CN113493507B - 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体及其制备方法和应用。其制备方法包括：(1)制备鸭呼肠孤病毒抗原；(2)将制备的鸭呼肠病孤毒抗原灭活后加油佐剂混合乳化制备得到鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗；(3)用灭活疫苗免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，提取卵黄抗体。本发明制备的新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体抗体可安全、有效的预防鸭呼肠孤病毒引起的以各个年龄阶段鸭脾脏肿大、出血和坏死，导致种鸭产蛋和肉鸭体重的下降，料肉比升高，肉鸭出栏合格率显著降低等临床症状，能够有针对性的防治鸭呼肠孤病毒的感染与爆发，同时简化了生产工艺，可规模化生产并应用于临床。

Description

新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及卵黄抗体，尤其涉及新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体及其制备方法，本发明进一步涉及该新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体在防治新型鸭呼肠孤病毒病，属于鸭呼肠孤病毒卵黄抗体及其制备领域。
背景技术
新型鸭呼肠孤病毒(Novel Duck Reovirus，NDRV)病又称“鸭坏死性肝炎”，该病毒在血清学上完全不同于之前的番鸭呼肠孤病毒，是鸭的一种以肝脏不规则坏死、出血斑/点和心肌、法氏囊出血为主要特征的传染性疾病，番鸭、半番鸭、麻鸭和北京鸭等各品种的鸭均可发病，该病无明显季节性，发病鸭一般为3～25日龄，鸭的日龄愈小，发病率和死亡率愈高。NDRV的感染严重损害鸭免疫器官，造成免疫抑制，导致其他传染病的继发。该病最先于2005年在中国的福建、浙江和广东等地鸭群中出现和流行，后蔓延至全国，近年来由于该病毒的肆虐给我国养鸭业造成较大的经济损失，现地急需能有效的疫苗或抗体对该病进行防治。
卵黄抗体(egg yolk antibodies，IgY)是指产蛋鸡受特定抗原免疫后产生并转移和贮存在卵黄中的特异性抗体，从蛋黄中将IgY提取并应用在动物疾病的防治中已得到广泛认可。卵黄抗体作为疫病的有效防控手段有安全性高、起效快、特异性强的特点一直被受现地养殖用户的青睐与关注，但由于国内卵黄抗体提取方法繁多，提取方法各异，导致抗体品质差异较大，其中效价损失大、纯度低、脂类物质大量残留等问题尤为突出。
发明内容
本发明的目的之一提供一种安全、高效、适用于企业大规模生产的鸭呼肠孤病毒卵黄抗体；
本发明的目的之二是提供一种制备所述新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的方法。
本发明的目的之三是将所述的新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体用于预防鸭呼肠孤病毒引起的各种疾病。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一种鸭呼肠孤病毒病卵黄抗体，其制备方法包括：
(1)制备鸭呼肠孤病毒抗原；
(2)将制备的鸭呼肠孤病毒抗原灭活后加油佐剂混合乳化制备得到鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗；
(3)用灭活疫苗免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，提取卵黄抗体，即得。
步骤(1)所述的鸭呼肠孤病毒抗原的制备方法包括，将鸭呼肠孤病毒疫苗株接种鸡肝癌细胞(LMH)，培养后收获细胞液，即得；其中，所述的鸭呼肠孤病毒疫苗株可以是任何一种能够通过商业途径购买或自行分离得到的鸭呼肠孤病毒疫苗株，作为本发明的一种具体的实施方式，本发明采用了新型鸭呼肠孤病毒疫苗S株，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20000；
作为本发明一种具体的实施方式，步骤(2)中所述的制备鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗的方法包括，
(a)油相制备；将白油和硬脂酸铝混合均匀后加热再加入司本-80再升温加热后冷却，即得；优选的，将注射用白油、硬脂酸铝以95份:1份的比例混匀并加热至80℃，再加入5份司本-80至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用；
(b)水相制备：将灭活后的病毒抗原与吐温-80混合至吐温-80完全溶解混匀均匀；优选的，将灭活的病毒抗原与吐温-80按95:5的比例混合，再搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解混匀；
