CN108912227B - 一种抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用，所述卵黄抗体是以灭活的保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒作为抗原制备的疫苗免疫蛋鸡，然后从高免鸡蛋蛋黄中提取纯化得到。本发明制备的卵黄抗体的安全性好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部或全身不良反应；而且能够有效的预防和/或治疗新型鸭呼肠孤病毒的感染，具有很好的商品化开发前景。

Description

一种抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用。

背景技术

呼肠孤病毒的基因组为双股分节段的RNA，1978年国际病毒分离委员会(ICTV)将其定为呼肠孤病毒科(Reoviridae)，包括呼肠孤病毒属、环状病毒属和轮状病毒属。呼肠孤病毒(Avian reovirus)首次在鸡的呼吸道内分离得到，感染易感鸡后，可表现为肌腱炎、滑膜炎和呼吸道疾病等症状。ARV可感染鸡、火鸡、鸭、鹅、鹦鹉、鸽子等禽类，可引起鸡的病毒性关节炎、腱鞘炎，同时也是其他病的病因，包括心肌炎、心包炎、心包积水、肝炎、胸腺萎缩、呼吸道病以及生长受阻等。

2017年起，我国山东、河北、河南、安徽及江苏等地鸭大范围爆发以脾脏坏死为主要症状的传染性疾病，该病主要引起各个年龄阶段鸭脾脏肿大、出血和坏死，导致种鸭产蛋和肉鸭体重的下降，料肉比升高，肉鸭出栏合格率显著降低，对肉鸭以及种鸭养殖业造成严重经济损失。

经研究发现，该病的爆发是由一种新型的鸭呼肠孤病毒感染所致，目前尚无疫苗可以进行预防，常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins)，简称为IgY。与血清抗体相比，卵黄抗体具有很多独特的优点：(1)无需采血，只需采集免疫高免鸡蛋卵黄纯化即可纯化得到卵黄抗体；(2)有良好的稳定性，耐热耐酸，且常温下仍能保持一定的活性；(3)治疗效果明显，特异性强，且可适应大规模生产；(4)安全、高效、无残留、温和环保。但由于该病在我国属于首次报道，目前尚无商品化的疫苗及抗体上市，用于该新型鸭呼肠孤病毒的紧急预防和早期感染治疗的卵黄抗体更是未见报道；而且，卵黄抗体是通过对蛋鸡进行免疫获得，但是免疫蛋鸡产生的免疫应答难以被预测，因为有很多因素影响免疫效果，最主要的影响因素有抗原(包括剂量和分子量)、佐剂的种类、免疫程序等，再加之卵黄中含有大量的脂质，给使用带来许多不便，这也制约了防治该新型鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体的研制与应用。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体，用于预防和治疗鸭群爆发的以脾脏坏死为主要症状的新型鸭呼肠孤病毒感染，从而弥补该疾病造成的严重经济损失。

本发明的另一目的是提供该抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体的制备方法。该制备方法易于操作，适合大规模生产；而且制备的卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性强，无药物残留，温和环保，对新型鸭呼肠孤病毒感染的预防及治疗极具应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明是基于从具有脾脏坏死症状的患鸭脾脏组织中分离得到的一株新型鸭呼肠孤病毒，保藏编号为CCTCC NO：V201843，保藏日期为2018年7月18日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学，分类命名为新型鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18株。在该分离株的基础上，研制了能够防治该新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗，利用该灭活疫苗高强度免疫健康蛋鸡，然后分离免疫后鸡蛋卵黄，提取制备卵黄抗体。具体的：

本发明的第一方面，提供保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒在制备预防或治疗鸭脾脏坏死的卵黄抗体中的应用。

进一步的，所述鸭脾脏坏死是由鸭呼肠孤病毒引起的。

本发明的第二方面，提供一种抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体，所述卵黄抗体是以灭活的保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒作为抗原制备的疫苗免疫蛋鸡，然后从高免鸡蛋蛋黄中提取纯化得到。

本发明的第三方面，提供上述卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)用保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒作为疫苗生产毒株，制成灭活疫苗；

(2)用制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；

(3)由高免蛋收集卵黄，经一次灭活、酸化萃取、二次灭活、粗滤、除菌过滤、浓缩和三次灭活后，制备成防治新型鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体。

优选的，步骤(1)中，所述灭活疫苗由如下方法制备而成：

将保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒接种SPF鸡胚，收集24-120h内死亡鸡胚尿囊液，获得病毒液；将病毒液浓缩至病毒含量≥10^5.0ELD₅₀，浓缩后的病毒液经甲醛灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将水相和油相按体积比1:1混合，乳化，制得灭活疫苗。

优选的，步骤(2)中，用制备的灭活疫苗分4次对产蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周。免疫途径为颈部皮下或肌肉注射灭活疫苗。

优选的，步骤(3)中，所述一次灭活具体为：将卵黄液与水按体积比1:(0.5～1.5)混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60～65℃条件下保温25～35min。

优选的，步骤(3)中，所述酸化萃取具体为：向卵黄稀释液中加入所述卵黄稀释液体积2.5～3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后过滤收集滤液。进一步优选的，所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.8-5.2；更优选为5.0。

