CN101081866A - 抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY，其特征在于，该IgY是选自抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY、抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性IgY、抗水产致病菌特异性复合IgY、抗水产真菌特异性复合IgY、抗水产病毒特异性复合IgY、抗呼肠孤病毒特异性IgY、抗鱼疱疹病毒抗原特异性IgY、抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY和抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性IgY中的一种或一种以上的组合。本发明还涉及该抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY的制备方法，以及该特异性IgY或复合IgY在注射剂、浸浴剂、饲料添加剂以及预配料中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及兽医领域，具体涉及一种抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY以及这种IgY在饲料添加剂和预配剂等中的应用。
背景技术
对于家畜中经常发生的感染性疾病，如感染性胃肠炎、流行性腹泻等，水产中经常发生的烂鳃病、肠炎病、烂尾病、细菌性败血症等，目前世界各地基本上主要采用抗生素和各种化学杀菌剂来防治。但是，一方面，家畜和鱼类中许多感染性疾病是由病毒引起的，抗生素对病毒是没有作用的；另一方面，全球都关注抗生素和化学药的残留问题，它会污染肉、鱼、蛋、奶等产品以及环境，危害人类健康；而且，滥用抗生素，还会诱发病菌发生变异，产生耐药菌，增加对这些疾病的治疗难度。开发一种安全有效的防治这样常见家畜和水产品感染性疾病的新方法，寻找既无药残，又无污染，又能提高饲養经济效益的抗生素替代品，成为摆在世界各国畜产、水产科学家和畜医学界的重要课题。
也有学者试图从猪的粪便中分离出一种大肠杆菌、一种传染性胃肠炎病毒、一种流行性腹泻病毒和轮状病毒，培飬后制作疫苗，用其免疫鸡，直接就采用母鸡卵黄干燥后作食品添加剂。由于引致猪腹泻的病菌除了大肠杆菌外，尚有魏氏梭菌和猪链球菌，而大肠杆菌、魏氏梭菌和猪链球菌又有几十种不同的型。引起传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒也有许多不同种型，而且经常发生变异。另外，未经提取的卵黄仅含有少量抗体成份，抗体活性很低，而且还含有许多脂蛋白和杂蛋白，直接用于治疗猪腹泻等疾病，效果成疑。因此，采用常规的方法所制成的认为可防治猪腹泻的仅可能对付个别细菌或病毒的、低活性的卵黄粉，对于种型繁多的顽固的致病菌及经常变异的病毒是难以真正达到实际效果的。
发明内容
针对现有技术的上叙缺陷，本发明的目的是提供一种抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY，通过对大肠杆菌、魏氏梭菌、链球菌菌株和病毒抗原的特殊处理方法以及采用基因工程重组传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒表达蛋白，提高其抗原性；并采用纯水提取IgY的工艺和纳米技术等方法，以增强所制备的卵黄免疫球蛋白的实际疗效。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
1.筛选引致家畜和水产感染性疾病的主要病原体，并根据这些有代表性的病原体的「抗原交叉性」进行分类组合。
1.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻：
1.1.1细菌类：
1.1.1.1肠毒性大肠埃希氏菌
1.1.1.2 C型魏氏梭菌菌株
1.1.1.3猪链球菌
1.1.2病毒类：
1.1.2.1猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)
1.1.2.2猪流行性腹泻病毒(PEDV)
1.1.2.3猪轮状病毒(HRV)
1.2水产类主要感染病原体
1.2.1细菌类：
1.2.1.1柱状嗜纤维菌
1.2.1.2嗜水气单胞菌
1.2.1.3气单胞菌
1.2.1.4孤菌
1.2.2真菌类：
1.2.2.1水霉菌
1.2.2.2绵霉菌
1.2.2.3丝囊霉菌
1.2.2.4鳃霉菌
1.2.3病毒类：
1.2.3.1呼肠孤病毒
1.2.3.2鱼疱疹病毒
1.3牛传染性胃肠炎和流行性腹泻：
1.3.1细菌类：
1.3.1.1牛肠毒性大肠埃希氏菌
1.3.1.2 B型魏氏梭菌菌株
1.3.2病毒类：
1.3.2.1牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)
1.3.2.2牛流行性腹泻病毒(PEDV)
1.3.2.3牛轮状病毒(HRV)
2.在筛选和分类组合各种家畜、水产类感染性疾病病原体的基础上，分别制备多种复合抗原：
2.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻两种抗原
2.1.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原
2.1.2制备致病菌抗原成份：
由于大肠杆菌型种太多，简单地用一种大肠杆菌免疫母鸡所制成的卵黄抗体对大多数大肠杆菌是无效的。针对这一难题，本发明采取以下两个方法解决：
2.1.2.1细菌超声粉碎，增加抗原性：
向美国病毒中心(ATCC)购买肠毒性大肠埃希氏菌(ATCC#51659)、C型魏氏梭菌(ATCC#12917)、猪链球菌(ATCC#700794)标准菌株按照肠毒性大肠埃希氏菌C型魏氏梭菌以及猪链球菌的培养特性和最适培养条件，分别选择适宜的培养基，进行菌株大量繁殖，收集培养物，提纯、分装；然后将肠毒性大肠埃希氏菌、C型魏氏梭菌、猪链球菌三种细菌按1∶1∶1的比例混合，再采用超声粉碎机将所培飬的大肠杆菌等粉碎，获得含全菌和菌体成份的混合物。
2.1.2.2用猪大肠杆菌k88、k99两种纤毛作为抗原成份：
委托新加坡国立大学培飬猪大肠杆菌k88、k99两种纤毛。由于这两种纤毛对是大多数大肠杆菌都具有抗原性；将其作为抗原成份，就可解决大肠杆菌型种繁复的难题。
2.1.3制作致病菌抗原
同样，采取两种不同方法：
2.1.3.1菌体抗原制作
把超声粉碎后所得到的大肠杆菌等的全菌和菌体成份混合物按1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌菌体组合复合抗原。
2.1.3.2杆菌纤毛抗原制作
将培飬好的猪大肠杆菌k88、k99两种纤毛混合先按1∶1比例混合均匀后按1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌纤毛组合复合抗原。
2.1.4猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒复合抗原
2.1.4.1本发明采用二种方法制作病毒抗原成份。
2.4.1.1.1病毒裂解法：
向美国病毒中心(ATCC)购买猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)-(ATCC#VR-743)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)-(ATCC#VR-669)以及猪轮状病毒(ATCC#VR-892)等三种病毒之标准毒株，采用常规方法增殖培飬，再提纯。将所增殖并提纯的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)以及猪轮状病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后加入十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为1.8-2.5％，裂解30分钟，即分别得到猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)以及猪轮状病毒组合的病毒裂解液。经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验分析，浓缩胶4％，分离胶7％，240V，电泳30分钟。考玛氏亮蓝染色，观察蛋白带。
2.1.4.1.2采用基因工程重组技术分别制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的表达蛋白，具体步骤如下：
2.1.4.1.2.1制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)表达蛋白用RT-PCR方法从猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)之RNA克隆基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T裁体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达裁体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichiapastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸馏水透析24小时以及SephacrylS-200和Sephacryl S-100柱层析后，即获得纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)表达蛋白。
