CN108659122B

CN108659122B - 一种防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN108659122B
Application number: CN201810494525.3A
Authority: CN
Inventors: 唐熠; 刁有祥; 姜晓宁
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2018-05-22
Publication date: 2020-04-14
Anticipated expiration: 2038-05-22
Also published as: CN108659122A

Abstract

本发明公开了一种防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法，所述卵黄抗体含有抗鸡呼肠孤病毒株抗体；所述鸡呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201817。本发明制备的卵黄抗体的安全性好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部或全身不良反应；而且能够有效的预防和/或治疗新型鸡呼肠孤病毒的感染，具有很好的商品化开发前景。

Description

一种防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus，ARV)属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属，是引起鸡病毒性关节炎的病原，主要感染肉鸡，肉蛋兼用型鸡也有感染。ARV主要侵害鸡的跗关节、趾关节、胫跖关节及其肌腱，引起关节滑膜炎或腱鞘炎等。患病鸡通常呈现跛行、蹲坐、不愿走动及食欲减退甚至废绝的症状，造成了饲料转化率低、死淘残鸡增多，降低了生产效益，给家禽养殖业造成严重经济损失。自20世纪80年代中期该病在我国首次报道以来我国ARV的感染情况呈现加重的趋势，临床表现也越来越多样化。

2016年，我国山东、江苏等地肉种鸡场和商品代肉鸡场相继以关节肿胀和跛行为症状的疾病。该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡都可以感染，但对商品肉鸡的危害尤为严重。发病初期主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲废绝及营养吸收不良等，随着病程的发展，感染鸡逐渐出现关节肿胀、发炎，不愿走动，跛行等症状；剖检可见关节腔内纤维素性渗出，腱鞘炎，腓肠腱断裂等病理变化，给我国肉鸡养殖业造成严重的经济损失。

经研究发现，该病的爆发是由一种新型的鸡呼肠孤病毒感染所致，目前尚无疫苗可以进行预防，常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins)，简称为IgY。与血清抗体相比，卵黄抗体具有很多独特的优点：(1)无需采血，只需采集免疫高免鸡蛋卵黄纯化即可纯化得到卵黄抗体；(2)有良好的稳定性，耐热耐酸，且常温下仍能保持一定的活性；(3)治疗效果明显，特异性强，且可适应大规模生产；(4)安全、高效、无残留、温和环保。但由于该病在我国属于首次报道，目前尚无商品化的疫苗及抗体上市，用于该新型鸡呼肠孤病毒的紧急预防和早期感染治疗的卵黄抗体更是未见报道；而且由于卵黄中含有大量的脂质，给使用带来许多不便，这也制约了防治该新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体的研制与应用。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体，用于预防和治疗鸡群爆发的新型呼肠孤病毒感染，从而弥补该疾病造成的严重经济损失。

本发明的另一目的是提供该防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体的制备方法。该制备方法易于操作，适合大规模生产；而且制备的卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性强，无药物残留，温和环保，对新型鸡呼肠孤病毒感染的预防及治疗极具应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明是基于从具有关节肿胀、跛行症状的肉鸡肌腱组织中分离得到的一株新型鸡呼肠孤病毒，保藏编号为CCTCC NO：V201817，在该分离株的基础上，研制了能够防治该新型鸡呼肠孤病毒的灭活疫苗，利用该灭活疫苗高强度免疫健康蛋鸡，然后分离免疫后鸡蛋卵黄，提取制备卵黄抗体。具体的：

本发明的第一方面，提供一种防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体，所述卵黄抗体含有抗鸡呼肠孤病毒株抗体；所述鸡呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201817。

本发明的第二方面，提供上述卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)用保藏编号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒作为疫苗生产毒株，制成灭活疫苗；

(2)用制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；

(3)由高免蛋收集卵黄，经一次灭活、酸化萃取、二次灭活、粗滤、除菌过滤、浓缩和三次灭活后，制备成防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体。

优选的，步骤(1)中，所述灭活疫苗由如下方法制备而成：

将保藏编号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒接种SPF鸡胚，收集24-120h内死亡鸡胚尿囊液，获得病毒液；将病毒液浓缩至病毒含量≥10^5.0ELD₅₀，浓缩后的病毒液经甲醛灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将水相和油相按体积比1:1混合，乳化，制得灭活疫苗。

优选的，步骤(2)中，用制备的灭活疫苗分4次对产蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周。免疫途径为颈部皮下或肌肉注射灭活疫苗。

优选的，步骤(3)中，所述一次灭活具体为：将卵黄液与水按体积比1:(0.5～1.5)混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60～65℃条件下保温25～35min。

优选的，步骤(3)中，所述酸化萃取具体为：向卵黄稀释液中加入所述卵黄稀释液体积2.5～3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后过滤收集滤液。进一步优选的，所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.8-5.2；更优选为5.0。

优选的，步骤(3)中，所述二次灭活具体为：向酸化萃取后的滤液中加入辛酸至终浓度3.5～4.5％，搅拌30-120min，搅拌后于2～8℃放置4～8小时。

优选的，步骤(3)中，所述粗滤具体为：先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清。进一步优选的，所述滤布是丙纶750B滤布。

优选的，步骤(3)中，所述除菌过滤具体为：用0.22μm滤膜过滤除菌。

优选的，步骤(3)中，所述浓缩具体为：利用30～50KD的PES中空纤维超滤膜在2～8℃条件下进行浓缩，至抗体效价不低于1:512。

优选的，步骤(3)中，所述三次灭活具体为：加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.1％，37℃灭活16h。

本发明的第三方面，提供上述卵黄抗体在制备用于预防和/或治疗鸡呼肠孤病毒感染的制品中的应用。所述鸡呼肠孤病毒的保藏编号为CCTCC NO：V201817。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用从发病肉鸡体内分离得到的一株新型鸡呼肠孤病毒，该新型鸡呼肠孤病毒株具有优异的免疫原性，能够在鸡胚中稳定的传代，针对当前地方流行的以关节肿胀、跛行为主要症状的新型鸡呼肠孤病毒感染具有更好的保护性。

(2)用保藏编号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒作为疫苗生产毒株制备灭活疫苗来免疫蛋鸡，可以高效的获得卵黄抗体，该卵黄抗体的安全性好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部或全身不良反应；而且能够有效的预防和治疗新型鸡呼肠孤病毒的感染，具有很好的商品化开发前景。

(3)本发明对卵黄抗体的制备工艺进行了优化，收集高免鸡蛋卵黄后先进行初步灭活，而后以醋酸盐缓冲液进行酸化萃提，再以辛酸作为灭活剂和萃提剂进行二次灭活，在此基础上进行过滤澄清、过滤除菌，最后经超滤浓缩后以甲醛进行三次灭活，最终得到卵黄抗体溶液。以上通过酸化水-辛酸方法有效降低了终产物中脂类的含量，降低了不良反应的风险，同时超滤浓缩步骤有助于保证溶液中抗体效价，提高保护率；较高的抗体效价在未来临床应用时需要较高的稀释倍数，从而间接降低了杂质含量，进而提升安全性。

附图说明

图1：本发明的病毒分离株在LMH细胞上的细胞病变；其中，A：正常生长状态下的LMH细胞；B：N-DAV-SD16在LMH细胞上出现的CPE。

图2：PCR鉴定结果；其中，M为Marker；泳道1为待测样品；泳道2为空白对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，2016年，我国山东、江苏等地肉种鸡场和商品代肉鸡场相继以关节肿胀和跛行为症状的疾病。该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡都可以感染，但对商品肉鸡的危害尤为严重。发病初期主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲废绝及营养吸收不良等，随着病程的发展，感染鸡逐渐出现关节肿胀、发炎，不愿走动，跛行等症状；剖检可见关节腔内纤维素性渗出，腱鞘炎，腓肠腱断裂等病理变化，给我国肉鸡养殖业造成严重的经济损失。采用市售的商品化鸡呼肠孤病毒疫苗已无法有效的防控该病的流行，由此推知，该传染性疾病可能是由新型呼肠孤病毒所引起的。目前尚无能够有效控制该新型鸡呼肠孤病毒感染的药物和方法。采用鸡呼肠孤病毒灭活疫苗接种是防治该呼肠孤病毒感染与爆发的有效措施，但前提是需要分离获得免疫原性优异的鸡呼肠孤病毒毒株。

由于呼肠孤病毒为RNA病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性上存在一定的差异，在遗传进化时，容易发生变异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的以关节肿胀、跛行为主要症状的禽呼肠孤病毒感染。

本申请发明人从具有关节肿胀、跛行症状的肉鸡肌腱组织中分离出一株N-ARV-LY383，禽类呼肠孤病毒基因由分节段的10个基因片段(包括：L1-L3、M1-M3、S1-S4)组成，本发明对上述新分离的鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383进行了全基因组测序，并分别将10个基因片段与现有报道的禽呼肠孤病毒进行了序列比对和同源性分析，结果发现，新分离毒株N-ARV-LY383的10个基因片段多位于一个相对独立的分支中，说明新分离的毒株N-ARV-LY383不同于其他的禽呼肠孤病毒，为正呼肠孤病毒属的1个单独种。并将该新型鸡呼肠孤病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201817。

