CN112608382B - 鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents

鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法。包括：(1)制备鸭呼肠孤病毒抗原以及鸭肝炎病毒液抗原；(2)将制备的抗原灭活后加油佐剂混合乳化得到鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗；(3)用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，提取卵黄抗体。根据本发明的抗体免疫攻毒试验结果可见，本发明抗体可安全、有效的预防新型鸭呼肠孤病毒引起的以肝脏不规则坏死、脾脏坏死为特征性病变的鸭新型鸭呼肠孤病和鸭肝炎病毒引起的以肝脏肿胀和出血为主要病理变化的鸭病毒性肝炎，能够一针防治新型鸭呼肠孤病毒病和鸭病毒性肝炎两种疫病。

Description

鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及鸭疫病卵黄抗体，尤其涉及鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体及其制备方法，属于鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体领域。
背景技术
新型鸭呼肠孤病毒病是中国近年来新出现的,以肝脏不规则坏死、出血斑/点和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病,俗称"鸭新肝病"、"鸭坏死性肝炎病"等。该病番鸭、半番鸭、麻鸭和北京鸭等各品种的鸭均可发病，该病无明显季节性，发病鸭一般为3～25日龄，鸭的日龄愈小，发病率和死亡率愈高。NDRV的感染严重损害鸭免疫器官，造成免疫抑制，导致其他传染病的继发。该病最先于2005年在中国的福建、浙江和广东等地鸭群中出现和流行，后蔓延至全国。
鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病。主要特征为肝脏肿大，有出血斑点和神经症状。鸭肝炎病毒有3个血清型，我国主要流行血清1型和3型鸭病毒性肝炎。本病主要发生于4～20日龄雏鸭，成年鸭有抵抗力，鸡和鸭不能自然发病。病鸭和带毒鸭是主要传染源，主要通过消化道和呼吸道感染。饲养管理不良，缺乏维生素和矿物质，鸭舍潮湿、拥挤，均可促使本病发生。本病发生于孵化雏鸭的季节，一旦发生，在雏鸭群中传播很快，发病率可达100％。
目前对于这两种疫病只能采用单独的疫苗进行防控，存在多次接种免疫导致出现不良反应，不方便、防治成本高等问题，由此尽快研制出一种安全有效的能够一针防治新型鸭呼肠孤病毒病和鸭病毒性肝炎两种疫病的卵黄抗体尤为重要。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种能够一针防治新型鸭呼肠孤病毒病和鸭病毒性肝炎两种疫病的鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一种鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体，其制备方法包括：
(1)分别制备鸭呼肠孤病毒抗原以及鸭肝炎病毒液抗原；
(2)将制备的抗原灭活后加油佐剂混合乳化制备得到鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗；
(3)用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，提取卵黄抗体，即得。
步骤(1)所述的鸭呼肠孤病毒抗原的制备方法包括，将鸭呼肠孤病毒疫苗株接种鸡肝癌细胞(LMH)，培养后收获细胞液，即得；其中，所述的鸭呼肠孤病毒疫苗株可以是任何一种能够通过商业途径购买或自行分离得到的鸭呼肠孤病毒疫苗株，作为本发明的一种具体的实施方式，本发明采用了新型鸭呼肠孤病毒疫苗S株，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20000；
步骤(1)中所述的鸭肝炎病毒液抗原的制备方法包括，将鸭肝炎病毒疫苗株接种鸭胚，培养后收获尿囊液；作为本发明的一种具体的实施方式，本发明将1型鸭甲型肝炎病毒JS株和3型鸭甲型肝炎病毒SD株分别接种易感鸭胚，培养后收获尿囊液；其中，所述新型鸭呼肠孤病毒S株是1型鸭甲型肝炎病毒JS株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号为：CGMCC No.6852；所述3型鸭甲型肝炎病毒SD株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号为：CGMCC No.8560。
