CN105950564B - 番鸭肝炎病毒及应用该病毒制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的方法 - Google Patents

番鸭肝炎病毒及应用该病毒制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种番鸭肝炎病毒及应用该病毒制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的方法。一种番鸭肝炎病毒GS14株，于2016年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No:V201623；应用该病毒制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的方法依次包括下述步骤：由番鸭肝炎病毒GS14株制备抗原；抗原灭活；制备疫苗用抗原；制备灭活疫苗；制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体。本发明的有益效果是本发明制备出的番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体，既可以预防，也可以治疗番鸭“白肝病”，为临床预防、治疗番鸭“白肝病”提供了有效手段。

Description

番鸭肝炎病毒及应用该病毒制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体 的方法
技术领域
本发明涉及一种番鸭肝炎病毒及应用该病毒制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的方法。
背景技术
自2013年以来，我国部分地区番鸭流行一种以临床症状为采食量猛增而后基本绝食，精神沉郁，喜伏卧，拉黄绿色稀便，偶见呼吸啰音，病鸭脱水、消瘦，死亡前有类似鸭病毒性肝炎的神经症状；剖检症状为偶见心包积液、心肌出血和胰腺坏死，常见肝脏肿大、比同日龄正常番鸭肝脏大至少20％，整个肝脏背景颜色为暗黄色或灰白色而非肝脏正常的暗红色，肝脏局部有密集出血点而出血点区域外则苍白或整个肝脏有散在的针尖大小血点，胆囊内有深绿色胆汁、体积比同日龄正常番鸭胆囊增大2～5倍，脾脏肿大、有白色坏死点的疾病，番鸭发病日龄最早为4～6日龄，发病率90％以上，死亡率30％以上，临床上称为番鸭“白肝病”。
番鸭肝炎病毒(“白肝病”)一旦感染，整群番鸭发病率大于90％，死亡率大于30％。临床发病后按常规抗病毒结合抗菌的治疗方案，效果不佳，治愈率低于40％，病程长，耐过番鸭发育受阻，料肉比正常番鸭高20％以上，出栏时间延长15天以上，发育不整齐，严重影响了番鸭养殖的经济效益。
发明内容
本发明提出了一种番鸭肝炎病毒及应用该病毒制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的方法，本发明分离的番鸭肝炎病毒GS14株为首次发现，应用该番鸭肝炎病毒GS14株制备出番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗和油乳剂灭活疫苗，然后按免疫程序免疫商品蛋鸡，收集高免鸡蛋，分离卵黄，制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体。本发明制备出的番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体，既可以预防，也可以治疗番鸭“白肝病”，为临床预防、治疗番鸭“白肝病”提供了有效手段。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种番鸭肝炎病毒GS14株，于2016年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:V201623。
上述的番鸭肝炎病毒GS14株在制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体中的应用。
一种番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体，该抗体利用番鸭肝炎病毒GS14株来制备。
一种番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的制备方法，它具体包括下述步骤：
(1)制备抗原：将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水5000～10000倍稀释，经尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，0.1～0.2ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，然后于-20～-40℃保存；同时取样用于鉴定；
(2)抗原灭活：抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃下灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为36～40％；
(3)将灭活后的抗原于4～8℃经4000～4500转/分钟离心20～30分钟，收集上清液，上清液用截留分子量为6000～10000道尔顿的中空纤维超滤器浓缩15～20倍，浓缩液转入灭菌容器，于4～8℃保存，取样进行灭活检验合格，即为制备疫苗用抗原；
(4)制备灭活疫苗：
1)制备番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗
将制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2溶液中，即为番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗；所述鸭白细胞介素2溶液中鸭白细胞介素2的含量为0.12mg/ml；所述制备疫苗用抗原以μg计，所述鸭白细胞介素2以ml计，制备疫苗用抗原与鸭白细胞介素2溶液间的质量体积比为4～5：1。
2)番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗
a、制备水相：将制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2溶液中，使鸭白细胞介素2终浓度为4～5μg/ml，然后加入体积终浓度为4％的灭菌吐温-80，充分振摇，使吐温-80溶解，即为水相；所述鸭白细胞介素2溶液中鸭白细胞介素2的含量为0.12mg/ml；
b、制备油相：注射用白油94份加入2份硬脂酸铝，搅拌均匀，加热使硬脂酸铝溶解，然后后加入6份司本-80，继续加热使司本-80溶解，溶液呈橙黄色至棕红色，灭菌备用，即为油相；