由于疫苗免疫是以预防为主，免疫后产生抗体所需时间长，在鸡群发病时难以进行及时、快速治疗。基于此，本发明通过分离的新型鸡呼肠孤病毒来制备疫苗免疫蛋鸡，采集高免鸡蛋制备卵黄抗体，以用于新型鸡呼肠孤病毒的紧急预防和早期感染治疗。与现有的禽呼肠孤病毒相比，本发明的鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383全基因组中的10个基因片段均发生了基因重组和突变，增强了本发明的鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383的免疫原性。

在本发明的一个实施方案中，给出的防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体由如下方法制备而成：

(1)取新型鸡呼肠孤病毒高免鸡蛋卵黄，搅拌均匀得到卵黄液；

(2)将步骤(1)所述卵黄液与水按1:(0.5～1.5)(V/V)比例混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60～65℃条件下保温25～35min；

(3)向卵黄稀释液中加入所述卵黄液体积2.5～3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后滤布过滤收集滤液；

(4)向步骤(3)所述滤液中加入辛酸至终浓度3.5～4.5％(V/V)，搅拌后于2～8℃放置4～8小时；

(5)取步骤(4)放置后的溶液过滤至滤液澄清，收集澄清滤液；

(6)取步骤(5)所述澄清滤液过滤除菌，而后加入甲醛至终浓度0.1％(V/V)，于35～37℃灭活12～20小时。

作为优选，步骤(1)所述的新型呼肠孤病毒高免鸡蛋是利用新型鸡呼肠孤病毒灭活疫苗分4次免疫母鸡后所产鸡蛋，每次免疫间隔2周；进一步优选，所述免疫途径为颈部皮下或肌肉注射新型鸡呼肠孤病毒灭活疫苗。

作为优选，步骤(1)所述新型鸡呼肠孤病毒高免卵黄液中，新型鸡呼肠孤病毒抗体效价不低于1:1024。

作为优选，步骤(1)中先对所述高免鸡蛋进行蛋壳消毒，而后收集卵黄；进一步优选的，所述消毒方法为先以1％新洁尔灭溶液浸泡消毒15min，蛋壳干燥后再喷洒75％酒精至蛋壳表面。

作为优选，步骤(1)中所述的水，是先于80℃保持30min，而后冷却至65℃以下的注射水。

作为优选，步骤(2)所述的醋酸盐缓冲液pH值为4.8～5.2，更优的是5.0。

作为优选，步骤(3)所述的搅拌，其持续是30～120min，更优的是90min。

作为优选，步骤(3)所述的滤布是丙纶750B滤布。

作为优选，步骤(4)所说的搅拌，其持续时间是30～120min，更优的是90min。

作为优选，步骤(5)所述的过滤是先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清；进一步优选的，所述滤布是丙纶750B滤布。

作为优选，步骤(6)中用于过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。

作为优选，步骤(6)除菌后的澄清滤液中新型鸡呼肠孤病毒抗体效价不低于1:512。

作为优选，步骤(6)中除菌后先进行超滤浓缩，而后再加入甲醛灭活；进一步优选的，所述超滤浓缩是利用30～50KD的PES中空纤维超滤膜实现的；进一步优选的，所述浓缩是在2～8℃条件下进行的。

在以上技术方案中，收集高免鸡蛋卵黄后先进行初步灭活，而后以醋酸盐缓冲液进行酸化萃提，再以辛酸作为灭活剂和萃提剂进行二次灭活，在此基础上进行过滤澄清、过滤除菌，最后经超滤浓缩后以甲醛进行三次灭活，最终得到卵黄抗体溶液。以上通过酸化水-辛酸方法有效降低了终产物中脂类的含量，降低了不良反应的风险，同时超滤浓缩步骤有助于保证溶液中抗体效价，提高保护率；较高的抗体效价在未来临床应用时需要较高的稀释倍数，从而间接降低了杂质含量，进而提升安全性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。本发明实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；本发明实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1：新型鸡呼肠孤病毒的发现和鉴定

1.病毒分离：

(1)临床上经PCR反应鉴定为阳性的关节炎发病雏鸡，剖检采集其肿胀的肌腱组织置于15mL离心管中，加入5倍体积的无血清的DMEM培养基，匀浆后反复冻融3次，每次解冻后在振荡器上震荡1-2min后在进行下一次冻融；冻融后将装有样品的15mL离心管于离心机中4000rpm离心5min；取上清，0.22μm微孔滤膜过滤后，备用；

(2)根据呼肠孤病的增殖特性，选用鸡肝癌细胞(LMH)进行病毒分离。按照常规细胞培养方法，待25cm²细胞瓶中的细胞铺满单层时，吸弃瓶中培养基并用PBS荡洗细胞2次，加入0.5毫升已滤过的样品冻融上清，将细胞置于37℃，5％CO₂浓度的培养箱中感作30min，感作结束后加入含2％胎牛血清的DMEM培养基，观察并记录出现细胞病变的时间。如第1代无细胞病变出现，则冻融后以第1代收获的培养物按照步骤(1)方法继续分离，直至获得稳定毒株；如传至第5代仍无细胞病变，则视为病毒分离阴性。最终得到一株稳定的毒株，其在接种LMH细胞后3天出现了较为明显的细胞病变，即表现为细胞变圆、融合，呈现团块脱落病变(图1)，同批次空白对照细胞正常，将该毒株命名为N-ARV-LY383。

2.病毒鉴定：

(1)PCR鉴定

1)RNA提取：

将毒株N-ARV-LY383的病毒液按照RNA提取试剂盒说明书要求，提取病毒RNA，置于-20℃保存备用；

2)反转录获得cDNA：

所用反转录试剂盒采用来自宝生物(大连)有限公司的货号为RR036A的PrimeScript^TM RT Master Mix，在200μLPCR反应管中依次加入5×PrimeScript RT MasterMix×2μL，步骤1.5.1中提取的待测样品Total RNA～2μL，使用RNase Free dH₂O补充至10μl体系。置于PCR仪中进行反应，反应条件为37℃15min；85℃5s之后4℃保存。

3)PCR扩增：

采用20μL体系进行扩增：模板cDNA×2μL，上、下游引物各×1μL，2×Es TaqMasterMix×10μL，采用ddH₂O补充至20μL体系。混匀并瞬离后置于PCR仪进行反应，反应条件为95℃，5min，之后95℃，45s，56℃，30s，72℃，45s进行30个循环，72℃，10min之后4℃保存备用。

上游引物：5′-GGT GCG ACT GCT GTA TTT GGT AAC-3′(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5′-AAT GGA ACG ATA GCG TGT GGG-3′(SEQ ID NO.2)。

4)PCR鉴定结果：

用引物进行PCR扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶中电泳后出现了与预期值513bp大小相符的特异性条带(图2)。表明各分离株的细胞培养物中存在新型鸡呼肠孤病毒。另外对分离株进行的常规鸡源病毒检测，并未检测到其他病毒污染。

(2)序列测定：

采用二代测序技术对毒株N-ARV-LY383进行全基因组序列测定，全基因组序列中L1、L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2、S3、S4这10个基因片段的序列分别如SEQ ID NO.3-SEQ IDNO.12所示。然后与现有技术中已公布的禽呼肠孤病毒序列进行同源性比对，结果发现，毒株N-ARV-LY383的10个基因片段多位于一个相对独立的分支中，说明新分离的毒株N-ARV-LY383不同于其他的禽呼肠孤病毒，为正呼肠孤病毒属的1个单独种。与现有的禽呼肠孤病毒相比，本发明的鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383全基因组中的10个基因片段均发生了基因重组和突变，增强了本发明的鸡呼肠孤病毒N-ARV-LY383的免疫原性。

将该病毒进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201817。

实施例2：灭活疫苗的制备

(1)病毒增殖程序：将实施例1分离的新型鸡呼肠孤病毒株按照0.2ml/枚的剂量接种9日龄健康SPF鸡胚，弃去24h内死胚，收集24～120h内死亡鸡胚尿囊液，获得病毒液，-20℃保存。

(2)病毒液浓缩：将收获的病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无菌生长，并留样备测毒价。病毒液每0.1ml病毒含量应≥10^5.0ELD₅₀，浓缩后的尿囊液随即进行灭活。

(3)灭活：将浓缩后的病毒液导入灭活罐中，加入10％甲醛溶液使其终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃密封灭活24小时(以罐内温度达到37℃开始计)，其间每隔4～6小时搅拌一次，灭活后，置于2～8℃保存备用。

