CN109336971A - 鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法及其产品。所述制备方法包括：(1)将鹅星状病毒液与佐剂配制后作为免疫原免疫健康产蛋鹅制备得到高免蛋，收集高免蛋；(2)将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄；采用酸水‑卡拉胶法从卵黄中提取卵黄抗体。本发明制备方法所提取的鹅星状病毒卵黄抗体的回收率大于93％，纯度大于95％，在回收率、提取量、纯度等指标上均显著优于采用现有方法制备得到的鹅星状病毒卵黄抗体。采用本发明制备的鹅星状病毒卵黄抗体，只需要0.5ml的预防剂量能起到较好的保护效果，对强毒的攻毒保护率达到100％。本发明可针对性的防治鹅星状病毒的感染与爆发，同时简化了生产工艺，可规模化生产并应用于临床。

Description

鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法及其产品
技术领域
本发明涉及鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，本发明进一步涉及由该制备方法得到的鹅星状病毒卵黄抗体及其应用，属于鹅星状病毒卵黄抗体的制备和应用领域。
背景技术
小鹅瘟(Gosling plague)，又称鹅细小病毒感染，是雏鹅的一种急性败血性传染病，以精神萎顿、食欲废绝、严重下痢，有时出现神经症状，死亡率高为临诊特点，可经消化道和呼吸道感染，并可经卵垂直传播。本病主要侵害4～20日龄的易感雏鹅，具有传播快、发病率高和致死率高的特点。目前本病呈世界性分布，常引起雏鹅大批死亡，对养鹅业的发展影响极大。
卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，因此称其为卵黄免疫球蛋白IgG(yolk antibody)，简称为IgY。当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体，IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG，单个卵黄(约15ml)中卵黄抗体含量可达200mg左右。再加之从卵黄中提取抗体较从动物血清中提取抗体简便，因此卵黄抗体具有明显的技术优势。
现有的鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法存在回收率低、纯度不高以及免疫保护效果不够理想等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，该制备方法具有回收率高、纯度高，所获得的鹅星状病毒卵黄抗体免疫保护效力高等优点；
本发明的目的之二是将所制备的鹅星状病毒卵黄抗体应用于防治鹅星状病毒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一种鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，包括：
(1)将鹅星状病毒液与佐剂配制后作为免疫原免疫健康产蛋鹅制备得到高免蛋，收集高免蛋；(2)将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄；采用酸水-卡拉胶法从卵黄中提取卵黄抗体；
其中，步骤(1)中将鹅星状病毒液与油乳佐剂混合配制得到油乳佐剂免疫原；为了实现更好的免疫效果，优选的，将鹅星状病毒液与油乳佐剂按照1:1.5(V/V)的体积比例混合配制得到油乳佐剂免疫原。
本发明通过优化实验发现，采用下述的免疫程序能够有效的提高免疫效果：
(1)基础免疫：将鹅星状病毒油乳佐剂免疫原皮下注射健康产蛋鹅星状病毒，每只1.0ml；
(2)加强免疫：基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只1.5ml；
(3)强化免疫：加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；
(4)维持免疫：在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。
步骤(1)中所述高免蛋的收集方法包括：产蛋鹅星状病毒强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免鹅星状病毒蛋黄中抗体效价，当中和指数≥500时，收集高免蛋。
步骤(2)中所述的酸水-卡拉胶法包括：
(a)去除卵黄中的脂肪；优选的，所述的去除卵黄中的脂肪的方法包括：将卵黄与0.12mol/L，pH5.0的醋酸盐缓冲液混合均匀后调至pH5.2，置2～8℃静置，取上清液；其中，卵黄与0.12mol/L，pH5.0的醋酸盐缓冲液按照5:1的体积比进行配制；所述的静置时间优选为4小时；
(b)萃取：将上清液与λ-卡拉胶按照1mL上清液:6mgλ-卡拉胶的配比进行混合搅拌后静置；取上清液过滤后，滤液调至pH7.2；
(c)过滤及浓缩：滤液加入辛酸后再进行过滤，将滤液浓缩；其中，所述的过滤优选采用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤；所述的浓缩是采用截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍；
(d)将浓缩液进行灭活、稀释、除菌，即得；其中，所述的灭活是按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，搅拌混匀，室温灭活24小时；所述的稀释是将浓缩灭活卵黄抗体用pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释为琼扩抗体效价不低于1:4；所述的除菌是用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。