优选的，步骤(3)中，所述二次灭活具体为：向酸化萃取后的滤液中加入辛酸至终浓度3.5～4.5％，搅拌30-120min，搅拌后于2～8℃放置4～8小时。

优选的，步骤(3)中，所述粗滤具体为：先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清。进一步优选的，所述滤布是丙纶750B滤布。

优选的，步骤(3)中，所述除菌过滤具体为：用0.22μm滤膜过滤除菌。

优选的，步骤(3)中，所述浓缩具体为：利用30～50KD的PES中空纤维超滤膜在2～8℃条件下进行浓缩，至抗体效价不低于1:512。

优选的，步骤(3)中，所述三次灭活具体为：加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.1％，37℃灭活16h。

本发明的第四方面，提供上述卵黄抗体在制备用于预防和/或治疗鸭呼肠孤病毒感染的制品中的应用。所述鸭呼肠孤病毒的保藏编号为CCTCC NO：V201843。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用从发病鸭坏死脾脏内分离得到的一株新型鸭呼肠孤病毒，该新型鸭呼肠孤病毒株具有优异的免疫原性，能够在鸡胚中稳定的传代，针对当前地方流行的以脾脏坏死为主要症状的新型鸭呼肠孤病毒感染具有更好的保护性。

(2)用保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒作为疫苗生产毒株制备灭活疫苗来免疫蛋鸡，可以高效的获得卵黄抗体，该卵黄抗体的安全性好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部或全身不良反应；而且能够有效的预防和治疗新型鸭呼肠孤病毒的感染，具有很好的商品化开发前景。

(3)本发明对卵黄抗体的制备工艺进行了优化，收集高免鸡蛋卵黄后先进行初步灭活，而后以醋酸盐缓冲液进行酸化萃提，再以辛酸作为灭活剂和萃提剂进行二次灭活，在此基础上进行过滤澄清、过滤除菌，最后经超滤浓缩后以甲醛进行三次灭活，最终得到卵黄抗体溶液。以上通过酸化水-辛酸方法有效降低了终产物中脂类的含量，降低了不良反应的风险，同时超滤浓缩步骤有助于保证溶液中抗体效价，提高保护率；较高的抗体效价在未来临床应用时需要较高的稀释倍数，从而间接降低了杂质含量，进而提升安全性。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，2017年起，我国山东、河北、河南、安徽及江苏等地鸭大范围爆发以脾脏坏死为主要症状的传染性疾病，对肉鸭以及种鸭养殖业造成严重经济损失。目前尚无能够有效控制该新型鸭呼肠孤病毒感染的药物和方法。本申请发明人从发病鸭坏死的脾脏组织中分离出一株病毒，并从病原生物学、动物回归试验、基因组特性及分子水平上首次证实了该病原是一种鸭呼肠孤病毒，命名为鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18。

本发明采用市售的商品化鸭呼肠孤病毒疫苗进行防治，但无法对该传染性疾病实现很好的防控。由于禽呼肠孤病毒为RNA病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性等方面存在一定的差异，在遗传进化时容易发生变异，由此推测鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18发生了变异，使之不同于以往分离的鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒和禽呼肠孤病毒。

本发明对上述新分离的鸭呼肠孤病毒N-DRV-XT18进行了全基因组测序，并分别将10个基因片段与现有报道的禽呼肠孤病毒进行了序列比对和同源性分析，结果发现，新分离毒株N-DRV-XT18的10个基因片段中L1、L2、L3、M1、M2、S3、S4均位于一个相对独立的分支中，且与目前已经上传在Genbank中鸭源呼肠孤病毒序列变异性较大，说明新分离的毒株N-DRV-XT18确实不同于其他的禽呼肠孤病毒，可以认定本发明中所发现的鸭呼肠孤病毒与现有已经报道的鸭呼肠孤病毒存在较大变异，为正呼肠孤病毒属的1个新的单独种。因此，本发明将该新型鸭呼肠孤病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201843。

由于疫苗免疫是以预防为主，免疫后产生抗体所需时间长，在鸭群发病时难以进行及时、快速治疗。基于此，本发明通过分离的新型鸭呼肠孤病毒来制备疫苗免疫蛋鸡，采集高免鸡蛋制备卵黄抗体，以用于新型鸭呼肠孤病毒的紧急预防和早期感染治疗。

在本发明的一个实施方案中，给出的抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体由如下方法制备而成：

(1)取保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒高免鸡蛋卵黄，搅拌均匀得到卵黄液；

(2)将步骤(1)所述卵黄液与水按1:(0.5～1.5)(V/V)比例混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60～65℃条件下保温25～35min；

(3)向卵黄稀释液中加入所述卵黄液体积2.5～3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后滤布过滤收集滤液；

(4)向步骤(3)所述滤液中加入辛酸至终浓度3.5～4.5％(V/V)，搅拌后于2～8℃放置4～8小时；

(5)取步骤(4)放置后的溶液过滤至滤液澄清，收集澄清滤液；

(6)取步骤(5)所述澄清滤液过滤除菌，而后加入甲醛至终浓度0.1％(V/V)，于35～37℃灭活12～20小时。

作为优选，步骤(1)所述的新型呼肠孤病毒高免鸡蛋是利用新型呼肠孤病毒灭活疫苗分4次免疫母鸡后所产鸡蛋，每次免疫间隔2周；进一步优选，所述免疫途径为颈部皮下或肌肉注射新型呼肠孤病毒灭活疫苗。本发明通过大量的试验最终发现，采用上述的免疫方案进行免疫，所产生的抗鸭呼肠孤病毒的抗体水平最高，且能够持续、稳定的表达。

