WO2020251405A1 - Получение антигена или антигенов для противогриппозной вакцины - Google Patents

Получение антигена или антигенов для противогриппозной вакцины Download PDF

Info

Publication number
WO2020251405A1
WO2020251405A1 PCT/RU2020/050107 RU2020050107W WO2020251405A1 WO 2020251405 A1 WO2020251405 A1 WO 2020251405A1 RU 2020050107 W RU2020050107 W RU 2020050107W WO 2020251405 A1 WO2020251405 A1 WO 2020251405A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antigen
virus
antigens
influenza
vaccine
Prior art date
Application number
PCT/RU2020/050107
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Виктор Павлович ТРУХИН
Анатолий Эдуардович ЕВТУШЕНКО
Игорь Викторович Красильников
Наталья Николаевна САВИНА
Станислав Валентинович УЙБА
Андрей Николаевич ВАСИЛЬЕВ
Елена Владимировна РЫСЬКОВА
Дмитрий Геннадьевич БЫКОВ
Елена Петровна НАЧАРОВА
Сергей Александрович АРАКЕЛОВ
Original Assignee
Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Санкт-Петербургский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток И Предприятие По Производству Бактерийных Препаратов" Федерального Медико- Биологического Агентства
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Санкт-Петербургский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток И Предприятие По Производству Бактерийных Препаратов" Федерального Медико- Биологического Агентства filed Critical Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Санкт-Петербургский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток И Предприятие По Производству Бактерийных Препаратов" Федерального Медико- Биологического Агентства
Publication of WO2020251405A1 publication Critical patent/WO2020251405A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses

Definitions

  • the invention relates to immunology, medicine, pharmacology and can be used for the production of inactivated influenza vaccines that can be used to vaccinate the population against influenza.
  • inactivated vaccines are divided into whole-virion, split, subunit, and virosomal.
  • Split vaccines occupy a significant part of the global market for inactivated vaccines. This is due to the fact that these vaccines are highly immunogenic, like whole virion vaccines, but their reactogenicity is significantly lower than that of whole virion vaccines. Subunit vaccines have very low reactogenicity, but their immunogenicity is inferior to that of split influenza vaccines.
  • a known method of obtaining a vaccinated substance by culturing vaccine strains of the influenza virus in a culture of MDCK cells on a nutrient medium, purifying the viral substance from ballast impurities, introducing stabilizing additives into the purified substance and drying the finished vaccine form (patent RU 2330885, publ. 08/10/2008).
  • the disadvantage of this method is the inability to obtain antigen for creating a vaccine on an industrial scale.
  • the disadvantage of this method is the insufficient degree of purification of the antigen from ovalbumin.
  • the closest analogue of the claimed invention is a method for producing influenza virus antigens, including infecting chick embryos with influenza virus, incubating embryos, cooling embryos, collecting virus-containing allantoic fluid (VAS), processing VAS for disaggregation and subsequent inactivation, microfiltration of VAS, ultrafiltration of VAZ and concentrate (patent RU 2584594, publ. 20.05.2016).
  • VAS virus-containing allantoic fluid
  • processing VAS for disaggregation and subsequent inactivation microfiltration of VAS
  • ultrafiltration of VAZ ultrafiltration of VAZ and concentrate
  • the problem to be solved by the present invention is to develop a new technology for the production of antigen and / or antigens of the influenza virus for the production of a Russian inactivated vaccine, which will make it possible to produce in our country a vaccine with a world quality level, the required degree of purification.
  • the technical result of the proposed invention consists in the development of an industrial method for producing antigen and / or antigens of the influenza virus of high purity for the production of Russian inactivated vaccine, which can be used for mass vaccination of the population.
  • This is achieved by the fact that, in the proposed method, we carry out the disaggregation of viruses during the treatment of VFA with sodium chloride in a final concentration of 0.23-0.30 Mole, inactivation of viral activity using b-propiolactone, purification of VAZ is carried out by microfiltration methods using a cascade of three filters with pore diameters of 10 ⁇ m, 1 ⁇ m, 0.6 ⁇ m and ultrafiltration with a cut-off limit of 300 kDa, followed by purification by double ultracentrifugation in sucrose density gradient, the subsequent purification of the antigen or antigens is carried out on a chromatographic carrier, and the stabilization of the obtained antigen or antigens or the finished dosage form is carried out using the detergent Triton X-100 at a concentration of
  • a method for obtaining antigen or antigens of the influenza virus including obtaining chicken embryos (CE), their disinfection, pre-incubation, infection with a working solution of the inoculum virus, incubation of infected CEs, cooling after incubation, collection of virus-containing allantoic fluid, disaggregation of isolated viruses by adding a NaCl solution to a final concentration of 0.23-0.30 M, inactivating them by adding b-propiolactone to a final concentration of 0.1%, and purifying VAS by microfiltration methods using a cascade of three filters with a pore diameter of 10 ⁇ m, 1 ⁇ m, 0.6 ⁇ m and ultrafiltration with a cut-off limit of 300 kDa, then the clarified vaccinated allantoic fluid is concentrated by no more than 20 times, the concentrate is purified by double ultracentrifugation in a sucrose density gradient, after which the inactivated viral concentrate is cleaved using detergent h-
  • an influenza vaccine is proposed containing an antigen or antigens obtained by the above method, and it may contain 1, 3 or 4 antigens.
  • the claimed production method consists of several technological stages:
  • the first stage consists in obtaining HAF and consists of several stages: obtaining chicken embryos (CE), their disinfection, preliminary incubation, infection with a working solution of inoculum virus, incubation of infected CEs, cooling after incubation, collection of HAF and purification of HAF.
  • CE chicken embryos
  • Incubation hen eggs are obtained only from clinically healthy birds from epizootologically safe poultry farms, free from infectious and invasive diseases. The quality of the supplied eggs is confirmed by a veterinary certificate.
  • the fertilized egg is placed in an incubator for incubation.
  • Disinfection of EC is carried out by spraying a disinfectant solution of 0.5% RZ-oxonium active 150 or another approved agent.
  • the process of infection of 9-11 daily CEs is carried out under aseptic conditions.
  • the container with the working solution of the inoculum virus is connected to an inoculator manufactured by Rame-Hart, USA, or similar equipment. Processing of EC shells and needles during the infection process, it is carried out with ethyl alcohol.
  • each CE is injected with (0.20 ⁇ 0.02) ml of the working dilution of the inoculum virus.
  • the needles of the infection boards are automatically disinfected with 70% ethyl alcohol after each puncture of the EC shell.
  • Controlled CEs are transferred to the incubation stage of infected CEs.
  • Chicken embryos infected with the influenza virus are incubated in the technological mode (temperature, relative humidity) in accordance with the modes specified in the strain passports or selected as a result of research.
  • the incubation time is usually 35 to 50 hours, and for type B viruses it is 50 to 65 hours, and the relative humidity is 55 to 65%.
  • Cooling of the CE is carried out in the refrigerating chamber for 12 to 20 hours at a temperature of (5 ⁇ 3) ° ⁇ .
  • the collection of VAZ is carried out using an automatic line for the collection of allantoic fluid (harvester) manufactured by Rame-Hart, USA. On this line, CE decapitation, their visual rejection (dead CEs, incubation defects, battle) and collection of VAS are carried out in aseptic conditions in an automatic mode.
  • the collected VAZ is pumped into the reactor using pumps.
  • the reactor Before the start of the collection of VAS, the reactor is cooled using water and a cooling device to the final temperature in the reactor (6 ⁇ 2) ° C.
  • a cooling device At the end of the collection of VAS using a pump, add a sterile solution of 2.5 M NaCl to a final concentration of 0.23-0.3 M to prevent aggregation and b-propiolactone to a final concentration of 0.1% to inactivate the virus.
  • the contents are stirred for 1 - 2 hours. After stirring, the stirrer is turned off and the contents of the reactor are left to stand for at least 6 hours. Selected time must ensure the inactivation of the influenza virus and foreign agents pathogenic for humans.
  • Stage 2 consists in purifying VAZ using micro- and ultrafiltration methods and purifying the resulting VAZ concentrate by ultracentrifugation in a sucrose density gradient.
  • Purification and concentration of VAS by micro- and ultrafiltration is carried out on a combined micro- and ultrafiltration unit in compliance with the rules of asepsis in the laminar flow zone.
  • After processing and inactivation of the VAS from the reactor using a pump it is fed to the microfiltration unit and passed through a cascade of depth filters with pore diameters of 10 ⁇ m, 1 ⁇ m, 0.6 ⁇ m into a sterile container.
  • the clarified VAZ obtained as a result of microfiltration is fed with a pump to an ultrafiltration unit with Pellicon 2 Biomax-ZOO cassette modules or similar with a cut-off limit of 300 kDa for further purification and concentration of VAZ. Concentration of the clarified VAZ is carried out no more than 20 times.
  • fractions of the inactivated viral concentrate are unloaded in a sterile box. Collect 20 fractions of the gradient contained in the rotor density of sucrose: the first two fractions, 200 ml each, the next - 100 ml. A sample is taken from each vial to control hemagglutinating activity (HA titer) and% sucrose content. After taking a sample, each bottle is closed with a silicone stopper and placed in a refrigerator for storage at a temperature of (5 ⁇ 3) ° ⁇ for up to 3 days. For further processing, fractions of inactivated VC are used with a HA titer of at least 1: 8000 and containing (28-51)% sucrose.
  • fractions of inactivated viral influenza concentrate purified influenza virus, inactivated VK, secondary VK fractions
  • a hemagglutinating activity titer of at least 1: 16000 and containing (19-50)% sucrose.
  • 80 ml of glycerin are added to the selected VC fractions, the vials are mixed, closed with silicone stoppers and transferred to a freezer for storage at a temperature from minus 9 to minus 15 ° C for a period not exceeding 6 months. It is allowed to store fractions at a temperature of (5 ⁇ 3) ° ⁇ without adding glycerin for up to 3 days.
  • Stage 3 includes the cleavage of inactivated viral particles from the obtained concentrates, the precipitation of underdestructed virions and complexes of ribonucleoproteins with membrane protein by ultracentrifugation, micro- and ultrafiltration, chromatographic purification and sterilizing filtration of antigens (monovaccines).
  • the cleavage of viral particles is carried out using a detergent octylglucoside or TDTAB.
  • the sample obtained using the detergent TDTAB forms weakly colored precipitation rings with indistinct boundaries (rows N ° 2 and N ° 5), which differ significantly in morphology from the rings of precipitation of the international standard antigen manufactured by NIBSC, UK (rows N ° 3 and N ° 6).
  • the protein / detergent ratio is selected, at which the yield of specific activity was within the maximum value, taking into account the results of the assessment of the polypeptide composition of the test samples.
  • the determination of the optimal detergent and the protein / detergent ratio is carried out for each serotype separately when changing the production strain, since they may have sensitivity to one or another detergent or when changing a batch of detergent, since due to strain differences and fluctuations in detergent properties from batch to batch, the optimal the protein / detergent ratio may vary.
  • the sedimentation of core structures (underdeveloped virions and complexes of ribonucleoproteins with a membrane protein) and aggregated virions from the resulting viral lysate is carried out by centrifugation (Fig. 4 - Electrophoregram of sediment from a centrifuge rotor and viral concentrate using the example of strain A / Michigan / 45/2015 (H1N1) , where 1 - viral concentrate, 2 - sediment from the centrifuge rotor, 3 - molecular weight markers).
  • the split VC is centrifuged in a closed cycle.
  • FIG. 4 shows the effectiveness of using centrifugation to remove non-protective proteins of the influenza virus.
  • the obtained supernatant of the influenza virus is passed using a peristaltic pump into a sterile glass container through depth filters, the pore diameter of which is 0.6 and 0.2 ⁇ m respectively at a pressure of not more than 0.5 bar.
  • the filtered supernatant, using a peristaltic pump, is passed through an ultrafiltration unit with membrane cassettes with a cutoff of 30 kDa to concentrate the material.
  • FIG. 5 shows a typical chromatogram of the removal of residues of impurities of the technological process using chromatographic purification, where 1 - Antigen, 2 - Ovalbumin, 3 - Sucrose, 4 - Octyl glucoside.
  • the material is transferred to sterilizing filtration.
  • a purified supernatant is poured into a reactor prepared in advance for operation, PBS is added to a hemagglutinin concentration of at least 100 ⁇ g / ml, it is also possible to add Triton X-100 to a final concentration of 100-200 ⁇ g / ml and stir at a speed of 200-220 rpm for 15-20 minutes at room temperature.
  • the obtained antigen (monovaccine) of the influenza virus is filtered using a sterile sterilizing capsule with pore size 0.22 ⁇ m (or less), membrane material polyethersulfone in a sterile disposable polymer container.
  • the resulting sterile monovaccine is transported to pharmaceutical refrigerators and stored at a temperature of (5 ⁇ 3) ° ⁇ for no more than a year.
  • Stage 4 - includes the mixing of vaccine components, sterilizing filtration of the vaccine, filling the drug into ampoules or vials, labeling and packaging.
  • the process of obtaining a trivalent influenza vaccine includes the mixing of antigens (monovaccines) of 3 types of influenza A (H1N1), A (H3N2) and B, with 1% solution of detergent Triton X-100, 1% solution of thiomersal (for preparations containing preservative) and FBI in the reactor.
  • the process of obtaining a quadrivalent influenza vaccine includes the mixing of antigens (monovaccines) of 4 types of influenza A (H1N1), A (H3N2), B / Yamagata lineage and B / Victoria lineage, with 1% solution of Triton X-100 detergent, 1 % thiomersal solution (for preparations containing a preservative) and PBS in a reactor with a capacity of 200 liters.
  • Semi-finished antigens (monovaccines) of the influenza virus, which have passed all the controls, are loaded from sterile disposable containers under aseptic conditions into the reactor.
  • the calculated amounts of PBS, 1% thiomersal solution to a final concentration (85-115) ⁇ g / ml (for a preparation containing a preservative) and a 1% solution of Triton X-100 detergent to a final concentration of 100-200 ⁇ g / ml are added to the reactor.
  • the contents of the reactor are stirred at a stirrer speed of 400 rpm for 15 minutes. Then turn off the mixer and settle the semi-finished product for 10 minutes. After settling, a sample is taken to control the semi-finished vaccine.
