CN114525263A - 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的纯化浓缩方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的纯化浓缩方法，属于病毒疫苗制备技术领域。提供的方法采用深层过滤和切向流过滤纯化浓缩相结合的方式对SADS‑CoV抗原进行纯化浓缩，两者共同作用，使得SADS‑CoV抗原的浓缩倍数可达10倍以上，并且抗原回收率高，可达100％左右，蛋白去除率在98％以上，可以为制备高质量的SADS‑CoV病毒疫苗提供高质量的病毒抗原原料。

Description

一种猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的纯化浓缩方法

技术领域

本发明属于病毒疫苗制备技术领域，具体涉及一种猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的纯化浓缩方法及其在猪急性腹泻综合征冠状病毒疫苗制备中的应用。

背景技术

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus，SADS-CoV)属于冠状病毒科α冠状病毒属，是有囊膜包被的单股正链RNA病毒，基因组全长27Kb，有五个非结构蛋白ORF1a、ORF1b、NS3a、NS7a、NS7b和四个结构蛋白S、E、M、N。猪急性腹泻综合征的临床症状与其他已知的猪肠道冠状病毒引起的临床症状非常相似：包括严重且急性呕吐和腹泻、新生仔猪体重迅速减轻、导致急性死亡等。该病可感染各种年龄的猪，但对新生仔猪的影响最为严重，在5d或者更小日龄仔猪中，死亡率高达90％，发病后3-6天死亡，感染成年母猪只有轻度腹泻症状，2天内即可恢复。

由于SADS-CoV常与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)等引起腹泻症状的病毒存在混合感染，且市场上没有商品化的检测试剂盒以及有效的针对SADS-CoV病毒感染的药物可用，一旦SADS-CoV病毒大面积爆发，将会对养猪业带来巨大的经济损失。因此研发针对SADS-CoV的疫苗药物对做好疫情防控准备至关重要。

灭活疫苗相比活疫苗具有安全性高，更适合猪场净化等优点，因此，研制SADS-CoV的灭活疫苗是预防该病毒大规模爆发的有效途径之一，然而，灭活疫苗的制备需要高含量的病毒抗原，即需要对培养获得的病毒液进行纯化浓缩，但由于SADS-CoV是一种新发现的病毒，目前现有技术中还没有针对该病毒抗原的纯化浓缩方法可用，阻碍了SADS-CoV病毒灭活疫苗的研制进程。

发明内容

针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的纯化浓缩方法，其包括对猪急性腹泻综合征冠状病毒液进行深层过滤预处理，和对预处理后的病毒液进行切向流过滤纯化浓缩处理，使得处理过程中病毒抗原基本不损失(病毒抗原损失率小于10％，可选为损失率小于5％，进一步可选为损失率小于2％)，且基本上去除所有蛋白(蛋白去除率为98％以上)，且基本上去除所有蛋白(蛋白去除率为98％以上)。

在一些实施方式中，所述深层过滤预处理可为采用深层过滤滤膜对所述猪急性腹泻综合征冠状病毒液进行滤过处理，其中所述深层过滤滤膜的孔径可为0.65μm-1.2μm。

在一些实施方式中，所述切向流过滤纯化浓缩处理可采用中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统对所述预处理后的病毒液进行纯化浓缩处理。

在一些实施方式中，所述对预处理后的病毒液进行切向流过滤纯化浓缩处理的操作可包括：

S1：将所述预处理后的病毒液置于所述中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统中进行切向流过滤纯化浓缩处理，控制进口压力≤0.1MPa，控制透过端流速为1-3L/min，控制跨膜压差≤0.1MPa；

S2：当浓缩至预定倍数时，使用磷酸盐缓冲液进行洗滤；

S3：洗滤结束后，使用预定量的磷酸盐缓冲液流经所述中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统收集纯化浓缩后的病毒液。

在一些实施方式中，所述中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统的截留猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的孔径可为100-300KD，使得10倍或10倍以上浓缩液中病毒抗原的含量为10^8.75TCID₅₀/ml以上(可选为10^9.00TCID₅₀/ml以上)或20μg/ml以上，且蛋白的含量为250μg/ml以下(可选为220μg/ml以下)。