(4)灭活疫苗制备：

1)油相制备：取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加Span-80 6份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

2)水相制备：将灭活后检验合格的病毒液96份加入4份灭菌Tween-80，开动匀浆机搅拌20～30min，使Tween-80完全溶解。

3)乳化：油相与水相比例为1:1(V/V)，先将油相导入胶体磨，2500转/分钟搅拌，缓慢加入水相，加完后10000转/分钟乳化5分钟。在终止乳化前按疫苗总量0.01％加入硫柳汞，充分振荡混匀。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

无菌分装后，轧盖贮存于2～8℃。

对制备的灭活疫苗进行包括：剂型、离心稳定性、粘度和无菌的质量检验，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。

结果为：本发明制备的灭活疫苗的剂型为油包水型(W/O)；离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。

实施例3：新型鸡呼肠孤病毒卵黄抗体的制备

1.采用灭活疫苗免疫产蛋鸡：

将实施例2制备的新型鸡呼肠孤病毒灭活疫苗免疫蛋鸡，首次免疫每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，14天后进行第二次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，二免后14天进行第三次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，三免后14天进行加强免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，加强免疫之后14天，采集卵黄测定新型呼肠孤病毒中和抗体效价应≥1:1024。

2.卵黄抗体制造：

(1)蛋壳消毒：收集高免鸡蛋浸泡于1％新洁尔灭溶液中15min。取出后自然晾干或吹干后，喷洒75％的酒精对蛋壳表面消毒备用。

(2)卵黄分离：采取机械打蛋方式，打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

(3)灭活Ⅰ：将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水(注射用水先经80℃30min消毒，并冷却至65℃以下)，搅拌混匀后，60～65℃保温(灭活)30min。

(4)酸化萃提：先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄3倍体积的pH值5.0的醋酸缓冲液，然后加入卵黄液，开启搅拌机，充分拌搅30分钟。

(5)灭活Ⅱ：卵黄液液中加入终浓度(V/V)为4％的辛酸作灭活剂和萃提剂，剧烈搅拌90min，2～8℃放置4～8小时。

(6)粗滤：用丙纶750B滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

(7)除菌过滤：用0.22μm滤膜过滤除菌。置2～8℃存放，应不超过14日。同时取样检测新型呼肠孤病毒的中和抗体效价。

(8)浓缩：如检测的新型呼肠孤病毒的中和抗体效价低于1:512，应将除菌过滤后的卵黄抗体在2～8℃条件下，用30～50KD的浓缩膜包进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩后的新型呼肠孤病毒中和抗体效价应均不低于1:512。

(9)灭活Ⅲ：将浓缩后的溶液导入灭活罐中，计量加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度(V/V)为0.1％，37℃灭活16小时。

(10)分装贮存：在无菌条件下将灭活好的滤液分装于无菌玻璃瓶中，盖好胶塞，轧铝盖，贴上标签，保存备用，保存温度为-20℃。

实施例4：卵黄抗体质量检验

1.安全性检验：

用1-3日龄易感雏鸡(新型鸡呼肠孤病毒母源抗体均＜1:4)10只，各肌肉分点注射本发明实施例3制备的卵黄抗体2.0ml，观察14日，易感雏鸡全部健康存活，说明本发明的卵黄抗体的安全性好。

2.无菌检验：

按照《中华人民共和国兽药典》(2015版)进行，结果为：无细菌、支原体和外源病毒污染。

3.效力检验(免疫攻毒法)：

1日龄易感雏鸡(新型鸡呼肠孤病毒母源抗体均＜1:4)20只，随机分为A、B四组，每组10只。其中，A为免疫组，颈部皮下或肌肉注射实施例3制备的卵黄抗体，每只0.4ml；B为攻毒对照组，皮下或肌肉注射生理盐水，每只0.4ml。隔离饲养。

16小时后，A、B两组雏鸡分别肌肉注射用生理盐水做10倍稀释的新型鸡呼肠孤病毒(保藏编号为CCTCC NO：V201817)，每只0.4ml。攻毒后观察10日，记录每组雏鸡发病、死亡情况。

结果：A组攻毒后10/10保护；B组攻毒14小时后开始发病，10日内死亡8只。

实施例5：卵黄抗体的应用

1.在对新型鸡呼肠孤病毒预防中的应用

以1日龄易感肉鸡(新型鸡呼肠孤病毒母源抗体均＜1:4)30只为试验对象，随机分为三组，每组10只。其中：

试验组：颈部皮下或肌肉注射实施例3制备的卵黄抗体，每只0.4ml；

对照组：以目前市售的禽呼肠孤病毒灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，并按实施例3的方法制备得到卵黄抗体，颈部皮下或肌肉注射该卵黄抗体，每只0.4ml；

空白对照组：皮下或肌肉注射生理盐水，每只0.4ml。

将上述三组肉鸡隔离饲养，16小时后，分别肌肉注射用生理盐水做10倍稀释的新型鸡呼肠孤病毒(保藏编号为CCTCC NO：V201817)，每只0.4ml。攻毒后观察10日，记录每组肉鸡发病、死亡情况。结果见表1。

表1：

组别	攻毒毒株	预防保护
			试验组	新型鸡呼肠孤病毒	10/10
对照组	新型鸡呼肠孤病毒	4/10
			空白对照组	新型鸡呼肠孤病毒	1/10

注：预防保护为攻毒后健康存活肉鸡数/肉鸡总数。

由表1可以看出，本发明的卵黄抗体具有极佳的预防保护效力，对于该新型鸡呼肠孤病毒能够提供100％的预防保护，保护效力优于采用现有的灭活疫苗制备的卵黄抗体。

2.在对新型鸡呼肠孤病毒治疗中的应用

在新型鸡呼肠孤病毒感染发病区，症状为关节肿胀、跛行，以病程相近的30只肉鸡为试验对象，随机分为3组，每组10只，全部隔离饲养，其中：

试验组：颈部皮下或肌肉注射实施例3制备的卵黄抗体，每只1.0ml；

对照组：以目前市售的禽呼肠孤病毒灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，并按实施例3的方法制备得到卵黄抗体，颈部皮下或肌肉注射该卵黄抗体，每只1.0ml；

空白对照组：皮下或肌肉注射生理盐水，每只1.0ml。

观察10日，记录每组肉鸡病情、死亡情况。

结果为：试验组注射卵黄抗体2天后，患病肉鸡的采食量开始增加，精神状态明显好转，10日内未有肉鸡死亡；10日后将其中1/2的肉鸡扑杀并解剖，结果发现患病肉鸡跗关节肿大症状已基本消失。对照组注射卵黄抗体后，患病肉鸡的采食量和精神状态未有显著好转，从注射卵黄抗体第4日开始有患病肉鸡死亡，10日内患病肉鸡的死亡率为50％；10日后将存活的肉鸡的1/2扑杀并解剖，结果发现患病肉鸡跗关节肿大症状仍少量存在。空白对照组的患病肉鸡10日内的死亡率达70％。

以上试验结果表明，本发明的卵黄抗体安全性好、预防效果好、治愈率高，可以用于新型鸡呼肠孤病毒感染的防治，具有重大的经济和社会效益。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法

<130> 2018

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtgcgactg ctgtatttgg taac 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aatggaacga tagcgtgtgg g 21