  • the filling of the drug in ampoules or vials is carried out under aseptic conditions.
  • the sterility of the process and the extractable volume (filling dose) of the drug are monitored.
  • the drug is transferred to the quarantine warehouse and stored at a temperature of 2 to 8 ° C.
  • Ampoules or vials with the finished dosage form of the drug are taken from the quarantine warehouse and controlled in accordance with the requirements of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation for the following quality indicators of influenza vaccines: description, authenticity, pH, total protein, sterility, bacterial endotoxins, abnormal toxicity, specific safety, specific activity of hemagglutinin, thiomersal (for a preparation containing a preservative), ovalbumin, Triton X-100, immunogenicity and reactogenicity.
  • Example 1 Obtaining antigen (monovaccine) of influenza virus serotype H3N2
  • the 5-pass level of the reassortant virus A / Singapore / INFIMH-16-GO 19/2017-like / (IVR-186) / H3N2 was used as a working solution.
  • a reassortant strain for the production of inactivated influenza vaccines was obtained from WHO. 60,061 pieces of eleven daily TBEs were infected with a dose working solution of inoculum virus having an infectious titer of 103.66 EID50 in 0.2 ml. Post-infection incubation was carried out at 35 ° C and 60% relative humidity for 45-48 hours. Post-incubation cooling was carried out in a cold chamber at (5 ⁇ 3) ° C for 12-15 hours.
  • the VAZ was collected in a reactor in a volume of 550 liters.
  • 50-70 L of a 2.5 M NaCl solution was added to the reactor with the collected VAF, followed by stirring, after which 0.55 L of b-propiolactone was added. Inactivation took place at a temperature of (6 ⁇ 2) ° C for 10 hours.
  • 40 liters of VAF concentrate were obtained, which were transferred for purification in a sucrose density gradient by ultracentrifugation. From the gradient were selected 700 ml (7 fractions) with the optimal concentration of sucrose and the titer of hemagglutinin (HA).
  • This volume of viral concentrate (VC) contained 13.2 g of protein (determination was carried out by the Bradford method) and 6.0 g of GA (determination was carried out by the ORID method).
  • the entire amount of the combined VC 700 ml was used to prepare one batch of monovaccine.
  • 198 g of octylglucoside detergent manufactured by Carbosynh Limited, Great Britain were used.
  • the lysate volume after digestion was 12 liters.
  • the rotor was washed with 5 L of Tris buffer at a liquid flow rate of 14 to 16 L / h.
  • the total volume of the material was 17 liters.
  • the material was filtered in a microfiltration unit.
  • the supernatant was concentrated using cassettes with a cutoff of 30 kDa to 2.0 L, chromatography was performed at room temperature. By optical density, a peak was collected volume of 2.9 liters, protein was determined in it by the Bradford method.
  • the total amount of protein in the peak was 7.0 g.
  • the material was diluted to a final protein concentration of up to 300 ⁇ g / ml with PBS buffer.
  • the resulting mixture was thoroughly mixed for 15 minutes.
  • the semi-finished product was filtered through a 0.22 ⁇ m disposable filter element.
  • the resulting antigen (monovaccine) with a volume of 23.0 liters is transferred to a pharmaceutical refrigerator and stored at a temperature of (5 ⁇ 3) ° ⁇ for no more than 12 months.
  • the resulting antigen (monovaccine) of the influenza virus 4.05 g of hemagglutinin was determined, while in the combined VC there was 6.00 g of hemagglutinin.
  • the efficiency of the technology for the release of hemagglutinin is 67.5%.
  • the obtained antigen contains hemagglutinin trimers, uncleaved hemagglutinin (HA0), hemagglutinin heavy chain (HA1), and a certain amount of nucleocapsid protein (NP) and neuraminidase (NA).
  • the original pooled VC from which this antigen (monovaccine) of the influenza virus was produced, also contains the Ml polypeptide (membrane protein) and significant amounts of the NP protein. This indicates that the resulting preparation is highly purified and does not contain uncleaved viral particles.
  • Example 2 Obtaining antigen (monovaccine) of influenza virus type B / Yamagata lineage
  • the obtained antigen (monovaccine) of the influenza virus contains hemagglutinin trimers and dimers, uncleaved hemagglutinin (HA0), severe and hemagglutinin light chain (HA1 and HA2) and some nucleocapsid protein (NP) and neuraminidase (NA).
  • the original pooled VC, from which this antigen (monovaccine) of the influenza virus was produced also contains the Ml polypeptide (membrane protein) and significant amounts of the NP protein. This indicates that the resulting preparation is highly purified and does not contain uncleaved viral particles.
  • Example 3 Obtaining antigen (monovaccine) of influenza virus type B / Victoria lineage
  • FIG. 8 Electropherogram of the antigen (monovaccine) of the influenza B / Magu land / 15/2016-like virus, where 1 is the combined VC, 2 is the antigen (monovaccine) of the influenza B / Maryland / 15/2016-like virus, 3 are molecular weight markers.
  • the obtained antigen (monovaccine) of the influenza virus contains hemagglutinin trimers and dimers, uncleaved hemagglutinin (HA0), hemagglutinin heavy and light chains (HA1 and HA2), and some amount of nucleocapsid protein (NP) and neuraminidase (NA).
  • the original pooled VC, from which this antigen (monovaccine) of the influenza virus was produced also contains the Ml polypeptide (membrane protein) and significant amounts of the NP protein. This indicates that the resulting preparation is highly purified and does not contain uncleaved viral particles.
  • Example 4 Obtaining antigen (monovaccine) of influenza virus serotype H1N1
  • the obtained antigen (monovaccine) of the influenza virus contains hemagglutinin trimers, uncleaved hemagglutinin (HA0), hemagglutinin heavy chain (HA1), and a certain amount of nucleocapsid protein (NP) and neuraminidase (NA).
  • the original pooled VC, from which this antigen (monovaccine) of the influenza virus was produced also contains the Ml polypeptide (membrane protein) and significant amounts of the NP protein. This indicates that the resulting preparation is highly purified and does not contain uncleaved viral particles.
  • sterile solutions of the obtained antigens (monovaccines) of serotypes A (H1N1), A (H3N2) and B were selected and, under aseptic conditions, they were added to the reactor in an amount of 7.4 liters, 9.1 or 7.4 liters. , respectively. Then there was added PBS M in an amount of 25.2 l and 0.9 l of 1% solution of Triton X-100 so that the final solution had a concentration of GA for all serotypes equal to 16 ⁇ g / dose.
  • the contents of the reactor were stirred for 15 min at a speed of 400 rpm, the stirrer was turned off, the semi-finished product was defended for 10 min and filtered through a disposable sterile filter capsule with a pore diameter of 0.22 ⁇ m into a sterile plastic container.
  • the volume of the semi-finished product after adding all the components corresponded to 50 liters.
  • the contents of the reactor were stirred for 15 min at a speed of 400 rpm, the stirrer was turned off, the semi-finished product was defended for 10 min and filtered through a disposable sterile filter capsule with a pore diameter of 0.22 ⁇ m into a sterile plastic container.
  • the volume of the semi-finished product after adding all the components corresponded to 50 liters.
  • the container with the vaccine was transferred for filling into ampoules.
  • the drug was filled into 1 ml ampoules with 0.6 ml of tetravalent vaccine in each ampoule.
  • 80,000 ampoules were received, which were checked for the presence of mechanical impurities. As a result, 800 ampoules were rejected for this indicator.
  • the rest of the ampoules were sent to a temporary storage warehouse with a temperature of (6 ⁇ 2) ° ⁇ .
  • the obtained stabilized dosage forms of the proposed vaccines were analyzed for some biochemical indicators of the quality of influenza vaccines in comparison with the Vaxigripp® vaccine (inactivated split vaccine for the prevention of influenza - Sanofi Pasteur S.A., France), Ultrix® (influenza vaccine inactivated split - FORT LLC, Russia), Grippol® quadrivalent (tetravalent inactivated influenza vaccine subunit adjuvant - NPO Petrovax Pharm LLC, Russia).
  • the results obtained are shown in Table N ° 2.
  • the obtained stabilized dosage forms of the proposed vaccines are not inferior in quality to other inactivated influenza vaccines registered in Russia.
  • quality indicators such as the ovalbumin content or the ratio of total protein to hemagglutinin, they even exceed other influenza vaccines, both Russian and foreign.
  • a marker of the presence of components of the producing organism in the antigens (monovaccines) of the influenza virus is the ovalbumin protein contained in the allantoic fluid of EC.
  • This impurity is an important indicator of the quality of any vaccine, the antigen of which was obtained by culturing the vaccine strain in EC.
  • the content of this protein can be interpreted as an integral indicator of the technology's ability to purify the drug from high-molecular impurities, ovalbumin requires special control due to its reactogenicity.
  • antigens of the influenza virus which can potentially contain ovalbumin and other proteins of the chicken embryo, are strictly contraindicated in persons with confirmed anaphylactic hypersensitivity, and vaccination of persons with a history of allergic reactions to chicken proteins should be carried out with extreme caution. Since among the existing anti-influenza drugs on the market there are vaccines with different levels of ovalbumin content, people with an allergy to chicken protein are advised to select drugs whose specification allows the lowest permissible ovalbumin concentration threshold.
  • the study of the immunogenicity of the proposed quadrivalent vaccine was carried out with a two-fold intramuscular injection of the vaccine to female Balb / c mice (6-8 weeks, weighing (17.08 ⁇ 0.03) g) in doses corresponding to 1 (group 1) and 1/2 inoculation dose for a person (group 2).
  • the third group of mice was injected with the comparison vaccine 1 Grippol® Quadrivalent twice intramuscularly in 1 dose for humans.
  • Comparative vaccine 2 - a trivalent vaccine of the invention was administered to the mice of group 4 twice intramuscularly in 1 human dose.
  • the control group of mice (group 5) was injected intramuscularly with 0.5 ml of 0.9% sodium chloride solution. The number of mice in each group was 10. Blood was taken from mice of the experimental and control groups on the 14th and 28th days of the study.
  • mice are considered not susceptible to influenza infection and are "naive" for influenza antigens, a single injection of influenza vaccine is not enough to development of a full-fledged immune response. Therefore, to develop a full-fledged immune response, the study drug and the reference drugs were injected intramuscularly in Balb / c mice (the route that is intended for clinical use of the study drug) twice with an interval of 14 days.
  • CCT Geometric mean titers
  • CCT Geometric mean titers
  • CCT Geometric mean titers
  • CCT Geometric mean titers
  • Example 9 Study of the comparative immunogenicity of the obtained trivalent vaccine and Vaxigripp® vaccine in the course of a clinical study on volunteers
  • Multiplicity of increase in antibody titer after vaccination > 2.5 in persons aged 18 to 60 years;
  • the level of seroconversion (increase in the titer of antibodies to HA not less than 4 times):> 40% for persons aged 18 to 60 years;
  • Seroprotection rate (number of persons with protective titer> 40):> 70% for persons aged 18 to 60 years.
  • the proposed trivalent and tetravalent vaccines are safe and well tolerated. Against the background of the use of vaccines, the death of animals was not observed, the deterioration of their condition, loss of body weight, increase in temperature were not established, a negative effect on the reproductive, immune system was not noted. It is worth noting that the proposed vaccines caused some allergic reaction when administered to guinea pigs, however, these effects were observed when a 10-fold dose was administered, and in addition, the manifestation of allergic reactions is acceptable for immunobiological preparations.
  • Example 11 Study of the safety of the obtained trivalent vaccine during a clinical study in volunteers
  • Phase I was a simple, blind, placebo-controlled, single-center, prospective study in which 45 volunteers took part, 33.3% men, 66.7% women, average age - 31.4 years. 15 volunteers received a trivalent vaccine with a preservative, 15 without a preservative, and 15 with a placebo.
  • the trivalent vaccine is characterized by weak reactogenicity and a high safety profile.
  • phase II in addition to immunogenicity, the reactogenicity and safety of the trivalent vaccine were assessed in 200 volunteers. The results obtained led to the conclusion that the trivalent vaccine is characterized by low reactogenicity and a high safety profile.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Способ включает заражение куриных эмбрионов вирусом гриппа, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), дезагрегацию добавлением раствора NaCl до конечной концентрации 0,23-0,30 М, инактивацию добавлением β-пропиолактона, очистку ВАЖ микрофильтрацией с использованием каскада из трех фильтров с диаметром пор 10 мкм, 1 мкм, 0,6 мкм и ультрафильтрацией с пределом отсечения 300 кДа, очистку концентрата двойным ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, расщепление очищенных вирионов детергентом п-октил-р-О-глюкопиранозидом (октилглюкозидом) или тетрадецилтриметиламмония бромидом (ТДТАБ), удаление недоразрушенных вирионов и комплексов рибонуклеопротеидов с мембранным белком методом центрифугирования, микро- и ультрафильтрацию, хроматографическую очистку и стерилизующую фильтрацию полученного антигена, стабилизацию антигена детергентом Тритон Х-100 в концентрации 100-200 мкг/мл.