c、按水相与油相的体积比1:1将水相和油相混合，用胶体磨乳化3～5分钟，呈乳白色，即为番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗。
(5)制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体：
1)高免鸡蛋摆入塑料蛋盘，浸入37～40℃、0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15～20分钟，而后将高免鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒20～30分钟；所述高免鸡蛋由经过番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗和番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗进行免疫过的产蛋鸡生产；
2)手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；
3)充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，转入灭菌的搅拌罐中，同时加入温度为20～25℃、pH值为4.2～4.7的灭菌注射用水(用0.2M盐酸调节pH值)，所述灭菌注射用水的加入量按卵黄：灭菌注射用水的体积比1:3～5加入；然后调整转速为200～250转/min，搅拌20～30分钟，而后静置3～5小时；
接着将卵黄液转入不锈钢桶中，加入体积终浓度为3～4％正辛酸，搅拌20～30min，室温放置12～24小时，然后用40～80目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，蛋黄用80～100目滤布过滤，收集滤液，滤液和下层液体合并，接着将滤液和下层液体用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，然后将滤液转入经0.1％甲醛溶液消毒后的冰柜中，在4～8℃下冷藏5～12小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目以上滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，然后加入醋酸-醋酸钠缓冲液调节滤液pH值为6.8～7.0，即为抗体半成品；
4)将抗体半成品用过滤精度为0.2μm的筒式滤芯过滤除菌，然后无菌操作分装，即为番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体。
进一步的，所述高免鸡蛋的生产过程如下：
(1)选择产蛋鸡：应具有商品蛋鸡的生产性能；
(2)按鸡群0.5％抽样采血，分别按ELISA和AGP法检测抗体，应全部为阴性；
(3)鸡白痢和鸡支原体：按NY/T 536～2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553～2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％；
(4)产蛋鸡的饲养管理：鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求，鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开，场内料、粪道路分开，鸡场进出口应设有消毒池，育雏舍与成鸡舍应设隔离带，此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康；
(5)鸡的疫病防治：根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，适时、适量投喂抗生素和抗球虫药品等。
(6)鸡的日龄：100～120日龄。
(7)将上述产蛋鸡进行疫苗免疫：
a、基础免疫：每只产蛋鸡的鸡腿部肌肉注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗1.0ml；
b、加强免疫：在基础免疫后21日进行第2次接种，每只产蛋鸡的鸡胸部肌肉注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗1.5ml；
c、强化免疫：在加强免疫后15日进行第3次接种，每只产蛋鸡鸡颈背部皮下注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗2.0ml；
d、维持免疫：当卵黄中番鸭肝炎病毒中和抗体效价临界1:512时，维持接种1次，每只产蛋鸡鸡颈背部皮下注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗2.0ml；
(8)收蛋：在强化免疫后7日，抽样取蛋，分离卵黄，搅拌成膏状，加入3倍体积的生理盐水，充分搅匀，加入体积终浓度20％的氯仿，剧烈震荡20分钟，于4℃条件下4000rpm离心20分钟，收集上清液，过滤除菌即为抗体样品，检测番鸭肝炎病毒中和抗体效价≥1:512为合格，收集高免鸡蛋，8～12℃贮存，贮存时间不超过10日。
1、制备出的精制卵黄抗体的检验方法如下：
1.1纯净性
按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，无细菌、支原体和外源病毒污染。
1.2效价检测
按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，番鸭肝炎病毒中和抗体效价应≥1:512。
1.3安全性检验
5日龄健康番鸭10只，每只皮下注射1.0ml，观察14日，应全部健活。
1.4辛酸和甲醛残留
按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，应符合规定。
2、番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的质量标准
本品系用番鸭肝炎病毒GS～14株接种易感番鸭胚培养，收获接种后60～168小时死亡番鸭胚的尿囊液，灭活、浓缩，制成番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗和番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗，按一定免疫程序，接种健康产蛋鸡，从高免卵黄中提取抗体制成。用于番鸭肝炎病毒病(“白肝病”)的预防和治疗。
【性状】本品为无色至微黄色澄明液体，久置瓶底有微量沉淀。
【无菌检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无细菌生长。