(c)乳化：将油相和水相混合乳化，即得；优选的，将油相和水相以1:2比例乳化30min。
步骤(3)中所述的用灭活疫苗免疫产蛋鸡的免疫程序优选为：(a)基础免疫：鸭呼肠孤病毒油乳佐剂免疫原，皮下注射健康产蛋鸡，每只1.0ml；(b)加强免疫：基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只1.5ml；(c)强化免疫：加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；(d)维持免疫：在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。
步骤(3)中所述的收集高免蛋的方法优选为：产蛋鸡强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免鸭呼肠孤病毒蛋黄中抗体效价，当中和效价不低于1:1024时，收集高免蛋，置10～15℃，应不超过10日。
步骤(4)中所述的提取卵黄抗体方法可以是各种常规的卵黄抗体方法,包但不限浓盐水法、聚乙二醇方法、氯仿法、苯酚法或辛酸-黄原胶法等,本发明根据提取方法的比较试验结果发现，选用辛酸-黄原胶法提取的卵黄抗体回收率、纯度、澄清度、除脂率和抗体效价均显著优于浓盐水法、氯仿法、聚乙二醇法或苯酚法等提取方法。
作为本发明的一种优选的具体实施方式，采用辛酸-黄原胶法法提取的卵黄抗体的方法包括：
(1)蛋壳消毒后进行蛋黄分离，收集卵黄；
(2)除脂：将卵黄和黄原胶水溶液混匀，静置，得上清液备用；
(3)萃取：向上清液中加入正辛酸，静置，取上清液过滤，滤液调至pH7.2；
(4)过滤、浓缩、灭活，即得。
优选的，步骤(2)中，按照体积比计，将卵黄和终浓度为0.1％的黄原胶水溶液按照1：2的比例混匀并调至pH5.2，置2～8℃静置16小时。
优选的，步骤(3)中向上清液中加入终浓度2％正辛酸，室温静置4小时取上清液过滤。
优选的，步骤(4)所述的过滤是将加辛酸处理好的卵黄上清液用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤；所述的浓缩是经截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍；所述的灭活是按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。
根据本发明的卵黄抗体免疫攻毒试验结果可以看出，3批鸭呼肠孤病毒卵黄抗体注射1日龄健康易感鸭对强毒的攻毒保护率分别为100％、100％和98％；根据本发明的卵黄抗体最小免疫剂量试验卵黄抗体的治疗效果可见，用鸭呼肠孤病毒S株注射3日龄雏鸭，攻毒1日后分别注射卵黄抗体进行治疗，2.0ml/只剂量，卵黄抗体对感染鸭呼肠孤病毒的雏鸭治愈率达到98％，表明本发明提取的卵黄抗体对鸭呼肠孤有较好的治疗效果。
本发明制备的新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体抗体可安全、有效的预防鸭呼肠孤病毒引起的以各个年龄阶段鸭脾脏肿大、出血和坏死，导致种鸭产蛋和肉鸭体重的下降，料肉比升高，肉鸭出栏合格率显著降低等临床症状，能够有针对性的防治鸭呼肠孤病毒的感染与爆发，同时简化了生产工艺，可规模化生产并应用于临床。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
生产用毒株
制苗免疫原用鸭呼肠孤病毒S株(中国微生物菌种保藏中心保藏，CGMCCNo.20000)，由哈药集团生物疫苗有限公司分离、鉴定、保管和供应。
实施例1新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及检验
1制苗用病毒液制备
将生长状态良好的鸡肝细胞单层弃去培养液，按2％的量吸附接种鸭呼肠孤病毒S株，37℃吸附1小时后加入维持液继续培养，每日观察记录细胞病变情况。当细胞80％以上病变时收获，冻融2次，取样进行半成品检验。-20℃以下保存，不超过30日。
2灭活
将检验合格的病毒液澄清过滤去细胞碎片，边搅拌边加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％。37℃灭活16h，期间不断搅拌。灭活后病毒液置2～8℃保存，保存期不超过30天。
3疫苗制备及分装
3.1油相制备
将注射用白油、硬脂酸铝以95:1的比例混匀并加热至80℃，再加入5份司本-80，至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用。
3.2水相制备
将检验合格的病毒液按95:5的比例与吐温-80混合，在搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解混匀。
3.3乳化
将油相和水相以1:2比例乳化30min。取10ml疫苗加入离心管中，3000rpm，离心15min，管底析出水相应不大于0.5ml。
