CN111420042A - 一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法，其中的鸭圆环病毒抗原是通过感染1日龄健康樱桃谷雏鸭，于25日龄采集感染鸭肝脏获得抗原组织，腺病毒抗原是通过感染20‑30日龄SPF雏鸡并采集死亡鸡只的肝脏获得；疫苗的抗原由质量比为1‑5:1的鸭圆环病毒和腺病毒肝脏组织组成，并制备疫苗用抗原液；并在抗原液中添加5‑40mg/mL浓度的松花粉多糖作为免疫增强剂，与常规白油佐剂乳化而成；所述卵黄抗体是将该疫苗免疫蛋鸡,然后从高免鸡蛋蛋黄中提取纯化得到，同时含有抗鸭圆环病毒和腺病毒二种抗体，所提供的疫苗和卵黄抗体制备工艺简单、成本低、作用效果好，剂型稳定，易储存具有广阔的应用前景。

Description

一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备 方法

技术领域

本发明涉及家禽疫病免疫控制领域，具体涉及一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法。

背景技术

鸭圆环病毒(duck circovirus，DuCV)是圆环病毒科圆环病毒属的新成员，无囊膜，单股环型DNA结构。该病毒于2003年由Hanemann在德国首次报道。在我国，姜世金等(2007)首次从2006年在福建省采集的鸭疫里默氏菌病鸭样品中检测到DuCV。刘少宁等(2008-2009)对来自山东、江苏、四川、福建和广东5个省份36个鸭群343份组织样品进行检测，发现DuCV检出率高达81.63％，鸭群阳性率达94.44％；其中山东18个肉鸭场阳性率为88.89％，12个种鸭场的阳性率为75％。这些数据说明鸭圆环病毒在中国主要养鸭省市鸭群中其感染相当普遍。从2016-2019年对全国各地发病鸭群的检测数据来看，DuCV的感染率仍然极高，并且多数与腺病毒、鸭细小病毒、坦布苏病毒、呼肠孤病毒、流感病毒和细菌等病原混感。对混感鸭群治疗发现，只要混感有DuCV的鸭群，都难以达到良好的治疗效果。DuCV感染过程缓慢，本身不造成明显的临床症状，因此非常容易被忽视，由于它主要侵害鸭的免疫系统，导致鸭抵抗力下降，因此极易造成其它病原的并发或继发感染，严重影响了治疗效果，造成了巨大的经济损失。由于目前DuCV在动物细胞和禽胚上难以增殖培养，因此目前尚无商品化疫苗。

禽腺病毒属于腺病毒科、禽腺病毒属，是鸡、鸭、鹅等禽类体内常见的传染性病毒。禽腺病毒，特别是血清IV型，对鸡的致病力较强，但在鸭上，其症状通常不典型。该病在鸭感染初期往往无明显症状，死亡率较低，常见有精神萎顿、瘫痪、头颈震颤、高烧、排黄绿色稀便。然而在感染后期，患病家禽表现为精神沉郁，羽毛蓬松，特征性症状为突然倒地，两脚划空，数分钟内死亡。发病鸭群多于3周龄开始出现死亡，4-5周龄达到死亡高峰。病理解剖主要肝脏松软肿大并伴有出血，心包明显可见淡黄澄清的积液为特征性病变，肺脏出血、水肿，肾脏肿大出血，肠道出血等病变。该病一年四季均能发生，夏秋季节多发。该病主要通过种蛋、鸭胚垂直感染，也可通过粪便、飞沫水平传播。事实上，近一两年大量临床监测发现，肉鸭腺病毒感染相当普遍，甚至已经成为养殖场的常驻性病原。腺病毒单一感染的情况较少，基本上都是与鸭圆环病毒、新型鸭细小病毒、鸭肝炎病毒、流感病毒等混合感染，并易导致细菌继发感染的发生。目前腺病毒也没有商品化疫苗，鸭腺病毒的防控依然是个空白。

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体,由于卵黄中仅有特异性的IgY类抗体,故称其为卵黄免疫球蛋白IgY。与血清抗体相比,卵黄抗体具有很多独特的优点：(1)来源广、产量高、成本低，只需连续免疫蛋鸡，从高免鸡蛋的卵黄中纯化即可得到；(2)卵黄抗体有良好的稳定性,耐热耐酸,且常温下保存时间长；(3)特异性强，针对不同抗原产生特异性抗体，治疗效果确切；(4)无过敏原，安全、高效、无残留、环保。由于受到鸭圆环病毒疫苗和腺病毒疫苗制作技术的限制，目前尚无商品化的疫苗上市，市场空缺巨大，用于预防和治疗早期感染的卵黄抗体更是未见报道。

