CN102898518A - 抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗牛乳房炎的产品，公开了一种抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法，包括以下步骤：(S1)、制取不同类的牛乳房炎致病微生物抗原；(S2)、制取免疫蛋；(S3)、制取抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY粗提物干粉；(S4)、制取抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品；(S5)、制取抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY。按本发明生产的产品具有对采用常规药物治疗无效的顽固性牛乳房炎的疗效特别明显；同时，还会明显增强奶牛体内白细胞的吞噬功能，提升其抗病原体感染的能力；可直接给奶牛补充抗体，抑灭奶牛体内的病原体，消除感染，迅速降低鲜奶体细胞数。

Description

抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法

技术领域

本发明涉及治疗牛乳房炎的产品，尤其是涉及一种不产生耐药性的可有效预防和治疗各种细菌、真菌和霉形体以及病毒引发的牛乳房炎的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY。

背景技术

奶牛乳房炎是世界范围内最常见而又最难防治的奶牛疾病之一。目前全世界约有2.2亿头奶牛，其中1/3患有各种类型的乳房炎。据统计，临床型乳房炎占奶牛总发病的2成多，一般造成产奶量下降，乳液废弃，严重时，患牛乳区肿胀硬化、化脓、坏疽甚至萎缩，失去泌乳能力，被迫淘汰，每年因乳房炎而最终淘汰的病牛约占总淘汰率的10％。在所有的牛乳房炎中，隐性乳房炎在奶牛群中最普遍，在一个牛群中，大多数乳房炎(大约90％)是隐性型。因此，造成经济损失的主要是隐性乳房炎，其损失占每头泌乳母牛每年总生产能力的10％～11％[。即使在饲养水平较高的发达国家，隐性乳房炎的发病率也在50％以上。因此，给世界各国以及我国的乳牛业造成相当大的经济损失。

目前，全球对奶牛乳房炎普遍采用抗生素进行治疗。但是，使用抗生素治疗一方面会造成牛乳中抗生素残留，另一方面会诱发细菌产生耐药性，使抗生素失效，造成慢性乳房炎特别是隐性乳房炎比例越来越来大。而且，抗生素只对细菌性乳房炎有一定疗效，对由真菌和霉形体以及病毒引起的牛乳房炎是无效的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不产生耐药性的可有效预防和治疗各种细菌、真菌和霉形体以及病毒引发的牛乳房炎的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY。

本发明是通过以下技术措施实现的，一种抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法，包括以下步骤：

(S1)、制取不同类的牛乳房炎致病微生物抗原：分别按致病微生物的分类培养并纯化一种或任意几种同类不同种的致病微生物，按任意比例混合均匀，然后加以超声粉碎；最后按重量1-10∶10-1的重量比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，重复上述方法分别制得各类不同类的致病微生物抗原；

(S2)、制取免疫蛋：采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类，再分别采用上一步骤制备不同类的致病微生物抗原对高免疫应答能力的选择产蛋禽类进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫的母鸡所产免疫蛋，并进行编码标记；

(S3)、制取抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY粗提物干粉：根据免疫所用不同类的致病微生物抗原，将免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用苏打水消毒，打蛋机打碎免疫蛋，筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.0，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-60℃，静置12小时-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清液置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠水溶液，稀释至0.1％的浓度，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl2液，稀释至0.1％的浓度，搅拌均匀，40℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清液；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；使用除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即分别制得不同类的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY粗提物干粉；最后，将所制备的对应不同致病微生物抗原的特异性TgY粗提物进行编码标记；

(S4)、制取抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品：将同类的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY粗提物干粉分别经过蛋白层析装置进行纯化处理，制得不同类的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品；

(S5)、制取抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY：将所制备的不同类的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品混合，充分搅拌均匀，即制得抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY。

作为一种优选方式，所述步骤(S4)后为：

步骤(S41)、制取纳米化抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品：抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品：对各类所述抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品进行纳米化处理，制得不同类的纳米化抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品；

步骤(S42)、制取纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品：对各类所述纳米化抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品进行脂质体化处理，制得不同类的纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品；