3.4分装定量分装，压盖，2-8℃保存。
4抗体制造及半成品检验
4.1高免蛋鸡群符合以下标准
4.1.1健康，无禽白血病、禽网状内皮组织增殖病，按0.5％抽样，血清抗体结果应全部为阴性。
4.1.2监测鸡白痢和鸡毒支原体，二者的阳性率不超过0.1％。
4.1.3应适时接种禽流感、鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病、鸡马立克氏病、鸡减蛋综合征(EDS76)及鸡大肠杆菌病等疫苗，并做好球虫病药物预防。
4.1.4应具有商品蛋鸡的良好生产性能。
4.2免疫程序
4.2.1基础免疫鸭呼肠孤病毒油乳佐剂免疫原，皮下注射健康产蛋鸭呼肠孤病毒，每只1.0ml。
4.2.2加强免疫基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只1.5ml。
4.2.3强化免疫加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml。
4.2.4维持免疫在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。
4.3高免蛋收集产蛋鸭呼肠孤病毒强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免鸭呼肠孤病毒蛋黄中抗体效价，当中和效价不低于1:1024时，收集高免蛋，置10～15℃，应不超过10日。
4.4鸭呼肠孤病毒蛋黄抗体提取(辛酸-黄原胶法)
4.4.1蛋壳消毒高免蛋浸入1‰新洁尔灭水溶液中消毒15分钟。然后用甲醛熏蒸高免蛋30分钟。
4.4.2蛋黄分离打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。
4.4.3除脂量取卵黄体积，加入灭菌玻瓶内，按其2体积量加入终浓度为0.1％黄原胶水溶液(W/V)，混匀，并调至pH5.2，置2～8℃静置16小时。
4.4.4萃取吸取并量取上清液体积，加入终浓度2％正辛酸(v/v)，室温静置4小时，取上清液经过滤后，滤液调至pH7.2。
4.4.5过滤、浓缩将加辛酸处理好的卵黄上清液用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤，再经截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍。
4.4.6灭活按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。
4.4.7半成品配制将浓缩灭活卵黄抗体用磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释为琼扩抗体效价不低于1:4，再用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。
4.5半成品检验
4.5.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
4.5.2中和效价测定卵黄抗体中和效价不低于1:128。
4.6分装定量分装，加盖密封，2～8℃保存。
5成品检验
5.1性状本品为透明液体，久置后底部有少量白色沉淀。
5.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，符合规定。
5.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
5.4支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。5.5外源病毒检验用3～5瓶抗体混合，取混合抗体20ml加入透析袋(孔径0.2～0.25nm)，在2～5℃用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)缓冲液对样品进行透析过夜，透析过夜后抗体样品体积应在20ml±0.5ml，作为检品。按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。
6.6甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。5.7辛酸残留量检验辛酸残留量不高于0.1％。
试验例1新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的安全性检验
1检验对象
实施例1制备的新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体成品。
2检验方法及结果
1日龄健康易感雏鸭10只，每只皮下注射抗体2.0ml；体重18～22g的SPF级小鼠10只，每只皮下注射抗体0.5ml。连续观察14日，雏鸭和小鼠全部健活，检验结果说明，本发明制备的新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体具有良好的安全性。