2.1.4.1.2.2制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)表达蛋白
用RT-PCR方法从猪流行性腹泻病毒(PEDV)之RNA克隆基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T裁体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达裁体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸馏水透析24小时以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱层析后，即获得纯化的猪流行性腹泻病毒(PEDV)表达蛋白。
2.1.5制备病毒复合抗原
2.1.5.1病毒裂解抗原：
将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒以及猪轮状病毒以三者组合的病毒裂解液的比例以1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的病毒裂解复合抗原。
2.1.5.2基因工程病毒表达蛋白复合抗原：
将纯化的猪传染性胃肠炎病毒表达蛋白和纯化的猪流行性腹泻病毒表达蛋白以1-10∶1-10的比例混合均匀，然后再以1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的病毒表达蛋白复合抗原。
2.2水产类三种复合抗原
2.2.1水产致病菌复合抗原
2.2.1.2向美国病毒中心(ATCC)购买柱状嗜纤维菌、嗜水气单胞菌、气单胞菌、孤菌四种标准菌株，按照这四种细菌的培养特性和最适培养条件，分别选择适宜的培养基，进行菌株大量繁殖，收集培养物，提纯、分装；
2.2.1.2将所培飬好的嗜纤维菌、嗜水气单胞菌、气单胞菌、孤菌按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后加以超声粉碎，再按1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得水产致病菌复合抗原。
2.2.2水产真菌复合抗原
2.2.2.1向美国病毒中心(ATCC)购买水霉菌、绵霉菌、丝囊霉菌、鳃霉菌四种标准真菌株，按照这四种真菌的培养特性和最适培养条件，分别选择适宜的培养基，进行真菌株大量繁殖，收集培养物，提纯、分装；
2.2.2.2将所培飬好的水霉菌、绵霉菌、丝囊霉菌、鳃霉菌四种真菌按1∶1∶1∶1的比例混合，然后加以超声粉碎，再按1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得水产真菌复合抗原。
2.2.3水产病毒复合抗原
向中国福建省水产研究所购买现成的草鱼出血病疫苗(抗呼肠孤病毒)和斑点叉尾鮰病毒疫苗(抗鱼疱疹病毒)采用本发明的特殊方法进行加工处理：将其按1∶1比例混合后进行超高速离心分离，再浓缩加工；然后加入十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为1.8-2.5％，裂解30分钟。再以1-10∶10-1比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得特别的水产病毒疫苗式复合抗原。
2.2.4呼肠孤病毒抗原
向中国福建省水产研究所购买现成的草鱼出血病疫苗(抗呼肠孤病毒)采用本发明的特殊方法进行加工处理：将其置入超高速离心分离，再浓缩加工；然后加入十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为1.8-2.5％，裂解30分钟。再以1-10∶10-1比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得特别的呼肠孤病毒抗原。
2.2.4鱼疱疹病毒抗原
向中国福建省水产研究所购买现成的斑点叉尾鮰病毒疫苗(抗鱼疱疹病毒)采用本发明的特殊方法进行加工处理：将其置入超高速离心分离，再浓缩加工；然后加入十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为1.8-2.％，裂解30分钟。再以1-10∶10-1比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得特别的抗鱼疱疹病毒抗原。
2.3牛传染性胃肠炎和流行性腹泻两种抗原
2.3.1牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原
同样参照猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原的两种制备方法制作：
2.3.1.1制备致病菌抗原成份
细菌超声粉碎，增加抗原性
向美国病毒中心(ATCC)购买牛肠毒性大肠埃希氏菌(ATCC#4350)、B型魏氏梭菌标准菌株(ATCC#12915)；按照牛肠毒性大肠埃希氏菌和B型魏氏梭菌的培养特性和最适培养条件，分别选择适宜的培养基，进行菌株大量繁殖，收集培养物，提纯、分装；然后将肠毒性大肠埃希氏菌、B型魏氏梭菌两种细菌按1∶1的比例混合，再采用超声粉碎机将所培飬的牛大肠杆菌等粉碎，获得含全菌和菌体成份的混合物。
2.3.1.2用牛大肠杆菌纤毛作为抗原成份
委托新加坡国立大学培飬牛大肠杆菌纤毛，将其作为抗原成份。制作致病菌抗原同样，采取两种不同方法：
2.3.1.2.1菌体抗原制作
把超声粉碎后所得到的牛大肠杆菌等的全菌和菌体成份混合物按1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌菌体组合复合抗原。
2.3.1.2.2杆菌纤毛抗原制作
将培飬好的牛大肠杆菌纤毛混合均匀后按1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌纤毛组合复合抗原。
2.3.2牛传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒复合抗原
2.3.2.1本发明采用二种方法制作病毒抗原成份。
2.3.2.1.1病毒裂解法：
向美国病毒中心(ATCC)购买牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)-(ATCC#VR-758)和牛流行性腹泻病毒(PEDV)-(ATCC#VR-1422)以及牛轮状病毒(ATCC#VR-2101)等三种病毒之标准毒株，采用常规方法增殖培飬，再提纯。将所增殖并提纯的牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)和牛流行性腹泻病毒(PEDV)以及牛轮状病毒按1∶1∶1的比例混合，然后加入十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为1.8-2.5％，裂解30分钟，即分别得到牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)和牛流行性腹泻病毒(PEDV)以及牛轮状病毒组合的病毒裂解液。经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验分析，浓缩胶4％，分离胶7％，240V，电泳30分钟。考玛氏亮蓝染色，观察蛋白带。
2.3.2.1.2采用基因工程重组技术分别制备牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)和牛流行性腹泻病毒(PEDV)的表达蛋白，具体步骤如下：
2.3.2.1.2.1制备牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)表达蛋白
用RT-PCR方法从牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)之RNA克隆基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T裁体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达裁体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱层析后，即获得纯化的牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)表达蛋白。
2.3.2.1.2.2制备牛流行性腹泻病毒(PEDV)表达蛋白
用RT-PCR方法从牛流行性腹泻病毒(PEDV)之RNA克隆基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T裁体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达裁体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50％硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱层析后，即获得纯化的牛流行性腹泻病毒(PEDV)表达蛋白。
2.3.2.2制备病毒复合抗原
2.3.2.2.1病毒裂解抗原：