发明内容

本发明的主要目的就在于克服上述现有技术的不足，提供一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法，其中的鸭圆环病毒抗原是通过腹腔注射感染1日龄健康樱桃谷雏鸭，每隔7天静脉注射加强感染一次，每次接种同时注射250mg/kg的环磷酰胺诱导免疫抑制加强病毒复制，于25日龄采集感染鸭肝脏组织获得；腺病毒抗原是通过感染20-30日龄SPF雏鸡并采集死亡鸡只的肝脏组织获得；疫苗所需的抗原液由质量比为1-5:1的鸭圆环病毒和腺病毒肝脏组织组成，经研磨、反复冻融、离心、过滤后制作而成，并添加5-40mg/mL浓度的松花粉多糖作为免疫增强剂，然后与常规白油佐剂乳化而成；所述卵黄抗体是将该疫苗免疫蛋鸡,然后从高免鸡蛋蛋黄中提取纯化得到，同时含有抗鸭圆环病毒和腺病毒二种抗体，所提供的疫苗和卵黄抗体制备工艺简单、成本低、作用效果好，剂型稳定，易储存，在养鸭业中的开发利用潜力巨大，具有广阔的应用前景。

综合考虑鸭圆环病毒和腺病毒的感染特性和流行情况，发明人认为这两种病原的防控意义重大，因此本发明公开了两种病原的产业化制备方法，并将两种病原联合制作成二联疫苗，同时添加免疫增强剂提高抗原的免疫原性，以达到同时预防这两种疾病的效果，从而为养鸭业的健康发展保驾护航，并且以该疫苗为基础，进一步制备获得了卵黄抗体，该卵黄抗体的安全性好,未出现由卵黄抗体引起的任何局部或全身不良反应，而且能够有效的预防和治疗鸭圆环病毒和腺病毒的感染,具有很好的商品化开发前景。

本发明的具体发明构思如下：

本发明所采用的鸭圆环病毒抗原为鸭的肝脏组织抗原。由于目前鸭圆环病毒难以体外培养，没有合适的细胞系，鸭胚上生长的也不理想，因此一直没有商品化的疫苗。又因为此病除了造成瘦小、免疫力下降之外，通常不表现出典型的临床症状，因此临床上容易受到忽视。不管是从临床意义还是技术难度上，该病毒的全病毒疫苗的研制一直是一个空白，也是现有技术缺失的环节。然而，近几年，鸭圆环病毒的感染率越来越高，危害越来越严重，疫苗研发的需求十分迫切。疫苗制作的关键是病毒的培养或保护性抗原的制备，有研究通过大肠杆菌或酵母菌等表达系统表达鸭圆环病毒的核衣壳蛋白，但是该方法制作要求高，纯化成本大，表达的抗原蛋白高级结构与天然的抗原结构存在明显差异，临床保护效果有待考证，而全病毒抗原不存在抗原性差的问题，但是如何解决圆环病毒的培养是现有技术中存在的显著难题。本发明从2019年众多发病的病料中分离、培养并连续传代驯化了一株鸭圆环病毒，该毒株在雏鸭体内生长良好，我们选用1日龄健康樱桃谷雏鸭接种该病毒，并采取间隔补接的技术及环磷酰胺人工诱导免疫抑制技术，大大提高了在鸭体内的病毒含量，使其能够达到疫苗制作的要求。本发明保存的鸭圆环病毒毒株为国内首次保藏，保藏编号为CGMCC No.19296。

如前所述，鸭圆环病毒通常与其他病毒或细菌混感，因此发明人认为单独的防控圆环病毒理论上并不能有效的控制疾病和混合感染，最佳的方式是联合容易与其混感的病毒制作成联苗，联合预防疾病才能起到更加显著的保护效果。血清IV型的腺病毒近五年来我国爆发的一种较新的病毒，之前在鸡上感染尤其严重，随着病毒的流行和发展，该病在鸭和鹅上的感染也越来越普遍，检出率高居不下，并且容易与鸭圆环病毒混感，除了造成实质性器官损伤外，也极大的破坏了免疫力，从而诱导更严重的细菌继发感染，对养禽业危害严重。由于血清IV型的腺病毒也没有合适的细胞系体外培养，在禽胚上繁殖也不理想，但是该病毒对雏鸡极其易感，特别是SPF鸡，感染之后通常在48-72h内致死雏鸡，死亡鸡的肝脏中含有大量的病毒。因此，本发明选用20-30日龄的SPF鸡感染一株纯化的腺病毒(保藏编号：CVCC AV211，从保藏机构直接获得)，用于制备疫苗用的抗原，该病毒株生长优良，前期试验证明保护效果良好，是一株特性优良的疫苗候选株。本发明首次将鸭圆环病毒和腺病毒制作二联灭活疫苗，并创新性的在抗原中加入松花粉多糖作为免疫增强剂，进一步提高抗原的免疫效果，为鸭圆环病毒和腺病毒的预防提供了一个可行的技术手段。