Description

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНА ИЛИ АНТИГЕНОВ ДЛЯ ПРОТИВОГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ
Изобретение относится к иммунологии, медицине, фармакологии и может быть использовано для производства инактивированных гриппозных вакцин, которые могут применяться для вакцинации населения против гриппа.
В настоящее время для вакцинации против гриппа используется 2 типа вакцин: инактивированные вакцины и «живые» вакцины. В свою очередь инактивированные вакцины подразделяются на цельновирионные, расщепленные, субъединичные и виросомальные. Значительную часть на мировом рынке инактивированных вакцин занимают расщепленные вакцины. Это обусловлено тем, что эти вакцины обладают высокой иммуногенностью, как и цельновирионные вакцины, однако их реактогенность существенно ниже цельновирионных вакцин. Субъединичные вакцины обладают очень низкой реактогенностью, однако их иммуногенность уступает иммуногенности расщепленных гриппозных вакцин.
В настоящее время известны различные способы производства инактивированных вакцин против вируса гриппа.
Известен способ получения вируссодержащей субстанции путем культивирования вакцинных штаммов вируса гриппа в культуре клеток MDCK на питательной среде, очистку вирусной субстанции от балластных примесей, введение в очищенную субстанцию стабилизирующих добавок и сушку готовой формы вакцины (патент RU 2330885, опубл. 10.08.2008). Недостатком этого способа является невозможность получения антигена для создания вакцины в промышленном масштабе. Известен способ получения антигенов для вакцины против вируса гриппа посредством получения неочищенного вирусного концентрата, очистку вирусного концентрата проводят методом гельфильтрации на носителе ДИСШ-500, далее вирусный концентрат расщепляют детергентом b-октилглюкозидом, а выделение вакцинных антигенов проводят методом гель-фильтрации на носителе Сефадекс G-50 (патент RU 2283139, опубл. 10.09.2006). Недостатком указанного способа является недостаточная степень очистки антигена от овальбумина.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ получения антигенов вируса гриппа, включающий заражение куриных эмбрионов вирусом гриппа, инкубацию эмбрионов, охлаждение эмбрионов, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), обработку ВАЖ с целью дезагрегации и последующей инактивации, микрофильтрацию ВАЖ, ультрафильтрацию ВАЖ и очистку вирусного концентрата (патент RU 2584594, опубл. 20.05.2016). Недостатком способа-прототипа является недостаточно полная очистка полученного антигена от яичного альбумина.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в разработке новой технологии получения антигена и\или антигенов вируса гриппа для производства российской инактивированной вакцины, которая позволит производить в нашей стране вакцину с мировым уровнем качества, требуемой степени очистки.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в разработке промышленного способа получения антигена и\или антигенов вируса гриппа высокой степени очистки для производства российской инактивированной вакцины, которую можно будет использовать для массовой вакцинации населения. Это достигается тем, что в предлагаемом способе дезагрегацию вирусов при обработке ВАЖ мы проводим хлористым натрием в конечной концентрации 0,23-0,30 Моля, инактивацию вирусной активности с использованием b- пропиолактона, очистку ВАЖ проводим методами микрофильтрации с использованием каскада из трех фильтров с диаметром пор 10 мкм, 1 мкм, 0,6 мкм и ультрафильтрации с пределом отсечения 300 кДа, последующее очищение - путем двойного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы, последующую очистку антигена или антигенов проводим на хроматографическом носителе, а стабилизацию полученного антигена или антигенов или готовой лекарственной форме проводим с использованием детергента Тритон Х-100 в концентрации 100-200 мкг/мл.
Указанные условия определены как оптимальные в результате многолетних экспериментов, проведенных авторами этого изобретения.
Таким образом, для решения поставленной задачи мы предлагаем способ получения антигена или антигенов вируса гриппа, включающий получение куриных эмбрионов (КЭ), их дезинфекцию, предварительную инкубацию, заражение рабочим раствором посевного вируса, инкубацию зараженных КЭ, охлаждение после инкубации, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости, дезагрегацию выделенных вирусов путем добавления раствора NaCl до конечной концентрации 0,23-0,30 М, инактивацию их добавлением b-пропиолактона до конечной концентрации 0,1% и очистку ВАЖ методами микрофильтрации с использованием каскада из трех фильтров с диаметром пор 10 мкм, 1 мкм, 0,6 мкм и ультрафильтрации с пределом отсечения 300 кДа, затем проводят концентрирование осветленной вируссодержащей аллантоисной жидкости не более чем в 20 раз, концентрат очищают путем двойного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы, после чего осуществляют расщепление инактивированного вирусного концентрата с использованием детергента h-oktpp-b-ϋ- глюкопиранозида (октилглюкозида) или тетрадецилтриметиламмония бромида (ТДТАБ), удаление недоразрушенных вирионов и комплексов рибонуклеопротеидов с мембранным белком методом центрифугирования, микро- и ультрафильтрацию, хроматографическую очистку и стерилизующую фильтрацию полученного антигена или антигенов, а стабилизацию антигена или антигенов проводят с использованием детергента Тритон Х-100 в концентрации 100-200 мкг/мл.
В частном случае предлагается противогриппозная вакцина, содержащая антиген или антигены, полученные вышеописанным способом, причем она может содержать 1, 3 или 4 антигена.
Сущность изобретения
Заявляемый способ получения состоит из нескольких технологических этапов:
Первый этап заключается в получении ВАЖ и состоит из нескольких стадий: получение куриных эмбрионов (КЭ), их дезинфекция предварительная инкубация, заражение рабочим раствором посевного вируса, инкубация зараженных КЭ, охлаждение после инкубации, сбор ВАЖ и очистка ВАЖ.
Яйца куриные инкубационные получают только от клинически здоровой птицы из благополучных в эпизоотологическом отношении птицеводческих хозяйств, благополучных по инфекционным и инвазивным заболеваниям. Качество поставляемых яиц подтверждают ветеринарным свидетельством. После проведения входного контроля яйцо оплодотворенное закладывают в инкубатор для инкубирования. Дезинфекцию КЭ проводят методом распыления дезинфицирующего раствора 0,5% РЗ-оксония актив 150 или другого разрешенного к применению средства. Процесс заражения 9-11 суточных КЭ проводится в асептических условиях. Емкость с рабочим раствором посевного вируса подсоединяется к инокулятору, производства фирмы Rame-Hart, США или аналогичному оборудованию. Обработку скорлупы КЭ и игл во время процесса заражения проводят этиловым спиртом. Далее пластиковые лотки передвигаются по конвейеру, проходя дезинфекцию этиловым спиртом, а после чего происходит заражение. В каждый КЭ вводят по (0,20±0,02) мл рабочего разведения посевного вируса. Иглы плат заражения автоматически проходят дезинфекцию 70% этиловым спиртом после каждого прокола скорлупы КЭ. После выхода лотков с зараженными КЭ проводится их визуальный выборочный контроль. Проконтролированные КЭ передают на стадию инкубации зараженных КЭ. Куриные эмбрионы, зараженные вирусом гриппа, инкубируют в технологическом режиме (температура, относительная влажность) в соответствии с режимами, указанными в паспортах на штамм или подобранными в результате исследований. Для вирусов гриппа типа А продолжительность инкубации, как правило, составляет от 35 до 50 ч, а для вирусов типа В - от 50 до 65 ч, а относительная влажности от 55 до 65%. Охлаждение КЭ осуществляется в холодильной камере в течение от 12 до 20 ч при температурном режиме (5±3)°С. Сбор ВАЖ осуществляется с помощью автоматической линии для сбора аллантоисной жидкости (харвестер) производства фирмы «Rame-Hart», США. На этой линии в автоматическом режиме осуществляют декапитацию КЭ, их визуальную отбраковку (погибшие КЭ, инкубационный брак, бой) и сбор ВАЖ в асептических условиях. Собранную ВАЖ с помощью насосов перекачивают в реактор. Перед началом сбора ВАЖ реактор охлаждают с использованием воды и охлаждающего устройства до конечной температуры в реакторе (6±2)°С. По окончанию сбора ВАЖ с помощью насоса добавляют стерильный раствор 2,5 М NaCl до конечной концентрации 0,23-0,3 М для предотвращения агрегации и b-пропиолактон до конечной концентрации 0,1% для инактивации вируса. Содержимое перемешивают в течении 1 - 2 часов. После перемешивания мешалку отключают и содержимое реактора отстаивают в течение не менее 6 часов. Выбранное время должно обеспечивать инактивацию вируса гриппа и посторонних агентов патогенных для человека.
2 этап заключается в очистке ВАЖ методами микро- и ультрафильтрации и очистке полученного концентрата ВАЖ методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.
Очистку и концентрирование ВАЖ микро- и ультрафильтрацией проводят на совмещенной установке микро- и ультрафильтрации с соблюдением правил асептики в зоне ламинарного потока. После обработки и инактивации ВАЖ из реактора с помощью насоса подают на установку микрофильтрации и пропускают через каскад глубинных фильтров с диаметром пор 10 мкм, 1 мкм, 0,6 мкм в стерильную емкость. Полученную в результате микрофильтрации осветленную ВАЖ с помощью насоса подают на установку ультрафильтрации с кассетными модулями Pellicon 2 Biomax-ЗОО или аналогичными с пределом отсечения 300 кДа, для дальнейшей очистки и концентрирования ВАЖ. Концентрирование осветленной ВАЖ осуществляют не более, чем в 20 раз.
Очистку и концентрирование вируса гриппа в градиенте плотности сахарозы проводят с использованием проточной ультрацентрифуги следующим образом: в ротор загружают стерильный трис-буфер (рН=7,4±0,2) и 60% раствор сахарозы при температуре (5±3)°С. После разгона до g=(85000±5000) м/с2 в ротор с помощью насоса со скоростью ( 10=ь 1 ) л/час подают концентрат ВАЖ. По окончанию прохождения всего объема концентрированной ВАЖ в ротор центрифуги подают трис- буфер и проводят изоплотностное центрифугирование в течение (2,0±0,5) ч. Растворы используются охлажденными до температуры (5±3)°С. После окончания изоплотностного центрифугирования ультрацентрифугу останавливают и производят разгрузку полученных фракций инактивированного вирусного концентрата (ВК) в стерильном боксе. Собирают 20 фракций содержащегося в роторе градиента плотности сахарозы: первые две фракции, объемом по 200 мл, последующие - по 100 мл. Из каждого флакона отбирают пробу для контроля гемагглютинирующей активности (титра ГА) и % содержания сахарозы. После взятия пробы каждый флакон закрывают силиконовой пробкой и помещают в холодильник на хранение при температуре (5±3)°С до 3 сут. Для дальнейшей обработки используются фракции инактивированного ВК, обладающие титром ГА не менее 1 :8000 и содержащие (28-51)% сахарозы.
Для повышения качества очистки проводят повторное центрифугирование. Для дальнейшей обработки используются фракции инактивированного вирусного гриппа (концентрированный очищенный вирус гриппа, инактивированный ВК, вторичные фракции ВК), обладающие титром гемагглютинирующей активности не менее 1 : 16000 и содержащие (19-50)% сахарозы. В отобранные фракции ВК добавляют по 80 мл глицерина, перемешивают флаконы, закрывают силиконовыми пробками и передают на хранение в морозильник при температуре от минус 9 до минус 15°С на срок не более 6 месяцев. Допускается хранение фракций при температуре (5±3)°С без добавления глицерина до 3 суток.
Повторное центрифугирование существенно увеличивает степень чистоты инактивированного ВК при минимальных потерях гемагглютинина (ГА) это наблюдается по снижению соотношения общего белка к ГА и снижению соотношения овальбумина к ГА (Таблица 1) и по хроматограммам (Фиг. 1 - Электрофореграмма образцов первичных фракций, полученных после концентрирования в градиенте плотности сахарозы на примере штамма A/Michigan/45/2015 (H1N1), где 1 - маркеры молекулярных масс, 2 - объединенные фракции N°3+4, 3 - объединенные фракции N°5+6, 4 - объединенные фракции N°7+8, 5 - объединенные фракции N°9+10, 6 - объединенные фракции N°l l+12, 7 - объединенные фракции N°13+14, 8 - объединенные фракции J » 15+16, 9 - объединенные фракции N°17+18, 10 - объединенные фракции N° 19+20. Выделенной областью определены границы выбранных фракций и Фиг. 2 - Электрофореграмма образцов фракций, полученных после концентрирования в градиенте плотности сахарозы при повторном центрифугировании на примере штамма A/Michigan/45/2015 (H1N1), где 1 - объединенные фракции N23+4, 2 - объединенные фракции N25+6, 3 - объединенные фракции N27+8, 4 - объединенные фракции N29+10, 5 - объединенные фракции No 11+12, 6 - объединенные фракции J » 13+14, 7 - объединенные фракции JM215+16, 8 - объединенные фракции JM2I 7+I 8, 9 - объединенные фракции J » 19+20, 1 - маркеры молекулярных масс. Выделенной областью определены границы выбранных фракций).