作为本发明一种具体的实施方式，步骤(2)中所述的制备鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗的方法包括，
(a)油相制备；将白油和硬脂酸铝混合均匀后加热再加入司本-80再升温加热后冷却，即得；优选的，将注射用白油、硬脂酸铝以95:1的比例混匀并加热至80℃，再加入5份司本-80至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用；
(b)水相制备：将灭活后的3种病毒抗原混合均匀后再与吐温-80混合，吐温-80完全溶解混匀均匀；优选的，将检验合格的3种病毒液按1:1:1的比例混合，再将混合液与吐温-80按95:5的比例混合，在搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解混匀；
(c)乳化：将油相和水相混合乳化，即得；优选的，将油相和水相以1:2比例乳化30min。
步骤(3)中所述的用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡的免疫程序优选为：(a)基础免疫：鸭呼肠孤病毒油乳佐剂免疫原，皮下注射健康产蛋鸡，每只1.5ml；(b)加强免疫：基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；(c)强化免疫：加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；(d)维持免疫：在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。
步骤(3)中所述的收集高免蛋的方法优选为：产蛋鸡强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免蛋鸭呼肠孤病毒、1型和3型鸭肝炎病毒蛋黄中抗体效价，当中和效价均不低于1:1024时，收集高免蛋。步骤(4)中所述的提取卵黄抗体方法可以是各种常规的卵黄抗体方法,包但不限于Triton x-100法、浓盐水法、聚乙二醇方法、氯仿法、苯酚法或酸化水-辛酸法等,本发明根据提取方法的比较试验结果发现，选用Triton x-100法提取的卵黄抗体回收率、纯度、澄清度、除脂率和抗体效价均显著优于浓盐水法、氯仿法、聚乙二醇法、苯酚法及酸化水-辛酸法。
作为本发明的一种优选的具体实施方式，Triton x-100法提取的卵黄抗体的方法包括：
(a)蛋壳消毒后蛋黄分离，收集卵黄；(b)除脂：将卵黄和PBS缓冲液混匀，静置；(c)萃取：吸取并量取上清液体积加入6％Triton x-100，搅拌，升温后放置，取下层液体；(d)过滤、浓缩：将卵黄清液过滤后再进行浓缩；(e)灭活：按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。
其中，步骤(b)所述的除脂包括将卵黄与PBS缓冲液按照1：8的体积比混合均匀，置2～8℃静置16小时；
步骤(c)中所述的萃取优选为：吸取并量取上清液体积，按体积比加入6％Tritonx-100，搅拌，升温至37℃，放置1～2h，取下层液体。
步骤(d)中所述的过滤和浓缩优选为：将卵黄清液用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤，再经截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍；
步骤(e)中所述的灭活优选为按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。
根据本发明的抗体免疫攻毒试验结果可见，用本发明制备的鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体注射1日龄健康易感鸭对新型鸭呼肠孤强毒的攻毒保护率分别为100％、100％和98％。用本发明制备的新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体注射1日龄健康易感鸭对1型和3型鸭肝炎强毒的攻毒保护率为98％～100％。本发明抗体可安全、有效的预防新型鸭呼肠孤病毒引起的以肝脏不规则坏死、脾脏坏死为特征性病变的鸭新型鸭呼肠孤病和鸭肝炎病毒引起的以肝脏肿胀和出血为主要病理变化的鸭病毒性肝炎，能够一针防治新型鸭呼肠孤病毒病和鸭病毒性肝炎两种疫病。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体的制备及检验生产用毒株：
制苗免疫原用新型鸭呼肠孤病毒S株(保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No.20000)、1型鸭甲型肝炎病毒JS株(保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为：CGMCC No.6852；)和3型鸭甲型肝炎病毒SD株(保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为：CGMCCNo.8560，)均由哈药集团生物疫苗有限公司分离、鉴定、保管和供应。
