CN105585632A - 肉鸭细小病毒精制卵黄抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，涉及抗体领域，针对现有对肉鸭细小病毒缺乏有效预防和治疗的问题提出本方案，主要包括疫苗制备、疫苗免疫程序、卵黄抗体提取，以实现对肉鸭细小病毒预防和治疗的功能。

Description

肉鸭细小病毒精制卵黄抗体

技术领域

本发明涉及一种肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，主要涉及抗体领域。

背景技术

2014年11月以来，我国部分地区肉鸭流行一种以临床症状为鸭喙发育不良，舌头外露、肿胀、向下弯曲，发病率为10-30％，鸭发病日龄集中在2个阶段，第一阶段为3～13日龄，症状为站立不稳，蹼外翻，强行驱赶时跛行或翻滚；第二阶段为21～28日龄，主要为运动障碍，跟不上大群，呈蹲坐式或侧卧，并表现出舌头外露症状，患病鸭料肉比比正常鸭高30％以上，同日龄出栏体重比正常鸭低20％以上，且发育不整齐，屠宰时易翅膀和腿骨折为特征的疾病。禽病专家刁有祥等最先分离到病原，基因序列鉴定与鹅细小病毒同源性大于98％，与番鸭细小病毒同源性为77％左右，命名为鸭细小病毒。常规治疗方法基本无效，对鸭养殖业造成巨大经济损失。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提出一种的肉鸭细小病毒精制卵黄抗体。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

第一步，将分离得到的肉鸭细小病毒经易感鸭胚传代12代获得作为毒种，然后将得到的肉鸭细小病毒用生理盐水20000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，0.1ml/胚，收集接种60～120小时死亡鸭胚尿囊液，无菌检验合格后得到抗原；

第二步，抗原加终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时；于4℃经4000转/分钟离心30分钟，收集上清液，上清液用超滤器浓缩15倍，浓缩液转入灭菌容器灭活检验合格后得到制备疫苗用抗原制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2，使鸭白细胞介素2终浓度为5μg/ml，即为鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗，无菌操作分装，于2～8℃保存；

第三步，选取商品蛋鸡进行抗原接种和收集高免鸡蛋，对高免鸡蛋进行消毒、分离卵黄、抗体的萃取和过滤。

进一步，第一步中得到的抗原，要进行病毒含量、纯净性、特异性和免疫原性进行鉴定。

进一步，抗原用生理盐水10倍系列稀释，取10^-5、10^-6和10^-73个稀释度接种9日龄易感鸭胚，每个稀释度各接种5枚，每一胚胎0.1ml，用蜡封孔，于37.5℃静置孵化，24小时以前死亡的鸭胚弃去不计，收集24～168小时死亡鸭胚，按Reed-Muench法计算病毒含量为10^-6.25ELD₅₀/0.1ml。

进一步，免疫原性按如下进行免疫接种：

对100～110日龄商品蛋30只进行接种，同时设10只对照，不做任何处理，免疫程序如下：

基础免疫每只鸡腿部肌肉注射1.0ml。

加强免疫在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.5ml。

强化免疫在加强免疫后15日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射2.0ml。

进一步，选取100-120日龄蛋鸡进行灭火抗原接种：维持免疫：当卵黄中鸭细小病毒琼扩抗体效价临界1:32时，维持接种1次，每只鸡颈背部皮下注射疫苗2.0ml。强化免疫后7日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，检测鸭细小病毒琼扩抗体效价大于等于1:32为合格，收集高免鸡蛋，8～12℃贮存，应不超过10日。

进一步，充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，装入灭菌搅拌罐中，按体积比1:3加入25℃左右、pH为4.7的灭菌注射用水，搅拌30分钟，将卵黄液转入不锈钢桶中，加入终浓度为4％正辛酸，继续搅拌30分钟，室温放置12～24小时，用40目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，用80目滤布过滤，收集滤液，滤出液和下层液体合并，用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，然后转入用0.2％甲醛溶液消毒的500L冰柜中，4℃冷藏5小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，用0.2M氢氧化钠溶液调pH7.0，再后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH6.9，即为抗体半成品。