所述步骤(S5)更换为步骤(S50)、制取纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY：将所制备的不同类的纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品混合，充分搅拌均匀，即制得纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY。

具体的，所述致病微生物包括致病细菌、致病真菌、致病霉形体以及病毒。

更具体的，所述致病细菌包括致病细菌包括无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及乳房链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、星形诺卡氏菌、化脓链球菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、爱德华氏菌、肠杆菌、结核杆菌、多杀性巴氏杆菌和绿脓杆菌中的任意一种或任意几种组合；所述致病真菌包括隐球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、烟曲霉菌、酵母菌和白色念珠菌中的任意一种或任意几种组合；所述致病霉形体包括牛霉形体、牛生殖道霉形体和产碱霉形体中的任意一种或任意几种组合；所述病毒包括口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛瘟病毒、牛疱疹性乳头炎病毒和牛传染性鼻气管炎病毒中的任意一种或任意几种组合。其中所选的微生物来源为向ATCC(美国标准生物品收藏中心)购买以下代表性致病真菌和霉形体以及病毒(括号内数字是ATCC商品编号)，并采用常规方法培养和纯化这些真菌和霉形体以及病毒：，

1.细菌：

无乳链球菌Streptococcus agalactiae(编号：4768)

停乳链球菌Streptococcus dysgalactiae(编号：6644)

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(编号：BBA-1681)

大肠杆菌Escherichia coli(编号：35150)

乳房链球菌Streptococcus uberis(编号：19436)

肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae(编号：29011)

星形诺卡氏菌Nocardia asteroides(编号：9955)

化脓链球菌Streptococcus pyogenes(编号：8669)

表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis(编号：35983)

变形杆菌Proteus vulgaris(编号：8427)

爱德华氏菌Edwardsiella tarda(编号：15947)

结核杆菌Mycobacterium tuberculosis(编号：25177)

多杀性巴氏杆菌Pasteurella multocida(编号：BBA-1113)

绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa(编号：12175)

2.真菌：

隐球菌(编号：32040)、奴卡氏菌(编号：22338)、

毛孢子菌(编号：4155)、烟曲霉菌(编号：1022)、

酵母菌(编号：22873)、白色念珠菌(编号：)

3.霉形体：

牛霉形体(编号：27367)、牛生殖道霉形体(编号：14173)

产碱霉形体(编号：29103)

4.病毒：

口蹄疫病毒(编号：VR-1432)、水疱性口炎病毒(编号VR-1415)、

牛瘟病毒(编号：VR-128)、牛疱疹性乳头炎病毒(编号：VR-845)、

牛传染性鼻气管炎病毒(编号：VR-2160)。

具体的，所述步骤(S1)中制备牛乳房炎病毒复合抗原：将所培养并纯化的口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛瘟病毒、牛疱疹性乳头炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒按重量10-1∶10-1∶10-1∶1-10∶1-10比例混合均匀得到病毒混合物，然后采用以下病毒裂解法进行裂解：

分别取上述提纯的病毒混合物加入20％十二烷基硫酸钠，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，即得到病毒裂解液，再将所得的病毒裂解液按重量1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得病毒复合抗原。

作为一种优选方式，所述步骤(S5)后增加步骤(S6)、制备组合制剂：将制得的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY加工成针剂或加入乳膏辅料加工成乳膏。

作为另一种优选方式，所述步骤(S50)后增加步骤(S60)、制备组合制剂：将制得的纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY加工成针剂或加入乳膏辅料加工成乳膏。

本发明加工的产品能定向杀灭引起牛乳房炎的多种致病细菌、真菌和致病霉形体以及致病病毒，有效预防和治疗这些病原体引起的临床牛乳房炎和隐性牛乳房炎；尤其是对那些采用常规药物治疗无效的顽固性牛乳房炎的疗效特别明显。同时，本发明的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY和抗牛乳房炎致病霉形体特异性复合TgY以及抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY，包括抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY，还会明显增强奶牛体内白细胞的吞噬功能，提升其抗病原体感染的能力；这一点是抗生素和化学药无法做到的。本发明还将抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY和抗牛乳房炎致病霉形体特异性复合TgY以及抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY，包括抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY加以辅料制成一种肌肉注射用的IgY针剂。给奶牛注射这种特殊针剂，可直接补充抗体，抑灭奶牛体内的病原体，消除感染，迅速降低鲜奶体细胞数。