作为优选，步骤(1)所述新型呼肠孤病毒高免卵黄液中，新型呼肠孤病毒抗体效价不低于1:1024。

作为优选，步骤(1)中先对所述高免鸡蛋进行蛋壳消毒，而后收集卵黄；进一步优选的，所述消毒方法为先以1％新洁尔灭溶液浸泡消毒15min，蛋壳干燥后再喷洒75％酒精至蛋壳表面。

作为优选，步骤(1)中所述的水，是先于80℃保持30min，而后冷却至65℃以下的注射水。

作为优选，步骤(2)所述的醋酸盐缓冲液pH值为4.8～5.2，更优的是5.0。

作为优选，步骤(3)所述的搅拌，其持续是30～120min，更优的是90min。

作为优选，步骤(3)所述的滤布是丙纶750B滤布。

作为优选，步骤(4)所说的搅拌，其持续时间是30～120min，更优的是90min。

作为优选，步骤(5)所述的过滤是先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清；进一步优选的，所述滤布是丙纶750B滤布。

作为优选，步骤(6)中用于过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。

作为优选，步骤(6)除菌后的澄清滤液中新型呼肠孤病毒抗体效价不低于1:512。

作为优选，步骤(6)中除菌后先进行超滤浓缩，而后再加入甲醛灭活；进一步优选的，所述超滤浓缩是利用30～50KD的PES中空纤维超滤膜实现的；进一步优选的，所述浓缩是在2～8℃条件下进行的。

在以上技术方案中，收集高免鸡蛋卵黄后先进行初步灭活，而后以醋酸盐缓冲液进行酸化萃提，再以辛酸作为灭活剂和萃提剂进行二次灭活，在此基础上进行过滤澄清、过滤除菌，最后经超滤浓缩后以甲醛进行三次灭活，最终得到卵黄抗体溶液。以上通过酸化水-辛酸方法有效降低了终产物中脂类的含量，降低了不良反应的风险，同时超滤浓缩步骤有助于保证溶液中抗体效价，提高保护率；较高的抗体效价在未来临床应用时需要较高的稀释倍数，从而间接降低了杂质含量，进而提升安全性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。本发明实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；本发明实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1：新型鸭呼肠孤病毒的发现和鉴定

1.病毒分离：

(1)细胞株选择了对呼肠孤病毒较易感的LMH细胞系，将实验室冻存的LMH细胞系进行复苏，培养至细胞状态良好，适合病毒接种以备用；

(2)取送检的有严重脾坏死症状的患鸭脾脏按1:5(W/V)比例加入灭菌生理盐水进行匀浆处理，将匀浆液反复冻融3次，6000rpm离心15min，取上清液备用。上清液中加双抗(青霉素、链霉素)各8000U/mL，置于4℃过夜。取上清液用滤器过滤细菌等物质，获取原始病毒混合液，将混合液接种易感细胞株LMH传代，传至5代分离到有细胞病变的病毒液。最终得到一株稳定的毒株，将该毒株命名为N-DRV-XT18。

2.病毒鉴定：

采用二代测序技术对毒株N-DRV-XT18进行全基因组序列测定，全基因组序列中L1、L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2、S3、S4这10个基因片段的序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.10所示。然后与现有技术中已公布的禽呼肠孤病毒序列进行同源性比对，结果发现，毒株N-DRV-XT18的10个基因片段中L1、L2、L3、M1、M2、S3、S4均位于一个相对独立的分支中，说明新分离的毒株N-DRV-XT18不同于其他的禽呼肠孤病毒，为正呼肠孤病毒属的1个单独种。

将该病毒进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201843。

实施例2：灭活疫苗的制备

(1)病毒增殖程序：将实施例1分离的新型鸭呼肠孤病毒株按照0.2ml/枚的剂量接种9日龄健康SPF鸡胚，弃去24h内死胚，收集24～120h内死亡鸡胚尿囊液，获得病毒液，-20℃保存。

(2)病毒液浓缩：将收获的病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无菌生长，并留样备测毒价。病毒液每0.1ml病毒含量应≥10^5.0ELD₅₀，浓缩后的尿囊液随即进行灭活。

(3)灭活：将浓缩后的病毒液导入灭活罐中，加入10％甲醛溶液使其终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃密封灭活24小时(以罐内温度达到37℃开始计)，其间每隔4～6小时搅拌一次，灭活后，置于2～8℃保存备用。

(4)灭活疫苗制备：

1)油相制备：取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加Span-80 6份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

2)水相制备：将灭活后检验合格的病毒液96份加入4份灭菌Tween-80，开动匀浆机搅拌20～30min，使Tween-80完全溶解。

3)乳化：油相与水相比例为1:1(V/V)，先将油相导入胶体磨，2500转/分钟搅拌，缓慢加入水相，加完后10000转/分钟乳化5分钟。在终止乳化前按疫苗总量0.01％加入硫柳汞，充分振荡混匀。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

无菌分装后，轧盖贮存于2～8℃。

对制备的灭活疫苗进行包括：剂型、离心稳定性、粘度和无菌的质量检验，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。