进一步，抗体半成品加入终浓度0.05％甲醛，用过滤精度0.2μm的筒式滤芯过滤除菌。

本发明的有益效果如下：将本技术方案正确的运用，用于预防，可阻断病毒感染，临床保护率大于93％以上；用于治疗，在发病3-5日以内及时使用抗体治疗，鸭体重低于1kg的，按1.5ml/只；大于1kg体重以上的，按1.2ml/kg体重。一般用药1次，3天后病鸭临床发病症状消失，配合抗生素来控制细菌继发感染效果更佳，小于10日龄发病的商品雏鸭愈后发育良好、后期出现喙短、舌头外翻症状的比例小于10％，基本不影响经济价值；但发病日龄超过10天的，对已形成喙短舌头突出的症状不能逆转。本发明制备的肉鸭细小病毒精制卵黄抗体为临床预防、治疗该病提供了有效手段，能显著减少该病给肉鸭养殖业带来的经济损失。

具体实施方式

实施例

1肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗制备

1.1抗原制备

肉鸭细小病毒，由公司研究人员于2015年1月从山东聊城某肉鸭养殖场分离到的肉鸭细小病毒，经易感鸭胚传代12代、鉴定获得。肉鸭细小病毒用生理盐水20000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，0.1ml/胚，收集接种60～120小时死亡鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，于-40℃保存。同时取样用于鉴定。

1.2抗原鉴定

1.2.1病毒含量

抗原用生理盐水10倍系列稀释，取10^-5、10^-6和10^-73个稀释度接种9日龄易感鸭胚，每个稀释度各接种5枚，0.1ml/胚，用蜡封孔，于37.5℃静置孵化，24小时以前死亡的鸭胚弃去不计，收集24～168小时死亡鸭胚，按Reed-Muench法计算病毒含量为10^-6.25ELD₅₀/0.1ml。

1.2.2纯净性

抗原按照现行《中华人民共和国兽药典》进行细菌、支原体和外源病毒检验合格。

1.2.3特异性

抗原用生理盐水稀释至200ELD₅₀/0.1ml，与等量抗肉鸭细小病毒特异性血清混合，37℃水浴中和1小时，尿囊腔接种9日龄易感鸭胚10枚，0.1ml/胚；同时设病毒对照10枚，接种同条件处理的病毒与生理盐水混合液0.1ml/枚，上述鸭胚用蜡封孔，于37℃静置孵育，观察至168小时。中和组鸭胚全部健活，对照组鸭胚全部死亡。说明抗原能被抗肉鸭细小病毒特异性血清中和。

1.2.4免疫原性

1.2.4.1抗原灭活

抗原加终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟。

1.2.4.2灭活检验

1.2.4.2.1无菌按照现行《中华人民共和国兽药典》检验，应无细菌生长。

1.2.4.2.2安全检验灭活抗原皮下或肌肉注射5日龄肉鸭10只，1.0ml/每只。饲养观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

1.2.4.2.3免疫接种

灭活抗原按如下免疫程序接种100～110日龄商品蛋30只，同时设10只对照，不做任何处理，免疫程序如下：

基础免疫每只鸡腿部肌肉注射1.0ml。

加强免疫在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.5ml。

强化免疫在加强免疫后15日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射2.0ml。

1.2.4.2.4抗体提取

强化免疫后10日分别收集鸡蛋，分离卵黄，按组混合，搅拌成膏状，加入3倍体积的生理盐水，充分搅匀，加入终浓度20％的氯仿，剧烈震荡20分钟，于4℃条件下4000rpm离心20分钟，收集上清液，过滤除菌即为抗体样品。

1.2.4.2.5琼脂扩散试验检测用抗原的制备

抗原300ml加入终浓度为20％的氯仿，剧烈振摇20分钟，于4℃条件下4000rpm离心20分钟，收集上清液，过滤除菌，滤液加入透析袋中，用夹子夹紧，放在直接15cm的平皿上，在透析袋上撒PEG2000，而后放入密封玻璃缸中，于4℃浓缩，期间根据情况更换PEG2000，至透析袋内液体全部无为止，用灭菌生理盐水洗去透析袋外附着的PEG2000，在透析袋内加入6ml生理盐水，夹上夹子，将其内壁充分清洗，吸出液体，转入10ml灭菌管制瓶中，加入终浓度0.1％甲醛，于室温灭活24小时，分装，装量0.2ml/管，-20℃保存，即为琼脂扩散试验检测用抗原。