具体实施方式

下面结合实验例和实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

各种抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法，

一、制备抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY

1.制备细菌复合抗原

1.1根据流行病学调查，乳房炎的致病细菌病原体有几十种，其中主要的为无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。向ATCC(美国标准生物品收藏中心)购买以下有代表性致病细菌：

无乳链球菌Streptococcus agalactiae(编号：4768)

停乳链球菌Streptococcus dysgalactiae(编号：6644)

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(编号：BBA-1681)

大肠杆菌Escherichia coli(编号：35150)

1.2采用常规方法培养和纯化这些细菌，然后按(10-1)∶(10-1)∶(1-10)∶(1-10)比例混合均匀，得细菌混合物。

1.3超声处理细菌混合物，得到菌株和菌体成份混合物。

1.4把超声处理后的细菌菌株和菌体成份混合物按(1-10)∶(10-1)的比例(通常为1∶1)加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得细菌蛋白复合抗原。

2.制备含高活性抗体的免疫蛋

可选用任何产蛋禽类免疫制备免疫蛋，限于篇幅仅以母鸡为例说明，其它禽类完全可依下文所述方法同样进行。

2.1采用淘汰法选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡

2.1.1选择正在产蛋的健康无特定病原体携带的(SPF)健康产蛋鸡200只并一一用数字进行编号标记。然后用上述制得的细菌蛋白复合抗原对这些产蛋鸡进行注射免疫。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。对所检取的免疫蛋按每只鸡的编号不同进行编码标记。

2.1.2当每种编码的免疫蛋数量达到10只左右时，将检取的每批免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15～30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩，得到200批抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY浓缩液体。

2.1.3分别以无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作为抗原，采用酶联免疫法(ELISA)检测所制得的200批抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY浓缩液体中每批对无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抗体结合效价。

2.1.4将凡是对无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抗体结合效价达到1∶1024以上的该批抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY浓缩液体单独挑选出来；找出其对应的产蛋母鸡的编号，把这些产蛋母鸡作为选择的“具有高免疫应答能力的产蛋母鸡”，其它不符合高免疫应答能力的母鸡则淘汰不用。

3.制备抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY粗品

检取选择的高免疫应答能力的产蛋母鸡所产的免疫蛋，将所获得的高免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15～30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩。

然后，采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。

第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。

最后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY粗品。

4.制备抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品

将所制得的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱再经过亲和层析柱进行纯化，即制得高活性的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY。采用常规“水稀释法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未经过亲和层析柱层析纯化的，所得到的只是初级的IgY粗制品，并不是纯化的IgY，其生物活性达不到医疗要求。

将所制得的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品干粉。

应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品进行检测，测得其中IgY含量都在98％以上。

5.制备纳米化抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品干粉

取所制得的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1～100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品干粉。

6.制备纳米脂质体抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY

将以上所制得的纳米化抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品作脂质体化处理，具体实施方法如下：

把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将纳米化抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY溶液；然后将含卵磷脂和胆固醇的混悬液与IgY溶液混合，超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/L PBS稀释，即制得纳米脂质体抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY。

二、制备抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY

1.制备真菌复合抗原：

1.1向ATCC(美国标准生物品收藏中心)购买以下有代表性致病真菌：隐球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、烟曲霉菌、酵母菌。

1.2采用常规方法培养和纯化这些真菌，然后按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)∶(1-10)比例混合均匀，得真菌混合物。

1.3超声处理真菌混合物，得到菌株和菌体成份混合物。

1.4把超声处理后的真菌菌株和菌体成份混合物按(1-10)∶(10-1)的比例(通常为1∶1)加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得真菌蛋白复合抗原。