本发明制备方法所提取的鹅星状病毒卵黄抗体的回收率大于93％，纯度大于95％，在回收率、提取量、纯度等指标上显著优于采用现有制备方法得到的鹅星状病毒卵黄抗体。
抗体最小预防剂量试验表明，采用本发明制备的鹅星状病毒卵黄抗体注射1日龄健康易感鹅，0.5ml的预防剂量能起到较好的保护效果。
根据抗体预防试验结果可见，采用本发明制备的鹅星状病毒卵黄抗体注射1日龄健康易感鹅对强毒的攻毒保护率均为100％。本发明制备的鹅星状病毒卵黄抗体可安全、有效的预防鹅星状病毒引起的以拉石灰样稀便、脱水、消瘦、瘫痪和死亡鹅剖检病理变化为肾肿大、斑驳、输尿管有白色尿酸盐沉积物，内脏、关节、皮下等有白色尿酸盐附着、结晶为临床症状的痛风病。
根据抗体被动免疫期试验结果可见，将本发明制备的鹅星状病毒卵黄抗体注射1日龄健康易感鹅，注射抗体后1～5日攻毒保护率为80～100％，7日攻毒保护率为80％以下，说明注射抗体后5日抗体仍能产生良好地保护作用，因此，本发明制备的卵黄抗体的被动保护期为5日。
本发明可以有针对性的防治鹅星状病毒的感染与爆发，同时简化了生产工艺，可规模化生产并应用于临床。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1鹅星状病毒卵黄抗体的制备
一、试验材料及制备方法
生产用毒株：制苗免疫原用鹅星状病毒HLJ株，由哈药集团生物疫苗有限公司分离、鉴定、保管并对外出售。
1病毒原液的制备
用灭菌生理盐水将生产用毒种作10000倍稀释，经卵黄囊接种11日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，用蜡封孔，于37℃静置孵育。弃去48小时前死亡的鸭胚，以后每隔6小时照蛋1次，收集48～120小时死亡鸭胚，于4℃冷却6～12小时。鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存，并取样进行病毒含量(ELD50)测定。HLJ株病毒含量应不低于106.0ELD50/0.1ml。
2抗原浓缩与灭活
将检验合格的抗原于2～8℃条件下解冻、混合，于4℃条件下4000rpm离心30min，取上清液用4层灭菌纱布过滤，收集滤液用截留分子量为6KD的中空纤维超滤器浓缩10倍，浓缩液加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，密闭后置37℃温箱中灭活24小时(其间4～6小时振摇1次，每次3分钟)，于4℃保存备用，同时取样用于检验。灭活后的病毒液置2～8℃保存，有限期为30日。
3油乳佐剂免疫原的配制
按灭活病毒液与油佐剂1:1.5(V/V)的比例进行配制。将1.5份油相注入预混罐中，低温搅拌的同时，缓慢加入1份水相，再注入乳化罐乳化5分钟。乳化后，取样10ml，以3000r/min离心15min，如不分层，终止搅拌，无菌操作分装至250ml无菌瓶。
4免疫原的检验
4.1无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
4.2安全检验
用1～3日龄的SPF鹅10只，每只胸部皮下接种2.0ml，观察14日，全部健活。
5抗体制造及半成品检验
5.1高免蛋鹅星状病毒群应符合以下标准
5.1.1健康，无禽白血病、禽网状内皮组织增殖病，按0.5％抽样，血清抗体结果应全部为阴性。
5.1.2监测鹅星状病毒白痢和鹅星状病毒支原体，二者的阳性率不超过0.1％。
5.1.3应适时接种禽流感、鹅星状病毒新城疫、鹅星状病毒传染性支气管炎、鹅星状病毒传染性法氏囊病、鹅星状病毒马立克氏病、鹅星状病毒减蛋综合征(EDS76)及鹅星状病毒大肠杆菌病等疫苗，并做好球虫病药物预防。
5.1.4应具有商品蛋鹅星状病毒的良好生产性能。
5.2免疫程序
5.2.1基础免疫
鹅星状病毒油乳佐剂免疫原，皮下注射健康产蛋鹅星状病毒，每只1.0ml。
5.2.2加强免疫
基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只1.5ml。
5.2.3强化免疫
加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml。
5.2.4维持免疫在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。
5.3高免蛋收集
产蛋鹅星状病毒强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免鹅星状病毒蛋黄中抗体效价，当中和指数≥500时，收集高免蛋，置10～15℃，应不超过10日。
5.4禽星状病毒蛋黄抗体制造
5.4.1蛋壳消毒
将鹅星状病毒蛋浸入1‰新洁尔灭水溶液中消毒15分钟。然后用甲醛熏蒸鹅星状病毒蛋30分钟。
5.4.2蛋黄分离
打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。
5.4.3除脂
量取卵黄体积，加入灭菌玻瓶内，按其5倍体积量加入醋酸盐缓冲液(0.12mol/L，pH5.0)，混匀，并调至pH5.2，置2～8℃静置4小时。5.4.4萃取
吸取并量取上清液体积，按每毫升体积加入6mgλ-卡拉胶，充分搅拌后，室温静置2小时，取上清液经过滤后，滤液调至pH7.2。
5.4.5过滤、浓缩
将加辛酸处理好的卵黄上清液用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤，再经截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍。