1.2.4.2.6抗体效价检测

按现行《中华人民共和国兽药典》的琼脂扩散试验法检测抗体样品中鸭细小病毒特异性抗体效价。结果为：试验组琼扩抗体效价为1:16，对照组中和抗体效价＜1:2。结果说明抗原的免疫原性良好。

1.3肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗制备

抗原加终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时(期间振摇4次，每次3分钟)。于4℃经4000转/分钟离心30分钟，收集上清液，上清液用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维超滤器浓缩15倍，浓缩液转入灭菌容器，于4℃保存，取样按1.2.4.2进行灭活检验合格，即为制备疫苗用抗原。

制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2，使鸭白细胞介素2终浓度为5μg/ml，即为鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗，无菌操作分装，于2～8℃保存。取样按现行《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验合格。

2鸭细小病毒精制卵黄抗体制造及检验

2.1高免鸡蛋的生产

2.1.1产蛋鸡应具有商品蛋鸡的生产性能。

2.1.1.1按鸡群0.5％抽样采血，分别按ELISA和AGP法检测抗体，应全部为阴性.

2.1.1.2鸡白痢和鸡支原体按NY/T536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。

2.1.1.3产蛋鸡的饲养管理鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求。鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开。场内料、粪道路分开。鸡场进出口应设有消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康。

2.1.1.4鸡的疫病防治根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，适时、适量投喂抗生素和抗球虫药品等。

2.1.1.5鸡的日龄100～120日龄。

2.1.2鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗免疫

按1.2.4.2.3执行。维持免疫：当卵黄中鸭细小病毒琼扩抗体效价临界1:32时，维持接种1次，每只鸡颈背部皮下注射疫苗2.0ml。

2.1.3收蛋强化免疫后7日，抽样取蛋，分离卵黄，按1.2.4.2.4提取抗体，按1.2.4.2.6检测鸭细小病毒琼扩抗体效价≥1:32为合格，收集高免鸡蛋，8～12℃贮存，应不超过10日。

2.2抗体制造

2.2.1消毒

高免鸡蛋摆入塑料蛋盘，浸入40℃、0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15～20分钟。而后将高免鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒30分钟。

2.2.2分离卵黄

手工或机械打蛋，除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集卵黄。

2.2.3抗体萃取

充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，装入灭菌的500L搅拌罐中，按体积比1:3加入25℃左右的灭菌注射用水(用0.2M盐酸调节pH4.3)，200转/分钟，搅拌30分钟，将卵黄液转入不锈钢桶中，加入终浓度为4％正辛酸，用转头装有桨叶的电转搅拌30分钟，室温放置12～24小时，用40目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，用80目滤布过滤，然后路转入用0.2％甲醛溶液消毒的500L冰柜中，4℃冷藏5小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，用0.2M氢氧化钠溶液调pH7.0，再后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH6.9，即为抗体半成品。

2.2.4过滤

抗体半成品加入终浓度0.05％甲醛，用过滤精度0.2μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，装量为250ml/瓶，即为肉鸭细小病毒精制卵黄抗体。

2.3抗体检验

2.3.1纯净性

按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，无细菌、支原体和外源病毒污染。

2.3.2效价检测

按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，鸭细小病毒琼扩抗体效价应≥1:32。

2.3.3安全性检验

5日龄健康鸭雏10只，每只皮下注射1.0ml，观察14日，应全部健活。

2.3.4辛酸和甲醛残留

按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，应符合规定。

肉鸭细小病毒精制卵黄抗体质量标准

本品系用肉鸭细小病毒接种易感鸭胚培养，收获接种后60～120小时死亡鸭胚的尿囊液，灭活、浓缩，制成鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗，接种健康产蛋鸡，从高免卵黄中提取抗体制成。用于肉鸭细小病毒病的预防和治疗。