2.制备含高活性抗体的免疫蛋

本发明可选用任何产蛋禽类免疫制备免疫蛋，限于篇幅仅以母鸡为例说明，其它禽类完全可依下文所述方法同样进行。

2.1采用淘汰法选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡

2.1.1选择正在产蛋的健康无特定病原体携带的(SPF)健康产蛋鸡200只并一一用数字进行编号标记。然后用上述制得的真菌蛋白复合抗原对这些产蛋鸡进行注射免疫。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。对所检取的免疫蛋按每只鸡的编号不同进行编码标记。

2.1.2当每种编码的免疫蛋数量达到10只左右时，将检取的每批免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15～30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩，得到200批抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY浓缩液体。

2.1.3分别以隐球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、烟曲霉菌、酵母菌作为抗原，采用酶联免疫法(ELISA)检测所制得的200批抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY浓缩液体中每批对隐球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、烟曲霉菌、酵母菌的抗体结合效价。

2.1.4将凡是对隐球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、烟曲霉菌、酵母菌的抗体结合效价达到1∶102,400以上的该批抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY浓缩液体单独挑选出来；找出其对应的产蛋母鸡的编号，把这些产蛋母鸡作为选择的“具有高免疫应答能力的产蛋母鸡”，其它不符合高免疫应答能力的母鸡则淘汰不用。

3.制备抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY粗品

检取选择的高免疫应答能力的产蛋母鸡所产的免疫蛋，将所获得的高免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15～30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩。

然后，采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。

第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。

最后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY粗品。

4.制备抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品

将所制得的抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱再经过亲和层析柱进行纯化，即制得高活性的抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY。采用常规“水稀释法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未经过亲和层析柱层析纯化的，所得到的只是初级的IgY粗制品，并不是纯化的IgY，其生物活性达不到医疗要求。

将所制得的抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品干粉。

应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品进行检测，测得其中IgY含量都在98％以上。

5.制备纳米化抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品干粉

取所制得的抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1～100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品干粉。

6.制备纳米脂质体抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY

将以上所制得的纳米化抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品作脂质体化处理，具体实施方法如下：

把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将纳米化抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY溶液；然后将含卵磷脂和胆固醇的混悬液与IgY溶液混合，超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/L PBS稀释，即制得纳米脂质体抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY。

三、制备抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY

1.制备霉形体复合抗原：1

1.1向ATCC(美国标准生物品收藏中心)购买以下有代表性致病霉形体：牛霉形体、牛生殖道霉形体和产碱霉形体。

1.2采用常规方法培养和纯化这些霉形体，然后按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)比例混合均匀，得霉形体混合物。

1.3超声处理霉形体混合物，得到菌株和菌体成份混合物。

1.4把超声处理后的菌株和菌体成份混合物按(1-10)∶(10-1)的比例(通常为1∶1)加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得霉形体蛋白复合抗原。

2.制备含高活性抗体的免疫蛋

本发明可选用任何产蛋禽类免疫制备免疫蛋，限于篇幅仅以母鸡为例说明，其它禽类完全可依下文所述方法同样进行。

2.1采用淘汰法选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡

2.1.1选择正在产蛋的健康无特定病原体携带的(SPF)健康产蛋鸡200只并一一用数字进行编号标记。然后用上述制得的霉形体蛋白复合抗原对这些产蛋鸡进行注射免疫。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。对所检取的免疫蛋按每只鸡的编号不同进行编码标记。

2.1.2当每种编码的免疫蛋数量达到10只左右时，将检取的每批免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15～30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩，得到200批抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY浓缩液体。

2.1.3分别以牛霉形体、牛生殖道霉形体和产碱霉形体作为抗原，采用酶联免疫法(ELISA)检测所制得的200批抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY浓缩液体中每批对牛霉形体、牛生殖道霉形体和产碱霉形体的抗体结合效价。

2.1.4将凡是对牛霉形体、牛生殖道霉形体和产碱霉形体的抗体结合效价达到1∶102,400以上的该批抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY浓缩液体单独挑选出来；找出其对应的产蛋母鸡的编号，把这些产蛋母鸡作为选择的“具有高免疫应答能力的产蛋母鸡”，其它不符合高免疫应答能力的母鸡则淘汰不用。