结果为：本发明制备的灭活疫苗的剂型为油包水型(W/O)；离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。

实施例3：新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备

1.采用灭活疫苗免疫产蛋鸡：

将实施例2制备的新型呼肠孤病毒灭活疫苗免疫蛋鸡，首次免疫每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，14天后进行第二次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，二免后14天进行第三次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，三免后14天进行加强免疫,每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，加强免疫之后14天，采集卵黄测定新型呼肠孤病毒中和抗体效价应≥1:1024。

2.卵黄抗体制造：

(1)蛋壳消毒：收集高免鸡蛋浸泡于1％新洁尔灭溶液中15min。取出后自然晾干或吹干后，喷洒75％的酒精对蛋壳表面消毒备用。

(2)卵黄分离：采取机械打蛋方式，打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

(3)灭活Ⅰ：将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水(注射用水先经80℃30min消毒，并冷却至65℃以下)，搅拌混匀后，60～65℃保温(灭活)30min。

(4)酸化萃提：先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄3倍体积的pH值5.0的醋酸缓冲液，然后加入卵黄液，开启搅拌机，充分拌搅30分钟。

(5)灭活Ⅱ：卵黄液液中加入终浓度(V/V)为4％的辛酸作灭活剂和萃提剂，剧烈搅拌90min，2～8℃放置4～8小时。

(6)粗滤：用丙纶750B滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

(7)除菌过滤：用0.22μm滤膜过滤除菌。置2～8℃存放，应不超过14日。同时取样检测新型呼肠孤病毒的中和抗体效价。

(8)浓缩：如检测的新型呼肠孤病毒的中和抗体效价低于1:512，应将除菌过滤后的卵黄抗体在2～8℃条件下，用30～50KD的浓缩膜包进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩后的新型呼肠孤病毒中和抗体效价应均不低于1:512。

(9)灭活Ⅲ：将浓缩后的溶液导入灭活罐中，计量加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度(V/V)为0.1％，37℃灭活16小时。

(10)分装贮存：在无菌条件下将灭活好的滤液分装于无菌玻璃瓶中，盖好胶塞，轧铝盖，贴上标签，保存备用，保存温度为-20℃。

实施例4：卵黄抗体质量检验

1.安全性检验：

用1-3日龄易感雏鸭(新型鸭呼肠孤病毒母源抗体均＜1:4)10只，各肌肉分点注射本发明实施例3制备的卵黄抗体2.0ml，观察14日，易感雏鸭全部健康存活，说明本发明的卵黄抗体的安全性好。

2.无菌检验：

按照《中华人民共和国兽药典》(2015版)进行，结果为：无细菌、支原体和外源病毒污染。

3.效力检验(免疫攻毒法)：

1日龄易感雏鸭(新型鸭呼肠孤病毒母源抗体均＜1:4)20只，随机分为A、B四组，每组10只。其中，A为免疫组，颈部皮下或肌肉注射实施例3制备的卵黄抗体，每只0.5ml；B为攻毒对照组，皮下或肌肉注射生理盐水，每只0.5ml。隔离饲养。

16小时后，A、B两组雏鸭分别肌肉注射用生理盐水做10倍稀释的新型鸭呼肠孤病毒(保藏编号为CCTCC NO：V201843)，每只0.5ml。攻毒后观察10日，记录每组雏鸭发病、死亡情况。

结果：A组攻毒后10/10保护；B组攻毒12小时后开始发病，10日内死亡7只。

实施例5：卵黄抗体的应用

1.在对新型鸭呼肠孤病毒预防中的应用

以1日龄易感雏鸭(新型鸭呼肠孤病毒母源抗体均＜1:4)30只为试验对象，随机分为三组，每组10只。其中：

试验组：颈部皮下或肌肉注射实施例3制备的卵黄抗体，每只0.5ml；

对照组：以目前市售的禽呼肠孤病毒灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，并按实施例3的方法制备得到卵黄抗体，颈部皮下或肌肉注射该卵黄抗体，每只0.5ml；

空白对照组：皮下或肌肉注射生理盐水，每只0.5ml。

将上述三组雏鸭隔离饲养，16小时后，分别肌肉注射用生理盐水做10倍稀释的新型鸭呼肠孤病毒(保藏编号为CCTCC NO：V201843)，每只0.5ml。攻毒后观察10日，记录每组雏鸭发病、死亡情况。结果见表1。

表1：

组别	攻毒毒株	预防保护
			试验组	新型鸭呼肠孤病毒	10/10
对照组	新型鸭呼肠孤病毒	4/10
			空白对照组	新型鸭呼肠孤病毒	1/10

注：预防保护为攻毒后健康存活雏鸭数/雏鸭总数。

由表1可以看出，本发明的卵黄抗体具有极佳的预防保护效力，对于该新型鸭呼肠孤病毒能够提供100％的预防保护，保护效力优于采用现有的灭活疫苗制备的卵黄抗体。

2.在对新型鸭呼肠孤病毒治疗中的应用

在新型鸭呼肠孤病毒感染发病区，症状为脾脏坏死，以病程相近的30只雏鸭为试验对象，随机分为3组，每组10只，全部隔离饲养，其中：

试验组：颈部皮下或肌肉注射实施例3制备的卵黄抗体，每只1.0ml；

对照组：以目前市售的禽呼肠孤病毒灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，并按实施例3的方法制备得到卵黄抗体，颈部皮下或肌肉注射该卵黄抗体，每只1.0ml；