【性状】本品为无色至微黄色澄明液体，久置瓶底有微量沉淀。

【无菌检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无细菌生长。

【支原体检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无支原体生长。

【外源病毒检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无外源病毒污染。

【安全检验】5日龄健康雏鸭10只，每只皮下注射本品2.0ml，连续观察14日，雏鸭应全部健活。

【效力检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，鸭细小病毒琼扩抗体效价应≥1:32。

【甲醛残留】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应符合规定。

【辛酸残留】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应符合规定。

【贮藏与有效期】2～8℃贮存，有效期为12个月。

肉鸭细小病毒精制卵黄抗体使用说明

【作用与用途】用于肉鸭细小病毒病的预防和治疗。

【用法与用量】皮下或肌肉注射。用于预防：建议肉鸭在整个饲养周期内使用2次，第一次在3日龄以内，肉雏鸭0.5ml/只；15日龄时1.0ml/只。用于治疗：鸭体重低于1kg的，按1.5ml/只；大于1kg体重以上的，按1.2ml/kg体重。

【注意事项】

1、本品口服无效。

2、有细菌继发感染时，配合兽用头孢类抗生素使用，抗生素用量参照其使用说明。

3、对临床发病鸭一般用药1次即可显著缓解临床症状，重症鸭可在24小时后重复用药1次，但对已形成喙短、舌头外翻的病理变化鸭无逆转作用。

【贮藏与有效期】8～12℃贮存，有效期为12个月。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，其特征在于，其制备流程包括以下：

第一步，将分离得到的肉鸭细小病毒经易感鸭胚传代12代获得作为毒种，然后将得到的肉鸭细小病毒用生理盐水20000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，0.1ml/胚，收集接种60～120小时死亡鸭胚尿囊液，无菌检验合格后得到抗原；

第二步，抗原加终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时；于4℃经4000转/分钟离心30分钟，收集上清液，上清液用超滤器浓缩15倍，浓缩液转入灭菌容器灭活检验合格后得到制备疫苗用抗原制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2，使鸭白细胞介素2终浓度为5μg/ml，即为鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗，无菌操作分装，于2～8℃保存；

第三步，选取商品蛋鸡进行抗原接种和收集高免鸡蛋，对高免鸡蛋进行消毒、分离卵黄、抗体的萃取和过滤。

2.根据权利要求1所述的肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，其特征在于：所述第一步中得到的抗原，要进行病毒含量、纯净性、特异性和免疫原性进行鉴定。

3.根据权利要求2所述的肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，其特征在于：抗原用生理盐水10倍系列稀释，取10^-5、10^-6和10^-73个稀释度接种9日龄易感鸭胚，每个稀释度各接种5枚，每一胚胎0.1ml，用蜡封孔，于37.5℃静置孵化，24小时以前死亡的鸭胚弃去不计，收集24～168小时死亡鸭胚，按Reed-Muench法计算病毒含量为10^-6.25ELD₅₀/0.1ml。

4.根据权利要求2所述的肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，其特征在于：所述免疫原性按如下进行免疫接种：

对100～110日龄商品蛋30只进行接种，同时设10只对照，不做任何处理，免疫程序如下：

基础免疫每只鸡腿部肌肉注射1.0ml；

加强免疫在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.5ml；

强化免疫在加强免疫后15日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射2.0ml。

5.根据权利要求4所述的肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，其特征在于：选取100-120日龄蛋鸡进行灭火抗原接种：维持免疫：当卵黄中鸭细小病毒琼扩抗体效价临界1:32时，维持接种1次，每只鸡颈背部皮下注射疫苗2.0ml。强化免疫后7日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，检测鸭细小病毒琼扩抗体效价大于等于1:32为合格，收集高免鸡蛋，8～12℃贮存，应不超过10日。

6.根据权利要求1所述的肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，其特征在于：充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，装入灭菌搅拌罐中，按体积比1:3加入25℃左右、PH为4.7的灭菌注射用水，搅拌30分钟，将卵黄液转入不锈钢桶中，加入终浓度为4％正辛酸，继续搅拌30分钟，室温放置12～24小时，用40目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，用80目滤布过滤，收集滤液，滤出液和下层液体合并，用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，然后转入用0.2％甲醛溶液消毒的500L冰柜中，4℃冷藏5小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，用0.2M氢氧化钠溶液调pH7.0，再后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH6.9，即为抗体半成品。

7.根据权利要求7所述的肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，其特征在于：抗体半成品加入终浓度0.05％甲醛，用过滤精度0.2μm的筒式滤芯过滤除菌。