Таблица 1
Влияние повторного центрифугирования на степень чистоты инактивированного ВК на примере штамма A/Michingan/45/2015 (H1N1)
Figure imgf000010_0001
3 этап включает в себя расщепление инактивированных вирусных частиц из полученных концентратов, осаждение недоразрушенных вирионов и комплексов рибонуклеопротеидов с мембранным белком методом ультрацентрифугирования, микро- и ультрафильтрацию, хроматографическую очистку и стерилизующую фильтрацию антигенов (моновакцин). Расщепление вирусных частиц проводят с использованием детергента октилглюкозида или ТДТАБ.
Детергенты, в силу механизма своего действия, вполне могут быть фактором частичной денатурации конформационных эпитопов гемагглютинина. В результате длительных анализов и технологических экспериментов был сделан вывод, что для каждого серотипа вируса гриппа существует свой оптимальный детергент, который позволяет выделять поверхностные антигены из вирионов данного серотипа с максимальным сохранением их исходной иммуногенности и протективной активности.
Выбор детергента осуществляют на основании результатов определения специфической активности в изученных образцах. В случае, когда на максимальных отношениях белок/детергент при применении одного из детергентов наблюдается снижение специфической активности, по сравнению с более низкими отношениями (феномен «сгорание» антигена), то в качестве единственного для данного серотипа выбирается детергент, который такого феномена не дает. На Фиг. 3 - Морфологический анализ колец преципитации в реакции одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД), образцов серотипа B/Phuket/3073/2013, полученных с использованием различных детергентов представлены результаты определения специфической активности образцов серотипа B/Phuket/3073/2013, из которых следует, что образец, полученный с использованием детергента октилглюкозид образует хорошо окрашенные кольца четко очерченной формы (ряды N°1 и N°4), которые по морфологии ничем не отличаются от колец преципитации международного стандартного антигена, производства NIBSC, Великобритания (ряды N°3 и N°6). Образец, полученный с использованием детергента ТДТАБ образует слабо окрашенные кольца преципитации с нечетко очерченными границами (ряды N°2 и N°5), которые существенно отличаются по морфологии от колец преципитации международного стандартного антигена, производства NIBSC, Великобритания (ряды N°3 и N°6).
После выбора детергента проводят подбор соотношения белок/детергент, при котором выход специфической активности был в пределах максимального значения, с учетом результатов оценки полипептидного состава исследуемых образцов.
Определение оптимального детергента и соотношения белок/детергент проводят для каждого серотипа отдельно при смене производственного штамма, так как они могут иметь чувствительность к тому или иному детергенту или при смене партии детергента, так как вследствие штаммовых различий и колебаний свойств детергента от партии к партии, оптимальное соотношение белок/детергента может варьироваться.
Осаждение кор-структур (недоразрушенных вирионов и комплексов рибонуклеопротеидов с мембранным белком) и агрегированных вирионов из полученного вирусного лизата проводят методом центрифугирования (Фиг. 4 - Электрофореграмма осадка с ротора центрифуги и вирусного концентрата на примере штамма A/Michigan/45/2015 (H1N1), где 1 - вирусный концентрат, 2 - осадок с ротора центрифуги, 3 - маркеры молекулярных масс).
С помощью насоса в ротор центрифуги подают трис-буфер, далее расщепленный ВК при скорости протока 4-6 л/ч при скорости вращения насоса от 16000 до 20000 об/мин (g=(13040-34774) м/с2) при температуре от 2 до 8°С. Расщепленный ВК центрифугируют в замкнутом цикле. На Фиг. 4 отражена эффективность использования центрифугирования для удаления непротективных белков вируса гриппа.
Затем полученный супернатант вируса гриппа с помощью перистальтического насоса пропускают в стерильную стеклянную емкость через глубинные фильтры, диаметр пор которых равен 0,6 и 0,2 мкм соответственно при давлении не более 0,5 бар. Профильтрованный супернатант, с помощью перистальтического насоса, пропускают через ультрафильтрационную установку с мембранными кассетами с пределом отсечения 30 кДа для концентрирования материала.
Для очистки сконцентрированного супернатанта используют хроматографический носитель для гельфильтрации Work Beads 40/100/sec компании Bio Works Company Ltd. (Швеция) или аналогичный. Гельфильтрацию проводят на производственной колонке из боросиликатного стекла. На колонку объемом 16-19 л носителя с помощью перистальтического насоса наносят сконцентрированный супернатант в объеме 2, 0-2, 5 л. Хроматографию ведут со скоростью потока не более 300 мл/мин и при давлении не более 1,0. Сбор материала осуществляют по показателям UV-детектора 200, KNAUER, Германия или аналогичного. Регистрацию данных проводят на персональном компьютере с системой МультиХром. После того, когда значение на детекторе достигает 10 mV начинают собирать материал. Сбор материала останавливают после падения оптической плотности от 10 до 20% от пикового значения. На Фиг. 5 представлена типичная хроматограмма удаления остатков примесей технологического процесса с использованием хроматографической очистки, где 1 - Антиген, 2 - Овальбумин, 3 - Сахароза, 4 - Октилглюкозид.
После проведения хроматографической очистки материал передают на стерилизующую фильтрацию. В заранее подготовленный к работе реактор заливают очищенный супернатант, добавляют ФБР до концентрации гемагглютинина не менее 100 мкг/мл, также возможно добавление Тритона Х-100 до конечной концентрации 100-200 мкг/мл и перемешивают со скоростью 200-220 об/мин в течение 15-20 мин при комнатной температуре.
Далее полученный антиген (моновакцину) вируса гриппа фильтруют с использованием стерильной стерилизующей капсулы с размерами пор 0,22 мкм (или менее), материал мембраны полиэфирсульфон в стерильный одноразовый полимерный контейнер. Полученную стерильную моновакцину транспортируют в фармацевтические холодильники и хранят при температуре (5±3)°С не более года.
Этап 4 - включает в себя сведение компонентов вакцины, стерилизующую фильтрацию вакцины, розлив препарата в ампулы или флаконы, маркировку и упаковку.
Процесс получения трехвалентной гриппозной вакцины включает в себя сведение антигенов (моновакцин) 3-х типов вируса гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В, с 1% раствором детергента Тритон Х-100, 1 % раствором тиомерсала (для препаратов, содержащих консервант) и ФБР в реакторе.
Процесс получения четырехвалентной гриппозной вакцины включает в себя сведение антигенов (моновакцин) 4-х типов вируса гриппа A(H1N1), A(H3N2), B/Yamagata lineage и В/Victoria lineage, c 1% раствором детергента Тритон Х-100, 1% раствором тиомерсала (для препаратов, содержащих консервант) и ФБР в реакторе вместимостью 200 л.
Полуфабрикаты антигенов (моновакцин) вируса гриппа, прошедшие все контроли, из стерильных одноразовых контейнеров в асептических условиях загружают в реактор. Далее в реактор добавляют расчетные количества ФБР, 1% раствор тиомерсала до конечной концентрации (85-115) мкг/мл (для препарата, содержащего консервант) и 1% раствор детергента Тритона Х-100 до конечной концентрации 100- 200 мкг/мл. Содержимое реактора перемешивают при скорости вращения мешалки 400 об/мин в течение 15 мин. Далее отключают мешалку и отстаивают полуфабрикат в течение 10 мин. После отстаивания отбирают пробу на контроль полуфабриката вакцины. Далее проводят стерилизующую фильтрацию перемешанного раствора через одноразовый фильтрующий элемент типа Sartobran 0,22 мкм, площадь фильтрации 0,45 м2. Из заполненного стерильного мешка в асептических условиях отбирают пробу для контроля полупродукта гриппозной вакцины в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи РФ.
Розлив препарата в ампулы или флаконы осуществляют в асептических условиях. Проводят контроль стерильности процесса и извлекаемого объема (дозы заполнения) препарата.
Далее все ампулы или флаконы с препаратом контролируют на герметичность и механические включения.
Затем препарат передают на склад карантинного хранения и хранят при температуре от 2 до 8°С.
Со склада карантинного хранения отбираются ампулы или флаконы с готовой лекарственной формой препарата и осуществляют контроль в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи РФ по следующим показателям качества гриппозных вакцин: описание, подлинность, pH, общий белок, стерильность, бактериальные эндотоксины, аномальная токсичность, специфическая безопасность, специфическая активность гемагглютинина, тиомерсал (для препарата, содержащего консервант), овальбумин, Тритон Х-100, иммуногенность и реактогенность.
Осуществление изобретения
Пример 1. Получение антигена (моновакцины) вируса гриппа серотипа H3N2
Для заражения КЭ в качестве рабочего раствора был использован 5 пассажный уровень реассортантного вируса A/Singapore/INFIMH- 16- GO 19/2016-like/(IVR-186)/H3N2. Реассортантный штамм для производства инактивированных гриппозных вакцин был получен от ВОЗ. 60061 штук одиннадцати суточных КЭ были инфицированы дозой рабочего раствора посевного вируса, имеющей инфекционный титр 103,66 ЭИД50 в 0,2 мл. Инкубация после заражения проводилась при температуре 35°С и относительной влажности 60% в течение 45-48 ч. Охлаждение после инкубации проводилось в холодной камере при температуре (5±3)°С в течении 12-15 часов. После охлаждения ВАЖ была собрана в реактор в объеме 550 л. Далее в реактор с собранной ВАЖ было добавлено 50-70 л 2,5 М раствора NaCl, с последующим перемешиванием, после чего добавили 0,55 л b-пропиолактона. Инактивация проходила при температуре (6±2)°С в течении 10 часов. Далее после очистки и концентрирования ВАЖ микро- и ультрафильтрацией было получено 40 л концентрата ВАЖ, которые были переданы для очистки в градиенте плотности сахарозы методом ультрацентрифугирования. Из градиента были отобраны 700 мл (7 фракций) с оптимальной концентрацией сахарозы и титром гемагглютинина (ГА). В этом объеме вирусного концентрата (ВК) содержалось 13,2 г белка (определение проводили методом Бредфорда) и 6,0 г ГА (определение проводили методом ОРИД). Все количество объединенного ВК (700 мл) было использовано для приготовления одной серии моновакцины. Для проведения разрушения было использовано 198 г детергента октилглюкозида, производства фирмы Carbosynh Limited, Великобритания. Объем лизата после расщепления составил 12 л. Далее была проведена очистка от кор-структур методом ультрацентрифугирования при скорости протока 4-6 л/ч при скорости вращения насоса от 16000 до 20000 об/мин (g=(13040-34774) м/с2) при температуре от 2 до 8°С. Далее промыли ротор 5 л трис-буфера со скоростью протока жидкости от 14 до 16 л/ч. Общий объем материала составил 17 л. После чего материал был профильтрован на установке микрофильтрации. Супернатант был сконцентрирован с использованием кассет с пределом отсечения 30 кДа до 2,0 л, хроматография проводилась при комнатной температуре. По оптической плотности был собран пик объемом 2,9 л, в нем был определен белок методом Бредфорда. Общее количество белка в пике составило 7,0 г. Далее материал был разведен до конечной концентрации по белку до 300 мкг/мл буфером ФБР. Полученную смесь тщательно перемешали, в течении 15 мин. Полуфабрикат профильтровали через одноразовый фильтрующий элемент 0,22 мкм. Полученный антиген (моновакцину) объемом 23,0 л переносим в фармацевтический холодильник и храним при температуре (5±3)°С в течении не более 12 месяцев. В полученном антигене (моновакцине) вируса гриппа определено 4,05 г гемагглютинина, тогда как в объединенном ВК было 6,00 г гемагглютинина. Таким образом, эффективность технологии по выходу гемагглютинина составляет 67,5%.