试验例2新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的效力检验试验1检验对象：实施例1制备的新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体成品。
2试验方法及结果
2.1中和抗体效价测定
抗体用灭菌生理盐水2倍比稀释，取1:64、1:128和1:256稀释度分别与等量鸭呼肠孤病毒S株(100TCID50/0.1ml)混合，置37℃中和1小时，每个稀释度接种6孔含生长状态良好的LMH细胞的96孔细胞板，每孔0.1ml，补充细胞维持液至0.2ml，同时设病毒对照6孔和正常细胞对照6孔，置37℃，5％CO2培养箱培养168小时，计算抗体的半数保护量(PD50)。病毒对照应细胞全部病变，正常对照细胞应全部健活，能使50％细胞保护的最高稀释倍数即为抗体的中和效价。计算抗体的中和效价，中和效价结果见表1。
表1卵黄抗体的治疗效果效价测定
Figure GDA0004039939390000081
2.2抗体免疫攻毒试验
1日龄健康易感雏鸭70只，随机分成3组，每1组50只，为注射抗体组，颈部皮下注射抗体0.5ml/只；第2组10只为健康对照组，不注射任何药品；第3组10只为攻毒对照组，颈部皮下注射生理盐水0.5ml/只。注射抗体后24小时，第1组和第3组雏鸭各颈部皮下注射检验用鸭呼肠孤病毒S株0.5ml/只(含100LD50)，连续观察10日。察期结束后各自雏鸭全部扑杀检查肝脏和脾脏，以第2组鸭肝脏和脾脏均应100％无异常；第3组鸭检查肝脏和脾脏，至少80％有鸭呼肠孤病毒感染导致的肝脏或脾脏坏死症状为试验成立，计算抗体免疫的攻毒保护率，共计进行3批抗体试验，试验结果见表2。
表2免疫攻毒试验结果
Figure GDA0004039939390000091
从表2结果可以看出，3批鸭呼肠孤病毒卵黄抗体注射1日龄健康易感鸭对强毒的攻毒保护率分别为100％、100％和98％。
2.3抗体最小免疫剂量试验
取实验室试制的卵黄抗体(中和效价1:128)，按0.2ml/只、0.5ml/只和1.0ml/只剂量经颈部皮下接种1日龄健康易感鸭，每个剂量接种健康易感鸭各50只，同时另设同批1日龄健康易感鸭鸭10只作为健康对照，10只作为攻毒对照。在注射抗体24小时后，试验抗体组与攻毒对照组鸭颈部皮下注射检验用鸭呼肠孤病毒S株0.5ml/只(含100LD50)，观察10日，结果见表3。
表3最小免疫剂量试验结果
Figure GDA0004039939390000101
从表3结果可以看出，1日龄健康易感鸭按0.2ml/只剂量注射抗体，鸭呼肠孤病毒的攻毒保护率为60％；按0.5ml/只剂量注射抗体，鸭呼肠孤病毒的攻毒保护率为94％；按1.0ml/只剂量注射抗体，鸭呼肠孤病毒的攻毒保护率为100％；攻毒对照组90％出现典型病变；健康对照组100％健活，且无典型病变。说明该抗体注射1日龄健康易感鸭，每只0.5ml的免疫剂量能起到较好的保护效果。
2.4抗体最小免疫剂量试验卵黄抗体的治疗效果
取3日龄易感雏鸭150只，颈部注射鸭呼肠孤病毒S株，0.5ml/只(含100LD50)，攻毒1日后随机分为3组，每组50只，分别按1.0ml/只、1.5ml/只和2.0ml/只剂量注射卵黄抗体(中和效价1:128)进行治疗，同时另设同批3日龄健康易感鸭鸭10只作为健康对照，10只作为攻毒对照。隔离饲养观察10日，观察治疗效果，结果见表4。
表4卵黄抗体的治疗效果
Figure GDA0004039939390000102
用鸭呼肠孤病毒S株注射3日龄雏鸭，攻毒1日后分别注射卵黄抗体进行治疗，2.0ml/只剂量，卵黄抗体对感染鸭呼肠孤病毒的雏鸭治愈率达到98％，表明提取的卵黄抗体对鸭呼肠孤有较好的治疗效果。
试验例3卵黄抗体不同方法的提取及比较试验
1卵黄抗体不同方法的提取
1.1浓盐水法：量取卵黄体积，按1:4比例加入16％的浓盐水充分混匀，4℃静置4小时，，上清用1.0μm中空纤维滤器过滤后，滤液用100KD超滤膜包进行3倍浓缩，浓缩液即为所提卵黄抗体。
1.2聚乙二醇：量取卵黄体积，按1:4比例加入终浓度为4％的PEG6000(v/w)，充分搅拌，室温下反应20min。5000r/min离心30min，取上清加入PEG6000，使其终浓度达到12％(v/w)，充分搅拌，室温作用10min。5000r/min离心30min，取沉淀加入与卵黄等体积的PBS缓冲液，即为提取的卵黄抗体。
1.3氯仿法：量取卵黄体积，按1:1比例加入PBS(pH 7.5)充分搅拌后加入等量的氯仿混匀，4℃静置1h，4000r/min离心20min取上清即为提取的卵黄抗体。
1.4苯酚法：量取卵黄体积，按1:4比例加入苯酚充分混匀，静置10分钟，加入等量的冰乙醇，8000r/min离心10min，取沉淀加入与卵黄等体积的PBS缓冲液，即为提取的卵黄抗体。
1.5辛酸-黄原胶法：具体方法请见实施例1中的“4.4鸭呼肠孤病毒蛋黄抗体提取(辛酸-黄原胶法)”有关内容。
2不同方法提取卵黄抗体的比较结果