1制苗用病毒液制备
1.1制苗用番鸭细小病毒液制备
将生长状态良好的鸡肝细胞单层弃去培养液，按2％的量吸附接种鸭呼肠孤病毒S株，37℃吸附1小时后加入维持液继续培养，每日观察记录细胞病变情况。当细胞80％以上病变时收获，冻融2次，取样进行半成品检验。-20℃以下保存，不超过30日。
1.2制苗用鸭肝炎病毒液制备
用灭菌生理盐水将1型和3型鸭肝炎病毒生产用毒种分别做1000倍稀释，分别经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，每胚0.2ml，用蜡封孔，于37℃静置孵育。弃去24小时前死亡的鸭胚，以后每隔6小时照蛋1次，收集24～120小时死亡鸭胚，于4℃冷却6～12小时。鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存，并取样进行病毒含量(ELD50)测定。病毒含量应不低于105.5ELD50/0.1ml。
2抗原灭活
将检验合格的抗原于2～8℃条件下解冻，分别边搅拌边加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％。37℃灭活16h，期间不断搅拌。灭活后病毒液置2～8℃保存，保存期不超过30天。
3疫苗制备及分装
3.1油相制备
将注射用白油、硬脂酸铝以95:1的比例混匀并加热至80℃，再加入5份司本-80至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用。
3.2水相制备
将检验合格的3种病毒液按1:1:1的比例混合，再将混合液与吐温-80按95:5的比例混合，在搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解混匀。
3.3乳化
将油相和水相以1:2比例乳化30min。取10ml疫苗加入离心管中，3000rpm，离心15min，管底析出水相应不大于0.5ml。
3.4分装定量分装，压盖，2-8℃保存。
4抗体制造及半成品检验
4.1健康，无禽白血病、禽网状内皮组织增殖病，按0.5％抽样，血清抗体结果应全部为阴性。
4.2监测鸡白痢和鸡毒支原体，二者的阳性率不超过0.1％。
4.3应适时接种禽流感、鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病、鸡马立克氏病、鸡减蛋综合征(EDS76)及大肠杆菌病等疫苗，并做好球虫病药物预防。
4.4应具有商品蛋鸡的良好生产性能。
5.免疫程序
5.1基础免疫鸭呼肠孤病毒油乳佐剂免疫原，皮下注射健康产蛋鸡，每只1.5ml。
5.2加强免疫基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml。
5.3强化免疫加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml。
5.4维持免疫在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。
6高免蛋收集
产蛋鸡强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免蛋鸭呼肠孤病毒、1型和3型鸭肝炎病毒蛋黄中抗体效价，当中和效价均不低于1:1024时，收集高免蛋，置10～15℃，应不超过10日。
7新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎卵黄抗体制造
7.1蛋壳消毒高免蛋浸入1‰二氯异氰尿酸钠溶液中消毒15分钟。然后用甲醛熏蒸高免蛋30分钟。
7.2蛋黄分离打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。
7.3除脂量取卵黄体积，加入灭菌玻瓶内，按其8体积量加入PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)(W/V)，混匀，置2～8℃静置16小时。
7.4萃取吸取并量取上清液体积，按体积比加入6％Triton x-100，搅拌，升温至37℃，放置1～2h，取下层液体。
7.5过滤、浓缩将卵黄清液用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤，再经截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍。
7.6灭活按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。