Был проведен сравнительный анализ полипептидного состава, объединенного ВК и полученного из него антигена (моновакцины) вируса гриппа A/Singapore/INFIMH- 16-0019/201 б-like/ (I VR- 186)/H3N2 методом электрофореза в ПААГ в нередуцирующих условиях. Результаты представлены на Фиг. 6 - Электрофореграмма антигена (моновакцины) вируса гриппа A/Singapore/INFIMH- 16-0019/2016- like/H3N2, где 1 - маркеры молекулярных масс, 2 - антиген
(моновакцина) вируса гриппа A/Singapore/INFIMH- 16-0019/2016- like/H3N2, 3 - объединенный вирусный концентрат (ВК).
Из представленных результатов следует, что в полученном антигене (моновакцине) присутствуют тримеры гемагглютинина, нерасщепленный гемагглютинин (HA0), тяжелая цепь гемагглютинина (НА1) и некоторое количество белка нуклеокапсида (NP) и нейраминидазы (NA). В исходном объединенном ВК, из которого был произведен этот антиген (моновакцина) вируса гриппа присутствуют также полипептид Ml (мембранный белок) и существенные количества белка NP. Это свидетельствует, что полученный препарат является высокоочищенным и не содержит нерасщепленных вирусных частиц. Пример 2. Получение антигена (моновакцины) вируса гриппа типа B/Yamagata lineage
Для получения объединенного ВК были проведены такие же процедуры, как и в примере 1. Отличия состояли в следующем: для заражения применяли 3 пассажный уровень реассортантного вируса B/California/2/2015/BX-69B-like (B/Phuket/3073/2013). 70704 штук одиннадцатисуточных КЭ были инфицированы дозой рабочего раствора посевного вируса, имеющей инфекционный титр 103,66 ЭИД50 в 0,2 мл. Инкубация после заражения проводилась при температуре 32,5 °С и относительной влажности 60% в течении 60-64 часов. Было собрано 720 л ВАЖ, которые сконцентрировали до 40 л. После второго ультрацентрифугирования из градиента были отобраны 700 мл (7 фракций) с оптимальной концентрацией сахарозы и титром ГА. В этом объеме ВК содержалось 21,0 г белка и 7,9 г ГА. После проведения разрушения, ультрацентрифугирования, микро- и ультрафильтрации, хроматографии и стерилизующей фильтрации, как указано в примере 1, было получено 25,0 л моновакцины. В этом объеме содержалось 12,63 г общего белка и 5,43 г ГА. Таким образом эффективность технологии по выходу ГА составила 68,7%.
Был проведен сравнительный анализ полипептидного состава, объединенного ВК и полученного из него антигена (моновакцины) вируса гриппа B/California/2/2015-like методом электрофореза в ПААГ в нередуцирующих условиях. Результаты представлены на Фиг. 7 Электрофореграмма антигена (моновакцины) вируса гриппа B/California/2/2015-like, где 1 - объединенный ВК, 2 - антиген
(моновакцина) вируса гриппа B/California/2/2015- like, 3 - маркеры молекулярных масс.
Из представленных результатов следует, что в полученном антигене (моновакцине) вируса гриппа присутствуют тримеры и димеры гемагглютинина, нерасщепленный гемагглютинин (HA0), тяжелая и легкая цепь гемагглютинина (НА1 и НА2) и некоторое количество белка нуклеокапсида (NP) и нейраминидазы (NA). В исходном объединенном ВК, из которого был произведен этот антиген (моновакцина) вируса гриппа присутствуют также полипептид Ml (мембранный белок) и существенные количества белка NP. Это свидетельствует, что полученный препарат является высокоочищенным и не содержит нерасщепленных вирусных частиц.
Пример 3. Получение антигена (моновакцины) вируса гриппа типа В/Victoria lineage
Для получения объединенного ВК были проведены такие же процедуры, как и в примере N°1 и N°2. Отличия состояли в следующем: для заражения применяли 5 пассажный уровень производственного штамма вируса B/Maryland/15/2016-like/BX-69A (B/Colorado/06/2017- like vims). 101101 штук одиннадцатисуточных КЭ были инфицированы дозой рабочего раствора посевного вируса, имеющей инфекционный титр 104,0 ИД в 0,2 мл. Инкубация после заражения проводилась при температуре 32,5°С и относительной влажности 60% в течении 60-64 часов. Было в 2 реактора собрано 965 л ВАЖ, которые сконцентрировали до 70 л. После второго ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы были отобраны 800 мл (8 фракций) с оптимальной концентрацией сахарозы и титром ГА. В этом объеме ВК содержалось 23,6 г белка и 7,4 г ГА. После проведения разрушения, ультрацентрифугирования, микро- и ультрафильтрации, хроматографии и стерилизующей фильтрации, как указано в примере 1, как указано в примере 1, было получено 34,0 л моновакцины. В этом объеме содержалось 15,27 г общего белка и 4,49 г. Таким образом эффективность технологии по выходу ГА составила 60,7%.
Был проведен сравнительный анализ полипептидного состава, объединенного ВК и полученного из него антигена (моновакцины) вируса гриппа B/Maryland/15/2016-like методом электрофореза в ПААГ в нередуцирующих условиях. Результаты представлены на Фиг. 8 - Электрофореграмма антигена (моновакцины) вируса гриппа В/Магу land/15/2016-like, где 1 - объединенный ВК, 2 - антиген (моновакцина) вируса гриппа B/Maryland/15/2016-like, 3 - маркеры молекулярных масс.
Из представленных результатов следует, что в полученном антигене (моновакцине) вируса гриппа присутствуют тримеры и димеры гемагглютинина, нерасщепленный гемагглютинин (HA0), тяжелая и легкая цепь гемагглютинина (НА1 и НА2) и некоторое количество белка нуклеокапсида (NP) и нейраминидазы (NA). В исходном объединенном ВК, из которого был произведен этот антиген (моновакцина) вируса гриппа присутствуют также полипептид Ml (мембранный белок) и существенные количества белка NP. Это свидетельствует, что полученный препарат является высокоочищенным и не содержит нерасщепленных вирусных частиц.
Пример 4. Получение антигена (моновакцины) вируса гриппа серотипа H1N1
Все технологические стадии соответствовали таковым в примерах N°l, N°2 и N°3. Отличия состояли в следующем: для заражения применяли 7 пассажный уровень вируса A/Michigan/45/2015/NYMC- 275A/H1N1. 106749 штук одиннадцатисуточных КЭ были инфицированы дозой рабочего раствора посевного вируса, имеющей инфекционный титр 103,66 ИД в 0,2 мл. Инкубация после заражения проводилась при температуре 35°С и относительной влажности 60% в течении 44-48 часов. Было в два реактора собрано 1085 л ВАЖ, которые сконцентрировали до 70 л. После второго ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы были отобраны 700 мл (7 фракций) с оптимальной концентрацией сахарозы и титром ГА. В этом объеме ВК содержалось 16,8 г белка и 6,8 г ГА. После проведения разрушения, ультрацентрифугирования, микро- и ультрафильтрации, хроматографии и стерилизующей фильтрации, как указано в примере 1, как указано в примере 1, было получено 20,0 л моновакцины. В этом объеме содержалось 7,66 г общего белка и 4,32 г ГА. Таким образом эффективность технологии по выходу ГА составила 63,9%.
Был проведен сравнительный анализ полипептидного состава, объединенного ВК и полученного из него антигена (моновакцины) вируса гриппа A/Michigan/45/2015/H1N1 методом электрофореза в ПААГ в нередуцирующих условиях. Результаты представлены на Фиг. 9 Электрофореграмма антигена (моновакцины) вируса гриппа A/Michigan/45/2015/H1N1, где 1 - объединенный ВК, 2 - антиген (моновакцина) вируса гриппа A/Michigan/45/2015/H1N1, 3 - маркеры молекулярных масс.
Из представленных результатов следует, что в полученном антигене (моновакцине) вируса гриппа присутствуют тримеры гемагглютинина, нерасщепленный гемагглютинин (HA0), тяжелая цепь гемагглютинина (НА1) и некоторое количество белка нуклеокапсида (NP) и нейраминидазы (NA). В исходном объединенном ВК, из которого был произведен этот антиген (моновакцина) вируса гриппа присутствуют также полипептид Ml (мембранный белок) и существенные количества белка NP. Это свидетельствует, что полученный препарат является высокоочищенным и не содержит нерасщепленных вирусных частиц.
Пример 5. Приготовление лекарственной формы трехвалентной вакцины
Для приготовления серии трехвалентной вакцины были отобраны стерильные растворы полученных антигенов (моновакцин) серотипов A(H1N1), A(H3N2) и В и в асептических условиях их добавили в реактор в количестве 7,4 л, 9,1 или 7,4 л., соответственно. Далее к ним был добавлен ФБР М в количестве 25,2 л и 0,9 л 1% раствора Тритона Х-100 таким образом, чтобы в конечном растворе была концентрация ГА для всех серотипов равная 16 мкг/доза. Далее содержимое реактора перемешали в течение 15 мин со скоростью 400 об/мин, отключили мешалку, отстаивали полуфабрикат в течение 10 мин и фильтровали через одноразовую стерильную фильтрующую капсулу с диаметром пор 0,22 мкм в стерильный пластиковый контейнер. Объем полуфабриката после добавления всех компонентов соответствовал 50 л.
После стерилизующей фильтрации был получен объем стерильной трехвалетной вакцины равный 49 л. После получения удовлетворительных результатов по всем необходимым показателям качества гриппозных вакцин контейнер с тривакциной передали для розлива в ампулы. Препарат был разлит в ампулы вместимостью 1 мл по 0,6 мл трехвалентной вакцины в каждую ампулу. После розлива было получено 80000 ампул, которые были проконтролированы на наличие механических включений. В результате по этому показателю было отбраковано 800 ампул. Остальные ампулы были отправлены на склад временного хранения с температурой (6±2)°С. Часть ампул была отобрана для проведения контролей согласно нормативной документации.
Пример 6. Приготовление лекарственной формы четырехвалентной вакцины
Для приготовления серии четырехвалентной вакцины были отобраны стерильные растворы полученных антигенов (моновакцин) серотипов A(H1N1), A(H3N2), B/Yamagata lineage и В/Victoria lineage и в асептических условиях их добавили в реактор в количестве 7,4 л, 9,1 л, 12,1 ли 7,4 л соответственно. Далее к ним был добавлен ФБР М в количестве 13,1 л и 0,9 л 1% раствора Тритона Х-100 таким образом, чтобы в конечном растворе была концентрация ГА для всех серотипов равная 16 мкг/доза. Далее, содержимое реактора перемешали в течении 15 мин со скоростью 400 об/мин, отключили мешалку, отстаивали полуфабрикат в течение 10 мин и фильтровали через одноразовую стерильную фильтрующую капсулу с диаметром пор 0,22 мкм в стерильный пластиковый контейнер. Объем полуфабриката после добавления всех компонентов соответствовал 50 л.
После стерилизующей фильтрации был получен объем стерильной четырехвалетной вакцины равный 49 л. После получения удовлетворительных результатов по всем необходимым показателям качества гриппозных вакцин контейнер с вакциной передали для розлива в ампулы. Препарат был разлит в ампулы вместимостью 1 мл по 0,6 мл четырехвалентной вакцины в каждую ампулу. После розлива было получено 80000 ампул, которые были проконтролированы на наличие механических включений. В результате по этому показателю было отбраковано 800 ампул. Остальные ампулы были отправлены на склад временного хранения с температурой (6±2)°С. Часть ампул была отобрана для проведения контролей согласно нормативной документации.
Пример 7. Сравнение результатов показателей качества предлагаемой вакцины и вакцин других производителей
Полученные стабилизированные лекарственные формы предлагаемых вакцин (трехвалентная и четырехвалентная) была проанализирована по некоторым биохимическим показателям качества гриппозных вакцин в сравнении с вакциной Ваксигрипп® (инактивированная сплит-вакцина для профилактики гриппа - Санофи Пастер С. А., Франция), Ультрикс® (вакцина гриппозная инактивированная расщепленная - ООО «ФОРТ», Россия), Гриппол® квадривалент (вакцина гриппозная четырехвалентная инактивированная субъединичная адъювантная - ООО «НПО Петровакс Фарм», Россия). Полученные результаты представлены в таблице N°2.
Таблица 2
Сравнение основных биохимических показателей качества гриппозных вакцин
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
По представленным результатам можно сделать выводы, что полученные стабилизированные лекарственные формы предлагаемых вакцин (трехвалентная и четырехвалентная) не уступают по качеству другим зарегистрированным в России инактивированным гриппозным вакцинам. По некоторым показателям качества, таким как содержание овальбумина или соотношение общего белка к гемагглютинину, даже превосходят другие гриппозные вакцины как российского производства, так и зарубежного.