在上述发明构思的基础上，发明人提供了具体技术方案如下：

一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，其有效组分为：

疫苗由质量比为1-5:1的鸭圆环病毒和腺病毒组织抗原液组成；同时抗原液中添加5-40mg/mL浓度松花粉多糖作为免疫增强剂；

其中采用的鸭圆环病毒毒株的保藏编号为CGMCC No.19296；

所述鸭圆环病毒抗原是通过将病毒腹腔注射病毒种感染1日龄健康樱桃谷雏鸭，此后每隔7天用静脉注射方式加强感染一次，每次感染病毒量不低于1×10⁷copies，每次接种同时注射250mg/kg的环磷酰胺诱导免疫抑制加强病毒复制，于25日龄采集感染鸭整个肝脏组织，通过荧光定量PCR技术检测肝脏中的病毒含量≥1×10⁸copies/g，即可作为原始抗原组织；

腺病毒抗原是通过肌肉注射病毒种感染20-30日龄SPF雏鸡并采集死亡鸡只的肝脏获得,感染病毒量不低于1×10⁸copies，肝脏组织通过荧光定量PCR技术检测肝脏中的病毒含量≥1×10⁹copies/g，即可作为原始抗原组织；

之后按照两种肝脏组织的重量1-5:1配比，然后再加5倍水一起研磨、匀浆、冻融、离心、过滤制备疫苗用抗原液；同时，抗原液中添加5-40mg/mL浓度松花粉多糖作为免疫增强剂；

抗原液经过甲醛灭活，与常规白油佐剂乳化，制作而成疫苗；

更进一步的，所述的二联灭活疫苗鸭圆环病毒和腺病毒(血清IV型)两种肝脏组织的重量比为2-4:1，松花粉多糖的浓度为10-30mg/mL；

最优选的，所述的二联灭活疫苗鸭圆环病毒和腺病毒(血清IV型)两种肝脏组织的重量比为3:1，松花粉多糖的浓度为20mg/mL；

之所以选择上述的质量比，是由于发明人发现鸭圆环病毒在鸭肝脏中的病毒含量低于腺病毒在SPF鸡肝脏中的含量，为了保证二联疫苗的免疫效果，发明人在试验中发现通过增加鸭圆环病毒的组织的比重，从而平衡鸭圆环病毒和腺病毒的抗原比例，以保证两种抗原均能提供良好的保护效果，这对于后期制备疫苗具有决定性的作用，也是上述两种抗原联用的最佳选择。同时本发明选择植物多糖添加至抗原液作为免疫增强剂，进一步提升抗原的免疫效果，提高两种抗原的抗体滴度，之所以选择上述松花粉多糖的浓度是充分保证免疫增强效果的前提下能够进一步的节约成本。

该疫苗更具体的制备方法如下：

选用1日龄健康樱桃谷雏鸭静脉注射接种纯化的鸭圆环病毒毒种，每隔7天补接一次，每次感染时同时注射250mg/kg剂量的环磷酰胺人工诱导免疫抑制以利于病毒复制，至25日龄时，采集鸭肝脏，检测鸭圆环病毒的含量≥1×10⁸copies/g，备用。

选用20-30日龄SPF鸡接种纯化的腺病毒(血清IV型)毒种，接种48-72h后，采集死亡鸡的肝脏，检测腺病毒的含量≥1×10⁹copies/g，备用。

将重量比为1-5:1的上述鸭肝脏和鸡肝脏混合，加入5倍质量的无菌水，用组织细胞破壁机充分研磨破壁，组织匀浆后反复冻融3次，然后用5000-8000rpm转离心机离心20-30min，收集上清并用纱布过滤，加入5-40mg/mL浓度松花粉多糖，加入终浓度为质量分数千分之二的甲醛于37℃灭活48h，作为最终的抗原液；之后按照质量比为1:1将抗原液与商品化的白油佐剂充分乳化，制作获得鸭圆环病毒-腺病毒二联灭活疫苗；

