CN103554251A - 一种简易提取卵黄抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种简易提取卵黄抗体的方法，所述的提取方法包括以下步骤：1）将蛋黄与蛋白分离；2）在上述的蛋黄中依次加入PBS缓冲液和氯仿，得混合液，将混合液在-15-25℃下冷冻3-8h后移至30-40℃下解冻，反复冻融三次以上；3）将上述反复冻融后的混合液放入37℃水浴锅中水浴25-35min，水浴的过程中要轻轻摇动容器，使蛋黄、PBS缓冲液和氯仿进一步混合均匀得混匀液；4）将上述的混匀液在2-8℃下静置3-5h，混匀液分层，取得上层的上清液即为含卵黄抗体的液体。本发明的方法工艺简单，易于操作，提取率高，成本低，适宜于工业化大量生产时使用。

Description

一种简易提取卵黄抗体的方法
技术领域
本发明涉及用禽蛋制备卵黄抗体的方法，尤其涉及一种简易提取卵黄抗体的方法。
背景技术
卵黄抗体是从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。 
目前提取卵黄抗体的方法有很多种：
1、酸化水提取法：将卵黄与纯化水按一定比例混合后，用盐酸调节PH值，通过静置离心收集上清液，来达到收集卵黄抗体的效果。但是这种方法收集的卵黄抗体含量较低，不能完全体现卵黄的真正抗体含量。而且需要用到4000-6000r/min离心，比较耗费财力物力。
2、聚乙二醇提取法：将卵黄与PBS缓冲液按一定比例混合后，加入一定比例的聚乙二醇粉末，然后静置，10000r/min离心。聚乙二醇溶于水中不会发热、升温，不会引起蛋白质变性，沉淀蛋白质的时间较短且不影响离心处理，并有促进蛋白质结晶的作用，但聚乙二醇易溶于水，目前尚没有办法去除，对畜禽的危害迄今也尚无确切定论。而且需要用到10000r/min离心，更耗费财力物力。
3、辛酸萃取法：向用酸化水法提取的IgY溶液中缓慢加入终浓度为1%的正辛酸，搅拌10min，放入冰箱中冷冻10min，抽滤得IgY溶液。该方法与聚乙二醇法相似，但辛酸在水中溶解度极低(0.062g/L)，因此在水溶性物质中辛酸残留量极微。但是这种方法需要冷冻抽滤，而且抗体含量不是很高。
4、普通氯仿提取法：将卵黄、生理盐水、氯仿按一定的比例混匀后室温放置30min，3000r/min离心20min，溶液分成3层，下层为有机溶剂，中间层为变性脂蛋白，上层为提取的IgY溶液。这种方法需要使用到离心机，而且不一定100%能分层，在室温低下非常难析出大量的IgY溶液。
因此，对于本领域技术人员来说，选用一种即能分离出含有大量卵黄抗体又要工艺简单能够适于工业化生产的提取卵黄抗体的方法成了一个技术难题。
发明内容
本发明的目的为提供即能够分离出含有大量卵黄抗体，又能适宜工业化生产的工艺简单，节省人力物力的一种简易提取卵黄抗体的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种简易提取卵黄抗体的方法，所述的提取方法包括以下步骤： 
1）将蛋黄与蛋白分离，并将蛋黄置于容器内；
2）在上述的蛋黄中依次加入PBS缓冲液和氯仿，得混合液，所述蛋黄、PBS缓冲液和氯仿的体积比为0.5-3:0.5-2:1-2，将混合液在-15-25℃下冷冻3-8h后移至30-40℃下解冻，反复冻融三次以上；