3.制备抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY粗品

检取选择的高免疫应答能力的产蛋母鸡所产的免疫蛋，将所获得的高免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15～30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩。

然后，采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。

第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。

最后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY粗品。

4.制备抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY纯品

将所制得的抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱再经过亲和层析柱进行纯化，即制得高活性的抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY。采用常规“水稀释法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未经过亲和层析柱层析纯化的，所得到的只是初级的IgY粗制品，并不是纯化的IgY，其生物活性达不到医疗要求。

将所制得的抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY纯品干粉。

应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY纯品进行检测，测得其中IgY含量都在98％以上。

5.制备纳米化抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY纯品干粉

取所制得的抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY纯品干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1～100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY纯品干粉。

6.制备纳米脂质体抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY

将以上所制得的纳米化抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY纯品作脂质体化处理，具体实施方法如下：

把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将纳米化抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY纯品加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY溶液；然后将含卵磷脂和胆固醇的混悬液与IgY溶液混合，超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/LPBS稀释，即制得纳米脂质体抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY。

四、制备抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY

1.制备病毒复合抗原：

1.1向ATCC(美国标准生物品收藏中心)购买以下有代表性致病病毒：口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛瘟病毒、牛疱疹性乳头炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒。

1.2采用常规方法培养和纯化这些病毒，然后按(10-1)∶(10-1)∶(10-1)∶(1-10)∶(1-10)比例混合均匀，得病毒混合物。

1.3采用特殊方法裂解病毒混合物，得到病毒蛋白成份混合物。

取病毒混合物加入20％十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，即得到病毒裂解液。经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验分析，浓缩胶4％，分离胶7％，240V，电泳30分钟。考玛氏亮蓝染色，观察蛋白带。

1.4把病毒蛋白成份混合物按(1-10)∶(10-1)的比例(通常为1∶1)加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得病毒蛋白复合抗原。

2.制备含高活性抗体的免疫蛋

本发明可选用任何产蛋禽类免疫制备免疫蛋，限于篇幅仅以母鸡为例说明，其它禽类完全可依下文所述方法同样进行。

2.1采用淘汰法选择具有高免疫应答能力的产蛋母鸡

2.1.1选择正在产蛋的健康无特定病原体携带的(SPF)健康产蛋鸡200只并一一用数字进行编号标记。然后用上述制得的病毒蛋白复合抗原对这些产蛋鸡进行注射免疫。在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。对所检取的免疫蛋按每只鸡的编号不同进行编码标记。

2.1.2当每种编码的免疫蛋数量达到10只左右时，将检取的每批免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15～30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩，得到200批抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY浓缩液体。

2.1.3分别以口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛瘟病毒、牛疱疹性乳头炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒作为抗原，采用酶联免疫法(ELISA)检测所制得的200批抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY浓缩液体中每批对口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛瘟病毒、牛疱疹性乳头炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的抗体结合效价。

2.1.4将凡是对口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛瘟病毒、牛疱疹性乳头炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的抗体结合效价达到1∶102,400以上的该批抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY浓缩液体单独挑选出来；找出其对应的产蛋母鸡的编号，把这些产蛋母鸡作为选择的“具有高免疫应答能力的产蛋母鸡”，其它不符合高免疫应答能力的母鸡则淘汰不用。

3.制备抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY粗品

检取选择的高免疫应答能力的产蛋母鸡所产的免疫蛋，将所获得的高免疫蛋分别用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15～30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩。

然后，采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。

第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌；第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体；第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。

最后，将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY粗品。

4.制备抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品

将所制得的抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱再经过亲和层析柱进行纯化，即制得高活性的抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY。采用常规“水稀释法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未经过亲和层析柱层析纯化的，所得到的只是初级的IgY粗制品，并不是纯化的IgY，其生物活性达不到医疗要求。

将所制得的抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品应用冷冻干燥机干燥，即制得抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品干粉。

应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品进行检测，测得其中IgY含量都在98％以上。

5.制备纳米化抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品干粉

取所制得的抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1～100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品干粉。

6.制备纳米脂质体抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY

将以上所制得的纳米化抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品作脂质体化处理，具体实施方法如下：