Маркером присутствия в антигенах (моновакцинах) вируса гриппа компонентов организма-продуцента является белок овальбумин, содержащийся в аллантоисной жидкости КЭ. Данная примесь является важным показателем качества любой вакцины, антиген которой был получен культивированием вакцинного штамма в КЭ. Кроме того, что содержание этого белка может интерпретироваться как интегральный показатель способности технологии очистить препарат от высокомолекулярных примесей, овальбумин требует особого контроля в связи с его реактогенностью. Так, антигены вируса гриппа, которые потенциально могут содержать овальбумин и другие белки куриного эмбриона, строго противопоказаны лицам с подтвержденной анафилактической гиперчувствительностью, а вакцинация лиц, имеющих в анамнезе аллергические реакции на куриные белки, должна проводится с особой осторожностью. Так как среди существующих на рынке противогриппозных препаратов присутствуют вакцины с различными нормами содержания овальбумина, лицам с аллергией на куриный белок рекомендуется подбирать препараты, спецификация которых допускает наименьший порог допустимой концентрации овальбумина.
Пример 8. Изучение антигенной активности полученных трехвалентной и четырехвалентной вакцин
Исследование иммуногенности предложенной четырехвалентной вакцины было проведено при двукратном внутримышечном введении вакцины мышам Balb/c самкам (6-8 недель, весом (17,08±0,03) г) в дозах, соответствующих 1 (группа 1) и 1/2 прививочной дозе для человека (группа 2). Третьей группе мышей вводили вакцину сравнения 1 Гриппол® Квадривалент двукратно внутримышечно в 1 дозе для человека. Вакцину сравнения 2 - трехвалентную предлагаемую вакцину вводили мышам группы 4 двукратно внутримышечно в 1 дозе для человека. Контрольной группе мышей (группа 5) внутримышечно вводили 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Количество мышей в каждой группе - 10. Кровь у мышей опытных и контрольных групп забирали на 14-е и 28-е сутки исследования.
Поскольку считается, что мыши не подвержены гриппозной инфекции и являются «наивными» по гриппозным антигенам, однократного введения гриппозной вакцины недостаточно для выработки полноценного иммунного ответа. Поэтому для выработки полноценного иммунного ответа исследуемый препарат и препараты сравнения вводили мышам линии Balb/c внутримышечно (путь, который предназначен для клинического применения исследуемого препарата) двукратно с интервалом 14 дней.
Оценку антиген-специфического гуморального иммунитета проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции микронейтрализации (РМН) в культуре клеток MDCK со штаммами вируса гриппа A(H1N1); A(H3N2); В (Victoria lineage) и В (Yamagata lineage).
Постановку реакций осуществляли согласно методикам, рекомендованным ВОЗ.
Результаты представлены в таблицах 3-6.
Таблица 3
Средние геометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа
A(H1N1) в сыворотках мышей опытных и контрольных групп на 14-й и 28-й день исследования и СГТ нейтрализующих антител к вирусу гриппа A(H1N1) в сыворотках мышей опытных и контрольных групп на 28-й день исследования
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
* - достоверное отличие от контроля (группа 5), р<0.01
** - достоверное отличие от контроля (группа 5), р<0.0001
х - достоверное отличие группы 1 от групп 2 и 3, р<0.01
+ - достоверное отличие группы 4 от группы 3, р = 0.0075
Таблица 4
Средние геометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа
A(H3N2) в сыворотках мышей опытных и контрольных групп на 14-й и 28-й день исследования и СГТ нейтрализующих антител к вирусу гриппа A(H3N2) в сыворотках мышей опытных и контрольных групп на 28-й день исследования
Figure imgf000028_0002
Figure imgf000029_0001
* - достоверное отличие от контроля (группа 5), р<0.01
** - достоверное отличие от контроля (группа 5), р<0.0001
Таблица 5
Средние геометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа В (Victoria lineage) в сыворотках мышей опытных и контрольных групп на 14-й и 28-й день исследования и СГТ нейтрализующих антител к вирусу гриппа В (Victoria lineage) в сыворотказ мышей опытных и контрольныз групп на 28-й день исследования
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000030_0001
* - достоверное отличие от контроля (группа 5), р<0.01
** - достоверное отличие от контроля (группа 5), р<0.0001
*** - достоверное отличие от контроля (группа 5), р<0.0004
х - достоверное отличие группы 1 от группы 2, р<0.03
хх - достоверное отличие группы 2 от группы 4, р<0.01
Таблица 6
Средние геометрические титры (СГТ) антител к вирусу гриппа В (Yamagata lineage) в сыворотках мышей опытных и контрольных групп на 14-й и 28-й день исследования и СГТ нейтрализующих антител к вирусу гриппа В (Yamagata lineage) в сыворотказ мышей опытных и контрольныз групп на 28-й день исследования
Figure imgf000030_0002
Figure imgf000031_0001
* - достоверное отличие от контроля (группа 5), р<0.02
** - достоверное отличие от контроля (группа 5), р<0.0001
х - достоверное отличие от группы 4, р=0.0047
хх - достоверное отличие от группы 4, р<0.0001
*** - достоверное отличие от контроля (группа 5) и группы 4, р<0.0001 ххх - достоверное отличие группы 1 от групп 2, 3, 4, р<0.0001
хххх - достоверное отличие группы 2 от группы 4, р<0.01
Результаты по доклиническому изучению иммуногенности предложенных вакцин свидетельствуют о том, что предлагаемые вакцины обладают выраженной специфической активностью по отношению ко всем штаммам вируса гриппа, входящим в ее состав. Пример 9. Изучение сравнительной иммуногенности полученной трехвалентной вакцины и вакцины Ваксигрипп® в ходе клинического исследования на добровольцах
Было проведено двойное слепое сравнительное рандомизированное многоцентровое исследование предлагаемой вакцины. В качестве препарата сравнении использовали инактивированную вакцину для гриппа Ваксигрипп®, производства «Санофи Пастер», Франция. Вакцины вводили однократно внутримышечно 400 добровольцам в возрасте от 18 до 60 лет. В исследование было включено 222 женщины (55,5%) и 178 мужчин (44,8%), средний возраст добровольцев составил 33,6±0,6 лет. Прививка предлагаемой вакциной проведена 200 добровольцам, вакциной Ваксигрипп® - 200 добровольцам.
Оценку показателей иммуногенности, исследуемых вакцин, проводили по критериям эффективности развития иммунного ответа ВОЗ:
1. Кратность нарастания титра антител после вакцинации: >2,5 у лиц в возрасте от 18 до 60 лет;
2. Уровень сероконверсии (увеличение титра антител к ГА не менее, чем в 4 раза): >40% для лиц в возрасте от 18 до 60 лет;
3. Уровень серопротекции (число лиц с защитным титром >40): >70% для лиц в возрасте от 18 до 60 лет.
Результаты исследований (Таблица 7-9) статистически обработаны с использованием t-критерия Стьюдента и при отсутствии признаков нормального распределения - с помощью непараметрических критериев (Вилкоксона и Мана-Уитни). Различия считали достоверными при р<0,05. Таблица 7
Результаты оценки иммуногенности (фактор сероконверсии)
Figure imgf000033_0001
Таблица 8
Результаты оценки иммуногенности (уровень сероконверсии)
Figure imgf000034_0001
Таблица 9
Результаты оценки иммуногенности (уровень серопротекции)
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000035_0001
Оценка иммуногенности предлагаемой вакцины в сравнении с вакциной Ваксигрипп® при однократном введении добровольцам в возрасте 18-60 лет выявила высокую иммуногенную активность ко всем штаммам вируса гриппа (A (H1N1), A(H3N2) и В).
Достоверных различий по показателям «уровень серопротекции», «уровень сероконверсии» и «фактор сероконверсии» при введении предлагаемой вакцины и вакцины Ваксигрипп® не выявлено (р>0,05).
Пример 10. Изучение безопасности полученных трехвалентной и четырехвалентной вакцин
Исследования безопасности трехвалентной и четырехвалентной вакцин включали в себя изучение острой и субхронической, репродуктивной токсичности, оценку фармакологической безопасности, местно-раздражающего действия, иммунотоксичности, аллергенности, пирогенности и проводились по дизайну, представленному в таблице 10.
Таблица 10
Дизайн исследования токсичности трехвалентной и
четырехвалентной вакцин
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
В ходе проведенных исследований установлено, что предлагаемые трехвалентная и четырехвалентная вакцины являются безопасными и характеризуются хорошей переносимостью. На фоне применения вакцин гибель животных не наблюдали, ухудшение их состояния, потеря массы тела, повышение температуры не установлены, негативного влияния на репродуктивную, иммунную систему не отмечали. Стоит отметить, что предлагаемые вакцины вызывали некоторую аллергическую реакцию при введении их морским свинкам, однако эти эффекты наблюдали при введении 10-кратной дозы и кроме того, проявления аллергических реакций допустимо для иммунобиологических препаратов.
Пример 11. Изучение безопасности полученной трехвалентной вакцины в ходе клинического исследования на добровольцах
В рамках I фазы было проведено простое слепое плацебо - контролируемое одноцентровое проспективное исследование, в котором приняли участие 45 добровольцев, 33,3% мужчины, 66,7% женщины, средний возраст - 31,4 года. 15 добровольцев получали трехвалентную вакцину с консервантом, 15 - без консерванта, 15 - плацебо.
Контрольные точки исследования: скрининговый визит, 3, 7, 21 -е сутки после вакцинации. Проведенные обследования: физикальные
(температура. АД, ЧСС, ЧДД), обследование терапевтом, сбор данных по сопутствующей терапии, контроль за нежелательными явлениями и серьезными нежелательными явлениями, также у добровольцев были взяты кровь, моча. Результаты оценки частоты поствакцинальных реакций среди добровольцев представлены в таблице 11.
Таблица 11
Частота поствакцинальных реакций среди добровольцев
Figure imgf000038_0001
За весь период поствакцинального наблюдения субъективно с 7 по 21 сутки местных и системных реакций выявлено и зарегистрировано не было.
Каких-либо отклонений от нормальных значений по регистрируемым показателям (температура. АД, ЧСС, ЧДД и др.) выявлено и зарегистрировано не было.
Аллергические свойства у трехвалентной вакцины оценивали по показателям общего IgE и специфического IgE к овальбумину (таблица 12). Таблица 12
Динамика показателей общего IgE и специфического IgE к
овальбумину
Figure imgf000039_0001
Установлено, что аллергические свойства у трехвалентной вакцины отсутствуют.
Таким образом, по результатам проведенных исследований можно заключить, что трехвалентная вакцина характеризуется слабой реактогенностью и высоким профилем безопасности.
В ходе проведения II фазы (см. пример 8), помимо иммуногенности были оценены показатели реактогенности и безопасности трехвалентной вакцины на 200 добровольцах. Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что трехвалентная вакцина характеризуется низкой реактогенностью и высоким профилем безопасности.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения антигена или антигенов вируса гриппа, включающий получение куриных эмбрионов (КЭ), их дезинфекцию, предварительную инкубацию, заражение рабочим раствором посевного вируса, инкубацию зараженных КЭ, охлаждение после инкубации, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости, дезагрегацию выделенных вирусов путем добавления раствора NaCl до конечной концентрации 0,23-0,30 М, инактивацию их добавлением b-пропиолактона до конечной концентрации 0,1% и очистку вируссодержащей аллантоисной жидкости методами микрофильтрации с использованием каскада из трех фильтров с диаметром пор 10 мкм, 1 мкм, 0,6 мкм и ультрафильтрации с пределом отсечения 300 кДа, затем проводят концентрирование осветленной вируссодержащей аллантоисной жидкости не более чем в 20 раз, концентрат очищают путем двойного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы, после чего осуществляют расщепление инактивированного вирусного концентрата с использованием детергента и-октил-Р-Э-глюкопиранозида (октилглюкозида) или тетрадецилтриметиламмония бромида (ТДТАБ), удаление недоразрушенных вирионов и комплексов рибонуклеопротеидов с мембранным белком методом центрифугирования, микро- и ультрафильтрацию, хроматографическую очистку и стерилизующую фильтрацию полученного антигена или антигенов, а стабилизацию антигена или антигенов проводят с использованием детергента Тритон Х-100 в концентрации 100-200 мкг/мл.
2. Противогриппозная вакцина, содержащая антиген или антигены, полученные способом по п. 1.
3. Вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит 1, 3 или 4 антигена, полученные способом по п. 1.
PCT/RU2020/050107 2019-06-14 2020-05-26 Получение антигена или антигенов для противогриппозной вакцины WO2020251405A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019118695A RU2710239C1 (ru) 2019-06-14 2019-06-14 Способ получения антигена или антигенов для производства противогриппозной вакцины и вакцина на его основе
RU2019118695 2019-06-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020251405A1 true WO2020251405A1 (ru) 2020-12-17