【支原体检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无支原体生长。
【外源病毒检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无外源病毒污染。
【安全检验】5日龄健康番鸭10只，每只皮下注射1.0ml，观察14日，应全部健活。
【效力检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，番鸭肝炎病毒中和抗体效价应≥1:512。
【甲醛残留】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应符合规定。
【辛酸残留】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应符合规定。
【规格】250ml/瓶
【贮藏与有效期】2～8℃贮存，有效期为12个月。
3、番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的使用说明
【作用与用途】用于番鸭肝炎病毒病(白肝病)的预防和治疗。
【用法与用量】皮下或肌肉注射。用于预防：建议在整个饲养周期内使用2次，第一次在3日龄以内，0.5ml/只；10日龄时1.0ml/只。用于治疗：番鸭体重低于1kg的，按1.5ml/只；大于1kg体重以上的，按1.3ml/kg体重。
【注意事项】
1、本品口服无效。
2、有细菌继发感染时，配合兽用头孢类抗生素使用，抗生素用量参照其使用说明。
3、对临床重症番鸭可在24小时后重复用药1次。
【规格】250ml/瓶。
【贮藏与有效期】2～8℃贮存，有效期为12个月。
可以用本发明中制备的疫苗免疫商品番鸭，收集屠宰后的鸭血，分离血清，制备番鸭肝炎病毒血清抗体，但在实际操作中难度较大且存在风险。其一：由于目前番鸭主要为平养而非肉鸭的网上养殖且番鸭具有部分飞翔能力，如按照本发明的免疫程序进行免疫，每次免疫时必需抓鸭子进行注射，番鸭会到处飞、应激较大，料肉比高和出栏时间延长，影响经济效益；如减少免疫次数，会影响番鸭肝炎病毒血清中和抗体效价，导致临床用于预防、治疗番鸭“白肝病”效果差。其二：所免疫番鸭必须定点屠宰、集中收集血液、分离血清，由于番鸭活体以小商贩收购、零散销售、现吃现杀为主，流动性较大，很难做到集中、定点屠宰。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明分离的番鸭肝炎病毒GS14株为首次发现，应用该番鸭肝炎病毒GS14株制备出番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗和油乳剂灭活疫苗，然后按一定的免疫程序免疫商品蛋鸡，收集高免鸡蛋，分离卵黄，制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体。
本发明制备出的番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体，当中和抗体效价≥1:512时，可以用于预防：雏番鸭在3日龄以下时皮下或肌肉注射抗体0.5ml/只，在10日龄时皮下注射0.8ml/只，可基本阻断该病易感期的病毒感染，预防保护率大于93％；还可以用于治疗：番鸭体重低于1kg的，按1.5ml/只；大于1kg体重以上的，按1.3ml/kg体重，一般用药1次，1天后病鸭临床发病症状显著缓解，2～3天基本痊愈，配合抗生素来控制细菌继发感染效果更佳。番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体为临床预防、治疗番鸭“白肝病”提供了有效手段。
具体实施方式
下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中的几个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、制备实施例：
原料：
1、番鸭肝炎病毒GS14株：于2016年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:V201623；
2、鸭白细胞介素2：于南京农业大学动物医学院预防兽医学系处购买。
实施例1：
(一)制备抗原：
将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水10000倍稀释，经尿囊腔接种12日龄易感番鸭胚，0.2ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，于-40℃保存；同时取样用于鉴定；鉴定方法如下：
1.1病毒含量
抗原用生理盐水10倍系列稀释，取10-5、10-6和10-73个稀释度接种12日龄易感番鸭胚，每个稀释度各接种5枚，0.2ml/胚，用蜡封孔，于37℃静置孵化，24小时以前死亡的番鸭胚弃去不计，收集24～168小时死亡番鸭胚，按Reed～Muench法计算病毒含量为10～ 6.25ELD50/0.2ml。
1.2纯净性
抗原按照现行《中华人民共和国兽药典》进行细菌、支原体和外源病毒检验合格。
1.3特异性
抗原用生理盐水稀释至200ELD50/0.2ml，与等量抗番鸭肝炎病毒特异性血清混合，37℃水浴中和1小时，尿囊腔接种12日龄易感番鸭胚10枚，0.2ml/胚；同时设病毒对照10枚，接种同条件处理的病毒与生理盐水混合液0.2ml/枚，上述番鸭胚用蜡封孔，于37℃静置孵育，观察至168小时。中和组番鸭胚全部健活，对照组番鸭胚全部死亡。说明抗原能被抗番鸭肝炎病毒特异性血清中和。
1.4免疫原性
1.4.1抗原灭活
抗原加体积终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟。
1.4.2灭活检验
1.4.2.1无菌：按照现行《中华人民共和国兽药典》检验，无细菌生长。
1.4.2.2安全检验：灭活抗原皮下或肌肉注射5日龄番鸭10只，1.0ml/只。饲养观察14日，不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
1.4.2.3免疫接种：
灭活抗原按如下免疫程序接种100～110日龄商品蛋鸡30只，同时设10只对照，不做任何处理，免疫程序如下：
基础免疫：每只鸡腿部肌肉注射1.0ml。
加强免疫：在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.5ml。
强化免疫：在加强免疫后15日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射2.0ml。
1.4.2.4抗体提取
强化免疫后10日分别收集鸡蛋，分离卵黄，按组混合，搅拌成膏状，加入3倍体积的生理盐水，充分搅匀，加入体积终浓度20％的氯仿，剧烈震荡20分钟，于4℃条件下4000rpm离心20分钟，收集上清液，过滤除菌即为抗体样品。