把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将纳米化抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY溶液；然后将含卵磷脂和胆固醇的混悬液与IgY溶液混合，超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/L PBS稀释，即制得纳米脂质体抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY。

实施例2

抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY注射剂生产。

具体实施方案如下：

配方(重量百分比)：

使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY 1.0％

棉籽油84.0％

吐温80  5.0％

蒸馏水适量10.0％

工艺：

1.取配方量棉籽油加热至100℃混匀，泠却至38℃得溶液A。

2.取480ml纯水，加入配方量纳米脂质体抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY，搅拌完全溶解得溶液B。

3.加入配方量吐温80到溶液B，搅拌完全溶解得溶液C。

4.将溶液C加入溶液A中，搅拌均匀得悬浮液成品。

5.分装，每支10ml。

实施例3

抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY注射剂生产。

具体实施方案如下：

配方(重量百分比)：

使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY 1.0％

棉籽油84.0％

吐温80  5.0％

蒸馏水适量10.0％

工艺：

6.取配方量棉籽油加热至100℃混匀，泠却至38℃得溶液A。

7.取480ml纯水，加入配方量纳米脂质体抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY，搅拌完全溶解得溶液B。

8.加入配方量吐温80到溶液B，搅拌完全溶解得溶液C。

9.将溶液C加入溶液A中，搅拌均匀得悬浮液成品。

10.分装，每支10ml。

实施例4

抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY注射剂生产。具体实施方案如下：

配方(重量百分比)：

使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY 1.0％

棉籽油84.0％

吐温80  5.0％

蒸馏水适量10.0％

工艺：

1.取配方量棉籽油加热至100℃混匀，泠却至38℃得溶液A。

2.取480ml纯水，加入配方量抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY，搅拌完全溶解得溶液B。

3.加入配方量吐温80到溶液B，搅拌完全溶解得溶液C。

4.将溶液C加入溶液A中，搅拌均匀得悬浮液成品。

5.分装，每支10ml。

实施例5

抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY注射剂生产。具体实施方案如下：

配方(重量百分比)：

使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY 1.0％

棉籽油84.0％

吐温80  5.0％

蒸馏水适量10.0％

工艺：

1.取配方量棉籽油加热至100℃混匀，泠却至38℃得溶液A。

2.取480ml纯水，加入配方量抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY，搅拌完全溶解得溶液B。

3.加入配方量吐温80到溶液B，搅拌完全溶解得溶液C。

4.将溶液C加入溶液A中，搅拌均匀得悬浮液成品。

5.分装，每支10ml。

实施例6

抗牛乳房炎致病真菌和霉形体特异性IgY注射剂生产。

首先将使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病真菌和霉形体特异性IgY和抗牛乳房炎致病真菌和霉形体特异性IgY按(1-10)∶(10-1)比例混合均匀，得到抗牛乳房炎致病真菌和霉形体特异性IgY。然后按以下配方和工艺操作：

配方(重量百分比)：

抗牛乳房炎致病真菌和霉形体特异性IgY 1.0％

棉籽油84.0％

吐温80  5.0％

蒸馏水适量10.0％

工艺：

1.取配方量棉籽油加热至100℃混匀，泠却至38℃得溶液A。

2.取480ml纯水，加入配方量抗牛乳房炎致病真菌和霉形体特异性IgY，搅拌完全溶解得溶液B。

3.加入配方量吐温80到溶液B，搅拌完全溶解得溶液C。

4.将溶液C加入溶液A中，搅拌均匀得悬浮液成品。

5.分装，每支10ml。

实施例7

抗牛乳房炎致病真菌和病毒特异性IgY注射剂生产。

首先将使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY和抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY按(1-10)∶(10-1)比例混合均匀，得到抗牛乳房炎致病真菌和病毒特异性IgY。然后按以下配方和工艺操作：