5.4.6灭活
按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。5.4.7半成品配制
将浓缩灭活卵黄抗体用磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释为琼扩抗体效价不低于1:4，再用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。
5.5半成品检验
5.5.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
5.5.2中和指数测定卵黄抗体中和指数≥200。
5.6分装定量分装，加盖密封，2～8℃保存。
6成品检验
6.1性状本品为透明液体，久置后底部有少量白色沉淀。
6.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，符合规定。
6.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
6.4支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。
6.5外源病毒检验用3～5瓶抗体混合，取混合抗体20ml加入透析袋(孔径0.2～0.25nm)，在2～5℃用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)缓冲液对样品进行透析过夜，透析过夜后抗体样品体积应在20ml±0.5ml，作为检品。按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。
6.6甲醛残留量测定
按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。
6.7辛酸残留量检验辛酸残留量不高于0.1％。
6.8安全检验
1日龄健康易感雏鹅10只，每只皮下注射抗体2.0ml；体重18～22g的SPF级小鼠10只，每只皮下注射抗体0.5ml。连续观察14日，雏鹅和小鼠全部健活。
试验例1鹅星状病毒卵黄抗体的效力检验试验
1中和指数测定
鹅星状病毒HLJ株毒种用生理盐水10倍系列稀释，分装到2列无菌西林瓶中，第1列加等量生理盐水(对照组)，第2列加被检抗体(试验组)，吹打混合后加塞、置37℃作用6～8小时，对照组取10-4～10-7稀释度和试验组取10-1～10-7稀释度，每个稀释度分别经卵黄囊途径接种6枚11日龄SPF鸭胚，0.2ml/胚，用蜡封孔，于37℃静置孵育，24小时以前死亡鸭胚弃去不计，24～120小时死亡鸭胚随时取出，按Reed-Muench法计算2组的ELD50，中和指数＝试验组ELD50/对照组ELD50，中和指数应≥300。
2抗体最小预防剂量试验
取3批实施例1制备的鹅星状病毒卵黄抗体，按0.5ml/只、1.0ml/只和1.5ml/只剂量经颈部皮下接种1日龄健康易感鹅，每个剂量接种健康易感鹅各60只，同时另设同批1日龄健康易感鹅10只作为健康对照，10只作为攻毒对照。在注射抗体24小时后，试验抗体组与攻毒对照组鹅颈部皮下注射鹅星状病毒HLJ株强毒0.5ml(含105ELD50)，观察10日，结果见表1。
表1最小预防剂量试验结果
从表1结果可以看出，1日龄健康易感鹅按0.2ml/只剂量注射抗体，鹅星状病毒的攻毒保护率为56.67％～63.33％；按0.5ml/只剂量注射抗体，鹅星状病毒的攻毒保护率为93.33％；按1.0ml/只剂量注射抗体，鹅星状病毒的攻毒保护率为96.67％；攻毒对照组90％出现典型病变；健康对照组100％健活，且无典型病变。说明该抗体注射1日龄健康易感鹅，0.5ml的预防剂量能起到较好的保护效果。
3抗体预防试验
取3批实施例1制备的鹅星状病毒卵黄抗体，每批用1日龄现地健康鹅60只，每只皮下注射鹅星状病毒卵黄抗体0.5ml，同时设同批1日龄健康易感鹅10只作为健康对照，10只作为攻毒对照组。24小时后抗体组和攻毒对照组鹅星状病毒每只皮下注射鹅星状病毒HLJ株强毒0.5ml(含105ELD50)；健康对照组，不注射任何药品。3个组隔离饲养。连续观察10日。结果见表2。
表2预防试验情况
从表2结果可以看出，3批鹅星状病毒卵黄抗体注射1日龄健康易感鹅对强毒的攻毒保护率均为100％。
4抗体被动免疫期试验
取3批实施例1制备的鹅星状病毒卵黄抗体，每批皮下注射1日龄现地健康易感鹅80只，0.5ml/只，同时设同批28日龄健康易感鹅10只作为健康对照，40只作为攻毒对照。在抗体注射后1、3、5和7日，从每批抗体注射鹅中随机抽取20只，连同攻毒对照10只健康易感鹅分别注射鹅星状病毒HLJ株强毒，每只0.5ml(含105ELD50)，健康对照组，不注射任何药品。连续观察10日，结果见表3。
表3抗体预防持续时间测定结果
从表3结果可以看出，3批鹅星状病毒卵黄抗体注射1日龄健康易感鹅，注射抗体后1～5日攻毒保护率为80～100％，7日攻毒保护率为80％以下，说明注射抗体后5日抗体仍能产生良好地保护作用，注射7日后以后抗体不能达到良好的保护效果。以此该卵黄抗体的被动保护期为5日。
试验例2卵黄抗体提取方法的筛选试验
1卵黄抗体不同方法的提取方法
1.1水提-超滤法
量取卵黄体积，按1:8比例加入纯化水，充分搅匀后调至pH4.3，4℃静置2小时，弃沉淀，上清用1.0μm中空纤维滤器过滤后，滤液用100KD超滤膜包进行8倍浓缩，浓缩液即为所提卵黄抗体。
1.2聚乙二醇-乙醇法
量取卵黄体积，按1:4比例加入PBS缓冲液(pH7.5)，然后加入粉末状PEG6000，加入量为总体积的3.5％，充分搅拌，室温下反应20min。5000r/min离心25min，取上清，加入总体积12％的PEG6000，充分搅拌，室温作用10min。离心取沉淀，加入与卵黄等体积的PBS缓冲液和预冷至-20℃的乙醇。5000r/min离心25min，沉淀溶解至与卵黄等体积的PBS缓冲液中，即为提取的卵黄抗体。