将牛传染性胃肠炎病毒和牛流行性腹泻病毒以及牛轮状病毒以三者组合的病毒裂解液的比例以1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得牛传染性胃肠炎和牛流行性腹泻的病毒裂解复合抗原。
2.3.2.2.2基因工程病毒表达蛋白复合抗原：
将纯化的牛传染性胃肠炎病毒表达蛋白和纯化的牛流行性腹泻病毒表达蛋白以1-10∶1-10的比例混合均匀，然后再以1-10∶1-10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得牛传染性胃肠炎和牛流行性腹泻的病毒表达蛋白复合抗原。
3.制备含高活性抗体的免疫蛋
选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的健康无特定病原体携带的(SPF)健康产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟等)，分别采用上叙制备的：
3.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原、
3.2猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒复合抗原、
3.3水产致病菌复合抗原、
3.4水产真菌复合抗原、
3.5水产病毒复合抗原、
3.6呼肠孤病毒抗原、
3.7鱼疱疹病毒抗原
3.8牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原、
3.9牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒复合抗原等
九种复合抗原在皮下注射，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记。
4.抗家畜和水产病原体特异性复合IgY或IgY粗品的制备
将不同抗原分别免疫的禽类所产高免疫蛋用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15-30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH至5.5-6.0，4-6℃下静置过夜，稀释液8,000-12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩。
然后，采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。
第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。
最后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得九种不同的抗家畜和水产病原体的特异性复合IgY或IgY粗品，分别为：
4.1抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性复合IgY、
4.2抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性复合IgY、
4.3抗水产致病菌特异性复合IgY、
4.4抗水产真菌特异性复合IgY复合抗原、
4.5抗水产病毒特异性复合IgY、
4.6抗呼肠孤病毒特异性IgY、
4.7抗鱼疱疹病毒抗原特异性IgY、
4.8抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性复合IgY、
4.9抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性复合IgY。
5.抗家畜和水产病原体特异性复合IgY或IgY纯品制备
将所制得的抗家畜和水产病原体特异性复合IgY或IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，即得纯复合IgY；
应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗家畜和水产病原体特异性复合IgY或IgY纯品进行检测，测得其中IgY含量为98％以上。
采用酶联免疫法(ELISA)测得抗家畜和水产病原体特异性复合IgY或IgY生物活性效价达1∶100,000。这是一般抗原制备方法和一般免疫方法所做不到的，更是直接将鸡蛋黄干燥制成的普通蛋黄粉所不可相提并论的。这样高的生物活性才有可能用于治疗和真正预防家畜和水产的疾病，才有可能替代目前广泛使用的抗生素；也只有具有这样高的生物活性才能当以高比例与饲料混合或用水高度稀释后仍然有效，才真正的具有在低价值的飬殖业实际应用的价值。
6.取所述抗家畜和水产病原体特异性复合IgY或IgY干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗家畜和水产病原体特异性复合IgY或IgY干粉。这种纳米化的抗家畜和水产病原体特异性复合IgY或IgY更容易渗透进入家畜或水产的胃肠粘膜发生作用。
7.实际应用：
将0.01-20.0％的抗家畜和水产病原体特异性复合IgY或IgY(上列九种中的其中一种或数种)配以99.99-80.0％的玉米蛋白粉或小麦粉或氨基酸粉或工业葡萄糖等载体成份或辅料，可制成各种家畜用和水产用饲料添加剂或预配料或注射剂或者水产专用之浸浴剂。用于预防和治疗各种家畜和水产感染性疾病。
7.1用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻：
将采用猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原高免疫禽类所制得的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY和采用猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒复合抗原高免疫禽类所制得的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异性IgY按1∶1的比例混合均匀，制成一种抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY，用其配以各种载体或辅料，就可代替抗生素和化学药用于预防和治疗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻等感染性疾病。也可分别将其中一种抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY或抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒IgY配以各种载体或辅料，代替抗生素和化学药用于预防和治疗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻等感染性疾病。
7.2用于水产常见的感染性疾病：
将采用水产致病菌复合抗原高免疫禽类所制得的抗水产常见致病菌特异性复合IgY和采用水产真菌复合抗原高免疫禽类所制得的抗水产真菌特异性复合IgY以及采用水产病毒复合抗原高免疫禽类所制得的抗水产常见病毒特异性复合IgY按1∶1∶1的比例混合均匀，制成一种抗水产感染性疾病特异性复合IgY，用其配以各种载体或辅料，就可代替抗生素和化学药用于预防和治疗水产常见感染性疾病，如：烂鳃病、草鱼出血病、鲤痘疮病、鱼肠炎病、败血症鱼肤霉病和鳃霉病等水产类常见的感染性疾病。也可分别将其中一种抗水产常见致病菌特异性复合IgY或抗水产真菌特异性复合IgY或抗水产常见病毒特异性复合IgY或者抗呼肠孤病毒特异性IgY、抗鱼疱疹病毒抗原特异性IgY配以各种载体或辅料，代替抗生素和化学药用于预防和治疗水产常见感染性疾病。
7.3用于牛传染性胃肠炎和流行性腹泻
将采用牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原高免疫禽类所制得的抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY和采用牛传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒复合抗原高免疫禽类所制得的抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异性IgY按1∶1的比例混合均匀，制成一种抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY，用其配以各种载体或辅料，就可代替抗生素和化学药用于预防和治疗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻等感染性疾病。也可分别将其中一种抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY或抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒IgY配以各种载体或辅料，代替抗生素和化学药用于预防和治疗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻等感染性疾病。
本发明的技术方案在以下方面有很大不同：