1.4.2.5抗体效价检测
按现行《中华人民共和国兽药典》的中和试验法，用12日龄易感番鸭胚检测抗体样品中番鸭肝炎病毒特异性抗体效价。结果为：试验组中和抗体效价为1:320，对照组中和抗体效价＜1:4。结果说明抗原的免疫原性良好。
(二)抗原灭活：
抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃想灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为40％；
(三)制备疫苗用抗原：
将灭活后的抗原于4℃经4000转/分钟离心30分钟，收集上清液，上清液用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维超滤器浓缩15倍，浓缩液转入灭菌容器，于4℃保存，取样进行灭活检验合格，即为制备疫苗用抗原；
(四)制备灭活疫苗：
1、制备番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗
将制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2溶液中，即为番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗；所述鸭白细胞介素2溶液中鸭白细胞介素2的含量为0.12mg/ml；所述制备疫苗用抗原以μg计，所述鸭白细胞介素2以ml计，制备疫苗用抗原与鸭白细胞介素2溶液间的质量体积比为4：1。将上述疫苗取样按现行《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验合格。
2、制备番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗
a、制备水相：将制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2溶液中，使鸭白细胞介素 2终浓度为4μg/ml，然后加入体积终浓度为4％的灭菌吐温-80，充分振摇，使吐温-80溶解，即为水相；所述鸭白细胞介素2溶液中鸭白细胞介素2的含量为0.12mg/ml；
b、制备油相：注射用白油94份加入2份硬脂酸铝，搅拌均匀，加热使硬脂酸铝溶解，然后后加入6份司本-80，继续加热使司本-80溶解，溶液呈橙黄色至棕红色，灭菌备用，即为油相；
c、按水相与油相的体积比1:1将水相和油相混合，用胶体磨乳化4分钟，呈乳白色，即为番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗。将上述疫苗取样按现行《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验合格。
(五)制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体及检验
1、生产高免鸡蛋
(1)选择产蛋鸡：应具有商品蛋鸡的生产性能；
(2)按鸡群0.5％抽样采血，分别按ELISA和AGP法检测抗体，应全部为阴性；
(3)鸡白痢和鸡支原体：按NY/T 536～2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553～2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％；
(4)产蛋鸡的饲养管理：鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求，鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开，场内料、粪道路分开，鸡场进出口应设有消毒池，育雏舍与成鸡舍应设隔离带，此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康；
(5)鸡的疫病防治：根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，适时、适量投喂抗生素和抗球虫药品等。
(6)鸡的日龄：100～120日龄。
(7)将上述产蛋鸡进行疫苗免疫：
a、基础免疫：每只产蛋鸡的鸡腿部肌肉注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗1.0ml；
b、加强免疫：在基础免疫后21日进行第2次接种，每只产蛋鸡的鸡胸部肌肉注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗1.5ml；
c、强化免疫：在加强免疫后15日进行第3次接种，每只产蛋鸡鸡颈背部皮下注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗2.0ml；
d、维持免疫：当卵黄中番鸭肝炎病毒中和抗体效价临界1:512时，维持接种1次，每只产蛋鸡鸡颈背部皮下注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗2.0ml；
(8)收蛋：在强化免疫后7日，抽样取蛋，分离卵黄，搅拌成膏状，加入3倍体积的生理盐水，充分搅匀，加入体积终浓度20％的氯仿，剧烈震荡20分钟，于4℃条件下4000rpm离心20分钟，收集上清液，过滤除菌即为抗体样品，检测番鸭肝炎病毒中和抗体效价≥1:512为合格，收集高免鸡蛋，8～12℃贮存，贮存时间不超过10日
2、制备精制卵黄抗体
(1)将高免鸡蛋摆入塑料蛋盘，浸入40℃、0.1％新洁尔灭水溶液中消毒20分钟，而后将高免鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒30分钟；所述高免鸡蛋由注射过番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗的产蛋鸡生产；
(2)机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；
(3)充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，转入灭菌的搅拌罐中，同时加入温度为25℃、pH值为4.7的灭菌注射用水(用0.2M盐酸调节pH值)，所述灭菌注射用水的加入量按卵黄：灭菌注射用水的体积比1:4加入；然后调整转速为200转/min，搅拌30分钟，而后静置3小时；