在一些实施方式中，步骤S2中所述磷酸盐缓冲液的流速可为1-3L/min。

在一些实施方式中，所述猪急性腹泻综合征冠状病毒液可为培养猪急性腹泻综合征冠状病毒所收获的病毒上清液，或经灭活后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液。

本发明另一方面提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒的纯化浓缩液，其由上述的方法制备，其中浓缩10倍或以上的猪急性腹泻综合征冠状病毒的纯化浓缩液中蛋白的含量为250μg/ml以下(可选为220μg/ml以下)，病毒抗原的含量为10^8.75TCID₅₀/ml以上(可选为10^9.00TCID₅₀/ml以上)或20μg/ml以上。

本发明再一方面提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒灭活疫苗的制备方法，其包括将上述的猪急性腹泻综合征冠状病毒的纯化浓缩液与免疫佐剂混合。

本发明再一方面还提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒灭活疫苗，其由上述的灭活疫苗的制备方法获得。

基于以上技术方案提供的猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的纯化浓缩方法采用深层过滤和切向流过滤纯化浓缩相结合的方式对SADS-CoV抗原(病毒原液或灭活后的病毒液)进行纯化浓缩，其中深层过滤和切向流过滤纯化浓缩两者相辅相成、共同作用，在深层过滤中可以去除较多的杂蛋白，有利于后续的切向流过滤纯化浓缩，并且不会导致病毒抗原的损失，在后续的切向流过滤纯化浓缩中则在对病毒液进行浓缩的同时去除剩余的杂蛋白，且也不会导致病毒抗原的损失。实施例结果表明，本发明提供的纯化浓缩方法可将猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原液浓缩10倍以上(包括10倍及10倍以上)，并且能够获得高纯度的猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原液(杂蛋白去除率达98％以上)，病毒液中的抗原基本上没有损失，抗原回收率约为100％，且各批次间无差异，因此可以为制备高质量的SADS-CoV病毒疫苗提供稳定且高质量的病毒抗原原料。另一方面，利用本发明提供的纯化浓缩方法，单次可以处理100L以上，可选为300L-500L的猪急性腹泻综合症冠状病毒液，因此纯化浓缩效率高，可适合用于大规模工业化生产猪急性腹泻综合症冠状病毒抗原和大规模工业化生产猪急性腹泻综合症冠状病毒疫苗。

具体实施方式

本发明旨在提供一种SADS-CoV抗原的纯化浓缩方法。虽然现有技术中已经存在多种用于病毒抗原纯化和/或浓缩的方法，例如PEG沉淀、蔗糖密度梯度离心法、超滤浓缩/切向流过滤纯化浓缩、深层过滤、离心结合切向流过滤纯化浓缩和离子交换层析等方法，然而，发明人发现，这些已有的纯化/浓缩方法在针对猪急性腹泻综合征冠状病毒液的纯化浓缩时虽能有效去除病毒液中大部分杂蛋白，但也会造成大量猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的损失，例如，采用深层过滤结合PEG沉淀、或蔗糖密度梯度离心法等方法时，杂蛋白去除率在94％以上，但抗原回收率仅为50％左右；采用离心结合切向流过滤纯化浓缩的方法时，杂蛋白去除率在94％以上，但平均抗原回收率仅为77.7％左右；采用切向流过滤纯化浓缩的方法时，杂蛋白去除率在94％以上，但平均抗原回收率仅为60.0％左右。因此，针对SADS-CoV这种新发现的病毒，需探索更有效的抗原纯化浓缩的方法。

通过对SADS-CoV病毒特性的深入分析，本发明提出了一种针对性的SADS-CoV抗原纯化浓缩方法，该方法主要采用深层过滤预处理和切向流过滤相结合的方式对SADS-CoV抗原进行纯化浓缩，使得在有效去除病毒液中的杂蛋白(杂蛋白的去除率高达98％以上)的同时，尽可能多(接近100％)地保留SADS-CoV抗原。

通过以下具体实施方式详细说明本发明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

以下实施例中使用的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统在使用前均先进行除菌及平衡，和完整性检测过程，具体为：