空白对照组：皮下或肌肉注射生理盐水，每只1.0ml。

观察10日，记录每组雏鸭病情、死亡情况。

结果为：试验组注射卵黄抗体2天后，患病雏鸭的采食量开始增加，精神状态明显好转，10日内未有雏鸭死亡；10日后将其中1/2的雏鸭扑杀并解剖，结果发现患病雏鸭脾脏坏死症状已基本消失。对照组注射卵黄抗体后，患病雏鸭的采食量和精神状态未有显著好转，从注射卵黄抗体第5日开始有患病雏鸭死亡，10日内患病雏鸭的死亡率为50％；10日后将存活的雏鸭的1/2扑杀并解剖，结果发现患病雏鸭脾脏坏死症状少量存在。空白对照组的患病雏鸭10日内的死亡率达60％。

以上试验结果表明，本发明的卵黄抗体安全性好、预防效果好、治愈率高，可以用于新型鸭呼肠孤病毒感染的预防和治疗，具有重大的经济和社会效益。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用

<130> 2018

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3959

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的L1基因

<400> 1

gctttttctc cgaacgccga aatgagttcg cgcaaagtgg ctagacgtcg tcataaggat 60

gctaccgaca ctaaagattc taagtacact gataaagata agtcctcagc cacaactact 120

gaaacgaagt ccgtcgactc cactaacaag agtgtaagcg ctccaaaatc tgatactcca 180

gcagcatcaa caccatcctc tacagatggc gcttctcagg ttgcagtcgc taaacaaacc 240

aatgataatg acgcttcttc taaagattct tcccctaaac caactgtcac tcccgacgga 300

aaggatggaa tgcatggtgc ggttaaatct caagacgcta aagctaccat tgctgttgat 360

gataacaagg acagggacgt ggtcttcggt ggcaagggtt caggtgataa aaatgctatt 420

acaaagactg ggtccgtgga taatgatggt ggtgttaaaa cgataccggc taaggatact 480

actatcgcat ccgctaaagc catgatggaa cagaaacagt tagttgcggg tcttccgaag 540

cagccaaaac ctgccagcca tctatgcact gtttgcatgg ctcaattcgc ttcagctgat 600

gcattgacta tacaccaaac aactcattcg attggatcca acgctgcact gactagcttt 660

tcgatctcta ccgccgttga ggagttcatt caatcttggg cctcggctac ttccactgct 720

aatactaaaa cagcactaac tgtggcggac gttgattctt taatgatgac tgaagggata 780

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caccagaatc cgtggatatc cacaattaca tagtctacgt ggactgcttt gttggtgtgt 480