7.7半成品配制将浓缩灭活卵黄抗体用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)稀释为鸭呼肠孤病毒、1型和3型鸭肝炎病毒抗体中和效价均不低于1:128，再用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。
8半成品检验
8.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
8.2效价测定鸭呼肠孤病毒、1型和3型鸭肝炎病毒抗体中和效价均不低于1:128。
8.3分装定量分装，加盖密封，2～8℃保存。
9成品检验
9.1性状本品为透明液体，久置后底部有少量白色沉淀。
9.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，符合规定。
9.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
9.4支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。9.5外源病毒检验用3～5瓶抗体混合，取混合抗体20ml加入透析袋(孔径0.2～0.25nm)，在2～5℃用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)缓冲液对样品进行透析过夜，透析过夜后抗体样品体积应在20ml±0.5ml，作为检品。按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。
9.6甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。9.7安全检验1日龄健康易感雏鸭10只，每只皮下注射抗体2.0ml；体重18～22g的SPF级小鼠10只，每只皮下注射抗体0.5ml。连续观察14日，雏鸭和小鼠均全部健活。
试验例1鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体的效力检验试验1中和抗体效价测定
1.1鸭呼肠孤病毒部分
实施例1制备的二联抗体用灭菌生理盐水2倍比稀释，取1:64、1:128和1:256稀释度分别与等量鸭呼肠孤病毒S株(100TCID50/0.1ml)混合，置37℃中和1小时，每个稀释度接种6孔含生长状态良好的LMH细胞的96孔细胞板，每孔0.1ml，补充细胞维持液至0.2ml，同时设病毒对照6孔和正常细胞对照6孔，置37℃，5％CO2培养箱培养168小时。病毒对照应细胞全部病变，正常对照细胞应全部健活，能使50％细胞保护的最高稀释倍数即为抗体的中和效价。抗体中和效价结果见表1。
表1鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的中和效价
1.2鸭肝炎部分
将1型和3型鸭肝炎病毒液分别稀释至0.2ml含200ELD50，与等量2倍系列稀释的待检抗体(实施例1制备)混合，病毒对照为病毒液与生理盐水等量混合物，37℃中和1小时。
将上述作用1小时后的两种混合物分别接种10～11日龄SPF鸭胚5枚，每胚0.2ml，同时设病毒对照组(接种0.2ml同条件处理的病毒液和生理盐水混合液)和健康对照组(接种0.2ml灭菌生理盐水)各5枚，置37℃培养168小时，记录24～168小时的鸭胚死亡数。健康对照组应全部健活，病毒对照组应全部死亡，能使50％鸭胚不发生死亡的最高抗体稀释倍数即为该抗体的中和效价。抗体中和效价结果见表2。
表2鸭肝炎病毒卵黄抗体的中和效价
2.抗体免疫攻毒试验
2.`1鸭呼肠孤病毒部分
1日龄健康易感雏鸭70只，随机分成3组，每1组50只，为注射抗体组，颈部皮下注射抗体0.5ml/只；第2组10只为健康对照组，不注射任何药品；第3组10只为攻毒对照组，颈部皮下注射生理盐水0.5ml/只。注射抗体后24小时，第1组和第3组雏鸭各颈部皮下注射检验用鸭呼肠孤病毒S株0.5ml/只(含100LD50)，连续观察10日。察期结束后各自雏鸭全部扑杀检查肝脏和脾脏，以第2组鸭肝脏和脾脏均应100％无异常；第3组鸭检查肝脏和脾脏，至少80％有鸭呼肠孤病毒感染导致的肝脏或脾脏坏死症状为试验成立，计算抗体免疫的攻毒保护率，共计进行3批抗体试验结果见表3。
表3免疫攻毒试验结果
从表3结果可以看出，3批新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体注射1日龄健康易感鸭对新型鸭呼肠孤强毒的攻毒保护率分别为100％、100％和98％。
2.2鸭肝炎部分
用1日龄健康易感雏鸭170只，随机分为5组，第1～3组各40只。第4组40只，为攻毒对照组；第5组10只，为健康对照组。第1～3组雏鸭颈部皮下注射卵黄抗体，每只0.5ml；第4组雏鸭颈部皮下注射生理盐水，每只0.5ml；第5组不注射任何物品。24小时后，第1～4组雏鸭再随机分为2组，每组20只。一组颈部皮下注射1型鸭肝炎检验用强毒，每只0.5ml(含100LD50)；另一组颈部皮下注射3型鸭肝炎检验用强毒，每只0.5ml(含100LD50)。各组雏鸭同条件下隔离饲养10日。观察各组雏鸭死亡及存活情况。结果见表4。