接着将卵黄液转入不锈钢桶中，加入体积终浓度为4％正辛酸，搅拌30min，室温放置24小时，然后用40目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，蛋黄用80目滤布过滤，收集滤液，滤液和下层液体合并，接着将滤液和下层液体用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，然后将滤液转入经0.1％甲醛溶液消毒后的冰柜中，在4℃下冷藏5小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目以上滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，然后加入醋酸～醋酸钠缓冲液调节滤液pH值为6.8，即为抗体半成品；
(4)将抗体半成品用过滤精度为0.2μm的筒式滤芯过滤除菌，然后无菌操作分装，即为番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体。
实施例2：
(一)制备抗原：
将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水5000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感番鸭胚，0.1ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，于-20℃保存；同时取样用于鉴定；鉴定方法和鉴定结果均同实施例1；
(二)抗原灭活：
抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃想灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为36％；
(三)制备疫苗用抗原：
将灭活后的抗原于8℃经4500转/分钟离心20分钟，收集上清液，上清液用截留分子量为10000道尔顿的中空纤维超滤器浓缩20倍，浓缩液转入灭菌容器，于8℃保存，取样进行灭活检验合格，即为制备疫苗用抗原；
(四)制备灭活疫苗：
1、制备番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗
将制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2溶液中，即为番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗；所述鸭白细胞介素2溶液中鸭白细胞介素2的含量为0.12mg/ml；所述制备疫苗用抗原以μg计，所述鸭白细胞介素2以ml计，制备疫苗用抗原与鸭白细胞介素2溶液间的质量体积比为5：1。将上述疫苗取样按现行《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验合格。
2、制备番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗
a、制备水相：将制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2溶液中，使鸭白细胞介素2终浓度为5μg/ml，然后加入体积终浓度为4％的灭菌吐温-80，充分振摇，使吐温-80溶解，即为水相；所述鸭白细胞介素2溶液中鸭白细胞介素2的含量为0.12mg/ml；
b、制备油相：注射用白油94份加入2份硬脂酸铝，搅拌均匀，加热使硬脂酸铝溶解，然后后加入6份司本-80，继续加热使司本-80溶解，溶液呈橙黄色至棕红色，灭菌备用，即为油相；
c、按水相与油相的体积比1:1将水相和油相混合，用胶体磨乳化3分钟，呈乳白色，即为番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗。将上述疫苗取样按现行《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验合格。
(五)制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体及检验
1、生产高免鸡蛋
(1)选择产蛋鸡：应具有商品蛋鸡的生产性能；
(2)按鸡群0.5％抽样采血，分别按ELISA和AGP法检测抗体，应全部为阴性；
(3)鸡白痢和鸡支原体：按NY/T 536～2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和 NY/T553～2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％；
(4)产蛋鸡的饲养管理：鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求，鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开，场内料、粪道路分开，鸡场进出口应设有消毒池，育雏舍与成鸡舍应设隔离带，此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康；
(5)鸡的疫病防治：根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，适时、适量投喂抗生素和抗球虫药品等。
(6)鸡的日龄：100～120日龄。
(7)将上述产蛋鸡进行疫苗免疫：
a、基础免疫：每只产蛋鸡的鸡腿部肌肉注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗1.0ml；
b、加强免疫：在基础免疫后21日进行第2次接种，每只产蛋鸡的鸡胸部肌肉注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗1.5ml；
c、强化免疫：在加强免疫后15日进行第3次接种，每只产蛋鸡鸡颈背部皮下注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗2.0ml；
d、维持免疫：当卵黄中番鸭肝炎病毒中和抗体效价临界1:512时，维持接种1次，每只产蛋鸡鸡颈背部皮下注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗2.0ml；
(8)收蛋：在强化免疫后7日，抽样取蛋，分离卵黄，搅拌成膏状，加入3倍体积的生理盐水，充分搅匀，加入体积终浓度20％的氯仿，剧烈震荡20分钟，于4℃条件下4000rpm离心20分钟，收集上清液，过滤除菌即为抗体样品，检测番鸭肝炎病毒中和抗体效价≥1:512为合格，收集高免鸡蛋，8～12℃贮存，贮存时间不超过10日。
2、制备精制卵黄抗体
(1)将高免鸡蛋摆入塑料蛋盘，浸入37℃、0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，而后将高免鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒20分钟；所述高免鸡蛋由注射过番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗的产蛋鸡生产；