ccgctcgaca agcggcttct aattttcagc agcacgttcc agtcatcacc aagtcaagaa 540

tgacacagtt catgacgtcc gcgcagaata tgcttcaggt ccttggccca tgggaacatg 600

acgttcgtga gcttctcacg atattgccga cttctaccac tgcaggcaag atcacttgtg 660

acatgaaatc cgtggttaac tttgtcaacg accagctctc tgacacaaat ttatgccgtc 720

tctatcctga atgtgctgct tcgtctgtag ctaaacgtaa tggcgggata cgatggaagc 780

aacctgacac tgacgaggct ccctcccttg caactaacga tatcgccgct tccacgatgg 840

gtgcgcttgc taacaccacc cccctggctg agaagtctaa ttctggtgaa gagtctatgc 900

gtttagtcaa cgacgtaggt gtggatatca tctgttctag agcgccagtc agctcctcag 960

tgtggtcacg tactgttgag ccaaaatcgt ataacatcag gacactccgc gtggaagaag 1020

cgctttggtt gcgggaatgt cagacatcta atggttttga cgttcagtac actctgccag 1080

atcagacaac tcataagcat ttctggcttc aacaaggttc cacagtgatt aacttggagc 1140

agacgggcgg catgatgttt gaggtgaata tctctggtaa agactacaag aagggcactt 1200

ttgatccaga taaccagaag ttggtgctcc tagttatgca atccaaaata ccttttgagt 1260

catggacttc cgcagcacag attactggta tagctcaagt ggctgaagtc actgtacacg 1320

ccgccgacag ctcgacacct ggtcggaaaa tcattggtga gacatcgtta tcgtatctgt 1380

ttgaaagaga gaccgttact acagctaaca ccgaggtgaa cacctacctc ttttgcacgt 1440

ggcaacttga cgatgctcag agtaatggcg acaatgcttg gcaggatgcg tgggatggta 1500

ttaccacttt gaccccactc acttcaggca ccgtgacggt taagggtacg tctgtggact 1560

ctgtcgtgcc gactgactta gtgggctctt atactcctga agctctggct gctgcccttc 1620

caaacgacgc cggacgtatt ctcgccaata aggctattaa gctggctgat gctatcaaga 1680

aagaggatga ttctgtcatt gacgagtctt ctccattcag cacccccatt cagggagtcc 1740

tcgccgtcca acagctagat accgttggga cacgtggtgt gcgtatcatc caacctccct 1800

cctttctgaa acgtgtcgct tcacgtgctc ttcacatgtt cctcggcgac cctcagtcca 1860

tcttgaagca ggcgacaccc gttcttcgag acccggacgt ttggactggc ttcatccaag 1920

gagttcgtga tgggatccgc accaagtctc tttccgctgg agttagatct gtctacaaca 1980

acgtcaccgc aactcaatca gtgcagacct ggaagcaggg atttctgact aagatacaga 2040

cgttgttcag accatagtga ggtgctaagg cctctctgcg cggcgggtcg gtgggcacgt 2100

cgcgttgatg ctgaatgcac ggggaggtga cgctctctgg gttagcacgt tactcatc 2158

<210> 6

<211> 1996

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的M3基因

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

nnnntttgag tcctagcgtg gatcatgtcg tcaaccaagt ggggagacaa accgatgtcg 60

ctctcaatgt ctcatgatgg gtcgtccatc cgttctgctg catcacaatt tttgtcggtt 120

ccattgtccc actccactcc tattccacct caacggaaga ctgtgcttct gaagttcatg 180

ctcggcgaag atctggttac cgttcagggt actctggctc cgtttgatga ctactggttc 240

gataatcaac ccctgctttc ccaggctgtg gaactgttgg catctgagga ccgtctacgt 300

aattttgagc attatgagaa gtttcttctc aagaagggtc atcagctacc ggagattatg 360

aacagactgc gtttattctt cactgatgtg ttgaaggtga aaatggaagc tgacaatcta 420

ccgtcccttg ctcaatattt gatggctgga accatggatg ccgtttctac tggtcaccct 480

cccggcgcct ctgtgccaga cgtctctaaa gtggtagcta agcagcaaac gatctctaaa 540

tcgcccggtc gtttggatga ggaagagtat aacgtaatac gttcacgctt cttaactcac 600

gaggtatttg acctgtcatc cgatctccca ggtgtccaac cctttctgga catgtattat 660

gctaccgttc cacgtgctga tgctactggc tggtgcgctt cacgacgcaa agggttactt 720

gttcacgctc ctggcgaacg tttcgaggat ctaaccatat ttgccactga tacctctcta 780

ccaaatgagc tcatattaac ggcaggtgat gtcactgtag cgcgctttga ccttcttgac 840

gtgtccggga tagcccctca acatcacgct tcagtccaag aagagcgtac tgttggaacg 900

agtcggtatt cagccattac tgcaaacgat caccctttgg tgttcttctc tccctcagcc 960

attcgttggg cgattgatca ttcgtgcact gattcgctca tttctcctcg gaatatcaga 1020

gtgtgcgttg gcatcgaccc gttgattacc cgttggacgc gcgatggtgt gcaagaagct 1080

gctattctga tggatgacaa gctcccgtct gtcggtcgcg ctcgcatggc tctcaggaca 1140

ttgactctcg ctcgtcggtc gccgatgatt tctttcatga ttggagcgtt gaagcactca 1200

ggtggtcaac tcatggaaca ctatcgatgt gacgcagcta atcgatacgg ttcgcccacg 1260

gtgccagcct ctcaccctcc accctgcgct aagtgcccgg agcttagaga acaaatcacg 1320

aggctatctt ctcaacccgt cgccaattca caacctctgg ccggtccagc tgctctgctg 1380

tcgaagatct ctgaattgca acgcctcaac cgggaattgt ctctgaagtt ggcagatgtt 1440

caaccggcac gtgaagacca tctcctagcg tatttgaacg agcatgtgtg cgtgaacgcc 1500

aaggatcatg agaaggacct ccttgcccgt tgcaatgtgt ctggtgactc agtcaatacc 1560

gtcgtcgccc agagagctaa gaatcgtgac aggtttgagg cccgcttgcg tcaggaagcc 1620

aacgctgaat gggagccccg catggctgca ctaaatcaag agctcacaca atcacgcgct 1680

gaacagcagg agatgatgac gcaggcgctg caatacctca acgagcgtga cgaattggct 1740

caagagttgg atgagttgaa acgggagatc actactctga gatctgcgaa cgtgaggttg 1800

aatgctgaga accaccgaat gagtcgagcg accagagtgg gtgattcttt tgtcagtgat 1860

gtcctctcga cgccttccga cgttccacga acttctgcac cttccatgga tgacctggtg 1920

gacgacctgt gagctttgac ctgtgactcg gtttctctct gactccatga ccccacggcg 1980

gactcggtta tccatc 1996

<210> 7

<211> 1568

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的S1基因

<400> 7

gcttttttct tctctgccca tggctgacgg tgcatgcaat cacgctactt ctatttttgg 60

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gactgattct gccgtgacaa ctttgcttcg tgatgtcact cccgccaacc ccgatcctgt 300