Family

ID=69022737

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2020/050107 WO2020251405A1 (ru) 2019-06-14 2020-05-26 Получение антигена или антигенов для противогриппозной вакцины

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2710239C1 (ru)
WO (1) WO2020251405A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112704733A (zh) * 2020-12-29 2021-04-27 深圳康泰生物制品股份有限公司 四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法
CN113293147A (zh) * 2021-01-28 2021-08-24 上海青赛生物科技有限公司 一种新型冠状病毒的规模化纯化方法
CN114525263A (zh) * 2022-02-25 2022-05-24 金宇保灵生物药品有限公司 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的纯化浓缩方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2741003C1 (ru) * 2020-03-27 2021-01-22 Евгений Дмитриевич Некрасов Способ производства четырехвалентной субъединичной вакцины против гриппа без адъювантов
RU2754398C1 (ru) * 2020-06-25 2021-09-01 Общество с ограниченной ответственностью «ФОРТ» Способ получения четырехвалентной вакцины для профилактики гриппа

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013010797A1 (en) * 2011-07-20 2013-01-24 Abbott Biologicals B.V. Process for producing viral antigen and vaccines
CN103721251A (zh) * 2013-12-12 2014-04-16 北京科兴生物制品有限公司 流感病毒裂解疫苗的纯化方法
RU2535153C1 (ru) * 2013-09-04 2014-12-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства России (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) Способ получения высокоочищенных вирионных концентратов
RU2584594C1 (ru) * 2015-07-02 2016-05-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) Вакцина гриппозная инактивированная расщепленная и способ ее получения
CN106668854A (zh) * 2016-12-23 2017-05-17 江苏中慧元通生物科技有限公司 一种四价亚单位流感疫苗及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5518041B2 (ja) * 2008-03-18 2014-06-11 ノバルティス アーゲー インフルエンザウイルスワクチン抗原の調製における改良
RU2423995C1 (ru) * 2009-11-10 2011-07-20 Общество с ограниченной ответственностью "ФОРТ" Способ производства вакцины против гриппа
RU2493872C1 (ru) * 2012-08-08 2013-09-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации ( ФГУП "НПО "Микроген" Минздрава России) Способ очистки вируса гриппа

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013010797A1 (en) * 2011-07-20 2013-01-24 Abbott Biologicals B.V. Process for producing viral antigen and vaccines
RU2535153C1 (ru) * 2013-09-04 2014-12-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства России (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) Способ получения высокоочищенных вирионных концентратов
CN103721251A (zh) * 2013-12-12 2014-04-16 北京科兴生物制品有限公司 流感病毒裂解疫苗的纯化方法
RU2584594C1 (ru) * 2015-07-02 2016-05-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) Вакцина гриппозная инактивированная расщепленная и способ ее получения
CN106668854A (zh) * 2016-12-23 2017-05-17 江苏中慧元通生物科技有限公司 一种四价亚单位流感疫苗及其制备方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112704733A (zh) * 2020-12-29 2021-04-27 深圳康泰生物制品股份有限公司 四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法
CN113293147A (zh) * 2021-01-28 2021-08-24 上海青赛生物科技有限公司 一种新型冠状病毒的规模化纯化方法
CN114525263A (zh) * 2022-02-25 2022-05-24 金宇保灵生物药品有限公司 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的纯化浓缩方法

Also Published As

Publication number Publication date
RU2710239C1 (ru) 2019-12-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2710239C1 (ru) Способ получения антигена или антигенов для производства противогриппозной вакцины и вакцина на его основе
US6048537A (en) Method for preparing an influenza virus, antigens obtained and applications thereof
JP2022034076A (ja) 卵を使用しないインフルエンザウイルスワクチンの作製
US10398771B2 (en) Process for producing influenza vaccine
PT904351E (pt) Células animais e processos para a replicação de vírus influenza
WO2006041819A1 (en) Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions
EA014190B1 (ru) Вакцины против гриппа, адсорбированные на алюминиевых адъювантах, для немедленного приёма
WO2008073490A1 (en) Purification of influenza viral antigens
RU2754398C1 (ru) Способ получения четырехвалентной вакцины для профилактики гриппа
CN102406930A (zh) 季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法
RU2584594C1 (ru) Вакцина гриппозная инактивированная расщепленная и способ ее получения
CN104258389A (zh) 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
CN113493507B (zh) 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体及其制备方法和应用
RU2283139C1 (ru) Способ получения антигенов для вакцины против вирусов гриппа
Tabynov et al. Immunogenic and protective properties of the first Kazakhstan vaccine against pandemic influenza A (H1N1) pdm09 in ferrets
CN103789272B (zh) H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物
CN107537032A (zh) 一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法
CN101511385A (zh) 不使用蛋制备流感病毒疫苗
CN112608382B (zh) 鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法
EA043807B1 (ru) Способ получения антигена или антигенов для производства противогриппозной вакцины и вакцина на его основе
RU2741003C1 (ru) Способ производства четырехвалентной субъединичной вакцины против гриппа без адъювантов
RU2220744C1 (ru) Вакцина против ящура типа азия-1 и способ ее изготовления
RU2682876C1 (ru) Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О
RU2294760C2 (ru) Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа а
RU2804948C2 (ru) Пентавалентная субъединичная вакцина против респираторных инфекций и способ ее получения

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20822431

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20822431

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1