(2)手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；
(3)充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，转入灭菌的搅拌罐中，同时加入温度为25℃、 pH值为4.2的灭菌注射用水(用0.2M盐酸调节pH值)，所述灭菌注射用水的加入量按卵黄：灭菌注射用水的体积比1:3加入；然后调整转速为250转/min，搅拌20分钟，而后静置5小时；
接着将卵黄液转入不锈钢桶中，加入体积终浓度为3％正辛酸，搅拌20min，室温放置12小时，然后用40目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，蛋黄用100目滤布过滤，收集滤液，滤液和下层液体合并，接着将滤液和下层液体用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，然后将滤液转入经0.1％甲醛溶液消毒后的冰柜中，在8℃下冷藏12小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目以上滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，然后加入醋酸～醋酸钠缓冲液调节滤液pH值为7.0，即为抗体半成品；
(4)将抗体半成品用过滤精度为0.2μm的筒式滤芯过滤除菌，然后无菌操作分装，即为番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体。然后将番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体进行检验，检验方法同实施例1。
实施例3：
(一)制备抗原：
将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水8000倍稀释，经尿囊腔接种12日龄易感番鸭胚，0.15ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，于-30℃保存；同时取样用于鉴定；鉴定方法和鉴定结果均同实施例1；
(二)抗原灭活：
抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃想灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为38％；
(三)制备疫苗用抗原：
将灭活后的抗原于6℃经4200转/分钟离心25分钟，收集上清液，上清液用截留分子量为8000道尔顿的中空纤维超滤器浓缩18倍，浓缩液转入灭菌容器，于6℃保存，取样进行灭活检验合格，即为制备疫苗用抗原；
(四)制备灭活疫苗：
1、制备番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗
将制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2溶液中，即为番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗；所述鸭白细胞介素2溶液中鸭白细胞介素2的含量为0.12mg/ml；所述制备疫苗用抗原以μg计，所述鸭白细胞介素2以ml计，制备疫苗用抗原与鸭白细 胞介素2溶液间的质量体积比为4.5：1。将上述疫苗取样按现行《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验合格。
2、制备番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗
a、制备水相：将制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2溶液中，使鸭白细胞介素2终浓度为4.5μg/ml，然后加入体积终浓度为4％的灭菌吐温-80，充分振摇，使吐温-80溶解，即为水相；所述鸭白细胞介素2溶液中鸭白细胞介素2的含量为0.12mg/ml；
b、制备油相：注射用白油94份加入2份硬脂酸铝，搅拌均匀，加热使硬脂酸铝溶解，然后后加入6份司本-80，继续加热使司本-80溶解，溶液呈橙黄色至棕红色，灭菌备用，即为油相；
c、按水相与油相的体积比1:1将水相和油相混合，用胶体磨乳化5分钟，呈乳白色，即为番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗。将上述疫苗取样按现行《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验合格。
(五)制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体及检验
1、生产高免鸡蛋
(1)选择产蛋鸡：应具有商品蛋鸡的生产性能；
(2)按鸡群0.5％抽样采血，分别按ELISA和AGP法检测抗体，应全部为阴性；
(3)鸡白痢和鸡支原体：按NY/T 536～2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553～2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％；
(4)产蛋鸡的饲养管理：鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求，鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开，场内料、粪道路分开，鸡场进出口应设有消毒池，育雏舍与成鸡舍应设隔离带，此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康；
(5)鸡的疫病防治：根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，适时、适量投喂抗生素和抗球虫药品等。
(6)鸡的日龄：100～120日龄。
(7)将上述产蛋鸡进行疫苗免疫：
a、基础免疫：每只产蛋鸡的鸡腿部肌肉注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗1.0ml；
b、加强免疫：在基础免疫后21日进行第2次接种，每只产蛋鸡的鸡胸部肌肉注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗1.5ml；
c、强化免疫：在加强免疫后15日进行第3次接种，每只产蛋鸡鸡颈背部皮下注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗2.0ml；
d、维持免疫：当卵黄中番鸭肝炎病毒中和抗体效价临界1:512时，维持接种1次，每只产蛋鸡鸡颈背部皮下注射番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗2.0ml；