1.由于肠毒性大肠埃希氏菌和魏氏梭菌型别很多，除了一部分大肠杆菌之间有抗原交叉外，许多型号互相间并没有抗原交叉；如果只是简单地选一种大肠杆菌来作抗原免疫鸡，所制成的抗体将只会仅对所免疫的那一种大肠杆菌有一定作用；对其他型号的大肠杆菌则没有作用，对经常发生的魏氏梭菌和猪链球菌更根本无效。为解决这一难题，本发明从两大途径来解决这一难题：第一，根据流行病学调查针对不同家畜选择最常发生的一种型号的大肠杆菌和魏氏梭菌以及链球菌，同时在制作抗原时采用专有技术将细菌超声粉碎，得到菌体成份，这样细菌表面的抗原表位与细菌菌体部分的抗原表位相结合，就大大增强了抗原表位，显著提高了其抗原性。使所制得的抗致病菌IgY对同种不同型的细菌都有抑制作用；第二，根据对大肠杆菌结构的研究，不同型种的大肠杆菌之间有共同的纤毛组织，我们以其共同的大肠杆菌纤毛作为抗原来免疫禽类，所制得的卵黄抗体就会对常见的各种不同的大肠杆菌有抑制作用。这一优点在下文的试验实例中己得到了验证。
2.由于引致家畜和水产感染性疾病的病毒往往会发生变异，如果采用常规方法制备卵黄抗体，对用以制作抗原的那一种病毒在某一次试验中也许表现有效；但是，这病毒是会不断变异的，这种卵黄抗体对变异了的病毒抑制作用就差得多。本发明人在深入研究病毒分子结构的基础上，针对病毒的变异性，采用了两大措施提高抗原性，特别是扩展抗原交叉范围：一是采用独创的方法将病毒裂解后再制作抗原，使病毒内部的抗原表位暴露出来，从而增加病毒的抗原表位，提高其抗原性；二是从强化抗原性和简化生产流程出发，应用基因工程技术制作了多种病毒表达蛋白，并用这种表达蛋白制备抗原，再用这种强化抗原性的表达蛋白抗原免疫禽类。这样，就使所制得的特殊IgY对容易变异的病毒一样有很强的抑灭作用，从而大大提高了最终产品的实际疗效，增强了其实用性。另外，采用基因工程表达蛋白制作抗原，也省略了病毒增殖的复杂程序；由于表达蛋白生产速度比病毒增殖快得多，也为大规模生产卵黄抗体创造了条件。
3.发明人在反复研究禽类对各种微生物抗原的免疫应答中发现，禽类对病毒和细菌的免疫应答反应是不一样的；另外，抗原所包含的微生物种类不可太多，否则会影响抗体的效价。根据这一发现，本发明人特地将抗原组成分成细菌组和病毒组，并采取特别的免疫启动方法进行免疫；从而，增强了被免疫的禽类之免疫应答，提高了所制成的特异性抗体的活性。
4.由于许多鱼类感染性疾病是真菌引发的，因此，发明人筛选了最有代表性的四种真菌制作抗原制备了一种抗水产霉菌特异性复合IgY，把它作为副作用很大的杀真菌化学药的最佳替代。
5为了使所制备的IgY抗体进入家畜或水产胃肠道后，更容易渗透到肠道粘膜发挥有效作用；本发明人应用纳米技术将所制得的IgY抗体纳米化，并在实际配方中加入了表皮渗透剂；从而，进一步提升了其功效。
具体实施方式
下面通过试验例与实施例对本发明进行进一步的说明。
一.试验例
试验例1：抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY和抗水产感染性疾病特异性复合IgY以及抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY的含量检测
应用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯凝胶)电泳测定法，分别对按以上工艺所制取的不同的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY和抗水产感染性疾病特异性复合IgY以及抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY粗提物进行检测，结果含IgY 45-52％。IgY粗提物经二次过柱纯化后，得到纯IgY。经SDS-PAGE分析，纯度达到PAGE纯，如下表所示：
| IgY纯品 | 纯IgY含量 |
| 抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合 | 99.99％ |
| IgY | |
| 抗水产感染性疾病特异性复合IgY | 99.98％ |
| 抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY | 99.99％ |
试验例2：抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY活性检测
分别采用按本发明之两种猪致病菌抗原方案所制备的两种抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY和只用一种分离所得的猪大肠杆菌作抗原免疫母鸡所得到的卵黄粉，共三种卵黄抗体，以(1)猪肠毒性大肠埃希氏菌标准株和纤毛蛋白、(2)台湾猪场分离得到的猪肠毒性大肠埃希氏菌野生株、(3)C型魏氏梭菌、(4)B型魏氏梭菌、(5)猪链球菌、(6)分离所得野生猪大肠杆菌等六种细菌作为检测抗原，用“ELISA”方法检测所制得的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY的抗体效价。结果如下表：
| IgY | 检测用抗原 | 抗体效价 |
| 用菌体抗原制成的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY | 猪肠毒性大肠埃希氏菌标准株猪肠毒性大肠埃希氏菌野生株C型魏氏梭菌B型魏氏梭菌猪链球菌 | 1∶20481∶20481∶20481∶10241∶2048 |
| 用纤毛抗原制成的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY | 猪肠毒性大肠埃希氏菌纤毛蛋白C型魏氏梭菌B型魏氏梭菌猪链球菌 | 1∶10241∶20481∶10241∶2048 |
| 只用一种大肠杆菌免疫母鸡所得的卵黄抗体 | 所免疫的猪大肠杆菌美国ATCC提供的猪肠毒性大肠埃希氏菌标准株 | 1∶320 |
从以上检测结果可看出，无论采取(1)预先将抗原细菌超声粉碎制作含菌体成份的抗原，所制备的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY不但对直接作为抗原免疫的菌型之细菌有很高的抗体结合效价，对没有作为抗原免疫的同型细菌也有很高效价，对没有作为抗原免疫的不同型细菌也有理想的效价。试验结果证明，本发明所采用的方法对提高所制备的IgY抗体的抗原性确实有理想的效果。反之，只用一种分离所得的猪大肠杆菌直接制备抗原免疫母鸡，收集卵黄干燥所得到的含少量抗体的卵黄粉，仅会对作为抗原那一种大肠杆菌有一点效价，对大多数其它种类繁多的大肠杆菌是没有作用的；上列的试验结果也证明了这一点。
试验例3：抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异性IgY活性检测
分别以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)标准株和台湾猪场分离得到的野生株以及猪流行性腹泻病毒(PEDV)标准株和台湾猪场分离得到的野生株作为检测抗原，用“ELISA”方法检测以病毒裂能解成分作为抗原免疫所制得的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY的抗体效价。结果如下表：
| IgY | 检测用抗原 | 抗体效价 |
| 抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异性IgY(以病毒裂能解成分作为抗原免疫) | 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)标准株猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)野生株猪流行性腹泻病毒(PEDV)标准株猪流行性腹泻病毒(PEDV)野生株 | 1∶102,4001∶102,4001∶102,4001∶51,200 |
从以上检测结果可看出，采用发明人的特殊方法将作为抗原的病毒裂解后将制作含裂解成份的抗原，所制备的特异性IgY，不但对直接作为抗原免疫的病毒有很高的抗体结合效价，对没有作为抗原免疫的有变异的同种病毒也有很高效价。试验结果证明，本发明的病毒裂解法对提高所制备的病毒抗原的抗原性确实很好的效果。
试验例4：各种不同抗流感病毒特异性IgY和抗继发感染细菌特异性IgY的活
性检测
取抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY(以表达蛋白制作病毒抗原)和抗水产感染性疾病特异性复合IgY以及抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY(以表达蛋白制作病毒抗原)，分别以猪、鱼、牛常见的病原体为检测抗原，采用“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)进行活性检测。结果如下表所列：
三种特异性复合IgY效价检测结果
| IgY | 抗原 | 抗体结合效价 |
| 抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY(以表达蛋白制作病毒抗原，以细菌超声粉碎法制作致病菌抗原) | 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)猪流行性腹泻病毒(PEDV)猪轮状病毒(HRV)肠毒性大肠埃希氏菌C型魏氏梭菌猪链球菌 | 1∶204,8001∶102,4001∶51,2001∶2,0481∶2,0481∶2,048 |
| 抗水产感染性疾病特异性复合IgY(以鱼出血病疫苗和斑点叉尾鲴病毒疫苗混合浓缩制作抗原) | 柱状嗜纤维菌嗜水气单胞菌气单胞菌孤菌水霉菌绵霉菌丝囊霉菌鲤霉菌呼肠孤病毒鱼疱疹病毒 | 1∶4,0961∶4,0961∶2,0481∶4,0961∶2,0481∶2,0481∶1,0241∶2,0481∶51,2001∶51,200 |