其中所述的机械乳化法采用设备为胶体磨、均质机或匀浆机完成，以混合物的特性达到上述标准为宜；

除此之外，本发明还进一步提供了利用该疫苗制作卵黄抗体的制备方法，具体步骤如下：

(1)用制备的灭活疫苗分4次对开产前1个月的蛋鸡进行免疫,每次免疫间隔2周；前期4次免疫完后，后续每隔1-2个月免疫一次，每次免疫剂量为1.0-2.0mL/只；

(2)第4次免疫后两周开始收集免疫蛋，持续收蛋过程中保持每隔1-2个月免疫一次；用蛋黄分离器将将卵黄与蛋清分离，卵黄与预热到30℃-37℃纯净水按体积3-5:1混合稀释蛋黄液,搅拌均匀后得到卵黄稀释液,于30℃-37℃条件下预温1h；

(3)向蛋黄稀释液中加入质量分数为3-4％的PEG6000，与蛋黄混合后充分搅拌均匀，静置4-6h，充分反应；

(4)将反应后的上清液抽出，用100-200目滤网粗滤，其中先用100目，再用200目过滤；

(5)将过滤的上清液装入无菌桶进行二次沉淀，时间为24-48h；

(6)将二次沉淀的上清液抽出，用200目滤网先粗滤一遍，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；除菌后的上清中加入体积分数为千分之一的甲醛作为防腐剂，即精制卵黄抗体，且经检测抗鸭圆环病毒和腺病毒抗体的琼扩试验效价最低应不低于1:64；

(7)在无菌条件下将滤液分装于无菌疫苗瓶中,盖好胶塞,轧铝盖,贴上标签,保存备用,保存温度为4-8℃；

更进一步的步骤(1)中4次免疫完后，后续每隔1.5个月免疫一次；

步骤(2)中的稀释体积比为3.5:1，温度为35℃；

步骤(3)中的PEG6000添加量为3.5％；其中PEG6000可预先用少量温水溶解。

与现有技术相比，本发明取得了如下的技术效果：

1.本发明提供的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，有效解决了鸭圆环病毒抗原制备的难题，且确定了鸭圆环病毒和腺病毒抗原的最佳配比。

2.本发明提供的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗为组织灭活苗，制备工艺简单、设备要求低、粘稠度适中、通针性好、应激小、保护效果好。适合小、中等规模生产或用于制备抗体用。

3.本发明提供的松花粉多糖佐剂，添加量小，成本适中，能够显著增强机体体液免疫和细胞免疫的功能，提高二种抗原的抗体效价。

4.本发明提供的卵黄抗体制备技术，优化了免疫程序和提取步骤，整个提取过程简单，易操作，适合大规模生产，提取过程中不使用任何有毒性的试剂，不需要浓缩，提取完剩余的蛋黄膏可制作成饲用蛋黄粉二次利用，无任何毒性。

5.本发明提供的卵黄抗体制备技术，两种病毒的抗体效价均不低于1：64，保护效果突出，能够有效预防和治疗两种病毒造成的危害。

综上所述，本发明提供的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制作工艺简单，使用方便，作用效果好，安全环保，在畜禽养殖业中的开发利用潜力巨大，具有广阔的应用前景。

保藏信息，

保藏时间：2020年2月26日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心

保藏编号：CGMCC No.19296

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

分类命名:鸭圆环病毒

附图说明

图1为不同接种方案对鸭肝脏中鸭圆环病毒含量的影响柱状图。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定：

实施例1疫苗的制备

圆环病毒原始毒种分离自2019年临床发病鸭的肝脏，用PCR检测技术确定发病鸭的病料感染鸭圆环病毒，并检测其他病原，排除病毒混合感染的可能，然后匀浆后离心，上清用一次性滤器过滤除菌；毒种感染1日龄雏鸭，连续传代3代，检测病毒量合格后作为纯化的毒种，发明人将该病毒毒株进行生物保藏，保藏编号：CGMCC No.19296；

腺病毒(血清IV型)毒种购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(保藏编号：CVCCAV211)；

选用1日龄健康樱桃谷雏鸭静脉注射接种纯化的鸭圆环病毒毒种，每隔7天补接一次，每次攻毒时同时注射250mg/kg剂量的环磷酰胺人工诱导免疫抑制以利于病毒复制，至25日龄时，采集鸭肝脏，检测鸭圆环病毒的含量，备用；