不同方法提取卵黄抗体的试验结果见表5。
表5不同方法提取卵黄抗体的比较结果
Figure GDA0004039939390000111
Figure GDA0004039939390000121
从表5结果可以看出，选用辛酸-黄原胶法提取的卵黄抗体回收率、纯度、澄清度、除脂率和抗体效价均较显著优于浓盐水法、氯仿法、聚乙二醇法和苯酚法。

Claims (9)

1.一种新型鸭呼肠孤病毒(NovelDuck Reovirus)病卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：
(Ⅰ)制备新型鸭呼肠孤病毒抗原；
(Ⅱ)将制备的新型鸭呼肠孤病毒抗原灭活后加油佐剂混合乳化制备得到新型鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗；
(Ⅲ)用灭活疫苗免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，采用辛酸-黄原胶法提取卵黄抗体，即得；
所述辛酸-黄原胶法提取的卵黄抗体的方法包括：
(1)蛋壳消毒后进行蛋黄分离，收集卵黄；
(2)除脂：将卵黄和黄原胶水溶液混匀，静置，得上清液备用；
(3)萃取：向上清液中加入正辛酸，静置，取上清液过滤，滤液调至pH7.2；
(4)过滤、浓缩、灭活，即得。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(Ⅰ)所述的新型鸭呼肠孤病毒抗原的制备方法包括，将新型鸭呼肠孤病毒疫苗株接种鸡肝癌细胞，培养后收获细胞液，即得。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(Ⅱ)中所述的制备新型鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗的方法包括，
(a)油相制备；将白油和硬脂酸铝混合均匀后加热再加入司本-80再升温加热后冷却，即得；
(b)水相制备：将灭活后的新型鸭呼肠孤病毒抗原与吐温-80混合至吐温-80完全溶解混匀均匀；
(c)乳化：将油相和水相混合乳化，即得。
4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中将注射用白油、硬脂酸铝以95份:1份的比例混匀并加热至80℃，再加入5份司本-80至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用；步骤(b)中将灭活的病毒抗原与吐温-80按95:5的比例混合，再搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解混匀；步骤(c)中将油相和水相以1:2比例乳化30min。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(Ⅲ)中所述的用灭活疫苗免疫产蛋鸡的免疫程序为：(a)基础免疫：新型鸭呼肠孤病毒油乳佐剂免疫原皮下注射健康产蛋鸡，每只1.0ml；(b)加强免疫：基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只1.5ml；(c)强化免疫：加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；(d)维持免疫：在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。
6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(Ⅲ)中所述的收集高免蛋的方法为：产蛋鸡强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免新型鸭呼肠孤病毒蛋黄中抗体效价，当中和效价不低于1:1024时，收集高免蛋。
7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，按照体积比计，将卵黄和终浓度为0.1％的黄原胶水溶液按照1：2的比例混匀并调至pH5.2，置2～8℃静置16小时；
步骤(3)中向上清液中加入终浓度2％正辛酸，室温静置4小时取上清液过滤；
步骤(4)所述的过滤是将加辛酸处理好的卵黄上清液用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤；所述的浓缩是经截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍；所述的灭活是按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。
8.由权利要求1-7任何一项制备方法得到的新型鸭呼肠孤病毒病卵黄抗体。
9.权利要求8所述的新型鸭呼肠孤病毒病卵黄抗体在制备预防由新型鸭呼肠孤病毒引起的疾病药物中的用途。
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