| 抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY(以表达蛋白制作病毒抗原，以细菌超声粉碎法制作致病菌抗原) | 午传染性胃肠炎病毒(TGEV)牛流行性腹泻病毒(PEDV)牛轮状病毒(HRV)肠毒性大肠埃希氏菌B型魏氏梭菌 | 1∶102,4001∶102,4001∶51,2001∶2,0481∶2,048 |
检测结果显示，所制得的三种不同特异性复合IgY，其中抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)以及猪轮状病毒(HRV)等病毒的抗体结合效价都达到1∶51,200以上，对肠毒性大肠埃希氏菌和C型魏氏梭菌以及猪链球菌的抗体结合效价也达到1∶2,048以上。而抗水产感染性疾病特异性复合IgY对柱状嗜纤维菌等致病菌的抗体结合效价达到1∶2,048以上；对水霉菌等真菌的抗体结合效价也达到1∶1,024以上；对呼肠孤病毒和疱疹病毒的抗体结合效价则达到1∶51,200以上。而抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY则对牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)和牛流行性腹泻病毒(PEDV)以及牛轮状病毒(HRV)三种病毒的抗体结合效价也都达到1∶51,200以上；对肠毒性大肠埃希氏菌和B型魏氏梭菌两种致病菌的抗体结合效价也都达到1∶2,048以上。
所作的酶联免疫吸附试验结果表明，采用本发明人的特殊抗原制作法和免疫启动方法以及改进的工艺技术所制得的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY和抗水产感染性疾病特异性复合IgY以及抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY分别对猪常见的致病菌和病毒、水产常见致病菌、真菌、病毒以及牛常见致病菌和病毒都有很强的抑制作用，既使高度稀释，在很低的使用浓度下仍然会有效，完全可满足在家畜和水产品中大面积使用的要求。
二.实施例
实施例1：用基因工程法制备抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异性复合鸭IgY
1.制备两种病毒的表达蛋白抗原成份，具体包括以下步骤：
用RT-PCR方法分别从抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)之RNA克隆基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T裁体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达裁体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经硫酸铵沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时以及Sephacryl S-200和Sephacryl S-100柱层析后，即分别获得纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)表达蛋白和猪流行性腹泻病毒(PEDV)表达蛋白。
2.制备基因工程表达蛋白抗原
将以上所制成的基因工程所述方法而制得的纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)表达蛋白和猪流行性腹泻病毒(PEDV)表达蛋白按1∶1比例混和(浓度：200微克/mL)，充分混合均匀；然后以1-10∶10-1加入福氏佐剂，置入高速匀浆器，采用30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得基因工程表达蛋白抗原。
3.制备免疫蛋
1)优选具有高免疫应答能力的良种母鸭
用所制得的基因工程表达蛋白抗原免疫100只产蛋母鸭，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些产蛋母鸭所产的蛋分别标记后，再按常规方法分别提取其中的IgY；以酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测所制得的IgY的效价，如果某只母鸭所产蛋制成的IgY的效价大于1∶1024，则选出该只母鸭；再用所选出母鸭所产的蛋孵出优良鸭种；待其长大至2～3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种母鸭。
2)分别对优选的特种母鸭进行强化免疫
用所制备的基因工程表达蛋白抗原，采用皮下注射的强化免疫法，分别对优选的特种母鸭进行免疫，每只母鸭每次注射量达到1～2ml抗原，每隔二周再强化注射一次，共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鸭所产免疫蛋。
3)制备抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异性复合鸭IgY粗提物
用流动水洗净免疫鸭蛋，再用酒精擦洗消毒；然后用打蛋机将免疫蛋打碎，蛋黄筛滤去蛋清，留下蛋黄并搅拌均匀；按蛋黄体积的4～6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用1.0N HCI溶液调pH至5.5～6.0；将调好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2～6℃，静置12小时～24小时；将上述稀释液于10000rpm条件下，离心20分钟；取分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩15倍；加入2.0％海藻酸钠溶液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊沉淀，再加入2.0％CaCl2溶液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，并于4℃条件下过夜；于8000rpm条件下离心20分钟，取上清，再用0.45um膜过滤除菌；再进行冷冻干燥，即制得抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异性复合鸭IgY的粗提物干粉。
4)提纯
将所述抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异性复合鸭IgY的粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)，再先后过离子交换柱、凝胶层析柱，再用美国Pall膜除菌过滤器和除病毒过滤器去除细菌和病毒，得到纯化的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒特异性复合鸭IgY纯品。
实施例2：用鱼用疫苗作抗原制备抗水产常见病毒特异性火鸡IgY
具体实施步骤如下：
向中国福建省水产研究所购买现成的草鱼出血病疫苗(抗呼肠孤病毒)和斑点叉尾鮰病毒疫苗各50支(每支300μg/1.5mL)先将二者混匀，然后置入超高速离心机中分离病毒成份。再加入十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为1.8-2.5％，于37℃裂解30分钟，即得到病毒裂解液。
再将这种裂解液按1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以30,000rpm高速匀化，形成油包水液体，即制成疫苗成份裂解抗原，计150mL。再以这种疫苗式抗原免疫健康的产蛋火鸡50只，每只肌内注射1mL，每隔二周注射一次，共计三次。
第一次注射后第20天开始检取免疫蛋，至第50天，共检取1,200只免疫蛋；将其用流动水冲净，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋壳，以蛋黄筛滤去蛋清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀，用1.0N HCI调pH至5.5-6.0，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCI2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥；即制得抗水产常见病毒特异性火鸡IgY粗提物120克。
将以上IgY粗提物先后过离子交换树脂柱和凝胶层析柱层析，即制得一种以疫苗成份裂解抗原免疫的抗水产常见病毒特异性火鸡IgY纯品25克。
检验生物活性
将制备得到抗水产常见病毒特异性火鸡IgY分别以呼肠孤病毒和鱼疱疹病毒作为检测抗原，用ELISA法检测这种抗水产常见病毒特异性火鸡IgY对这两种病毒的抗体结合效价。结果如下面所示：
| IgY | 抗原 | 抗体结合效价 |
| 抗水产常见病毒特异性火鸡IgY(以「疫苗裂解成份」免疫) | 呼肠孤病毒 | 1∶51,200 |
| 鱼疱疹病毒 | 1∶51,200 |
实施例3：将抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY和抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY的纳米化，提高生物利用度，进一步增强其疗效
纳米化IgY干粉的制备：