3）将上述反复冻融后的混合液放入37℃水浴锅中水浴25-35min，水浴的过程中要轻轻摇动容器，使蛋黄、PBS缓冲液和氯仿进一步混合均匀得混匀液； 
4）将上述的混匀液在2-8℃下静置3-5h，混匀液分层，取得上层的上清液即为含卵黄抗体的液体。
优选地，所述的提取方法包括以下步骤： 
1）将蛋黄与蛋白分离，并将蛋黄置于容器内；
2）在上述的蛋黄中依次加入PBS缓冲液和氯仿，得混合液，所述蛋黄、PBS缓冲液和氯仿的体积比为2:2:1，将混合液在-20℃下冷冻4h后移至35℃下解冻，反复冻融三次以上；
3）将上述反复冻融后的混合液放入37℃水浴锅中水浴30min，水浴的过程中要轻轻摇动容器，使蛋黄、PBS缓冲液和氯仿进一步混合均匀得混匀液； 
4）将上述的混匀液在4℃下静置4h，混匀液分层，取得上层的上清液即为含卵黄抗体的液体。
进一步，所述的PBS缓冲液的pH值为7.2-7.6。
本发明采用以上技术方案，通过在分离的蛋黄中依次加入PBS缓冲溶液和氯仿，经过反复冻融、水浴和静置步骤，得到上清液即为含卵黄抗体的液体，不需经过复杂的工艺，也不需要往蛋黄中加入难分离的成分，还不需要使用离心机等大型的设备，本发明的方法工艺简单，易于操作，提取率高，成本低，适宜于工业化大量生产时使用。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
一种简易提取卵黄抗体的方法，所述的提取方法包括以下步骤： 
1）将蛋黄与蛋白分离，并将蛋黄置于容器内；
2）在上述的蛋黄中依次加入PBS缓冲液和氯仿，得混合液，所述蛋黄、PBS缓冲液和氯仿的体积比为0.5-3:0.5-2:1-2，将混合液在-15-25℃下冷冻3-8h后移至30-40℃下解冻，反复冻融三次以上；
3）将上述反复冻融后的混合液放入37℃水浴锅中水浴25-35min，水浴的过程中要轻轻摇动容器，使蛋黄、PBS缓冲液和氯仿进一步混合均匀得混匀液； 
4）将上述的混匀液在2-8℃下静置3-5h，混匀液分层，取得上层的上清液即为含卵黄抗体的液体。
优选地，所述的提取方法包括以下步骤： 
1）将蛋黄与蛋白分离，并将蛋黄置于容器内；
2）在上述的蛋黄中依次加入PBS缓冲液和氯仿，得混合液，所述蛋黄、PBS缓冲液和氯仿的体积比为2:2:1，将混合液在-20℃下冷冻4h后移至35℃下解冻，反复冻融三次以上；
3）将上述反复冻融后的混合液放入37℃水浴锅中水浴30min，水浴的过程中要轻轻摇动容器，使蛋黄、PBS缓冲液和氯仿进一步混合均匀得混匀液； 
4）将上述的混匀液在4℃下静置4h，混匀液分层，取得上层的上清液即为含卵黄抗体的液体。
进一步，所述的PBS缓冲液的pH值为7.2-7.6。
实施例1  
扬州康威的非免蛋进行检查
提取卵黄抗体： 
1）将蛋黄与蛋白分离，并将蛋黄置于容器内；
2）在上述的蛋黄中依次加入pH值为7.2为PBS缓冲液和氯仿，得混合液，所述蛋黄、PBS缓冲液和氯仿的体积比为2:2:1，将混合液在-20℃下冷冻4h后移至35℃下解冻，反复冻融三次以上；
3）将上述反复冻融后的混合液放入37℃水浴锅中水浴30min，水浴的过程中要轻轻摇动容器，使蛋黄、PBS缓冲液和氯仿进一步混合均匀得混匀液； 
4）将上述的混匀液在4℃下静置4h，混匀液分层，取得上层的上清液即为含卵黄抗体的液体。
检测：