(1)除菌及平衡

用0.5mol/L的NaOH溶液循环清洗中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统30-60min，清洗后将中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统在0.5mol/L的NaOH溶液中浸泡过夜除菌。

(2)完整性检测

将(1)中浸泡在NaOH溶液中的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统取出，用纯化水清洗，待洗出液的pH值≤7.0时，向中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统施加0.08-0.1MP。使用洁净压缩空气进行检漏，若1min内无持续气泡逸出则为合格，备用；否则为不合格，取下不合格的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统并更换新的系统重复上述步骤，直至合格为止。用40mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0-7.2)溶液100L清洗检漏合格的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统，待洗出液的pH值≤7.5时，结束清洗待用。

为了多次利用中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统，还对使用后的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统进行原位消毒处理，具体为：纯化浓缩结束后，使用0.5mol/L的NaOH溶液循环清洗中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统30min，清洗后将中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统在0.5mol/L的NaOH溶液浸泡保存待用

实施例1：猪急性腹泻综合征冠状病毒液的纯化浓缩

(1.1)猪急性腹泻综合征冠状病毒液预处理

取猪急性腹泻综合征冠状病毒原液(弱毒或强毒，由金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室提供)，使用深层过滤滤膜(0.65μm≤滤膜孔径≤1.2μm，滤膜进出口压差控制在0.5MPa以内)进行过滤澄清，取滤出液，即为预处理后病毒液(病毒清液)。

(1.2)纯化浓缩(以10倍浓缩为例)

将(1.1)中病毒清液420L通过300KD中空纤维浓缩系统进行切向流过滤纯化浓缩，控制进口压力≤0.1MPa，控制透过端流速为1L/min，跨膜压差≤0.1MPa，浓缩倍数达到5倍时，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，以1L/min的流速连续流加至浓缩罐内进行洗滤，洗滤体积为420L磷酸盐缓冲溶液。洗滤结束后，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，流经中空纤维浓缩系统至浓缩罐内达到最终浓缩体积42L，得到猪急性腹泻综合征冠状病毒纯化浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的病毒液进行检测，结果见表1。

表1：纯化浓缩前后病毒液检测结果

由上表1记载的结果可知，将420L的猪急性腹泻综合征冠状病毒原液经深层过滤预处理、和切向流过滤纯化浓缩10倍后，其抗原回收率可达100％，即抗原没有损失，并且杂蛋白去除率可达98％以上，并且与切向流过滤纯化浓缩之前的病毒液相比，切向流过滤纯化浓缩后的病毒液中的蛋白含量明显降低。因此，本发明提供的方法可以对猪急性腹泻综合征冠状病毒原液进行纯化浓缩，深层过滤预处理和切向流过滤纯化浓缩处理共同作用，能够获得高纯度的猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原浓缩液(杂蛋白去除率达98％以上)，且病毒液中的抗原没有损失，抗原回收率为100％，并且各批次间无差异，可以为制备高质量的SADS-CoV病毒疫苗提供病毒抗原原料。

根据以上实施例结果也可知，利用本发明提供的纯化浓缩方法，单次可以处理100L以上，可选为300L-500L的猪急性腹泻综合症冠状病毒液，因此纯化浓缩效率高，该方法适合用于大规模工业化生产猪急性腹泻综合症冠状病毒抗原和大规模工业化生产猪急性腹泻综合症冠状病毒疫苗(例如灭活疫苗)。其中猪急性腹泻综合症冠状病毒灭活疫苗的制备方法可为将该实施例纯化浓缩后的病毒液经灭活(例如可采用β-丙内酯进行灭活)后与疫苗佐剂混合，其中疫苗佐剂可为常规使用的那些，例如氢氧化铝胶佐剂、弗氏佐剂、ISA206佐剂等。

实施例2：猪急性腹泻综合征冠状病毒液的纯化浓缩

(2.1)猪急性腹泻综合征冠状病毒液预处理

取猪急性腹泻综合征冠状病毒原液，使用深层过滤滤膜(0.65μm≤滤膜孔径≤1.2μm，滤膜进出口压差控制在0.5MPa以内)进行过滤澄清，取滤出液，即为预处理后病毒液(病毒清液)。

