CN114891094A - 一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：S1制备禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗，S2：产蛋鸡免疫处理后获得高免鸡蛋，S3：收集高免鸡蛋进行预处理获得卵黄液，S4：对卵黄液进行灭菌处理获得禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体。本发明在抗体制备过程中，抗原的纯度及浓度都非常重要，抗原纯度越高，卵黄抗体中特异性抗体分子越多更容易得到高效价的特异性抗体，故在免疫前要对抗原浓度进行优化，通过本发明制备出的禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体，卵黄抗体活性较高对禽腺病毒和番鸭细小病毒有明显的中和作用，能有效保护雏番鸭，对番鸭禽腺病毒和番鸭细小病毒的流行控制有积极作用。

Description

一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法。
背景技术
Ⅰ群禽腺病毒病最早于1987年发生于临近巴基斯坦卡拉奇的安格拉地区，因此又称“安格拉病”。在短短一年内，本病迅速传播到巴基斯坦地区的多数肉仔鸡群。我国1988年山东即有Ⅰ群禽腺病毒的报道，2015年安徽淮北发现有鸡群感染Ⅰ群禽腺病毒，2016年蔓延至全省。近两年病毒毒力有所改变，能引起水禽发病。
番鸭细小病毒为细小病毒科细小病毒属的成员，病毒直径20～24nm，无囊膜、呈二十面体对称，基因组大小约5kb，是以喘气、腹泻及胰脏坏死和出血为主要特征的传染病，具有高度传染性，且发病率和死亡率都很高，常造成严重的经济损失。主要引起1～3周龄雏番鸭发病，发病率为27％～62％，病死率为22％～43％，且病愈鸭大部分成为僵鸭。近年常有番鸭细小病毒和禽腺病毒混全感染，为有效防治番鸭细小病毒病和禽腺病毒病，我们亟待需要研发疗效更高的疫苗。
发明内容
为此，需要提供一种一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，制备出的抗禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体，卵黄抗体活性较高，对禽腺病毒和番鸭细小病毒有明显的中和作用，能有效保护雏番鸭，对番鸭禽腺病毒和番鸭细小病毒的流行控制有积极作用。
为实现上述目的，本发明提供了一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗；
S2：产蛋鸡免疫处理后获得高免鸡蛋；
S3：收集高免鸡蛋进行预处理获得卵黄液；
S4：对卵黄液进行灭菌处理获得禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体。
作为本发明的进一步改进：所述S1制备禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗，包括：
S1a：将禽腺病毒(FAdv-4)AH株和番鸭细小病毒AH株的免疫抗原用冷冻真空干燥机进行冻干浓缩一倍；
S1b：水相：取按重量份计的甲醛灭活的禽腺病毒和番鸭细小病毒鸭胚尿囊液96份，吐温-80 4份；
S1c：油相：取10号白油和司本-80以96∶4混合，加入2％硬脂酸铝，高压灭菌；
S1d：以油相与水相3∶1的比例，于组织捣碎机中充分乳化，制备成禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗。
作为本发明的进一步改进：所述产蛋鸡免疫处理，包括：
选择健康140日龄高产蛋鸡20只，隔离饲养观察一周，表现正常时接种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗。
作为本发明的进一步改进：所述禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗的接种，包括：三针禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗，接种剂量为第一针：注射2mL/只，第二针：注射2.5mL/只，第三针：注射2.5mL/只。
作为本发明的进一步改进：所述接种三针禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗时每两针之间的间隔时间为一周。
作为本发明的进一步改进：所述禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗为颈部皮下注射。
作为本发明的进一步改进：所述高免鸡蛋预处理，包括：使用清水洗净，放入稀释的百毒杀溶液中浸泡20min，取出擦干。
作为本发明的进一步改进：所述百毒杀溶液的稀释比例为1:600。
作为本发明的进一步改进：所述对卵黄液进行灭菌处理，包括：所述卵黄液与灭菌生理盐水按1∶10稀释混合搅拌均匀。
区别于现有技术，上述技术方案：
1、在抗体制备过程中，抗原的纯度及浓度都非常重要，抗原纯度越高，卵黄抗体中特异性抗体分子越多更容易得到高效价的特异性抗体，抗原浓度直接决定抗体效价，抗原浓度过低，机体产生的抗体水平也低，抗原浓度过高易引起免疫耐受，产生的抗体水平也低，故在免疫前要对抗原浓度进行优化。