将本发明所制备的抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY和抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY干粉经超精细方法加工成1～100nm之间的超微颗粒，就成为纳米级的IgY超微粉末。本发明是将这两种IgY之一加入“超微粉碎机”中碾磨粉碎，得到≥15,000目的超微粒子。将这种抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY和抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY纳米干粉，做成预配料或饲料添加剂供家畜食用，可使其中的IgY对胃肠粘膜的吸附能力和渗透能力大幅度提高，更易进入粘膜层中发挥抑制病毒和病菌的作用。
实施例4：抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY预配料的配制
用前叙方法分别制备抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性致病菌特异性IgY和抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性病毒特异性IgY，然后将二者按1-2∶2-1比例混合成抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY200g，以此作为主要原料制成一种可预防和治疗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的猪饲料绿色预配料。
猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY 200g
工业用葡萄糖 20,000g
把两个成份加入混料机中充分搅匀。然后用包装机按每袋100g分装，再装箱。抽样检验合格后出厂。
实施例5：抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY预配料的配制
用前叙方法分别制备抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性致病菌特异性IgY和抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性病毒特异性IgY，然后将二者按1-2∶2-1比例混合成抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY600g，以此作为主要原料制成一种可预防和治疗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的牛饲料绿色预配料。
牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY 600g
工业用葡萄糖 60,000g
把两个成份加入混料机中充分搅匀。然后用包装机按每袋100g分装，再装箱。抽样检验合格后出厂。拌在饲料中喂食，或用水稀释供乳牛或病牛饮用。
实施例6：抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY预配料的实际应用在饲料中添加量：
人工乳、教槽料 2kg/MT
哺乳料 1kg/MT
肉猪料 0.5kg/MT
母猪料 0.3-0.5kg/MT
配成饮水剂：
加护离乳猪饮用 1kg泡5-10升水
普通猪只饮用 1kg泡100升水
疫情严重治疗，可加大用量使用。
实施例7：治疗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻注射剂制造配方如下表所示：
| 材料 | 配方一(kg) | 配方二(kg) | 配方三(kg) |
| 抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY | 3 | 3 | 3 |
| Pluronic | 4 | 5 | 6 |
| 聚乙烯吡咯烷酮 | 4 | 5 | 6 |
| PEG400 | 46 | 66 | 86 |
| 聚山梨醇酯-88 | 13 | 11 | 9 |
| 注射用水 | 加至1000L | 加至1000L | 加至1000L |
取上述配方一为例，制备工艺如下：
取注射用水800L加Pluronic和聚乙烯吡咯浣酮加热溶解，另取聚山梨醇酯-80加PEG400混匀，在搅拌下加入上述混合液中，再加0.1％针用活性碳，60℃下搅拌15分钟，脱炭过滤，再将滤液密封加热至100℃，30分钟；然后冷却至室温备用。
另取用针用活性炭吸附，脱炭，煮沸，并冷至室温的注射用水剩余量，于无菌容器中加入IgY冻干粉溶解，继续搅拌下，呈细注加入第1)项之溶液中，用脱炭无菌注射用水补足全量。
用美国Pall膜除菌过滤器和除病毒过滤器去除细菌和病毒，于无菌灌装机中灌装于无菌容器中，每支50ml，含IgY 150毫克，印字，包装即得。实施例8：治疗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻注射剂制造
用前述的方法制备抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY 500g，按下丁配方制成一种治疗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的新型注射剂。
抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY 500g
Pluronic F68 1,000g
聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 1,000g
PEG400 1,1000g
聚山梨醇酯-80 1,000g
注射用水 加至100L
注射用水，加入Pluronic和PVP，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混匀；在搅拌下加入上述混合液中；再加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min；脱炭过滤；滤液密闭加热100℃ 30min，冷却至室温备用。
取经活性炭处理过的灭菌注射用水，于灭菌容器中加入抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY冻干粉溶解，继续搅拌下，以细流加于上述混合液中，用0.1mol的NaOH溶液调节pH至6.0～7.5，用脱炭灭菌注射用水补足全量。
已灭菌的0.45μm串联0.22μm微孔滤膜除菌过滤。于无菌灌封机中灌封于无菌容器中。每支5mL含抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY纯冻干粉12.5mg。灯检、检漏、印字、包装即得20000支IgY注射剂。规格12.5mg/5mL。
实施例9：鱼用绿色饲料配制
配方如下表所示：
饲料组成 配比(％)
抗水产感染性疾病特异性复合Igy 0.05
葵花仔饼粉 20
花生饼粉 20
小麦粉 30
麸皮 5
豌豆粉 5
碎米 9
混合维生素 0.95
啤酒酵母 10
按配方，制备工艺如下：
先将配方中除IgY和混合维生素以外成份依次加入搅拌机中充分混合均匀，80℃干燥2小时，冷至室温，按等量递加法与IgY、混合维生素混匀；用全自动包装机，按每袋100克分袋包装密封，打码。抽样检测合格后出厂。
实施例10：水产用新一代水产饲料的配制
用前叙方法制备抗水产感染性疾病特异性复合IgY干粉100克，以这种复合IgY为主要原料，制成新一代水产饲料，用于鱼类肠炎病、烂鳃病、孤菌病、红鳍病(鳗鱼)以及虾类黑鳃病红腿病、烂眼病等；对水产其它病毒性、细菌性、霉菌性水产疾病也都有显著疗效。
配方如下表：
抗水产感染性疾病特异性复合IgY干粉 100g
全蛋粉 900g
制备工艺如下：
将全蛋粉按等量递加法与IgY混匀；用全自动包装机，按每袋100克分袋包装密封，打码。抽样检测合格后出厂。
用法及用量：
拌饲口服，预防用量为50-100mg/kg体重，治疗用量为100-200mg/kg体重。制成药饵投喂；每日一次，连用5-7日。
也可直接将抗水产感染性疾病特异性复合Igy干粉或者抗呼肠孤病毒特异性IgY、抗鱼疱疹病毒抗原特异性IgY干粉之其中一种或二种以万分之一至千分之五的浓度用水稀释，然后采用这种“无药残，又无污染”的IgY水溶液浸浴水产，达到除菌消毒的目的。
实施例11：治疗草鱼出血病注射剂制造
用前述的方法制备抗呼肠孤病毒特异性IgY 50g，按下丁配方制成一种治疗草鱼出血病的新型注射剂。
抗呼肠孤病毒特异性IgY 50g
Pluronic(聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物)F68 100g
聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 100g
PEG400 1,100g
聚山梨醇酯-80 100g
注射用水 加至10L
注射用水，加入Pluronic和PVP，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混匀；在搅拌下加入上述混合液中；再加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min；脱炭过滤；滤液密闭加热100℃ 30min，冷却至室温备用。
取经活性炭处理过的灭菌注射用水，于灭菌容器中加入抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY冻干粉溶解，继续搅拌下，以细流加于上述混合液中，用0.1mol的NaOH溶液调节pH至6.0～7.5，用脱炭灭菌注射用水补足全量。