1.3酸水-硫酸铵法
量取卵黄体积，按1:4比例加入醋酸缓冲液(pH5.2)，充分搅拌-4℃静置4小时，弃沉淀，量取上清体积，按每100ml体积上清液加入硫酸铵33克，充分搅拌均匀，3000r/min离心30min，沉淀按卵黄液体积加入PBS缓冲液(pH7.5)，溶液即为提取的卵黄抗体。
1.4酸水-卡拉胶法
量取卵黄体积，加入灭菌玻瓶内，按其5倍体积量加入醋酸盐缓冲液(0.12mol/L，pH5.0)，混匀，并调至pH5.2，置2～8℃静置4小时；吸取并量取上清液体积，按每毫升体积加入6mgλ-卡拉胶，充分搅拌后，室温静置2小时，取上清液经过滤后，滤液调至pH7.2；将加辛酸处理好的卵黄上清液用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤，再经截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍；按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时；将浓缩灭活卵黄抗体用磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释再用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。
2不同方法提取卵黄抗体的比较结果
不同方法提取卵黄抗体的回收率以及纯度等结果见表4。
表4不同方法提取卵黄抗体的比较结果
从表4结果可以看出，选用酸水-卡拉胶法提取的卵黄抗体在回收率、提取量、纯度等指标显著优于水提提-超滤法、聚乙二醇-乙醇法以及酸水-硫酸法。

Claims (10)

1.一种鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将鹅星状病毒液与佐剂配制后作为免疫原免疫健康产蛋鹅制备得到高免蛋，收集高免蛋；(2)将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄；采用酸水-卡拉胶法从卵黄中提取卵黄抗体。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将鹅星状病毒液与油乳佐剂混合配制得到油乳佐剂免疫原；优选的，将鹅星状病毒液与油乳佐剂按照1:1.5的体积比例混合配制得到油乳佐剂免疫原。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述免疫的程序包括：
(1)基础免疫：将鹅星状病毒油乳佐剂免疫原皮下注射健康产蛋鹅星状病毒，每只1.0ml；
(2)加强免疫：基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只1.5ml；
(3)强化免疫：加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；
(4)维持免疫：在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述高免蛋的收集方法包括：产蛋鹅星状病毒强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免鹅星状病毒蛋黄中抗体效价，当中和指数≥500时，收集高免蛋。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的酸水-卡拉胶法包括：
(a)去除卵黄中的脂肪；(b)萃取：将上清液与λ-卡拉胶进行混合搅拌后静置；取上清液过滤后，滤液调至pH7.2；(c)过滤及浓缩：滤液加入辛酸后再进行过滤，将滤液浓缩；(d)将浓缩液进行灭活、稀释、除菌，即得。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中所述的去除卵黄中的脂肪的方法包括：将卵黄与0.12mol/L，pH5.0的醋酸盐缓冲液混合均匀后调至pH5.2，置2～8℃静置，取上清液；优选的，将卵黄与0.12mol/L，pH5.0的醋酸盐缓冲液按照5:1的体积比进行配制；所述的静置时间为4小时。
7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中将上清液与λ-卡拉胶按照1mL上清液:与6mgλ-卡拉胶的配比比例进行混合搅拌后静置。
8.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述的过滤采用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤；所述的浓缩是采用截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍；
优选的，所述的灭活是按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，搅拌混匀，室温灭活24小时；所述的稀释是将浓缩灭活卵黄抗体用pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释为琼扩抗体效价不低于1:4；所述的除菌是用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。
9.权利要求1-8任何一项制备方法得到的鹅星状病毒卵黄抗体。
10.权利要求9所述的鹅星状病毒卵黄抗体在制备诊断、预防或治疗由鹅星状病毒引起疾病的试剂或药物中的用途。
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