<210> 3

<211> 3959

<212> DNA

<213> L1基因片段

<400> 3

ttccgatctc cgaacgccga aatgagttcg cgcaaagtgg ctagacgtcg tcataaggat 60

gctactgaat ttaaatacac taagaacgtt aacaagtcta agccatcctc tactgacgtt 120

aaagaacctg cggatagtgc cacagataag aaagtcactg ttccatcacc agacaatcca 180

gccgcttcta ctccctcttc cactgatgga gcttctcaaa catccgttgc taagcagacg 240

aatgataatg acgcctcagt taaggaatca gctcccaagc ctaccgtatc tagcgatggg 300

aaagacggaa tgcatggtgc tgtgaagttg caagacgcta aggccactgc agctgtggat 360

agtaataagg atagagatgt ggtatttggt ggcgcaggct ctggtgacaa aaatgctatt 420

acgaagactg gttccgttga caatgatggg ggcgttaaag tcgttccagc caaggatgct 480

acgatatctt cggccaaagc catgatggaa cagaagcagt tagttgctgg tcttccgaag 540

caaccgaagt ctgctaatca tttgtgcacc gtttgtatgg cacaattcgc gtctgctgac 600

gccctaacta tccatcagac tacgcactcc attggctcca atgctgctct gacgagcttc 660

tcgatttcta ctgctgttga agaattcatt caatcatggg ctgctgctac gtccactgcc 720

aataccaaga cggccttaac tgtgtctgac gtggactcgc tgatgatgac tgaaggaata 780

cgtctcataa cttgggattc tgggttatgt acatcttttg agcttgtccc gattgtccat 840

tcaaacactg ttcaagatgt aatttcgtac tcatggttca catcaagtta taatatcaca 900

actcccttcc cacaggcgcc tgtcgtgcga attgttttac gtactaattg ggctgccaaa 960

ttggactctc cctcgtcgtc gcgtgaatgt gatcttcgcc tcgccccacc tacagagagt 1020

aatgctcgat cattctcaat gctgctcaat actggtgcga ctccagaagg tactttcaac 1080

cccaacaccc ttcgtatgaa tgtgctgcag atgtgtcttc agtatgttct ggctaaccta 1140

cacttgaatc gtagcactca gttcaccatg gatttgactg ccgcagctcc caatctgtcg 1200

gcgtctcaac tccgtatcgt tccagatgat aaagatggta aatggttccc tgtcatgtat 1260

ccatctcgcg tgaacatccc actgttcaat aagacagctg attttgttaa tcagtgcatt 1320

cgtgacagaa ttggccgata tgaccgcgcc cagactttcg ctggcgcacc ctctgaatgg 1380

gctgacatgt gggaaacagc ggacgcgtta actctctccg tccgtgaaat gtggatgtca 1440

cgtatttccc aaatgaatat ctctcctgct gatatcgctg acgctatctc tcgatgttct 1500

cagtccctgc tcactgttgc cgcgccaaca gctccttctg tagctcgtct gttaccttgg 1560

cgggttagtt ccgatgagag gcagctcctc caattgttga tgtacttgaa cgttgggact 1620

agtgccgact acgtccaacc tattctgtct gcgttcgctc gaactctatc tcgcgtgtca 1680

ccattgcgta ttaatcccac tttaatcgct aatgccatgt cgacaattgt cgagagcact 1740

actaataccc agagtcctgc ggcagctatt ttgtcgaagc ttaaacctgt tgcctcggac 1800

ttctccgatt ttaggttggc gtgtgccgct tggttgtata atggttgcgt ccagacatac 1860

ttgtctgagg attcatatcc aagcagtggt ggatctgtta ctagcattga tacattggtt 1920

gatatgtttg tgtgcttgtt ggctttgcct cttgttactg atcctaatgc tccttgccaa 1980

gcctttatgg ttgtcgctaa tgccatggtt ggttacgaga atctaccgat ggacgaccct 2040

aattttactc agcaaagatt ggctgcagcg ttcaacaatc ccacgacctg gcctcaatgt 2100

ttcctccacc ctcaaaacat cgatcgacgc caatgtccga ttctctcatg gtgggctcag 2160

cagattcatc gtaattggcc cacaccgtct caaattactt atggggcgcc tgacatcatt 2220

gggtccgcta acttgtttac tcctcctgac gtgctgttgc ttccattaca gcataggccc 2280

atccgtatta ctaatcccac cctgaacttc gataatgagt tgacgacttg gcgtaacacc 2340

gtggttgatc tggttctgcg catcatcgac agtggtcggt accagcccaa ttggaatcag 2400

tccatccgtg cctctatgcg gaatgcgatg acaaatttca gaattattaa gtcctatact 2460

cctgcttaca tagcagaact gctacctgtg gaactggcag ctatcgctcc aactctaccc 2520

ttccagcctt ttcaggtgcc gtttgcccgc ttagatcgcg acgctatcgt cactcacgtc 2580

aatgtatcta gacaagctcc caacaatctt gctcaacctg cattgaacat gtccatgacg 2640

taccagcgca caggggttcc aatctctctt agtgcccgtc ccttggcagt cgctcttctg 2700

tcaggccagt accctactga tccccctctt cagactaatg tttggtacgt aaacactctc 2760

acgcctctat attccaatga tggtctcttt aataacgtcc agcacgctat ggttgcttct 2820

gaagcttacg ctaccttgat caccatgctg gctcagtgca ctgacatgca gtaccctgtg 2880

gatcggccat tgaattggct tcgtcagatt aatttggctg ctaatgaggc gacgattttc 2940

ggtcggtcaa ttaattcact tttccagact gctttcgacc tttcaccttc cactgtattg 3000

cttcaaccgt ttttggaatc tgatccacgt gcgacacagc tagccatttc ttacgttcgt 3060

tataatggtg acagtgaaac cttcgtgcca acagtgcgtc catctatgat ttcagaagcg 3120

acattgctcg ttgagcgtac tctctcgcac gaatacaacc tcttcggttt atgccgtggt 3180

gacatcatcc tgggacagca catgactcca actgcgttca atcctttggc tccgcctcct 3240

tccgtcgttt ttaacagggg tgatactgat gtctatgagt ttggctctcg tagcttcgcc 3300

aacttcggca tgaatgggga ggagatcttg gtcatggatg cgaacggcgt gcgtcgtcca 3360

ttactcggcc ggtgggttat gccactgcag cttttgatgg ttaatattgg cgtatttcct 3420

aagctgttgc tggatcgtat cctgaagggg cgcttgtata tccgacttga agttggcgcg 3480

tatccatata cggtgcagta ttaccaggga cgtgagttta cggatggctt cactctgctt 3540

gagcaatgga tgtctaaggt gtcgcccatg ggtatccctc ccgtcccttt cctcatgccg 3600

cagtccgaag gacacaacat cacttcaggc atggttactc attacatctg gtccactgaa 3660

tataatgatg ggtccctctt cgccacgaac accgacctac cagttactgt gttcggccct 3720

gaccgcacca tcccaatcga gcgttatcgg gcactcgtag atccaggtgc tcttcctgct 3780

accaaccaac tgccgcacac catcgacctt tactgctcac tgagacggta ttatctggaa 3840

acacctccta tcaccgctac tgttaccact tatggcgatg gactccccgc gctgaaccat 3900

tagagcggcg aggctagacg cgagttgatc gcgtcgactc tcgttggaga ttattcatc 3959

<210> 4

<211> 3830

<212> DNA

<213> L2基因片段

<400> 4

gtattttcct caccatgcat gtcaacgggt ttgatgatgc tactctctcc tacgcacagt 60

ccatatcggg ggttatccca atgacaaata agttatttga gcaagcatct acctcaatac 120

gtgccctacc acgctcacat gtttatgcta tattagataa tgttaatttt tcagtttcat 180

gtgtcatccc gaatcgtatt ttccatcatc ctgatcactc tgagtacttt tacattgatg 240

cggttaacag agttagacgg aaacaagtta tcgatcctga tgatgtattt gtgccaaact 300

gcaatttgca gggtcttatt actccaatgg agagattacc aaattatggt caattgtctg 360

agactatttc gtcgaacgct cgggatggct tgccatctgc acgcgtagca gctacttttt 420

ataacacttc ggtgtcacag gctcgccaag ttaaagctcc acttgaatcc tttttgttgc 480

ctttgctatt atctgagact tgctcattat cagacgatcc ttgcggactt gacaccgcag 540

cttctcctcc gatccatacc aatctggcgt tatgggtgtt acgcgaaatt agtcgaacta 600

tttgtggatc ttcgaatgac cgttcacctt ggttactgct cgattcaggg gttgcgtggt 660

tcatgtctcc gttaatgtca tcggccattc cacctcttat ggctgactta acgaatctag 720

cgatctacaa acaaatttgt tctgtgtctg atgagcttca ttcccttgca gttcaagtgg 780

ttttgcaggc cgcggcgtca caatcgtatg gacactacat attgcagacg aagtcagtat 840

tcccccaaaa tacgttacat aacatgtttc gtacgctcac tgatggtatt gttccggtca 900

tagattggtt agaaccgcgt tcaaactatc gcttcatgct tcaaggtgcg cgtaaagtga 960