(2.2)纯化浓缩

将(2.1)中病毒清液350L通过200KD超滤膜包系统进行切向流过滤纯化浓缩，控制进口压力≤0.1MPa，控制透过端流速为2L/min，跨膜压差≤0.1MPa，浓缩倍数达到10倍时，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，以1L/min的流速连续流加至浓缩罐内进行洗滤，洗滤体积为350L磷酸盐缓冲溶液。洗滤结束后，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，流经超滤膜包系统至浓缩罐内达到最终浓缩体积35L，得到猪急性腹泻综合征冠状病毒纯化浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的病毒液进行检测，结果见表2。

表2：纯化浓缩后病毒液检测结果

由上表2记载的结果可知，将350L的猪急性腹泻综合征冠状病毒原液经深层过滤预处理、和切向流过滤纯化浓缩10倍后，其抗原回收率可达100％，即抗原没有损失，且杂蛋白去除率可达98％以上，并且与切向流过滤纯化浓缩之前的病毒液相比，切向流过滤纯化浓缩后的病毒液中的蛋白含量明显降低。因此，本发明提供的方法可以对猪急性腹泻综合征冠状病毒原液进行纯化浓缩，深层过滤预处理和切向流过滤纯化浓缩处理共同作用，能够获得高纯度的猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原浓缩液(杂蛋白去除率达98％以上)，且病毒液中的抗原没有损失，抗原回收率为100％。利用该纯化浓缩后的病毒液可以生产高质量高安全性的猪急性腹泻综合征冠状病毒疫苗。

实施例3：猪急性腹泻综合征冠状病毒液的纯化浓缩

(3.1)猪急性腹泻综合征冠状病毒液预处理

取灭活(按照病毒液体积的0.2‰加入β-丙内酯，4℃孵育24h，37℃水解2h，进行病毒灭活)后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液，使用深层过滤滤膜(0.65μm≤滤膜孔径≤1.2μm，滤膜进出口压差控制在0.5MPa以内)进行过滤澄清，取滤出液，即为预处理后病毒液(病毒清液)。

(3.2)纯化浓缩

将(3.1)中病毒清液400L通过300KD超滤膜包系统进行切向流过滤纯化浓缩，控制进口压力≤0.1MPa，控制透过端流速为1L/min，跨膜压差≤0.1MPa，浓缩倍数达到10倍时，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，以1L/min的流速连续流加至浓缩罐内进行洗滤，洗滤体积为400L磷酸盐缓冲溶液。洗滤结束后，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，流经超滤膜包系统至浓缩罐内达到最终浓缩体积40L，得到猪急性腹泻综合征冠状病毒纯化浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的病毒液进行检测，结果见表3。

表3：纯化浓缩后病毒液检测结果

由上表3记载的结果可知，将400L灭活后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液经深层过滤预处理、和切向流过滤纯化浓缩10倍后，其抗原回收率可达约100％，即抗原基本上没有损失，且杂蛋白去除率可达98％以上，并且与切向流过滤纯化浓缩之前的病毒液相比，切向流过滤纯化浓缩后的病毒液中的蛋白含量明显降低。因此，本发明提供的方法可以对灭活后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液进行纯化浓缩，深层过滤预处理和切向流过滤纯化浓缩处理共同作用，能够获得高纯度的猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原浓缩液(杂蛋白去除率达98％以上)，且病毒液中的抗原基本上没有损失，抗原回收率约为100％。利用该纯化浓缩后的病毒液可以生产高质量高安全性的猪急性腹泻综合征冠状病毒疫苗。

综上实施例1-3的结果可知，在本发明提供的方法中，深层过滤预处理和切向流过滤纯化浓缩两者相辅相成、共同作用，其中在深层过滤中可以去除病毒液(可以为培养病毒所收获的病毒原液，也可以是经病毒原液灭活后的病毒液)中较多的杂蛋白，为后续的切向流过滤纯化浓缩奠定良好的条件，并且不会导致病毒抗原的损失，在后续的切向流过滤纯化浓缩中则在对病毒液进行浓缩的同时去除剩余的杂蛋白，且也基本上不会导致病毒抗原的损失，最终能够获得高纯度的猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原浓缩液(杂蛋白去除率达98％以上)，且病毒液中的抗原基本上没有损失，抗原回收率约为100％，因此可以为制备高质量的SADS-CoV病毒疫苗提供稳定且高质量的病毒抗原原料。