本实施例对补接次数和环磷酰胺作用进行了鉴定，通过设立2个大组(A和B)，每个大组分为3个小组，每小组5只雏鸭。A大组里的三个小组分别在1日龄接种、1+8日龄接种、1+8+15日龄接种鸭圆环病毒；B大组里的三个组用相同的方法接种的同时注射250mg/kg剂量的环磷酰胺；各组都于25日龄剖杀，取肝脏，通过荧光定量PCR检测相对病毒含量。结果见附图1，结果证明接毒次数与病毒含量成明显正相关，接毒三次能够提高病毒量100倍以上；另外，从B组结果看，使用环磷酰胺诱导免疫抑制后明显的增加病毒的复制，在1+8+15天接毒方案下B组比A组病毒含量还能够提高10倍。因此本发明最终决定使用1+8+15天接毒并联合环磷酰胺处理的方案获取高含量的鸭圆环病毒抗原组织。

选用20-30日龄SPF鸡接种纯化的腺病毒(血清IV型)毒种，接种48-72h后，采集死亡鸡的肝脏，检测腺病毒的含量，备用。

分别将质量比为1:1、3:1、5:1的鸭肝脏和鸡肝脏混合，加入5倍质量的无菌水，用组织细胞破壁机充分研磨破壁，组织匀浆后反复冻融3次，然后用5000-8000rpm转离心机离心20-30min，收集上清，加入终浓度为千分之二的甲醛于37℃灭活48h，作为最终的抗原液；

质量比为1:1的抗原液与商品化的白油佐剂用均质机充分乳化，制作而成不同抗原比例的鸭圆环病毒-腺病毒二联灭活疫苗，通过免疫效果比较，最终确定最佳的抗原比例。

用上述筛选的最佳抗原比例制作抗原液，在抗原液中分别加入10、20、40mg/mL三个浓度的松花粉多糖，制作成含不同浓度多糖的鸭圆环病毒-腺病毒二联灭活疫苗，通过免疫效果比较，最终确定最佳的松花粉多糖含量。

实施例2疫苗免疫效果比较

1.试验设计

1.1试验分组：

A组：使用本发明实施例1中用鸭肝脏和鸡肝脏质量比为1:1制备的疫苗。

B组：使用本发明实施例1中用鸭肝脏和鸡肝脏质量比为3:1制备的疫苗。

C组：使用本发明实施例1中用鸭肝脏和鸡肝脏质量比为5:1制备的疫苗。

I组:使用本发明实施例1中用鸭肝脏和鸡肝脏质量比为3:1并添加10mg/mL浓度的松花粉多糖制备的疫苗。

II组:使用本发明实施例1中用鸭肝脏和鸡肝脏质量比为3:1并添加20mg/mL浓度的松花粉多糖制备的疫苗。

III组:使用本发明实施例1中用鸭肝脏和鸡肝脏质量比为3:1并添加40mg/mL浓度的松花粉多糖制备的疫苗。

Mock阴性对照组：不免疫任何疫苗,接种等剂量的生理盐水。

1.2疫苗接种：35只健康樱桃谷雏鸭，平均分成7组，每组5只。在7日龄各组雏鸭肌肉注射1.1中对应的疫苗，接种剂量为0.5mL/只,一周后用相同剂量加强免疫1次。分别在二免后7、14、21d采血，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价。所有数据用SPSS 17.0软件进行Duncan’s多重比较分析，数据为平均值±SD，P<0.05表示差异显著。在二免后21d对各组鸭进行鸭圆环病毒和腺病毒攻毒，分别接种含鸭圆环病毒和腺病毒的肝脏匀浆上清液0.5mL和0.2mL，攻毒后5d用PCR技术检测肝脏中两种病毒的阳性率。

2.结果与分析

2.1血清抗体效价比较

各试验组于二免后7、14、21d，对各组每只鸭进行翅下静脉采血1.0mL，分离血清，用琼脂扩散试验检测抗体效价，结果以效价log2的平均数表示。结果见表1和表2。从表1可以看出，随着A-C组鸭圆环病毒抗原比例的增加，三个组在不同时间点的鸭圆环病毒抗体效价平均值逐渐增加，到二免后21d时，A组(抗原比例1:1)鸭圆环病毒抗体平均效价为4.6，而B组(抗原比例3:1)和C组(抗原比例5:1)鸭圆环病毒抗体平均效价分别为6.4和6.8，二者差异不显著，但均显著高于A组(P<0.05)。对于腺病毒抗体，A组数值在每个时间点都最高，在二免后21d时，A组抗体效价达到7.2，显著高于C组(P<0.05)，与B组差异不显著。因此根据本结果判断，抗原比例在3:1时，鸭圆环病毒和腺病毒血清抗体均能达到6以上，是一个优选的比例。