cttcagatga tgcgaatcag gctccggata acacggaagc cgcggagcaa ctcggtcgca 1020

agatggggtg cctcgatgtc gtacgctcct tacgtaagat gtcctcgtcc atcactgtcc 1080

attcacacga tgccatgacc ttcgtacgtg atgctatgtc gtgcactagt ggcatcttta 1140

tcacgcgtca acctactgag accgttttaa aagagtacac tcaagcgccg accattgaag 1200

tccctattcc tcaatcggac tggtcaccgc ctattggatc tctgcgatat ctctctgatg 1260

cctgttccct ccccgctgtg tatctggcta gggcttggcg cagagctgcc tctgctgtag 1320

tagataatcc gcacacttgg gaccctttat atcaggccat ccttcgctct caatatgtga 1380

cgtcacgcgg tgggtccggt gccgcgttaa gagatgcttt gaaggctgcg gaagttgagc 1440

ttcctcagta tcctggggtc agtgttaaag tggcgaccaa gatttatcaa gcggctcaga 1500

ctgctgacgt gcctttcgat aaattatctc gtgctgttct agctccattg tcgatgggct 1560

tacgtaacca agttcagcga cgtccaagaa ccatcatgcc catgaatgtg gttcaacagc 1620

agatttcagc ggctcatact ctctccgctg actacattaa ttatcacatg aacttgtcga 1680

cgacctcggg tagcgctgtg attgagaagg tggttccatt aggtatgtat gcatcctgtc 1740

ctcccgctca agcggttaat attgatatta aggcttgtga cgcgtccatc acgtaccagt 1800

attttctttc tgttatcgtc ggtgccattc atgagggtgc agcaggccgt cgtgtctcgt 1860

cttcattcat gggcgttcca ccaagcgtgc tgtccgttgt cgatgctagc ggagtgactt 1920

catccatgcc catctcaggt tttcaagtca tgtgtcaatg gttggctaaa ctttaccagc 1980

gaggttttga gtatcaagtg acggatacat tctcacctgg caatattttc acgcatcaca 2040

ctactacttt tccctctggt tcaacagcga cgtctacaga acatactgcc aataatagca 2100

cgatgatgga tggcttcctg cgcgcttgga ttccttcctc cggtgcgtcc gacgtactga 2160

agaagttctg caaatccatc tcaatacaac ggaattacgt ttgtcagggt gacgatggtc 2220

taatggtcgt tgatgggcta tcgacaggta aattatcagg cgagataatc gatgaatttg 2280

ttaaggaatt gagagcctat ggtaaatcat ttgggtggaa ctatgatata gagtttaccg 2340

gaaatgcgga gtatctaaag ttgtatttcc taaacggttg ccgtatacct aatgtttctc 2400

gacatccgat ctgtggcaaa gagcgcgctt caggggacaa gttagaaatg tggccgtcca 2460

ccattgacat cttcaatggc atatttgtga atggtgtgca tgatggtttg ccgtggcgca 2520

gatggttacg ttattgttgg gctcttgctc ttatgtattc tggaaagacc gtgcgtcatg 2580

atgattctga ggtgttgatc caatatccta tgtggtcttt tgtgtattgg ggtttgcctc 2640

ccgtgagcgc gtttgggtct gatccatgga tcttttctcc atatatgccc actggtgatc 2700

atggtttcta ttcaatgttg actttagtgc gccctctgat cactaacttg tccccatcgt 2760

cagacgcttc gggattattt ggtcaatgcg atcacaacgt tttgttcaat tctgagctag 2820

tttatcaggg ctattacatg gctcaatgcc cacggcaacc ttctcgctcg aaccgtagag 2880

atgatcccga ctctgtacag cgcttcgtca aggccttgga gtcttacctt tacatttccc 2940

ctgagctaaa atcgcgagtg cgccttggtc gtgaccgctg gcagaagttg gttgggtata 3000

cggaaaaatc tcccccgtcg cttgatgacg tggcgttcaa atggttccgt agtgcacagg 3060

aagctgatct cccaaccgct acagagattc aaagcatgga tctggccttg ctggcagcca 3120

gacgtaggac atatcagggc ttctccaagt tgttgaatac ctatttaagg gtaacctggg 3180

atttatctga tcctgttgaa cacgctgtag atccccgcgt acccttgtgt gccggtgtct 3240

ctccatcaaa tagcgagccg ttcctcaaat tgtactccgt aggtcctatg atgcaatcca 3300

cgcgtaaata ctttagcaat acgctattta tccatcggac tgtgtctggt cttgacgtcg 3360

atgtcgtcga tcgtgcgctc cttaggttgc gtgcccttaa tgcgcctgat gacgtggttg 3420

tagctcaact tttgatggta gggttgtctg aagccgaagc cgctacatta gcagcgaaaa 3480

tacggacgat ggatatcaat gccgtgcaat tggccagagt tgtcaactta tccatccctg 3540

actcatggat gaccatggat tttgatcgct tgatacgaga tatcgtgtct gtcactcctc 3600

tgaccgttcg atccctaacc accgatctac cctctggcgt accgtgggct cgcgcgatct 3660

tacagttctt aggtgcgggt gtcgccatga cggccgtcgg acccttgcgt cgtccctact 3720

tacactcagt tgccggaggc atgtcttcat tcattaagca gttccgccgg tggatgcgtg 3780

ccgaaacgag gtagcgtccg tgcccggcat ggctcgagga attacccatc 3830

<210> 5

<211> 3876

<212> DNA

<213> L3基因片段

<400> 5

gcttttccac ccatggctca gattcgaggc cttcggttgt ctacgacgct ctcagctcca 60

cctccacgca agattataac atctcacact tatgatgagc tgatctccgc tctgaagtta 120

gcaaccaagc cttggcgccc tttgaagtcg cgaaataatg attctgtcac ggcagtgcag 180

ctcctttttc cccttaatgg ttatattgaa cccatgttca tgttggaaaa ggatatagcc 240

cttagtgatt ttgaggcctg gttgacgcct cttctatctg cactcgctga ccagttgctt 300

agacactacc ctatcgccgc ctatcacggg cgtttgatta atccgctgct atctaatgca 360

attgttgccg ctttcttgtc taacgtgcct tatgcgcatg cattggatca tctcttcctt 420

gttagaggaa acgtcgagga tattatggat gcggggatcg caattcagaa tcacttgtgg 480

ttcgatcgcg gtgcactagt gacccctgct ggacagaaat ttgttcagct gactggctat 540

aacttctcct ctaatgatcc gtgtctattt tctaagcaat tgcgttgtta tggcctcgtt 600

tactactttc tcgacatggc cgaatgtctg gcgtattgtt ggcgtcatct atccaattca 660

actccactga tacactttga ccgtccgtcc aatggagttc attgtttggt gccctctgaa 720

tccacgacgc ctatcgctgg ttcgttacca gtgtcagcac tcagctctat tttgttggaa 780

tcctgtcttc agcaatctac aattaatgcc cttactccca ctggttcgcc cgtcattaga 840

caaatagaag cattgttgcc tatatcatca ccgtttttcg aacgacggaa cactctggaa 900

tattctctct tcgcactgtc aaatgctctg gtaaatggtt atcagcttgt agacttgcgt 960

tccggccacc ctgattgcgc tactgttgct gccatcctag ctagattgat tgatttctct 1020

aaggatatca ccgttattca accgcgccct gctctctttg ctatcaacag cgacagtccg 1080

cttacgtata gtggagaaaa tgctaatttt atttcgcgct tgacttgtgc gtccggtaga 1140

cctattggtc cggtcgttgt cggtaaatcc gttgatcatg ccgttggttg gatgccccag 1200

tttgaccccg ccacgtccta caaccctgat ctctcgatgg actcacttgc tcgtgccacg 1260

acactgcctc tccgtgctaa gtattcgact ttctggtcag gcccagcatt gttttctttc 1320

gcttcatgta ataggcacaa tggtgtatat gacatacagt tcatggctca atttcctcct 1380

acttacttta gtgatgatga cgccttttct agatcacgat tctcttctta tcgtgcagtt 1440

agggaccggt cattgttgaa ggataccgct aatttgatgt acatctcgaa tttgtccagc 1500

tctcacgacc atcgtcttgt cccagattct aaaactatga tttatgtggg ttcctctggt 1560

actcatgtag ataatcaacc ttctatcatt aaacctctct tagctggaac tcttccgggt 1620

gtttttcgcc ccctttctat aaaacaggtt ggttgggagg tcactaatgg aacgatttgt 1680

gatgttgagc ttcctttagc cactggtacg ttcttcttcg tgtacagtga tgtggatcaa 1740

gtgcaatcag gtgattctga tttggacgcc tcctcgcgtc gcttttgctc ccaattggac 1800

atgctaatga agttgacgtt tactggtgga tcgcttgtcg ttaaatgcaa ttttccgact 1860

agtctagtgt ggcgtcacat cttctccact gtttctcctt atttctcggc tattcattta 1920

atgaagcctc tcgtgtcaaa taatttagaa ctgtatctat tgtttgcgga gcgtttgccc 1980

gttcctgacg tcgcgttccg tccttcagcg gacgttgtcg ttttctggcg atcacagcta 2040

caacgctatc gagtgttgcg tgattccttt tctaatgtgc cctccatcgg gtccactctc 2100