tcaagtcgtt taaagtccac tcgtggcgtc ttttgtccca atccccgttc cacgttcagt 360

tctgcgacgc aggactccaa tcctacgacg tctattcacg tttcccttct gtgtgtgacc 420

tttcgctctg ttattatctt aatacacctt tcgagtttgg aattgctgct atagaggggc 480

gtcccggtga ctattatttg ctgttcgctg gcaagtccag tgactctaac tcacgagtat 540

ctttgtacgc tacgcggcaa gccggtgacg atggatcgca acgaggtgat acgcctgata 600

ctttccctcc tcccctacca gtcaagcgac gtcgatcatt tgacgacaca gatcaaatcc 660

ctccaaagcg ccgtcgactc actgaaagaa tcacaagtgg tagtgttgag acgcctgact 720

acgattacgt cgacggtggc ggatctacaa tcaacaactg aattgttgac ctcacaggtg 780

gcaggactta gttcccgtgt ggcttcagtg actgatgagg tagtccgtgt aaattcagtg 840

attggaacta cgatcactaa tcttgacaat gtccggtccg agctatcctc tctctcctcc 900

caagtctcgt cgcagacgtc cactctaacg aatcttacat caaccgtttc atcccagtct 960

cttgcgattt ctgatctcca gcgacgagtt acggccttag aacgatcggg tggtgcgccg 1020

acacaatttg aagctccctt gcacctacaa aacggagtcg tctcactcca agcatctccc 1080

tctttctgtt ctttgtctcc gatcctctcc ggacctgctg atgctgctgt tttcaaggtt 1140

ggtgagtggc tgggaactgt catatctggt caaagtcagt catctgcaat catgaacgtg 1200

cggattcatt catttgggca gcggaccatg ttgcttatgt cttcgcaaaa tgtattcact 1260

attccgccag gttcgggtgc gtctttgcag ctagatgtga atcgtataac gacccctgcc 1320

attgacgctg ctatggtaac tccttccgct gcttttgctt ctgcttcctt tatggctgac 1380

atagctttca aagactctaa gacaggagaa gtccatgctt tacacactac tggctctttt 1440

cgatcacctt ctttctctat cgtttgggtc ccggttgctt cggaaactcg taattatcaa 1500

ataatggcgt tacgcttcac cgtcgccacg ggctaggctg tggcgcgcaa tgagaagagc 1560

tattcatc 1568

<210> 8

<211> 1324

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的S2基因

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1323)..(1324)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

nctttttctt ccacgatggc gcgtgccgtg tacgactttt tatctacgcc tttcggtaac 60

cgtggtctag caactaaccg tactcaactg tcgtcactac tgtcaagttc aaattcgcca 120

tggcaacgct ttttgtccgc cttaactcca ctgaccgctc caggcattgt ttcaacccct 180

gaggcaccct acccgggttc atcgttatac caggagtcca tgcttcacag cgctactatc 240

cctgggattc taggtaatag agacgcgtgg cgcaatttca acgtattcgg cttttcatgg 300

acagatgaag gtttgtcagg acttgtcgct gctcaggacc ctcctccagc tccaccgtac 360

caaccagctt cgggacagtg gtctgatctg cttcagtatc ctcgatgggc taatcgtcaa 420

cgtgagttgc agtctaaata tcccattctg ttgagatcta ctttgctttc agctatgcgc 480

gctggaccgg tgttgtacgt tgagacttgg cccaacatga tttctggtcg acttgctgac 540

tggttcatgt cgcagtatgg aaacaacttc gttgacatgt gtgcacgatt aactcagtcc 600

tgcatgaaca tgccagttga gccggatggt aattatgacc agcagatgcg agcattaatt 660

agtctgtggc tcctctcgta tattggcgtt gtgaatcaat ctaacactat taacggcttc 720

tactttgctt ccaagacgcg tgggcaggct atggataact ggacgctgtt ctatgctacc 780

aacaccaatc gggtgcagat tactcagcgc cactttgcct acgtttgcgc tcgctccccc 840

gactggaatg tcgataagtc ctggatcagc gctgccaatt tgactgccat tatcatggct 900

tgccgccagc cgccagcctt tgccaaccag ggggtaatca accaggccca gaatcgaccc 960

ggattctcga tgaatggtgg aacgcctgtg cacgagctga acctgctgac taccgctcaa 1020

gcttgtatcc agcagtgggt cgtagctggt ttgatctcag cagctaaggg tcagtccatg 1080

acgcaggagg cgaatgactt ctcgaacctc atccaagccg atcttgggcg gatcaaagcg 1140

caagatgacg cgttgtacaa ccaacaacct ggttacgctc gtcgcattaa gccgtttgcc 1200

aacggagatt ggacgcctgg aatgactgcg caagcattag ctctactagc cacttttacc 1260

gtctaggcgt agggtcgtac gctgcctgag tccagccctc cggcagcacg tggacgtact 1320

cann 1324

<210> 9

<211> 1202

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的S3基因

<400> 9

gctttttgag tccttagcgt gcaagccgca atggaggtgc gtgtgccaaa ctttcactcc 60

tttatcgaag gtattactac tagttacttg tgttctcctg cgtgctggaa ttcgaagacg 120

ttatgggata ttgaagaatt tcacacacct gacgttatca gggtcggcaa cgcttattgt 180

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ccacatcaca agtgtcatca acagcaatat cgtactgaga ctccgctcat gagatatatt 300