(8)收蛋：在强化免疫后7日，抽样取蛋，分离卵黄，搅拌成膏状，加入3倍体积的生理盐水，充分搅匀，加入体积终浓度20％的氯仿，剧烈震荡20分钟，于4℃条件下4000rpm离心20分钟，收集上清液，过滤除菌即为抗体样品，检测番鸭肝炎病毒中和抗体效价≥1:512为合格，收集高免鸡蛋，8～12℃贮存，贮存时间不超过10日。
2、制备精制卵黄抗体
(1)将高免鸡蛋摆入塑料蛋盘，浸入38℃、0.1％新洁尔灭水溶液中消毒18分钟，而后将高免鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒25分钟；所述高免鸡蛋由注射过番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗的产蛋鸡生产；
(2)手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；
(3)充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，转入灭菌的搅拌罐中，同时加入温度为22℃、pH值为4.5的灭菌注射用水(用0.2M盐酸调节pH值)，所述灭菌注射用水的加入量按卵黄：灭菌注射用水的体积比1:4加入；然后调整转速为220转/min，搅拌25分钟，而后静置4小时；
接着将卵黄液转入不锈钢桶中，加入体积终浓度为3.5％正辛酸，搅拌25min，室温放置18小时，然后用60目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，蛋黄用100目滤布过滤，收集滤液，滤液和下层液体合并，接着将滤液和下层液体用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，然后将滤液转入经0.1％甲醛溶液消毒后的冰柜中，在6℃下冷藏9小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目以上滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，然后加入醋酸～醋酸钠缓冲液调节滤液pH值为6.9，即为抗体半成品；
(4)将抗体半成品用过滤精度为0.2μm的筒式滤芯过滤除菌，然后无菌操作分装，即为番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体。然后将番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体进行检验，检验方法同实施例1。
二、实验例：
(一)将上述实施例1、实施例2和实施例3中制备的番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体按下述方法进行检验:
1、纯净性
按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，无细菌、支原体和外源病毒污染。
2、效价检测
按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，番鸭肝炎病毒中和抗体效价应≥1:512。
3、安全性检验
5日龄健康番鸭10只，每只皮下注射1.0ml，观察14日，应全部健活。
4、辛酸和甲醛残留
按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，应符合规定。
检验结果表1所示：
表1抗体检验
(二)本发明制备出的番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体，当中和抗体效价≥1:512时，可以用于预防：雏番鸭在3日龄以下时皮下或肌肉注射抗体0.5ml/只，在10日龄时皮下注射0.8ml/只，可基本阻断该病易感期的病毒感染，预防保护率大于93％；还可以用于治疗：番鸭体重低于1kg的，按1.5ml/只；大于1kg体重以上的，按1.3ml/kg体重，一般用药1次，1天后病鸭临床发病症状显著缓解，2～3天基本痊愈，配合抗生素来控制细菌继发感染效果更佳。番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体为临床预防、治疗番鸭“白肝病”提供了有效手段。
1、应用本发明实施例1中制备的番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体进行具体预防和治疗：
广东省佛山市三水区某番鸭养殖场，该场自2015年3月开始发生番鸭“白肝病”，连续4批次循环养殖的番鸭均在进场后8-15天开始发病，经我公司采用诊断为番鸭肝炎病毒感染，临床称为“白肝病”，每批进番鸭雏1500只，发病率100％，死亡率60％以上，常规抗病毒和抗生素治疗无效，造成巨大经济损失，该场于2015年11月进行全场消毒，空场半个月。
2015年12月该场引进4500只番鸭雏，分3个棚饲养，每棚1500只。第1和2棚在番鸭1日龄时皮下注射番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体0.5ml/只，第2棚番鸭在10日龄时再次皮下注射番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体0.8ml/只，第3棚为对照，不做任何处理。在番鸭进场后5天，第3棚番鸭雏开始发病，临床症状为“白肝病”典型症状，无菌操作采集病死鸭肝脏，实验室诊断为番鸭肝炎病毒，发病后1天死亡376只，马上对该棚每只番鸭肌肉注射番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体1.5ml/只，第二天番鸭死亡数将至31只，第三天平息，未再出现死亡；而第1和2棚番鸭在该时间段均健康，无发病；第1棚番鸭在11日龄时有24只发病，经用番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体皮下注射1.5ml/只，第二天痊愈，未死亡。
2、应用本发明实施例1中制备的番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体进行治疗：
2016年1月，广东省梅州市某番鸭养殖场3500只番鸭在11日龄时发生“白肝病”(后经实验室确诊)，发病后1天和2天分别死亡572只和663只，在发病后第2天下午时对剩余番鸭肌肉注射番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体1.5ml/只，同时在饮水中添加抗生素预防细菌继发感染，连用3天，治疗后1天早上，死亡雏鸭37只，第2天未再出现死亡，一周后回访，剩余番鸭全部痊愈，精神状态良好，采食正常。