2、通过实验制备出的抗禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体，卵黄抗体活性较高，对禽腺病毒和番鸭细小病毒有明显的中和作用，能有效保护雏番鸭，对本地区番鸭禽腺病毒和番鸭细小病毒的流行控制有积极作用。
附图说明
图1为一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法流程图；
图2为番鸭细小病毒抗体检测结果；
图3为禽腺病毒抗体检测结果。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
请参阅图1～3，本实施例一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1：制备禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗：
S1a：将禽腺病毒(FAdv-4)AH株和番鸭细小病毒AH株的免疫抗原用冷冻真空干燥机进行冻干浓缩一倍；
S1b：水相：甲醛灭活的禽腺病毒和番鸭细小病毒鸭胚尿囊液96份，吐温-80 4份(按重量份计)；
S1c：油相：取10号白油和司本-80以96∶4混合，加入2％硬脂酸铝，高压灭菌；
S1d：以油相与水相3∶1的比例，于组织捣碎机中充分乳化，制备成禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗；
S2：产蛋鸡免疫处理后获得高免鸡蛋：选择健康140日龄高产蛋鸡20只，隔离饲养观察一周，表现正常时接种油乳剂灭活苗；首免：颈部皮下注射2mL/只，一周后二免，颈部皮下注射2.5mL/只，再过一周后三免颈部皮下注射2.5mL/只，三免后获得高免鸡蛋；
S3：收集高免鸡蛋进行预处理获得卵黄液：取收集的高免鸡蛋，用清水洗净，放1∶600倍稀释的百毒杀溶液中浸泡20min，取出擦干；敲开蛋壳，除去蛋清，取出卵黄，划破卵黄膜，集中收集流出的卵黄液；
S4：对卵黄液进行灭菌处理获得卵黄抗体：对S3中收集的卵黄液与灭菌生理盐水按1∶10稀释混合搅拌均匀，即得禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体。
对所述方案中制备的禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体进行检测与结论分析如下：
1检验与测定
1.1无菌检验
分别取0.2mL制备的卵黄抗体分别接种营养琼脂培养基和血琼脂培养基。将培养基放于37℃，培养观察3～5天。
1.2抗体安全性检测
取卵黄抗体，分别经肌肉注射和口服途径接种1日龄雏鸭各5只，接种剂量雏番鸭为1ml/只，同时取1日龄雏番鸭5只接种生理盐水作对照。各组隔离饲养，观察并记录各组生产性能。
1.3抗体效价测定
采用琼脂扩散试验法检测番鸭细小病毒抗体，取制备的卵黄抗体进行1∶2、1∶4、1∶8……1∶64倍系列稀释，取每个稀释度卵黄抗体0.1mL分别加入琼脂扩散试验板打好的孔内，中间孔加入番鸭细小病毒琼脂扩散试验抗原，放入湿盒内置37℃作用48h，观察番鸭细小病毒抗体效价。
采用血凝抑制方法检测禽腺病毒抗体，取制备的卵黄抗体在血凝板上进行1∶2、1∶4、1∶8……1∶64倍系列稀释，加入4单位禽腺病毒血凝抗原，37℃作用20min，再加入等量1％鸡红细胞，37℃作用30min，观察禽腺病毒抗体效价。
1.4动物中和实验
1日龄雏番鸭随机分成中和组和接毒组，每组10只。取1∶10稀释的卵黄抗体5mL与等量1000倍ELD50/mL的禽腺病毒和番鸭细小病毒分离毒混合物混匀，37℃作用1h，肌肉注射雏番鸭，1.0mL/只，接毒组肌肉注射生理盐水与等量1000倍ELD50/mL的分离毒混合物，1.0mL/只，饲养观察10天，记录各组雏番鸭精神状态及发病死亡情况。
1.5卵黄抗体预防效果观察
5日龄雏鸭随机分成四组，每组10只，第1组肌肉注射1000倍ELD50/mL的禽腺病毒分离毒，0.2mL/只。第2组肌肉注射1000倍ELD50/mL的番鸭细小病毒分离毒，0.2mL/只，第3组肌肉注射卵黄抗体0.5mL/只，第4组不做任何处理，做好标记，把40只鸭子混在一起饲养，观察10天，记录各组雏番鸭发病死亡情况及最后体重。
2结果与分析
2.1免疫原制备
制备的禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗质量匀一，3000rpm离心15min不分层。
2.2产蛋鸡免疫
20只产蛋母鸡接种后采食、产蛋正常，没有不良反应。
2.3无菌检验结果
接种卵黄抗体的营养琼脂培养基和血琼脂培养基经37℃培养5天，取出观察无细菌生长。
2.4抗体安全性检测结果
接种的1日龄雏番鸭实验组和对照组，生产性能无明显差异。
2.5中和效价测定结果
制备的卵黄抗体经琼脂扩散试验法检测，番鸭细小病毒抗体效价达1：64，经血凝抑制试验法检测，禽腺病毒抗体效价达1：1024。
2.6动物中和实验
中和组雏番鸭的没有死亡，精神正常，采食量变化不大，接毒组第二天采食量减少约20％，缩头，第三天死亡1只，第四天死亡2只，第五天死亡1只，第六天死亡1只。
2.7卵黄抗体预防效果观察