aaggtgggtc gcactacaga gcaactgctt gatcaatatg ccattgctct gcatgtcatt 360

gcagattact atgatgaggc gagtaagcaa cctcatgata ttgctgaagc tgagtcaatc 420

gcaccatttg atatcgtaac caggactgaa tctattcgca gtgaccgtgc cgttgacccg 480

gaattctgga cttatccgtt agagaggcga ggatacgacg cgcgacatga gattgctaga 540

gcgggttgga agatgatcga tgcttcatcg cgaagtcaca ctcttcctga atgtctggtg 600

tcaaatatgc tacatactag gcatgtcttc agccaaatgt tgaccacgac aaccatctat 660

gatgtcgctg tcacgggtaa ggccgttaaa ttcagtccga tggtagcaac catgccaact 720

cgaggagatg gtgctgtggc tctgtcaaga ggtaacttgg atcatgatgt cgaggactgt 780

tggatggatg gttttgcatt ctcccccctc atcggcggtg ttggcatcac tggtcaattt 840

gagcgtggtt cctgccataa ttttgggcac cccatgattg ggagcggtaa gaaagcttct 900

cactaccgca atttgttcat ggaatcctgg cgtggatggt caaagtcgtg ctttacatgt 960

gctgcaggga tggagcccgc ggagtgcgaa tctaggctgc gaggccacgc cagaactatg 1020

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tccgcgccat taaagaaggc cacgaaattg tccttcctgg agtgtaggtg gtaagcacct 1140

ctgggtcaaa atgcacatag gctcccacct atgtgacggt tagcgggact cacctattca 1200

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<210> 10

<211> 1191

<212> DNA

<213> 毒株N-DAV-XT18的S4基因

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

nnnntttgag tccttgttca gccatggaca acaccgtgcg tgttggagtt tcccgcaaca 60

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ctgtccgttg cttgtccccg cttgctgctc actgtgctga tagaactctt cgtcgtgata 240

acgtcaagaa cattttgacg cgtgatctgc cctttccatc cgatctcatt aactacgctc 300

accacgtgaa ctcgtcctcc ctcaccactt cccaaggcgt tgaagccgct cgtctcgtgt 360

cccaggttta cggggagcaa gttcctttcg accacgttta tccatctggt tcagcaacct 420

actgtcccgg tgccgtcgcc aacgctatct ctcggcttat ggcaggtttt gtgcctcagg 480

aaggtgacga tttcatgccg actggtccaa tcgattatct cgcagctgat cttgtggcgt 540

acaagtttgt tttaccgtat atgttagata tggtggatgg acgtccccaa attgtgctac 600

cctctcacac cgttgaggaa atgttgactg acactggcct gctgaatgct attgatgcct 660

catttggcat tgagtctaaa agtgatcaac gcatgacgcg tgatgctgct gagatgagct 720

ctcgttcgct caatgagtta gagaaccatg aacatcgcgg gcgcatgccg tggaagatta 780

tgcttgctat gatggccgcg caactgaagc ttgaactgga cgcattagca gacgaacgca 840

ctgagtctca ggctaacgct catgttacat ccttcggctc acgtctattc aatcagatgt 900

cagcctttgt gcctatcgat cgtgagttga tggagcttgc tctcctaatc aaagaacaag 960

gctttgccat gaatcctggt caggttgcgg ccaaatggtc gtctattagg aggtccagtg 1020

cagtacgttc cctggcgagt gcgcgtcttg agattcgaaa tgggaactgg atgatccgcg 1080

aaggcgacca gacgctgctg tctgtctctc cagctaggat ggcgtagacg ggacccatgg 1140

tgtgggtgag gggggccacg acctctgcca cgacttggac tcttattcat c 1191

Claims (11)

1.保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒在制备预防或治疗鸭脾脏坏死的卵黄抗体中的应用；所述鸭脾脏坏死是由保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒感染引起的。

2.一种抗鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体是以灭活的保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒作为抗原制备的疫苗免疫蛋鸡，然后从高免鸡蛋蛋黄中提取纯化得到。

3.权利要求2所述卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒作为疫苗生产毒株，制成灭活疫苗；

（2）用制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；

（3）由高免蛋收集卵黄，经一次灭活、酸化萃取、二次灭活、粗滤、除菌过滤、浓缩和三次灭活后制备成防治新型鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述灭活疫苗由如下方法制备而成：

将保藏编号为CCTCC NO：V201843的鸭呼肠孤病毒接种SPF鸡胚，收集24-120h内死亡鸡胚尿囊液，获得病毒液；将病毒液浓缩至病毒含量≥10^5.0ELD₅₀，浓缩后的病毒液经甲醛灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将水相和油相按体积比1:1混合，乳化，制得灭活疫苗。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，用制备的灭活疫苗分4次对产蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述一次灭活具体为：将卵黄液与水按体积比1:(0.5~1.5)混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60~65℃条件下保温25~35min。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述酸化萃取具体为：向卵黄稀释液中加入所述卵黄稀释液体积2.5~3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后过滤收集滤液；所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.8-5.2。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述醋酸盐缓冲液的pH值为5.0。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述二次灭活具体为：向酸化萃取后的滤液中加入辛酸至终浓度3.5~4.5%，搅拌30-120min，搅拌后于2~8℃放置4~8小时。

10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述浓缩具体为：利用30-50KD的PES中空纤维超滤膜在2-8℃条件下进行浓缩，至抗体效价不低于1:512。

11.权利要求2所述的卵黄抗体在制备用于预防和/或治疗新型鸭呼肠孤病毒感染的制品中的应用；所述新型鸭呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201843。