3、上述应用本发明实施例1中制备的番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体进行预防和治疗均达到了良好的效果，应用本发明实施例2和实施例3制备的番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体进行预防和治疗均可得到同实施例1一样良好的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：它依次包括下述步骤：(1)由番鸭肝炎病毒GS14株制备抗原，所述番鸭肝炎病毒GS14株的保藏编号为：CCTCCNo:V201623；(2)抗原灭活；(3)制备疫苗用抗原；(4)制备灭活疫苗；(5)制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体；
所述步骤(1)中由番鸭肝炎病毒GS14株制备抗原的具体方法为：将番鸭肝炎病毒GS14株毒种用生理盐水5000～10000倍稀释，经尿囊腔接种11～12日龄易感番鸭胚，0.1～0.2ml/胚，收集接种60～168小时死亡番鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，然后于-20～-40℃保存。
2.根据权利要求1所述的鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中抗原灭活的具体方法为：抗原加入体积终浓度为0.1％的甲醛溶液，在37℃下灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟；所述甲醛溶液中甲醛的含量为36～40％。
3.根据权利要求2所述的鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中制备疫苗用抗原的具体方法为：将灭活后的抗原于4～8℃经4000～4500转/分钟离心20～30分钟，收集上清液，上清液用截留分子量为6000～10000道尔顿的中空纤维超滤器浓缩15～20倍，浓缩液转入灭菌容器，于4～8℃保存，取样进行灭活检验合格，即为制备疫苗用抗原。
4.根据权利要求3所述的鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中制备灭活疫苗的具体方法为：
1)制备番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗
将制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2溶液中，即为番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗；所述鸭白细胞介素2溶液中鸭白细胞介素2的含量为0.12mg/ml；所述制备疫苗用抗原以μg计，所述鸭白细胞介素2以ml计，制备疫苗用抗原与鸭白细胞介素2溶液间的质量体积比为4～5：1；
2)番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗
a、制备水相：将制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2溶液中，使鸭白细胞介素2终浓度为4～5μg/ml，然后加入体积终浓度为4％的灭菌吐温-80，充分振摇，使吐温-80溶解，即为水相；所述鸭白细胞介素2溶液中鸭白细胞介素2的含量为0.12mg/ml；
b、制备油相：注射用白油94份加入2份硬脂酸铝，搅拌均匀，加热使硬脂酸铝溶解，然后加入6份司本-80，继续加热使司本-80溶解，溶液呈橙黄色至棕红色，灭菌备用，即为油相；
c、按水相与油相的体积比1:1将水相和油相混合，用胶体磨乳化3～5分钟，呈乳白色，即为番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗。
5.根据权利要求4所述的鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中制备番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的具体方法为：
1)高免鸡蛋摆入塑料蛋盘，浸入37～40℃、0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15～20分钟，而后将高免鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒20～30分钟；所述高免鸡蛋由经过步骤(4)的1)中制备的番鸭肝炎病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗和步骤(4)的2)中制备的番鸭肝炎病毒白细胞介素2油乳剂灭活疫苗进行免疫过的产蛋鸡生产；
2)手工或机械打蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；
3)充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，转入灭菌的搅拌罐中，同时加入温度为20～25℃、pH值为4.2～4.7的灭菌注射用水，所述灭菌注射用水的加入量按卵黄：灭菌注射用水的体积比1:3～5加入；然后调整转速为200～250转/min，搅拌20～30分钟，而后静置3～5小时；
接着将卵黄液转入不锈钢桶中，加入体积终浓度为3～4％正辛酸，搅拌20～30min，室温放置12～24小时，然后用40～80目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，蛋黄用80～100目滤布过滤，收集滤液，滤液和下层液体合并，接着将滤液和下层液体用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，然后将滤液转入消毒后的冰柜中，在4～8℃下冷藏5～12小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目以上滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，然后加入醋酸-醋酸钠缓冲液调节滤液pH值为6.8～7.0，即为抗体半成品；
4)将抗体半成品用过滤精度为0.2μm的筒式滤芯过滤除菌，然后无菌操作分装，即为番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体。
6.根据权利要求5所述的一种番鸭肝炎病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中应用0.2M盐酸来调节灭菌注射用水的PH值；所述冰柜的消毒采用0.1％甲醛溶液。
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