actttagatg aacctttgac tgtctctatt ctcaattttg ttgacgtcac ctccctttct 2160

tctcttgagg atcaacgagc cttatctgct ttttcagttt taacttctct agggtcacag 2220

aaactctcgc ttcatcctta ctttgatagc taccgcacgc agctcactgg aataattact 2280

ccacattcac gtaatcttct agatagactg gcgtacgtcc cgcgcgtttt tccttcgacg 2340

attgatgtgc aacatcgtgt catggcctct tcagatccag aaatttttgg ttttcgttct 2400

aattcatgga ctcaactgtc cttcttctac gacgcgacgt taacttctat tgattttact 2460

gatgtaaagc actggttaga tttagggacc gggcctgagg cgcgaccgtt gtcttttctg 2520

ccttccgatc ttcccgtcac gttatgtgac actcgtccat tcatcttccc ttccggctgc 2580

tgggctactt tcactgattt cttaagttat gactaccttg tcacgaatgt cgtgctctca 2640

actggtgccg atgtcgtatc ctgtgttctt tctctgggtg cggcctgtgc tgatgccaac 2700

ataactttac atgaaggcgt gcggcagctg atttcccaat gcgtggatgc caatgtcaag 2760

acattgttcc tgcagcttaa ttgtcctctc ccatctgcgg gtgatgtatc tcgggagatt 2820

cttgagatgg ttcagactaa ttcaacttac gtgtttcata ccttgggtcg tattgaaccg 2880

ttcattccat actccgctct ttcagagata gttgaggact tgtgtcccgg catcgtcatt 2940

gaaattaaga ctatggatcc ctctctctca tggcttgatt acgctgttca atccaatgcg 3000

tcagtgacgt cggatgatat cgtattggca atgcgtctgt ctcacttctg tccacttttc 3060

gtgtttcatt ttgaccgtca gtctgctcaa tttccggatg atgcgcgtgt tgggactcct 3120

tttactgtca cgctgttaga ttatgaagat actcgttcat acgaggtgac gttagataat 3180

gtcactatcg ccaccgttac cgcaggtgct ttggtgggtt tctcatctgg tgtcagcgtc 3240

agttcaacca acaatcagct tattttaact atcgattccg caagtccagg aattctctcg 3300

gtcattcaga ttcttcccgc tcgtatctct ttaggcagtt gtgtgataga agcaccggat 3360

ccatctctct ccttgatctt ccccgccacg ttagatacct ctttgtcggg aaccgatttg 3420

gagctgtatt tgtctgactg gtacgatgtt gcattatttt acgtcgatga aatccactcc 3480

cgcttgctgc cagtgtccga taccaagtat gaaatatatc gcaaggatca ggcgccgaac 3540

agccgggtga tcaactatat tttcgatcgg tctgatgtgt ttttcaagct agtgttatgt 3600

gacgtatctc cctcaggagt aggccgtttc atctaccgtg agttgccaga attaagttca 3660

cctgtttggc cagacaacgc gcgcactttc ttgtccatac cgttcgagtc acccatggtg 3720

attgtctcgc cggacggacc tgttaattac gatggcgcaa actttactcc tccaaactca 3780

tggttgacgg ttgatggcag tacctgcgtt gtagatggcc gtccttcgtt ctacgtgccc 3840

cctggccgat atggtctggt gagagtctaa acgact 3876

<210> 6

<211> 2283

<212> DNA

<213> M1基因片段

<400> 6

gcttttctcg acatggccta tctagccaca cctgtgctag gagtcggttc tcgcattacc 60

gctttagatc gtactattga tgctatcacg ttgaaacctc gaatcgactt acaagatgta 120

tacacaattg atcccacttt gactctgcgt cagatagagt taatctcttc gggaacttca 180

atggacgata tcgctcgtgg actgttgcac cgagactggc gtcgtcaatc catcatcgtt 240

ttgcttccct cgcgtcgctc tctccttgag tatctattgt ctaacccttc tgtctgtcca 300

gacggtttag atcgttctcg acttaaagga tttcagaagc gtccaaatga ttttcgtgtt 360

caagatttct tctctccact gatcacggac tcgacgtcaa ttgctacata ctctcgatgg 420

cttaatgccc accctgttgt gtactcaact actcataagg tcgctggtgc tcgggtgcgt 480

ctctttggac ctgccaaatt atacattctg tcacctgacg ttcttcgcga attatccatt 540

ttgagatcca cggatcgtgt cctcgttgta cctacagcac gtgtatatgt tggttgcttt 600

cctagcgctt ccactagtaa ttgtgtgctc actgcacgcg accgctggaa tgctcctgac 660

gttcatcccg ttgtcaaggc aatccaatta gcatatgacc atcaatatcg tgtcaccgct 720

cgctatcttt cggatcccct tgtctccgcc cttcttgttg ggaatcggtc ggtgaagacc 780

ttgaaggtac agccagtaga ggccagagca gcacgatcag tcggcattcg cgttcaagcg 840

atgacgcccc ctcgtggtat caacacctct atcatccaag tcgttgatct caggctgcaa 900

tgtcgacatt ctctcattcc caccgaaagg cccttcccgc tgacatttat cggcctccca 960

tcctgtttgc tccagcattt ggatttgacg ctatctgacg attgggtgcc tattcgtgat 1020

cccacgggca tgtttgaaat gtggttcatg attcttacgc tcacttgtga taagattctt 1080

gatggacggg gcaacgctgt ttttctcatc cccagttcta ctaatgcatt gtcgattaat 1140

tatgtacagc ttacatcgac cgcgtctcaa cgccctcagt cattagcggc aaatgcatct 1200

ggacggatag attctatcgg actatgtatg cctaaggggt cttttaagtc aactatgatt 1260

aaatttctca ctggcttgga gatttgcggc acacgagtga tgtactcgga cgtcgtgatg 1320

gacagtgatg acgtgggtga cgctttggat cctacttttg aaacggcttt gtatgatgca 1380

ctggtagcac ttgatccgcc ttttgacgtt gataagttgg ctagccccac tgatctagtt 1440

aatcaggagt acgttgcgtc tcatatgtac ccgacattct tacggcttgt caatgagctg 1500

ctgactccta aggcttcaga gttgtactct gagcgtagcg ttgaattccg atctcttact 1560

tacgcgcacg ctgattctga atttcttaac tcatgctgga ccgctcgctt aatgcgttgc 1620

tttatcaact atcatgaaga gcagaatatc ttacttcgtc ctggacgcgt tggtggggtg 1680

ttatttcaag tcgcgttgag ccgttgctat aagatgttcg ctacttccac tcctgcttcc 1740

cctctgtcat tgttcctcaa gtcgttgttc gttccttgga ttgagtctgc cccactgtta 1800

gcgaatctaa cgccaaatga gtcttctcgt gtgttagcat ggtatattcc ttcctcgtac 1860

tggagcgaca atggttggtg cgtttgtgac actcatcgtc acgtcacctt ctccttcatc 1920

cgcggtcttc ccgccgacct gtcggtgtta gatctgtttg attggtctcg attccgcgcg 1980

actataaacg tggacacgtc tctcgtggag ctaggcgcag acattcgtgc ggtcaaagta 2040

tcagtccatt ggacatctca gaagcccact gtggacgttt ttgacaatcg tgcgcttttc 2100

acccccttcc agcactacca tttgagtctc cactgtaatt gcgcacctgg tcgacctttc 2160

ttcgcgaaga acatgaagct atatttgtcg acggtaggag gcgagcactg acgggccgtg 2220

gggcggtgac acccagggag ggtatgctgg taaccctggg ttagtcgtct tgagatactc 2280

agt 2283

<210> 7

<211> 2157

<212> DNA

<213> M2基因片段

<400> 7

gctttttcag tgccagtctt tctcacaaaa tgggaaacgc gacgtctgtt gtgcagaact 60

tcaatatcca aggtgatggt aatcattttg ctccatccgc tgagactgct tcatccgccg 120

taccgtcatt atctttgaat cccggactgt taaatccagg tggtaaggcg tgggtcctga 180

ttgatccatc tctaaatgct tccgatcctt catcactacg tctgatgact tcggctgatc 240

tatcaacact tcctcgatct gctactagta actctaccgg gtttctcccc acttctggca 300

tgtatgccat tgctactaag gagacgttga gtgtaattac tgagcacgcg atttcccagt 360

ttgataagtt acagatggct tgtgagttgg accgcgatta tctggatgct agaggtgttt 420

ctcctgagtc tgtgaatatt catagttata tagcctacgt tgattgcttc gtgggtgtat 480

ctgcaaggca ggctgcgtca aattttaagc ggcatgtgcc agttatcacc aaatctcgta 540

tgacacaatt tatgacatcc gcgcagaata tgttgcaagt gcttgggccc tgggaacgtg 600

atgttcgtga gttactcact attcttccta cttccactac cgctggtaaa attacgtgcg 660

acatgaagtc tgttgtcgct ttcattgatg atcagctctc tgataccagt ttgtgtcgtc 720

tgtaccccga ctgtgctgct gcggcggtgg ctagacgtaa tggtggcatt cgatggaaga 780

cacctgatac tgacgaggct ccttcacttg caactaacga tattgctgct tcaactatgg 840

gtacgcttgc gaatactaca ccactggctg agaagtcgaa ctcgggcgag gagtcgatgc 900