表4免疫攻毒试验结果
从表4结果可以看出，3批新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体注射1日龄健康易感鸭对1型和3型鸭肝炎强毒的攻毒保护率为98％～100％。
3.抗体最小免疫剂量试验
3.1鸭呼肠孤病毒部分
取实施例1制备的二联卵黄抗体(中和效价1:128)，按0.2ml/只、0.5ml/只和1.0ml/只剂量经颈部皮下接种1日龄健康易感鸭，每个剂量接种健康易感鸭各50只，同时另设同批1日龄健康易感鸭鸭10只作为健康对照，10只作为攻毒对照。在注射抗体24小时后，试验抗体组与攻毒对照组鸭颈部皮下注射检验用鸭呼肠孤病毒S株0.5ml/只(含100LD50)，观察10日。结果见表5。
表5最小免疫剂量试验结果
从表5结果可以看出，1日龄健康易感鸭按0.2ml/只剂量注射抗体，鸭呼肠孤病毒的攻毒保护率为60％；按0.5ml/只剂量注射抗体，鸭呼肠孤病毒的攻毒保护率为94％；按1.0ml/只剂量注射抗体，鸭呼肠孤病毒的攻毒保护率为100％；攻毒对照组90％出现典型病变；健康对照组100％健活，且无典型病变。说明该二联抗体注射1日龄健康易感鸭，每只0.5ml的免疫剂量能起到较好的保护效果。
3.2鸭肝炎部分
取实施例1制备的二联卵黄抗体(中和效价1:128)，按0.2ml/只、0.5ml/只和1.0ml/只剂量经颈部皮下接种1日龄健康易感鸭，每个剂量接种健康易感鸭各40只，同时另设同批1日龄健康易感鸭40只作为攻毒对照，10只作为健康对照。在注射抗体24小时后，试验抗体组与攻毒对照组雏鸭随机分为2组，一组颈部皮下注射1型鸭肝炎检验用强毒，每只0.5ml(含100LD50)；另一组颈部皮下注射3型鸭肝炎检验用强毒，每只0.5ml(含100LD50)。各组雏鸭同条件下隔离饲养10日。观察各组雏鸭死亡及存活情况。结果见表6。
表6最小免疫剂量试验结果
从表6结果可以看出，1日龄健康易感鸭按0.2ml/只剂量注射抗体，抗体对免疫鸭1型和3型鸭肝炎病毒的攻毒保护率为60％～65％；按0.5ml/只剂量注射抗体，抗体对鸭攻毒保护率为94％～98％；按1.0ml/只剂量注射抗体，抗体的攻毒保护率为100％；攻毒对照组100％死亡；健康对照组100％健活，且无典型病变。说明该抗体注射1日龄健康易感鸭，每只0.5ml的免疫剂量能起到较好的保护效果。
试验例2卵黄抗体不同提取方法的比较试验
1卵黄抗体不同方法的提取
1.1浓盐水法
量取卵黄体积，按1:4比例加入16％的浓盐水充分混匀，4℃静置4小时，，上清用1.0μm中空纤维滤器过滤后，滤液用100KD超滤膜包进行3倍浓缩，浓缩液即为所提卵黄抗体。
1.2聚乙二醇
量取卵黄体积，按1:4比例加入终浓度为4％的PEG6000(v/w)，充分搅拌，室温下反应20min。5000r/min离心30min，取上清加入PEG6000，使其终浓度达到12％(v/w)，充分搅拌，室温作用10min。5000r/min离心30min，取沉淀加入与卵黄等体积的PBS缓冲液，即为提取的卵黄抗体。
1.3氯仿法
量取卵黄体积，按1:1比例加入PBS(pH 7.5)充分搅拌后加入等量的氯仿混匀，4℃静置1h，4000r/min离心20min取上清即为提取的卵黄抗体。
1.4苯酚法
量取卵黄体积，按1:4比例加入苯酚充分混匀，静置10分钟，加入等量的冰乙醇，8000r/min离心10min，取沉淀加入与卵黄等体积的PBS缓冲液，即为提取的卵黄抗体。
1.5酸化水-辛酸法
量取卵黄体积，按1:4比例加入加入0.05％醋酸盐缓冲液(0.12mol/L，pH5.0)(W/V)，混匀，并调至pH5.2，置2～8℃静置16小时。吸取并量取上清液体积，加入终浓度2％正辛酸(v/v)，室温静置4小时，取上清液经过滤后，滤液调至pH7.2。
1.6Triton x-100法：该方法与实施例1的“7新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎卵黄抗体制造”的卵黄抗体提取方法相同。
2.试验结果
不同方法提取卵黄抗体的比较结果见表7。
表7不同方法提取卵黄抗体的比较结果
从表7结果可以看出，选用Triton x-100法提取的卵黄抗体回收率、纯度、澄清度、除脂率和抗体效价均较浓盐水法、氯仿法、聚乙二醇法、苯酚法及酸化水-辛酸法好。

Claims (8)

1.一种鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：