已灭菌的0.45μm串联0.22μm微孔滤膜除菌过滤。于无菌灌封机中灌封于无菌容器中。每支5mL含抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY纯冻干粉12.5mg。灯检、检漏、印字、包装即得2000支IgY注射剂。规格12.5mg/5mL。
实施例12：治疗鱼疱疹病毒病注射剂制造
用前述的方法制备抗鱼疱疹病毒抗原特异性IgY 50g，按下丁配方制成一种治疗鱼疱疹病毒病注射剂。
抗鱼疱疹病毒抗原特异性IgY 50g
Pluronic F68 100g
聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 100g
PEG400 1,100g
聚山梨醇酯-80 100g
注射用水 加至10L
注射用水，加入Pluronic和PVP，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混匀；在搅拌下加入上述混合液中；再加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min；脱炭过滤；滤液密闭加热100℃ 30min，冷却至室温备用。
取经活性炭处理过的灭菌注射用水，于灭菌容器中加入抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY冻干粉溶解，继续搅拌下，以细流加于上述混合液中，用0.1mol的NaOH溶液调节pH至6.0～7.5，用脱炭灭菌注射用水补足全量。
已灭菌的0.45μm串联0.22μm微孔滤膜除菌过滤。于无菌灌封机中灌封于无菌容器中。每支5mL含抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY纯冻干粉12.5mg。灯检、检漏、印字、包装即得2000支IgY注射剂。规格12.5mg/5mL。
实施例13：动物试验验证实际应用效果
试验材料：普通饲料加抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY预配料(2kg/MT)
试验动物：出生至70龄仔猪
数量：683只
试验地点：台湾台南市猪场
| 项目 | 对照组(普通饲料) | 试验组(普通饲料加抗猪流行性腹泻IgY预配料) |
| 试验初期试验结束总发生事故猪只 | 320208112 | 36334817 |
| 营飬不良死亡淘汰总发生事故率试验初期体重试验终了体重 | 31712035％1.324.9 | 4944.7％1.327.3 |
从试验结果可以清楚看出：给刚出生的幼猪喂食含抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻特异性复合IgY的饲料，可使仔猪的存活率大幅度提高，仔猪体重也明显增加。
Claims (10)
1.一种抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY，其特征在于，该IgY是选自抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY、抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性IgY、抗水产致病菌特异性复合IgY、抗水产真菌特异性复合IgY、抗水产病毒特异性复合IgY、抗呼肠孤病毒特异性IgY、抗鱼疱疹病毒抗原特异性IgY、抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY和抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性IgY中的一种或一种以上的组合。
2.一种制备抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY的方法，其特征在于，包括一下步骤：
1)筛选引致家畜和水产类感染性疾病的主要病原体，并按照这些病原体的“抗原交叉性”进行分类组合；
2)针对筛选和分类组合出的各种家畜、水产类感染性疾病病原体，制备相应的抗原；
3)制备含高活性抗体的免疫蛋：取上述抗原，选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的健康无特定病原体携带的健康产蛋禽类，对其进行免疫注射，首次免疫注射时对每只产蛋禽注射抗原1ml，第一次注射后间隔7天，以同样剂量注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量、方法注射第3次；从第一次注射后第20天开始拣取产蛋禽所产出的高免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；
4)制备抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY粗品：取上述高免疫蛋用消毒液浸泡15～30分钟消毒，再经无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄，加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，调节pH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液在8,000-12,000r/min下高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩；除菌后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY粗品；
5)制备抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY纯品：将上述制得的抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY粗品经离子交换柱和凝胶交换柱纯化，即得纯特异性IgY或复合IgY。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中筛选和提取出的病原体是引起猪、牛、水产致病的细菌类、病毒类、真菌类病原体，包括：肠毒性大肠埃希氏菌、C型魏氏梭菌菌株、猪链球菌、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、柱状嗜纤维菌、嗜水气单胞菌、气单胞菌、孤菌、水霉菌、绵霉菌、丝囊霉菌、鳃霉菌、呼肠孤病毒、鱼疱疹病毒、牛肠毒性大肠埃希氏菌、B型魏氏梭菌菌株、牛传染性胃肠炎病毒、牛流行性腹泻病毒以及牛轮状病毒。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中制备的家畜和水产病原体抗原包括：猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原、猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒复合抗原、水产致病菌复合抗原、水产真菌复合抗原、水产病毒复合抗原、呼肠孤病毒抗原、鱼疱疹病毒抗原、牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原、牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒复合抗原。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中制备猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原的方法是：取肠毒性大肠埃希氏菌、C型魏氏梭菌、猪链球菌标准菌株进行培养繁殖，收集培养物，提纯后得到肠毒性大肠埃希氏菌、C型魏氏梭菌、猪链球菌，然后将此三种细菌按1∶1∶1的比例混合，再采用超声粉碎机粉碎，获得含全菌和菌体成份的混合物；将混合物按1～10∶10～1的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中粉碎匀化，形成油包水溶液，制得牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌菌体组合复合抗原。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中制备猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原的方法是：培养猪大肠杆菌k88、k99两种纤毛，再将培养好的两种纤毛先按1～10∶10～1的比例混合均匀后按1～10∶10～1的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中粉碎匀化，形成油包水溶液，制得传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌纤毛组合复合抗原。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中制备猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒复合抗原的方法是：取猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒以及猪轮状病毒三种病毒的标准毒株，采用常规方法增殖培养、提纯，将所增殖并提纯的三种病毒按1∶1∶1的比例混合，然后加入十二烷基硫酸钠，最终浓度为1.8～2.5％，裂解30分钟，即分别得到猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒以及猪轮状病毒组合的病毒裂解液；再将这些病毒裂解液以1～10∶1～10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中粉碎匀化，形成油包水乳液，即制得猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的病毒裂解复合抗原。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)、5)中制备的抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY包括：抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY、抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性IgY、抗水产致病菌特异性复合IgY、抗水产真菌特异性复合IgY、抗水产病毒特异性复合IgY、抗呼肠孤病毒特异性IgY、抗鱼疱疹病毒抗原特异性IgY、抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性IgY、抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性IgY。