第3天第2组有1只死亡，第4天第1组死亡1只，第2组死亡1只，第5天第1组死亡2只，第2组死亡1只，第4组死亡1只，第6天第2组死亡1只，第4组死亡2只，第7天第1组死亡1只，第2组死亡1只，第4组死亡1只，只有第3组未死亡。最后称重结果见表2，第3组平均体重明显高于其它组。
表1各组饲养情况统计表
Figure BDA0003626802150000061
Figure BDA0003626802150000071
3、结论
3.1通过实验制备出抗禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体，卵黄抗体活性较高，对禽腺病毒和番鸭细小病毒有明显的中和作用，能有效保护雏番鸭，对本地区番鸭禽腺病毒和番鸭细小病毒的流行控制有积极作用。
3.2番鸭细小病毒病是危害雏番鸭的一种重要疾病，主要引起1～3周龄雏番鸭发病，发病率和死亡率均较高，且病愈鸭大部分成为僵鸭。禽腺病毒病近两年对水禽致病性增强，常有水禽感染禽腺病毒，特别是雏番鸭，常与番鸭细小病毒混合感染，使发病率和死亡率增高，给养殖企业造成了巨大经济损失。研究证明IgY是一种高效、特异的抗体，且方便、廉价，二联卵黄抗体的研制为禽腺病毒病和番鸭细小病毒病的预防和治疗提供了一种新手段。
3.3番鸭细小病毒抗体效价检测的方法较多，琼脂扩散试验方法仍是其中能够定量且操作比较简单的方法，但其敏感性差且不易观察，在观察时需侧光观察。
3.4在抗体制备过程中，抗原的纯度及浓度都非常重要，抗原纯度越高，卵黄抗体中特异性抗体分子越多更容易得到高效价的特异性抗体，抗原浓度直接决定抗体效价，抗原浓度过低，机体产生的抗体水平也低，抗原浓度过高易引起免疫耐受，产生的抗体水平也低，故在免疫前要对抗原浓度进行优化。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (9)

1.一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：制备禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗；
S2：产蛋鸡免疫处理后获得高免鸡蛋；
S3：收集高免鸡蛋进行预处理获得卵黄液；
S4：对卵黄液进行灭菌处理获得禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述S1制备禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗，包括：
S1a：将禽腺病毒(FAdv-4)AH株和番鸭细小病毒AH株的免疫抗原用冷冻真空干燥机进行冻干浓缩一倍；
S1b：水相：取按重量份计的甲醛灭活的禽腺病毒和番鸭细小病毒鸭胚尿囊液96份，吐温-80 4份；
S1c：油相：取10号白油和司本-80以96∶4混合，加入2％硬脂酸铝，高压灭菌；
S1d：以油相与水相3∶1的比例，于组织捣碎机中充分乳化，制备成禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗。
3.根据权利要求1所述一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述产蛋鸡免疫处理，包括：
选择健康140日龄高产蛋鸡20只，隔离饲养观察一周，表现正常时接种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗。
4.根据权利要求3所述一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗的接种，包括：三针禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗，接种剂量为第一针：注射2mL/只，第二针：注射2.5mL/只，第三针：注射2.5mL/只。
5.根据权利要求4所述一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述接种三针禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗时每两针之间的间隔时间为一周。
6.根据权利要求3所述一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述禽腺病毒和番鸭细小病毒二联油乳剂灭活苗为颈部皮下注射。
7.根据权利要求1所述一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述高免鸡蛋预处理，包括：
使用清水洗净，放入稀释的百毒杀溶液中浸泡20min，取出擦干。
8.根据权利要求7所述一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述百毒杀溶液的稀释比例为1:600。
9.根据权利要求1所述一种禽腺病毒和番鸭细小病毒二联卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述对卵黄液进行灭菌处理，包括：
所述卵黄液与灭菌生理盐水按1∶10稀释混合搅拌均匀。
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