比较例1：猪急性腹泻综合征冠状病毒液的纯化浓缩

(1)猪急性腹泻综合征冠状病毒液预处理

取灭活(按照病毒液体积的0.2‰加入β-丙内酯，4℃孵育24h，37℃水解2h，进行病毒灭活)后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液，通过间歇式高速离心机12000rpm/min离心20min，弃去沉淀，取上清(病毒清液)备用。

(2)纯化浓缩

将(1)中病毒清液100L通过300KD超滤膜包系统进行切向流过滤纯化浓缩，控制进口压力≤0.1MPa，控制透过端流速为1L/min，跨膜压差≤0.1MPa，浓缩倍数达到10倍时，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，以1L/min的流速连续流加至浓缩罐内进行洗滤，洗滤体积为100L磷酸盐缓冲溶液。洗滤结束后，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，流经超滤膜包系统至浓缩罐内达到最终浓缩体积10L，得到猪急性腹泻综合征冠状病毒纯化浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的病毒液进行检测，结果见表4。

表4：纯化浓缩后病毒液检测结果

由上表4记载的结果可知，将100L灭活后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液经离心预处理、和切向流过滤纯化浓缩10倍后，虽然杂蛋白的去除率也较高，达到95％左右，但是平均抗原回收率仅为77.7％左右，即有部分抗原损失。因此，虽然可以利用离心和切向流过滤纯化浓缩的方式对灭活的猪急性腹泻综合征冠状病毒液进行纯化浓缩，并去除了较多的杂蛋白(95％左右)，但是对于抗原的回收并不利(平均抗原回收率仅为77.7％左右)。另一方面，根据上表4记载的结果也可知，通过离心的方式只能去除猪急性腹泻综合征冠状病毒液中的少量杂质或沉淀，对杂蛋白的去除无义，反而会导致病毒抗原损失，并且在后续的切向流纯化浓缩过程中，可能由于猪急性腹泻综合征冠状病毒液中的杂蛋白含量过高，而影响最终的杂蛋白的去除率，并会导致切向流过滤纯化浓缩中病毒抗原的损失，使得最终的平均抗原回收率仅为77.7％左右。再者，采用离心的方式对灭活的猪急性腹泻综合征冠状病毒液进行预处理对于大规模工业化生产猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原不利，会降低生产效率。

比较例2：猪急性腹泻综合征冠状病毒灭活毒液的蔗糖密度梯度离心法纯化浓缩

取灭活(按照病毒液体积的0.2‰加入β-丙内酯，4℃孵育24h，37℃水解2h，进行病毒灭活)的猪急性腹泻综合征冠状病毒液30ml，4℃，8000rpm/min离心30min，取上清；向超速离心管中依次加入70％、55％、40％蔗糖溶液形成密度梯度；向铺好蔗糖密度梯度的超速离心管中加入2ml灭活病毒离心后上清；30000rpm/min，离心3.5小时；用长针头吸取蔗糖密度为55％与70％之间明亮的区带，得到猪急性腹泻综合征冠状病毒浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的病毒液进行检测，结果见表5。

表5：浓缩前后检测结果

由上表5记载的结果可知，利用蔗糖密度梯度离心法对灭活后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液进行纯化浓缩，其杂蛋白的去除率可达99％左右，但是抗原回收率仅为50％左右，即在纯化浓缩过程中有约50％的病毒抗原损失，这对于大规模高效生产猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原及其疫苗是不利的，会造成生产效率大幅降低以及生产成本大幅上升。

比较例3：猪急性腹泻综合征冠状病毒液的聚乙二醇(PEG)沉淀法纯化浓缩

(1)取灭活(按照病毒液体积的0.2‰加入β-丙内酯，4℃孵育24h，37℃水解2h，进行病毒灭活)后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液，使用深层过滤滤膜(0.65μm≤滤膜孔径≤1.2μm，滤膜进出口压差控制在0.5MPa以内)进行过滤澄清，取滤出液，即为预处理后病毒液(病毒清液)。