gcttggttag tgatgttggc gtggacatcg tttgttctcg tggccccatc agttcttcag 960

tttggtcccg cacggttgaa cccaaatcgt acaatattag aacccttcgt gtagaagaag 1020

cgctttggct acgcgagtgc caagcgacta ctggttttga tgtacagtac acgctgcccg 1080

accagactac acataagcat ttctggcttc agaaggggtc agtcgtcata aatcttgagc 1140

aaacgggtag tatgatgttc gatgtgaaca tagcgggtaa agattacaag aagggcacct 1200

ttaatcctga taatcataaa ttggtcctct tggttatgca gtcaaagatc cctttcgagt 1260

cttggaccgt cgcttctcaa attactggta tcgctcaagt ggctgaggtc actgtgcatg 1320

ctgctgatag ttcgactcct aaccaaaaga taatcggtga aacttcgctg tcttatttat 1380

ttgagaggga gacggtgacc acatccaata ctgaagtcaa tacatatctg ttgtgcactt 1440

ggcagcttga cgacgcgcag agcaatgacg caaacgcctg gccagatgct tgggacggga 1500

tcacaacatt gaccccactt acgtccggta ctgtaaccat caaggggact tcggtggatt 1560

ctgtcgtacc gtctgattta gttggtgctt atacacctga ggctttggct gccgcgcttc 1620

ctaacgacgc tgggttaatt ttggctaata aggcaactaa attggctgac gccatcaaga 1680

aggaggatga ttctgtgatt gatgagtctt ctccctttag cacccccatt caaggagttc 1740

tggctgttca acaacttgat accgtgggga cacgcggtac acgtgcactc cagcctccat 1800

ccattctgaa acgcatcgcc tcacgagctc ttcacatgtt tcttggtgat ccaaagtcta 1860

ttctaaaaca ggcgacgccc gtattgaggg accctgacgt ttggaccggc tttgttcaag 1920

gtgttagaga cggcatccgg actaagtcgc tatccgctgg agtacggtcc gtgtataata 1980

acgttaccgc cacacagtct gtacaaacgt ggaaacaggg gttcctgacg aaaatacaga 2040

cgttgttcaa gccatcgtga ggtgctaagg cctctctctg cggcgggtcg gtgggcacgt 2100

cgtagtgacg ctgaatgcac ggggaggtga cgctccctgg attggcacgt tattcat 2157

<210> 8

<211> 1999

<212> DNA

<213> M3基因片段

<400> 8

gctttttgag tcctagcgtg gatcatggcg tcaaccaagt ggggagacaa gccgatgtcg 60

ctctcaatgt ctcacgatgg atcatctatc cgcagtgcgg cctcacaatt tctgtctgat 120

cccctgtctc attcaacgcc gatcccacct caacggaaga ccgtactgct gaaattcatg 180

attggtgatg acctggttac cgttcagggc gccctcgctc cttttgatga gtactggtac 240

gataatcaac cgctattgtc tcaggctgtt gagctgctcg cttctgagga tcgtctacgt 300

caatttgagc attatgagaa atttctgctt aagaagggcc accaaatcgc tgagatcatg 360

aacaggctac gtcttttctt cactgacgtt ctcaaagtga agatggaagc tgatgctctt 420

ccttctctgg ctcaatacct aatggctggt acgttggatg ccgtctccaa cgttcacgaa 480

cctgatgctt gtgttccagt cacttcaaaa atcatagcta agcagcagac tgtgtccaag 540

tcccctggac gtcttgatga agaggagtat aatgttatta gatcacgttt cctcactcat 600

gagatctttg acttaacgtc tgacttgccc ggtgttcaac cattcatgga tatgtactat 660

gccaccgttc ctcgtgccga ttccaccggt tggtgtgtct accgcagaaa aggtctattg 720

attcatgccc ctgatgagca atactcggat ctgactattt tcaccacccg tcttacggca 780

gcgcgtgagt tacagcttgt ggctggggag gtcgttgtgg cttgcttcga tcttatggat 840

atctctgata ttgctccatc tcatcatgca tcggttcaag aggaacgtac tctcggcact 900

agcaagtatt ccaacgttac agctaatgag catccgttgg tgttcttttc acccaatgca 960

ttacgctggg caatagatca tgcctgtact gattccttga tttccactag gaatattcgg 1020

gtctgcgtcg gtattgaccc cttagtgacc agatggactc gcgatggcgt gcaggaggct 1080

gcaattctta tggatgacaa gctaccctca gcaggacgtg ctcggatggc tctacgaacc 1140

ttgcttctag cgcgtcgctc accaatgacg tccttcttac taggtgctct caagcagtcc 1200

ggtggtcagc taatggaaca ttatcgatgt gatgcggcta ataggtatgg atctcccacc 1260

attccagttt ctcaccctcc accgtgtcca aaatgtcctg agctgaaaga acagatcacc 1320

aaactttcgt cagctcctgc gcctaaagtt gactcgtccg ctggtcctgc cgtgctgttg 1380

tcgaagatcg ctgagctcca acgtgctaac cgagaactgt ccttgaagtt agtggacgtt 1440

cagccagccc gagaagacca ccttctagct tacctcaacg agcacgtatg tgttaacgct 1500

aaagatcacg agaaaggtct actagcccgt tgtaatgtct cgagtgattc aatcgccgct 1560

atccttggtc aacgtttgaa aaatcgagaa cggtttgaaa cgagactacg gcacgaggct 1620

ggtgcggagt gggagccacg agtggaagcg ttgaatcaag agttggctaa ggcgcgtatt 1680

gagcaacaag atatgatgac tcagtcctta cagtacctga atgaacgtga tgaactgctg 1740

cgcgaggtgg atgagctcaa acgcgaactg gctaccctac ggtttgctaa tgtgagacta 1800

aatgccgata accaccgcat gagtcgtgcg acccgtgttg gagatgtatt cgtcagtgat 1860

gttgatccct taccacccgg tcttcctggt gaatcgaaac catccattga agaactggta 1920

gatgatctgt gagctttgcc ttgtgactcg acttctctct gattccatgt acccacggcg 1980

gactcggcta ttcatctac 1999

<210> 9

<211> 1644

<212> DNA

<213> S1基因片段

<400> 9

gctttttcag tcccttgtat cgatgttccg tatgtcttcc ggttcatgca acggcgcgac 60

gtcaatattt ggtaacgtgc attgtcaagc ggcccaaaat accgcaggcg gagatcttca 120

agctacctcg tcattaattg cttattggcc ttatctcgct gctggtggtg gtctcattat 180

aattttaatt attgttatag gtataatctg ttgttgtaag gccaaagtta aggctgacgc 240

taccagaagt gtgttctatc gggagttgct tgctctgaac tcgggcaagt gtaatgcagc 300

acctccgtca tacgacgttt gatgtgcggc ggtttgagtt ttctccgacg gtgtttgaag 360

agtgtttgac tccatctttt accgctgtga ctgacactga ccctgtgagg tactttaata 420

ttgagcttcc gtcaactcac cgtctcctcc cttggcttcc cgttcttctg ttccaatcct 480

gtaaagtgca tgtttcttta gtacgtagat tctctttatg ctcgacttta tctgatattt 540

gtgagtacga ttgcaaattg cttccgtcta ttaacgctat tgtgtcgaat ccagtgtcga 600

gcgcggtttc atctatcgtc gttcactggg atggacggat taactcaaca gcagcgaaga 660

gaagtcgtgg ggttgatact gtcgttgact tcgagcgtga gtataagttc tggcgatttg 720

acgcaaattc gtgagcgtct ttccgctttg gaatctgcga ctgcgtcgct gaacgaatcc 780

gttaatacag ctttgtctag gttagtggat ttgtctgcat cgcttgataa cgtggcggcc 840

tcgttagcgg agacgaaagt ggaaatgaac tcactagttt ctgacgttca gggtttgcga 900

gcttcccttg actcttctgc ttcagagctg gcttctctat cttcattggt gcgtgatcac 960

ggctcttcga ttgctggcct acagagagaa gtaagtgcct tatcgagtga ggtaggcaac 1020

cttaaaacct cggtatcatc gcagggcctt actatcacta gccttgagaa acgagtgcaa 1080

gctttagaag gtggttctag tacgactctg tcatttgctg atcctcttaa gttagaggct 1140

gggaccgtgt cactcgaggt agatccgtat ttctgctctg tgaatcgtaa tctgacgtcg 1200

tattctgctg atgctcagtt gatgcaattt cagtggtctg tgaaagggga agatggcgcg 1260

gccaactcta ttgatatgga cgtgaacgct cactctcatg gttcacgcac tgattatctg 1320

atgtcaacca agcaatcatt gactgttaca acgtctcccg ctactcttgt ctttgaactg 1380

gataggatta ttgctcttcc ctccgacctt tctcgcctaa ttccatgtta tggttttcag 1440

caagccactt ttcccgttga tatctccttc cagcgagatg gcgtttcgca tacgtatcaa 1500

gtctatggga agtacacatc ttctcgcgtc ttcaagatta cgttctcgcc tggctcctca 1560

ggtcccgcag tgattaagtt tttgaccgtg cgtacgggca tcgataccta aggtgtggcg 1620

ccgtacgggg attggttatt catc 1644

<210> 10

<211> 1324

<212> DNA