配方(重量百分比)：

抗牛乳房炎致病真菌和病毒特异性IgY 1.0％

棉籽油84.0％

吐温80  5.0％

蒸馏水适量10.0％

工艺：

1.取配方量棉籽油加热至100℃混匀，泠却至38℃得溶液A。

2.取480ml纯水，加入配方量抗牛乳房炎致病真菌和病毒特异性IgY，搅拌完全溶解得溶液B。

3.加入配方量吐温80到溶液B，搅拌完全溶解得溶液C。

4.将溶液C加入溶液A中，搅拌均匀得悬浮液成品。

5.分装，每支10ml。

实施例8

牛乳房炎致病霉形体和病毒特异性IgY注射剂生产。

首先将使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY和抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY按(1-10)∶(10-1)比例混合均匀，得到抗牛乳房炎致病霉形体和病毒特异性IgY。然后按以下配方和工艺操作：

配方(重量百分比)：

抗牛乳房炎致病霉形体和病毒特异性IgY 1.0％

棉籽油84.0％

吐温80  5.0％

蒸馏水适量10.0％

工艺：

1.取配方量棉籽油加热至100℃混匀，泠却至38℃得溶液A。

2.取480ml纯水，加入配方量抗牛乳房炎致病霉形体和病毒特异性IgY，搅拌完全溶解得溶液B。

3.加入配方量吐温80到溶液B，搅拌完全溶解得溶液C。

4.将溶液C加入溶液A中，搅拌均匀得悬浮液成品。

5.分装，每支10ml。

实施例9

抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY注射剂生产。

首先将使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY和抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY以及抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY按(1-10)∶(1-10)∶(1-10)∶(10-1)∶(1∶10)比例混合均匀，得到抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY。然后按以下配方和工艺操作：

配方(重量百分比)：

抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY 1.0％

棉籽油84.0％

吐温80  5.0％

蒸馏水适量10.0％

工艺：

1.取配方量棉籽油加热至100℃混匀，泠却至38℃得溶液A。

2.取480ml纯水，加入配方量抗牛乳房炎致病真菌和霉形体以及病毒特异性IgY，搅拌完全溶解得溶液B。

3.加入配方量吐温80到溶液B，搅拌完全溶解得溶液C。

4.将溶液C加入溶液A中，搅拌均匀得悬浮液成品。

5.分装，每支10ml。

实施例11

抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY乳膏生产。具体实施方案如下：

配方：

原料重量百分比(％)

1.使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY 1.0

2.钛白粉15

3.微粉硅胶1.5

4.棉籽油82.5

工艺：

1.将配方量棉籽油加热至100℃，然后冷却至30～45℃成溶液A。

2.将配方量抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY加入溶液A，充分搅拌均匀，制成溶液B。

3.边搅拌边分别加入钛白粉和微粉硅胶至溶液B，充分搅拌均匀制成成品(乳膏状)。

4.将成品分装，检验出厂。

实施例11

抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY乳膏生产。具体实施方案如下：

配方：

原料百分比(％)

1.使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY 1.0

2.钛白粉15

3.微粉硅胶1.5

4.棉籽油82.5

工艺：

5.将配方量棉籽油加热至100℃，然后冷却至30～45℃成溶液A。

6.将配方量抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY加入溶液A，充分搅拌均匀，制成溶液B。

7.边搅拌边分别加入钛白粉和微粉硅胶至溶液B，充分搅拌均匀制成成品(乳膏状)。

8.将成品分装，检验出厂。

实施例12

抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY乳膏生产。具体实施方案如下：

配方：

原料重量百分比(％)

1.使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY 1.0

2.钛白粉15

3.微粉硅胶1.5

4.棉籽油82.5

工艺：

1.将配方量棉籽油加热至100℃，然后冷却至30～45℃成溶液A。

2.将配方量抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY加入溶液A，充分搅拌均匀，制成溶液B。

3.边搅拌边分别加入钛白粉和微粉硅胶至溶液B，充分搅拌均匀制成成品(乳膏状)。

4.将成品分装，检验出厂

实施例12

抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY乳膏生产。具体实施方案如下：

配方：

原料重量百分比(％)