(2)取预处理后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液350ml，4℃，8000rpm/min离心30min，取上清；向离心上清液中加入终浓度为9％(w/v)的PEG 8000，4℃，搅拌1h，9000rpm/min，离心30min，弃掉上清液，用冷却的40mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PH＝7.0-7.2)将沉淀重悬至终体积35ml，得到猪急性腹泻综合征冠状病毒灭活浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的病毒液进行检测，结果见表6。

表6：纯化浓缩前后检测结果

由上表6记载的结果可知，利用深层过滤结合聚乙二醇(PEG)沉淀法对灭活后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液进行纯化浓缩，其杂蛋白的去除率可达95％左右，但是抗原回收率仅为50％左右，即在纯化浓缩过程中有约50％的病毒抗原损失，这对于大规模高效生产猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原及其疫苗是不利的，会造成生产效率大幅降低以及生产成本大幅上升。

比较例4：猪急性腹泻综合征冠状病毒液的纯化浓缩

将灭活(按照病毒液体积的0.2‰加入β-丙内酯，4℃孵育24h，37℃水解2h，进行病毒灭活)后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液100L通过300KD超滤膜包系统进行切向流过滤纯化浓缩，控制进口压力≤0.1MPa，控制透过端流速为1L/min，跨膜压差≤0.1MPa，浓缩倍数达到10倍时，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，以1L/min的流速连续流加至浓缩罐内进行洗滤，洗滤体积为100L磷酸盐缓冲溶液。洗滤结束后，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，流经超滤膜包系统至浓缩罐内达到最终浓缩体积10L，得到猪急性腹泻综合征冠状病毒纯化浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的病毒液进行检测，结果见表7。

表7：纯化浓缩后病毒液检测结果

由上表7记载的结果可知，将100L灭活后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液不经深层过滤预处理操作，而只经切向流过滤纯化浓缩10倍后，虽然杂蛋白的去除率也较高，达到94％左右，但是平均抗原回收率仅为约60.0％，即会有较多抗原损失。可见，当对猪急性腹泻综合征冠状病毒液进行纯化浓缩时，如果不首先经过深层过滤预处理去除病毒液中部分杂蛋白，会影响到最终对病毒液的纯化浓缩效果，与实施例1-3中采用深层预处理和切向流过滤相结合的方式相比，会显著降低抗原的回收率和蛋白的去除率。

比较例5：猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的纯化浓缩

(1)猪流行性腹泻病毒液的制备

当生物反应器中培养的悬浮ST细胞密度达到约7×10⁶-8×10⁶个/mL时，用培养液将细胞密度稀释至2×10⁶-3×10⁶个/mL，加入终浓度为10μg/mL的胰酶，将作为种毒的PEDV弱毒株(CCTCC NO：V202007)按1％的培养体积比接种猪流行性腹泻病毒，37℃继续培养，pH为7.2，DO为50％，转速为75rpm。接毒后24-72h，细胞病变达80％以上时收获病毒，吸取自然沉淀的病毒上清液，作为猪流行性腹泻病毒原液，备用。

(2)猪流行性腹泻病毒液的预处理

取猪流行性腹泻病毒原液，使用深层过滤滤膜(0.65μm≤滤膜孔径≤1.2μm，滤膜进出口压差控制在0.5MPa以内)进行过滤澄清，取滤出液，即为预处理后病毒液(病毒清液)。

(3)纯化浓缩

将(2)中病毒清液350L通过300KD超滤膜包系统进行切向流过滤纯化浓缩，控制进口压力≤0.1MPa，控制透过端流速为1L/min，跨膜压差≤0.1MPa，浓缩倍数达到5倍时，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，以1L/min的流速连续流加至浓缩罐内进行洗滤，洗滤体积为350L磷酸盐缓冲溶液。洗滤结束后，使用20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0-7.2)，流经超滤膜包系统至浓缩罐内达到最终浓缩体积35L，得到猪流行性腹泻病毒纯化浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的病毒液进行检测，结果见表8。