（1）制备鸭呼肠孤病毒抗原以及鸭肝炎病毒液抗原；用于制备鸭呼肠孤病毒抗原的疫苗株是新型鸭呼肠孤病毒疫苗S株，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 20000；用于制备鸭肝炎病毒液抗原的疫苗株是1型鸭甲型肝炎病毒JS株和3型鸭甲型肝炎病毒SD株，其中，1型鸭甲型肝炎病毒JS株的微生物保藏编号为：CGMCC No. 6852；3型鸭甲型肝炎病毒SD株的微生物保藏编号为：CGMCC No. 8560；
（2）将制备的抗原灭活后加油佐剂混合乳化得到鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗；
（3）用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，提取卵黄抗体，即得；
其中，步骤（3）中所述的提取卵黄抗体的方法包括：
（a）蛋壳消毒后蛋黄分离，收集卵黄；（b）除脂：将卵黄与pH值7.2的PBS缓冲液按照1：8的体积比混合均匀，2-8℃静置；（c）萃取：吸取并量取上清液体积，按体积计加入6%Tritonx-100，搅拌，升温至37℃后放置，取下层液体；（d）过滤、浓缩：将卵黄清液过滤后再进行浓缩；（e）灭活：按终浓度为0.05%加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的鸭呼肠孤病毒抗原的制备方法包括，将鸭呼肠孤病毒疫苗株接种细胞，培养后收获细胞液，即得；
步骤（1）中所述的鸭肝炎病毒液抗原的制备方法包括，将鸭肝炎病毒疫苗株接种鸭胚，培养后收获尿囊液。
3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将1型鸭甲型肝炎病毒JS株和3型鸭甲型肝炎病毒SD株分别接种易感鸭胚，培养后收获尿囊液。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的制备鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎二联灭活疫苗的方法包括：
（a）油相制备；将白油和硬脂酸铝混合均匀后加热再加入司本-80再升温加热后冷却；（b）水相制备：将灭活后的3种病毒抗原混合均匀后再与吐温-80混合，吐温-80完全溶解混匀均匀；（c）乳化：将油相和水相混合乳化，即得。
5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（a）中将注射用白油、硬脂酸铝以95:1的比例混匀并加热至80℃，再加入5份司本-80至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用；步骤（b）中将检验合格的3种病毒液按1:1:1的比例混合，再将混合液与吐温-80按95:5的比例混合，在搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解混匀；步骤（c）中将油相和水相以1:2比例乳化30min。
6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的用二联灭活疫苗免疫产蛋鸡的免疫程序为：（a）基础免疫：鸭呼肠孤病毒油乳佐剂免疫原，皮下注射健康产蛋鸡，每只1.5ml；（b）加强免疫：基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；（c）强化免疫：加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；（d）维持免疫：在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2~3个月再加强接种1次，每只2.0ml。
7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的收集高免蛋的方法为：产蛋鸡强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免蛋鸭呼肠孤病毒、1型和3型鸭肝炎病毒蛋黄中抗体效价，当中和效价均不低于1:1024时，收集高免蛋。
8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（b）所述的除脂包括将卵黄与PBS缓冲液按照1：8的体积比混合均匀后置2～8℃静置16小时；步骤（c）中放置1~2h取下层液体；
步骤（d）中所述的过滤和浓缩为：将卵黄清液用孔径为1.0µm和0.45µm的筒式滤芯过滤，再经截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍；
步骤（e）中所述的灭活为按终浓度为0.05%加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温灭活24小时。
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