表1无松花粉多糖佐剂疫苗免疫组血清抗体琼扩效价检测(mean,log2)

注：^a左侧为抗鸭圆环病毒抗体效价，右侧为抗腺病毒抗体效价。

从表2结果分析来看，随着I、II、III组松花粉多糖含量的升高，在三个时间点鸭圆环病毒抗体和腺病毒抗体都有增加。与抗原组成相同的B组(不含多糖)相比，到二免后21d时，II组和III组比B组两种抗体的效价均高1个滴度以上(P<0.05)。I组与B组差异不显著，II组和III组差异不显著。因此，综合考虑成本和效果，优选II组为最佳松花粉多糖剂量组(20mg/mL)。

表2不同浓度松花粉多糖佐剂疫苗免疫组血清抗体琼扩效价检测(mean,log2)

注：^a左侧为抗鸭圆环病毒抗体效价，右侧为抗腺病毒抗体效价。

2.2攻毒保护试验

在二免后21d，按照1.2要求进行鸭圆环病毒和腺病毒攻毒，攻毒后5d用PCR技术检测肝脏中两种病毒的阳性率。结果显示，两种病毒在A、B、C、I、II、III组肝脏中均未检测到，而在Mock阴性对照组，能检测到两种病毒核酸，表明疫苗免疫组均能够有效保护病毒感染，疫苗产生的抗体是有效的，即使A组鸭圆环病毒抗体平均值为4.6，依然能够有效抵抗病毒感染。从临床考虑，由于存在某些免疫抑制因素，疫苗产生抗体效价越高保护效果越好，因此本发明优选抗原比例3:1，松花粉多糖浓度20mg/mL作为疫苗生产的基本参数。

实施例3疫苗接种剂量和安全性评价

根据实施例2中得出的结论，按照鸭圆环病毒和腺病毒抗原比例3:1，松花粉多糖浓度20mg/mL，生产疫苗，并评价疫苗的接种剂量和安全性。将疫苗接种剂量设定为0.2、0.5、1.0mL三个剂量，每个剂量接种1、4、7日龄的雏鸭5只(只接种一次，不加免)，接种后28天，翅下静脉采血，分离血清，进行琼脂扩散试验检测鸭圆环病毒抗体的效价，结果用效价log2的平均数±SD表示。各组接种后的应激情况被记录，应激表现为精神沉郁、不愿走动、进食减少等，严重时死亡。

表3结果显示，接种日龄对抗体产生的影响不大，而接种剂量越大，抗体效价也越高。表4结果显示，1日龄接种0.5mL时即出现明显应激反应，4日龄接种0.5mL时部分出现应激，7日龄接种0.5mL无应激；而接种剂量到1.0mL时，三个日龄应激都出现。根据结果判断，7日龄接种0.5mL时，不仅无应激反应，而且抗体效价也能够达到4.8±0.26，根据实施例2的结论判断，该效价能够有效保护鸭圆环病毒感染，因此本发明优选7日龄免疫0.5mL作为安全有效的剂量，可应用于临床雏鸭的免疫。

表3不同接种日龄和接种剂量对鸭圆环病毒抗体效价的影响(mean±SD,log2)

表4不同接种日龄和接种剂量对雏鸭应激的影响

注：“/”比值代表出现应激数比总数。

实施例4卵黄抗体的制作

(1)用实施例3中使用的疫苗分4次对开产前1个月的蛋鸡进行免疫,接种剂量为1.5mL/只，每次免疫间隔2周，后续每隔1-2个月免疫一次；

(2)第4次免疫后两周开始收集免疫蛋，持续收蛋过程中保持每隔1-2个月免疫一次；用蛋黄分离器将将卵黄与蛋清分离，卵黄与预热到35℃的纯净水按体积3.5:1稀释蛋黄液,搅拌均匀后得到卵黄稀释液,于35℃条件下预温1h。