表8：纯化浓缩后病毒液检测结果

由上表8记载的结果可知，将350L的猪流行性腹泻病毒原液经深层过滤预处理、和切向流过滤纯化浓缩10倍后，其杂蛋白的去除率可达97％左右，但是抗原回收率仅为56.2％左右，即在纯化浓缩过程中有约40％以上的猪流行性腹泻病毒抗原损失。可见，虽然猪流行性腹泻病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒同属于冠状病毒属，并且都会引起猪的腹泻症状，但是用同样的纯化浓缩方式(深层过滤预处理和切向流过滤纯化浓缩)对两种病毒原液分别进行纯化浓缩时，会产生不同的结果，即会导致猪流行性腹泻病毒抗原在纯化浓缩过程中发生大量损失，而可以基本上全部回收猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原，抗原回收率可达约100％，其中可能的原因是猪流行性腹泻病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒对切向流过滤系统中在过滤介质表面产生的剪切力的敏感性不同，即猪流行性腹泻病毒抗原对剪切力比较敏感，产生的剪切力可能会容易破坏猪流行性腹泻病毒抗原的完整性，造成病毒抗原的损失。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的纯化浓缩方法，其包括对猪急性腹泻综合征冠状病毒液进行深层过滤预处理，和对预处理后的病毒液进行切向流过滤纯化浓缩处理，使得处理过程中病毒抗原基本不损失(病毒抗原损失率小于10％，可选为损失率小于5％，进一步可选为损失率小于2％)，且基本上去除所有蛋白(蛋白去除率为98％以上)。

2.根据权利要求1所述的纯化浓缩方法，其中，所述深层过滤预处理为采用深层过滤滤膜对所述猪急性腹泻综合征冠状病毒液进行滤过处理，其中所述深层过滤滤膜的孔径为0.65μm-1.2μm。

3.根据权利要求1或2所述的纯化浓缩方法，其中，所述切向流过滤纯化浓缩处理采用中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统对所述预处理后的病毒液进行纯化浓缩处理。

4.根据权利要求3所述的纯化浓缩方法，其中，所述对预处理后的病毒液进行切向流过滤纯化浓缩处理的操作包括：

S1：将所述预处理后的病毒液置于所述中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统中进行切向流过滤纯化浓缩处理，控制进口压力≤0.1MPa，控制透过端流速为1-3L/min，控制跨膜压差≤0.1MPa；

S2：当浓缩至预定倍数时，使用磷酸盐缓冲液进行洗滤；

S3：洗滤结束后，使用预定量的磷酸盐缓冲液流经所述中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统收集纯化浓缩后的病毒液。

5.根据权利要求3或4所述的纯化浓缩方法，其中，所述中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统的截留猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的孔径为100-300KD，使得10倍或10倍以上浓缩液中病毒抗原的含量为10^8.75TCID₅₀/ml以上(可选为10^9.00TCID₅₀/ml以上)或20μg/ml以上，且蛋白的含量为250μg/ml以下(可选为220μg/ml以下)。

6.根据权利要求4或5所述的纯化浓缩方法，其中，步骤S2中所述磷酸盐缓冲液的流速为1-3L/min。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的纯化浓缩方法，其中，所述猪急性腹泻综合征冠状病毒液为培养猪急性腹泻综合征冠状病毒所收获的病毒上清液，或经灭活后的猪急性腹泻综合征冠状病毒液。

8.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒的纯化浓缩液，其由权利要求1-7中任一项所述的方法制备，其中浓缩10倍或以上的猪急性腹泻综合征冠状病毒的纯化浓缩液中蛋白的含量为250μg/ml以下(可选为220μg/ml以下)，病毒抗原的含量为10^8.75TCID₅₀/ml以上(可选为10^9.00TCID₅₀/ml以上)或20μg/ml以上。

9.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒灭活疫苗的制备方法，其包括将权利要求8所述的猪急性腹泻综合征冠状病毒的纯化浓缩液与免疫佐剂混合。

10.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒灭活疫苗，其由权利要求9所述的制备方法获得。