片；所述消化后细胞收获滤网，用于只收集细胞；微载体截留滤网,阻挡微载体和细胞，培养基及细胞碎片透过微载体截留滤网，无菌空气吹干；所述微载体截留滤网上的孔径为10-30um纤维素滤板，采用摇动过滤的方式，阻挡微载体和贴附细胞，滤除培养基中的血清及细胞碎片；可摇动微载体细胞分离腔体为316不锈钢制作直径为60cm，高为10cm容纳不大于20L微载体和细胞，底部设置有微载体截留滤网，顶部设置有消化后细胞收获滤网；

所述步骤102中，所述培养基去除缓冲液平衡是指：在摇动状态下用无钙镁离子缓冲液冲洗微载体中残存的血清和胰酶抑制剂；

所述步骤103中，胰酶消化是指：加入胰酶消化随后摇动滤器使细胞与微载体分离，随后用含血清的培养基反向冲洗同时灭活胰酶；

所述步骤104中，细胞微载体分离，只收集细胞或加入下一级细胞反应器接种放大是指：通过消化后细胞收获滤网只收集从出口出来的细胞；摇动状态下，微载体比重大于细胞，从下向上培养基带着细胞透出细胞收获滤网，作为种子进入下一级细胞反应器；消化后细胞收获滤网为316不锈钢滤网100um；细胞平均粒径10um,微载体粒径100-300um；消化后的细胞透过细胞收获滤网，而微载体截留，在摇动混合状态下，液流向上分离状态，细胞收率高于向下过滤收获状态。

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