(3)向蛋黄稀释液中加入终浓度为3.5％的PEG6000，与蛋黄混合后充分搅拌均匀，静置4h，充分反应。

(4)将反应后的上清液抽出，先用100目，再用200目滤网过滤。

(5)将过滤的上清液装入无菌桶进行二次沉淀，沉淀时间为48h。

(6)将二次沉淀的上清液抽出，先用200目滤网粗滤一遍，然后用0.22μm滤膜过滤除菌。

(7)除菌后的上清中加入一定量的防腐剂或千分之一浓度的甲醛，即精制卵黄抗体。

(8)琼脂扩散试验检测抗鸭圆环病毒和腺病毒抗体的琼扩试验效价≥1：64。

(9)分装贮存。在无菌条件下将滤液分装于无菌疫苗瓶中,盖好胶塞,轧铝盖,贴上标签,保存备用,保存温度为4-8℃。

实施例5卵黄抗体的质量检验

(1)安全性检验

用1日龄健康樱桃谷雏鸭20只,肌肉多点注射本发明实施例4制备的卵黄抗体2.0mL,观察14日,易感雏鸭全部健康存活,说明本发明的卵黄抗体的安全性好。

(2)无菌检验

按照《中华人民共和国兽药典》(2015版)执行,结果本发明的卵黄抗体无细菌、支原体和外源病毒污染。

(3)效力检验

1日龄健康樱桃谷雏鸭40只(血清检查为鸭圆环病毒和腺病毒抗原、抗体阴性),随机分为A、B 2个组,每组20只。A组肌肉注射实施例4制备的卵黄抗体,每只0.5mL；B组为对照组,肌肉注射生理盐水,每只0.5mL，隔离饲养。注射8h后，每只鸭再同时注射含鸭圆环病毒和腺病毒的肝脏匀浆上清液0.5mL(>1×10⁷copies)和0.2mL(>1×10⁸copies)。攻毒后5d,剖杀10只，采集肝脏用PCR技术检测病毒阳性情况，剩余10只观察到14日龄，记录临床症状，然后剖杀检测病毒阳性情况。

结果显示，卵黄抗体组(A组)所有20只鸭肝脏中鸭圆环病毒和腺病毒全部为阴性，对照组(B组)所有20只鸭圆环病毒和腺病毒全部为阳性。此外，A组在观察期内无任何临床症状，B组部分鸭表现为精神沉郁、食欲不佳、不愿走动等症状。结果表明，实施例4制备的卵黄抗体有效，1日龄雏鸭注射0.5mL即可。

实施例6卵黄抗体的应用

在疑似鸭圆环病毒和腺病毒感染的养殖厂,挑选明显瘦小、食欲不振、精神萎顿的病鸭，通过采血并用PCR技术，筛选确诊为鸭圆环病毒和腺病毒感染的鸭40只(25日龄左右)，随机分为A、B 2个组,每组20只,隔离饲养。A组注射实施例4制备的卵黄抗体2.0mL，B组注射生理盐水2.0mL。观察14d,记录每组鸭的病情和死亡情况，然后剖杀并用PCR技术检测肝脏中病毒的阳性率。

结果：A组注射卵黄抗体2d后,患病雏鸭的采食量开始增加,精神状态明显好转,14d内未有雏鸭死亡。14d后将鸭扑杀并解剖,大部分鸭剖检病变轻微或无症状，用PCR技术检测肝脏中鸭圆环病毒的阳性率3/20，腺病毒的阳性率为2/20。B组注射生理盐水后,患病鸭的采食量和精神状态未有显著好转,从注射后第2日开始有患病鸭死亡,14d内患病鸭的死亡率为30％。观察期到14d将存活的鸭扑杀并解剖，发现大部分鸭肝脏发黄，有出血点及心包积液等症状，用PCR技术检测肝脏(包括死亡鸭冻存的肝脏)中鸭圆环病毒的阳性率18/20，腺病毒的阳性率为14/20。

以上试验结果表明,本发明的卵黄抗体安全性好、预防效果好、治愈率高,可以用于鸭圆环病毒和腺病毒感染的预防和治疗,具有重大的经济和社会效益。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，其特征在于：其有效组分为：

疫苗由质量比为1-5:1的鸭圆环病毒和腺病毒组织抗原液组成；同时抗原液中添加5-40mg/mL浓度松花粉多糖作为免疫增强剂；

其中采用的鸭圆环病毒毒株的保藏编号为CGMCC No.19296。

2.根据权利要求1所述的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，其特征在于：

所述鸭圆环病毒抗原是通过将病毒腹腔注射病毒种感染1日龄健康樱桃谷雏鸭，此后每隔7天用静脉注射方式加强感染一次，每次感染病毒量不低于1×10⁷copies，每次接种同时注射250mg/kg的环磷酰胺诱导免疫抑制加强病毒复制，于25日龄采集感染鸭整个肝脏组织，通过荧光定量PCR技术检测肝脏中的病毒含量≥1×10⁸copies/g，即可作为原始抗原组织；