9.一种制备抗家畜和水产病原体的饲料添加剂或预混料的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)筛选引致家畜和水产类感染性疾病的主要病原体，包括猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌、猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒、水产致病菌、水产真菌、水产病毒、呼肠孤病毒、鱼疱疹病毒、牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌、牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒，并按照这些病原体的“抗原交叉性”进行分类组合；
2)针对筛选和分类组合出的上述各种家畜、水产类感染性疾病病原体，制备相应的抗原；
3)制备含高活性抗体的免疫蛋：取上述抗原，选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的健康无特定病原体携带的健康产蛋禽类，对其进行免疫注射，首次免疫注射时对每只产蛋禽注射抗原1ml，第一次注射后间隔7天，以同样剂量注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量、方法注射第3次；从第一次注射后第20天开始拣取产蛋禽所产出的高免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；
4)制备抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY粗品：取上述高免疫蛋用消毒液浸泡15～30分钟消毒，再经无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄，加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，调节pH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液在8,000-12,000r/min下高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩；除菌后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY粗品；
5)制备抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY纯品：将上述制得的抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY粗品经离子交换柱和凝胶交换柱纯化，即得纯特异性IgY或复合IgY；
6)取上述抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY的干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之间、粒度≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化IgY或复合IgY干粉；
7)按重量百分比称取0.01～20.0％的上述纳米化IgY或复合IgY干粉，加入到99.99～80.0％的饲料添加剂或预混料的辅料之中，混和均匀，即得含抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY的饲料添加剂或预混料。
10.一种抗家畜和水产病原体注射剂的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)筛选引致家畜和水产类感染性疾病的主要病原体，包括猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌、猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒、水产致病菌、水产真菌、水产病毒、呼肠孤病毒、鱼疱疹病毒、牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌、牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒，并按照这些病原体的“抗原交叉性”进行分类组合；
2)针对筛选和分类组合出的上述各种家畜、水产类感染性疾病病原体，制备相应的抗原；
3)制备含高活性抗体的免疫蛋：取上述抗原，选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的健康无特定病原体携带的健康产蛋禽类，对其进行免疫注射，首次免疫注射时对每只产蛋禽注射抗原1ml，第一次注射后间隔7天，以同样剂量注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量、方法注射第3次；从第一次注射后第20天开始拣取产蛋禽所产出的高免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；
4)制备抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY粗品：取上述高免疫蛋用消毒液浸泡15～30分钟消毒，再经无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄，加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，调节pH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液在8,000-12,000r/min下高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩；除菌后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY粗品；
5)制备抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY纯品：将上述制得的抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY粗品经离子交换柱和凝胶交换柱纯化，即得纯特异性IgY或复合IgY；
6)取注射用水加Pluronic以及聚乙烯吡咯烷酮加热溶解，另取聚山梨醇酯-80与PEG400的混合物，在搅拌下加入上述溶解液中，再加0.1％针用活性碳，60℃下搅拌15分钟，脱炭过滤，再将滤液密封加热至100℃，30分钟，然后冷却至室温备用；另取用针用活性炭吸附，脱炭，煮沸，并冷至室温的注射用水剩余量，于无菌容器中加入上述制得的纯特异性IgY或复合IgY干粉溶解，继续搅拌下，呈细注加入前述制得的备用溶液中，用脱炭无菌注射用水补足余量，灭菌、罐装，即得。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20080620 Address after: Guangdong province Shenzhen city Nanshan District high tech District in a biological high-tech incubator building 1204 Applicant after: Shenzhen Yachen Biotechnology Technology Co., Ltd. Address before: Hongkong, China, Sha Tin Road, Sha Tin twelve, biotechnology two, Hongkong Institute of biotechnology, room 115, 115A Applicant before: Yachen Pharmaceutical Group (Yuandong) Co., Ltd. |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20071205 |