用血凝抑制实验检测非免蛋鸡新城疫病抗体，结果几何平均值为20.2，符合规定；用血凝抑制实验检测非免蛋鸡流行性感冒病抗体，结果为全阴性符合规定，两种检测结果均与厂家报告一致。
实施例2  
江苏保康的非免蛋进行检查
提取卵黄抗体： 
1）将蛋黄与蛋白分离，并将蛋黄置于容器内；
2）在上述的蛋黄中依次加入pH值为7.4为PBS缓冲液和氯仿，得混合液，所述蛋黄、PBS缓冲液和氯仿的体积比为3:2:2，将混合液在-15℃下冷冻8h后移至30℃下解冻，反复冻融三次以上；
3）将上述反复冻融后的混合液放入37℃水浴锅中水浴35min，水浴的过程中要轻轻摇动容器，使蛋黄、PBS缓冲液和氯仿进一步混合均匀得混匀液； 
4）将上述的混匀液在2℃下静置3h，混匀液分层，取得上层的上清液即为含卵黄抗体的液体。
检测：
用血凝抑制实验检测非免蛋鸡新城疫病抗体，结果几何平均值为20.4，符合规定；用血凝抑制实验检测非免蛋鸡流行性感冒病抗体，结果为全阴性符合规定，两种检测结果均与厂家报告一致。
实施例3  
取市场买的普通蛋进行检查
提取卵黄抗体： 
1）将蛋黄与蛋白分离，并将蛋黄置于容器内；
2）在上述的蛋黄中依次加入pH值为7.6为PBS缓冲液和氯仿，得混合液，所述蛋黄、PBS缓冲液和氯仿的体积比为0.5:0.5:1.5，将混合液在-25℃下冷冻3h后移至40℃下解冻，反复冻融三次以上；
3）将上述反复冻融后的混合液放入37℃水浴锅中水浴25min，水浴的过程中要轻轻摇动容器，使蛋黄、PBS缓冲液和氯仿进一步混合均匀得混匀液； 
4）将上述的混匀液在8℃下静置5h，混匀液分层，取得上层的上清液即为含卵黄抗体的液体。
检测：
用血凝抑制实验检测非免蛋鸡新城疫病抗体，结果几何平均值为28；用血凝抑制实验检测非免蛋鸡流行性感冒病抗体，结果几何平均值为25。上清液蛋白含量为1.03mg/mL。

Claims (3)

1. 一种简易提取卵黄抗体的方法，其特征在于：所述的提取方法包括以下步骤： 
1）将蛋黄与蛋白分离，并将蛋黄置于容器内；
2）在上述的蛋黄中依次加入PBS缓冲液和氯仿，得混合液，所述蛋黄、PBS缓冲液和氯仿的体积比为0.5-3:0.5-2:1-2，将混合液在-15-25℃下冷冻3-8h后移至30-40℃下解冻，反复冻融三次以上；
3）将上述反复冻融后的混合液放入37℃水浴锅中水浴25-35min，水浴的过程中要轻轻摇动容器，使蛋黄、PBS缓冲液和氯仿进一步混合均匀得混匀液； 
4）将上述的混匀液在2-8℃下静置3-5h，混匀液分层，取得上层的上清液即为含卵黄抗体的液体。
2. 根据权利要求1所述的一种简易提取卵黄抗体的方法，其特征在于：所述的提取方法包括以下步骤： 
1）将蛋黄与蛋白分离，并将蛋黄置于容器内；
2）在上述的蛋黄中依次加入PBS缓冲液和氯仿，得混合液，所述蛋黄、PBS缓冲液和氯仿的体积比为2:2:1，将混合液在-20℃下冷冻4h后移至35℃下解冻，反复冻融三次以上；
3）将上述反复冻融后的混合液放入37℃水浴锅中水浴30min，水浴的过程中要轻轻摇动容器，使蛋黄、PBS缓冲液和氯仿进一步混合均匀得混匀液； 
4）将上述的混匀液在4℃下静置4h，混匀液分层，取得上层的上清液即为含卵黄抗体的液体。
3. 根据权利要求1或2所述的一种简易提取卵黄抗体的方法，其特征在于：所述的PBS缓冲液的pH值为7.2-7.6。
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