<213> S2基因片段

<400> 10

gctttttctc ccacgatggc gcgtgccgtg tacgacttct tttctacgcc tttcgggaat 60

cgtggtctag cgacgaatcg tactcaacta tcatcactac tatcaagctc gaattcccca 120

tggcaacgtt ttctatcatc aatgactcca ttgacagcgc cgggcatcgt ttcgacacct 180

gaagcaccct atccaggttc gttaatgtat caagagtcta tgctccacag tgctaccgtc 240

cctggagtac ttggcaatcg cgacgcttgg cgtacgttca atgtcttcgg actttcatgg 300

actgacgaag gactgtcagg actagtggct acccaagatc ctcctcccgc cgccccgtat 360

cagccagcct ctgctcagtg gtcggatctt ctcaactacc ccagatgggc aaacagacgt 420

cgtgagctgc aatctaagta cccgcttctg cttcgctcca ctctgctctc tgccatgcga 480

gctggtcctg ttctatatgt tgagacgtgg ccgaatatga tttctggacg attagctgat 540

tggtttatgt cccaatatgg caataatttc gttgacatgt gtgctaggtt gacccagtct 600

tgttcgaaca tgcctgttga acctgatggg aattatgatc aacagatgcg tgctttaatt 660

agtttgtggc ttctgtcata cattggggta atcaaccaaa ccaacaccat cagcggtttc 720

tacttctcct caaagactcg gggtcaagcg ttggacagtt ggactttgtt ctataccacg 780

aatactaatc gtgtccaaat tacgcagaga cattttgctt atgtgtgcgc ccgatctcct 840

gattggaacg tggacaaatc atggatcgct gctgcgaact taaccgccat tgttatggct 900

tgccgtcaac cgccgatgtt tgctaatcaa ggcgtcatta atcaggcgca gaaccgaccc 960

ggattctcca tgaatggggg gacgcccgtc cacgagctca acttacttac tactgcgcaa 1020

gagtgcatca ggcagtgggt ggtagcaggc ttggtgtcgg cagcaaaggg gcaagcacta 1080

acgcaggaag ctaatgactt ctcaaacctc atccaggcgg atctaggcca gatcaaggcg 1140

caggacgacg ctttgtacaa tcagcagccg ggatacgcga ggagaataaa acctttcgtt 1200

aatggtgact ggacaccagg tatgaccgct caagctctgg ccgttctagc cacttttacc 1260

gcctaggcgt agggtcgtac gctgcccgag tccagccctc cggcagcacg tggatgtact 1320

catc 1324

<210> 11

<211> 1202

<212> DNA

<213> S3基因片段

<400> 11

gctttttgag tccttagcgt gcaagccgca atggaggtac gtgtgccaaa ctttcactcg 60

ttcgttgaag gaataacatc tagctacttg aagactcctg cttgctggaa tgcacaaaca 120

gcttgggata ctgtgacctt tcacgtccct gatgtaatta gagttggtaa cgcctactgt 180

tgttctcaat gttgtggtgt actctactac gggactctgc cctcggacgg taattatttc 240

cctcatcaca agtgtcatca gcaacagttt aggactgata ctccactgct tcgatacgtg 300

cgcattggta gaaccactga gcatctgatg gatcaatatg ctgtcgctct ggagtccatt 360

gctgaacact atgacgagat tagtcaacgt atggtcgatg agccagagaa tgacgaggtt 420

acacctcttg atatcgttac gcgtaccgaa tctatcagga gtgacaaggc agtcgaccca 480

gacttttgga catacccact tgagcggcgt tctgatgatt ctcgtagaga catcgcctca 540

gcatgctgga aaatgattga cgcgtcggcg cgtagtctca ctcttccaaa ttgcctcgtc 600

tccccctctt tgcactctcg ctccgtcttt ggtcagatgc aaacgaccac cactatatac 660

gatgttgcgg catcgggaaa ggccgttaag ttttcaccaa tggttgctac actagcgcaa 720

cgtgatgctg gccctgtaat gcttgcgaat gctgacccgg cggaaggcgt gtactctttc 780

tggacgtcgc acttcgcttt ctcaccgctc atcggcggag ttggaattac gggacagtac 840

gctcgtgagt cgtaccatca agtgggtcat ccagtgattg ggagtggtaa gaaggcatcg 900

cattacagga atctgttcat ggaagcgtgg cgcgggtggt cgaagtcagc tttcgcatgt 960

gctactggaa tggagccagc tgaatgtgaa tctcgtctga gaggacacgc tcgtactatg 1020

ctcggacgct ctctgccgcc cgtttgtgac gatgatgttg ctcagcagtc tggcgcggta 1080

ctgacttcgc tgcagaaaac gaacaagttc accgttgtgg agtgtggttg gtaagtacct 1140

ccgggtcaaa atgcacatag gctcccacct atgtgacggt tagcgggaca gatcggaaga 1200

gc 1202

<210> 12

<211> 1192

<212> DNA

<213> S4基因片段

<400> 12

gctttttgag tccttgcgca gccatggaca acaccgtgcg tgttggagtt tcccgcaaca 60

catccggcgc agctggtcag actgttttta gaaactttta cttactacga tgcaatatct 120

cagctgacgg tcgtaatgca acaaaagctg tgcaatccca ttttccattc ctttctcgtg 180

ctgtccgttg cctatctcct ctagccgctc attgtgctga taggactctt cgtcgtgaca 240

atgtgaaaca aattcttact cgtgagctgc catttccatc ggatttaatc aattacgcac 300

atcatgtgaa ctcatcctcc cttactactt ctcagggtgt cgaggcggca cgtctagtgg 360

cccaagtcta tggagaacag ctatcgtttg atcacattta tcccactggt tccgcaactt 420

actgccctgg agcgattgct aatgcgattt cccgtatcat ggctggtttt gtgccccacg 480

aaggtgacaa ctttaccccg gacggttcta ttgactatct cgccgccgac ctggtcgcgt 540

ataagttcgt gctcccttac atgctagata ttgtggacgg acgtccgcag attgttcttc 600

catcacacac tgttgaggag atgctgtcca acacgagttt gcttaattcg attgacgctt 660

catttggtat tgaatcgaag agcgatcaac gcatgacccg tgacgcggct gaaatgagtt 720

ctcgctcact taatgagctt gaggatcatg agcagagggg tcgaatgcct tggaaaatca 780

tgacggcaat gttcgcggcg caattgaagg tggagttgga cgccctagct gatgagcgcg 840

ttgaatctca ggctaacgct catgtgacat cttttgggtc tcgtctgttc aaccaaatgt 900

ctgcttttgt cccaattgat cgtgagttga tggagctggc tctactcatc aaagagcagg 960

gtttcgcaat gaatccaggg caagtcgcat ctaaatggtc gctgatacga cgatctggcc 1020

ccactcgccc gctatcaggc gcacgccttg agatcaggaa tggcaactgg acaattcgtg 1080

aaggtgacca gacgcttctg tctgtctccc cagctaggat ggcgtaaacg ggacccatgg 1140

tgcgggtgag gggccgccac accctctgcc gcgacctgga ctcttattca tc 1192

Claims

1.一种防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体含有抗鸡呼肠孤病毒株抗体；所述鸡呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201817。

2.权利要求1所述卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用保藏编号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒作为疫苗生产毒株，制成灭活疫苗；

（2）用制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；

（3）由高免蛋收集卵黄，经一次灭活、酸化萃取、二次灭活、粗滤、除菌过滤、浓缩和三次灭活后制备成防治新型鸡呼肠孤病毒的卵黄抗体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述灭活疫苗由如下方法制备而成：

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，用制备的灭活疫苗分4次对产蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述一次灭活具体为：将卵黄液与水按体积比1:(0.5~1.5)混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60~65℃条件下保温25~35min。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述酸化萃取具体为：向卵黄稀释液中加入所述卵黄稀释液体积2.5~3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后过滤收集滤液；所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.8-5.2。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述醋酸盐缓冲液的pH值为5.0。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述二次灭活具体为：向酸化萃取后的滤液中加入辛酸至终浓度3.5~4.5%，搅拌30-120min，搅拌后于2~8℃放置4~8小时；

步骤（3）中，所述除菌过滤具体为：用0.22μm滤膜过滤除菌。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述浓缩具体为：利用30-50KD的PES中空纤维超滤膜在2-8℃条件下进行浓缩，至抗体效价不低于1:512。

10.权利要求1所述的卵黄抗体在制备用于预防和/或治疗新型鸡呼肠孤病毒感染的制品中的应用；所述新型鸡呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201817。

11.保藏编号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒在制备治疗由鸡呼肠孤病毒引起的关节炎的卵黄抗体中的应用。