腺病毒抗原是通过肌肉注射病毒种感染20-30日龄SPF雏鸡并采集死亡鸡只的肝脏获得,感染病毒量不低于1×10⁸copies，肝脏组织通过荧光定量PCR技术检测肝脏中的病毒含量≥1×10⁹copies/g，即可作为原始抗原组织；

之后按照两种肝脏组织的重量1-5:1配比，然后再加5倍水一起研磨、匀浆、冻融、离心、过滤制备疫苗用抗原液；同时，抗原液中添加5-40mg/mL浓度松花粉多糖作为免疫增强剂；

抗原液经过甲醛灭活，与白油佐剂乳化，制作而成疫苗。

3.根据权利要求1所述的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，其特征在于：

所述的二联灭活疫苗中鸭圆环病毒和腺病毒两种肝脏组织的重量比为2-4:1，松花粉多糖的浓度为10-30mg/mL。

4.根据权利要求1或3所述的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，其特征在于：所述的二联灭活疫苗鸭圆环病毒和腺病毒两种肝脏组织的重量比为3:1，松花粉多糖的浓度为20mg/mL。

5.权利要求1所述的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

选用1日龄健康樱桃谷雏鸭腹腔注射接种纯化的鸭圆环病毒毒种，每隔7天静脉注射补接一次，每次感染病毒量不低于1×10⁷copies，每次感染时同时注射250mg/kg剂量的环磷酰胺人工诱导免疫抑制以利于病毒复制，至25日龄时，采集鸭肝脏，检测鸭圆环病毒的含量≥1×10⁸copies/g，备用；

选用20-30日龄SPF鸡接种纯化的腺病毒毒种，感染病毒量不低于1×10⁸copies，接种48-72h后，采集死亡鸡的肝脏，检测腺病毒的含量≥1×10⁹copies/g，备用；

将重量比为1-5:1的上述鸭肝脏和鸡肝脏组织混合，加入5倍质量的无菌水，用组织细胞破壁机充分研磨破壁匀浆，组织匀浆后反复冻融3次，然后用5000-8000rpm转离心机离心20-30min，收集上清并用纱布过滤，加入5-40mg/mL浓度松花粉多糖，加入终浓度为体积分数千分之二的甲醛于37℃灭活48h，作为最终的抗原液；之后按照质量比为1:1将抗原液与商品化的白油佐剂充分乳化，制作获得鸭圆环病毒-腺病毒二联灭活疫苗；

其中所述的机械乳化法采用设备为胶体磨、均质机或匀浆机完成，以混合物的特性达到上述标准为宜。

6.利用权利要求1所述的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗制作卵黄抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)用制备的灭活疫苗分4次对开产前1个月的蛋鸡进行免疫,每次免疫间隔2周；前期4次免疫完后，后续每隔1-2个月免疫一次，每次免疫剂量为1.0-2.0mL/只；

(2)第4次免疫后两周开始收集免疫蛋，持续收蛋过程中保持每隔1-2个月免疫一次；用蛋黄分离器将将卵黄与蛋清分离，卵黄与预热到30℃-37℃纯净水按体积3-5:1混合稀释蛋黄液,搅拌均匀后得到卵黄稀释液,于30℃-37℃条件下预温1h；

(3)向蛋黄稀释液中加入质量分数为3-4％的PEG6000，与蛋黄混合后充分搅拌均匀，静置4-6h，充分反应；

(4)将反应后的上清液抽出，用100-200目滤网粗滤，其中先用100目，再用200目过滤；

(5)将过滤的上清液装入无菌桶进行二次沉淀，时间为24-48h；

(6)将二次沉淀的上清液抽出，用200目滤网先粗滤一遍，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；除菌后的上清中加入体积分数为千分之一的甲醛作为防腐剂，即精制卵黄抗体，且经检测抗鸭圆环病毒和腺病毒抗体的琼扩试验效价最低应不低于1:64；

(7)在无菌条件下将滤液分装于无菌疫苗瓶中,盖好胶塞,轧铝盖,贴上标签,保存备用,保存温度为4-8℃。

7.根据权利要求6所述卵黄抗体的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中前期4次免疫完后，后续每隔1.5个月免疫一次；

步骤(2)中的稀释体积比为3.5:1，温度为35℃；

步骤(3)中的PEG6000添加量为3.5％；其中PEG6000可预先用少量温水溶解。

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