1.使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY 1.0

2.钛白粉15

3.微粉硅胶1.5

4.棉籽油82.5

工艺：

1.将配方量棉籽油加热至100℃，然后冷却至30～45℃成溶液A。

2.将配方量抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY加入溶液A，充分搅拌均匀，制成溶液B。

3.边搅拌边分别加入钛白粉和微粉硅胶至溶液B，充分搅拌均匀制成成品(乳膏状)。

4.将成品分装，检验出厂

实施例14

抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY乳膏生产。

首先将使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY和抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY以及抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY按(1-10)∶(1-10)∶(10-1)∶(1∶10)比例混合均匀，得到抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY。然后按以下配方和工艺操作：

配方：

原料重量百分比(％)

1.抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY 1.0

2.钛白粉15

3.微粉硅胶1.5

4.棉籽油82.5

工艺：

1.将配方量棉籽油加热至100℃，然后冷却至30～45℃成溶液A。

2.将配方量抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY加入溶液A，充分搅拌均匀，制成溶液B。

3.边搅拌边分别加入钛白粉和微粉硅胶至溶液B，充分搅拌均匀制成成品(乳膏状)。

4.将成品分装，检验出厂。

实施例15

抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY肌肉注射用针剂生产。

首先将使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品和抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY纯品以及抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品按(1-10)∶(1-10)∶(10-1)∶(1∶10)比例混合均匀，得到抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性复合纯IgY。然后按以下配方和工艺操作：

一.配方(重量百分比)

抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性复合纯IgY 10.0％

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1.0％

吐温80  1.0％

注射用水88.0％

二.生产工艺

1.取注射用水，加入PVP，加热溶解加入吐温-80，得到澄清液A，密闭加热100℃30min，冷却至室温备用。

2.将牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性复合纯IgY加入溶液A，搅拌均匀得溶液B。

3.用0.1N NaOH调节pH7.2-7.5。

4.采用0.22的微孔滤膜将溶液B过滤除菌。

5.于无菌灌封机中灌封于无菌容器中。灯检、检漏、印字、包装即得100支IgY注射剂。规格10mL/支。

实施例16

抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY肌肉注射用针剂生产。

一.配方

使用实施例1制备的抗牛乳房炎致病病毒特异性复合纯IgY 10.0％

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1.0％

吐温80  1.0％

注射用水88.0％

二.生产工艺

1.取注射用水，加入PVP，加热溶解加入吐温-80，得到澄清液A，密闭加热100℃30min，冷却至室温备用。

2.将牛乳房炎致病病毒特异性复合纯IgY加入溶液A，搅拌均匀得溶液B。

3.用0.1N NaOH调节pH7.2-7.5。

4.采用0.22的微孔滤膜将溶液B过滤除菌。

5.于无菌灌封机中灌封于无菌容器中。灯检、检漏、印字、包装即得100支IgY注射剂。规格10mL/支。

采用本发明制备的「抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY注射剂」治疗顽固性乳房炎患牛。

试验地点：中国广州市某奶牛场。

试验时间：2010年9月1日～9月15日。

试验对象：患隐性乳房炎奶牛302头，用“便携式牛奶体细胞计数仪”检测鲜奶体细胞数，平均值75万/ml。

试验方法及结果：采用本方法治疗前已采用多种抗生素治疗，解奶体细胞数居高不下，产奶量下降很多。使用本发明制备的「抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY注射剂」进行治疗，注射前用酒精消毒，每头奶牛注射4针(每个乳池一针)，注射后用本发明制备的「抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体以及病毒特异性IgY乳膏」揉摸2分钟。注射时间间隔24小时。连续注射三天。第四天复查病牛所产奶的体细胞数，平均下降至20万/ml，产奶量也全部恢复正常。

采用本发明制备的「抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY注射剂」防治牛乳房炎。

试验地点：中国上海市乳业集团下属奶牛场。

试验时间：2010年4月5日～2011年3月31日。

试验对象：30个牧场16000头奶牛，每月用“便携式牛奶体细胞计数仪”抽查鲜奶体细胞数。试验前鲜奶体细胞数平均值45万/ml。

试验方法：使用本发明制备的「抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY注射剂」进行防治，注射前用酒精消毒，每头奶牛注射4针(每个乳池一针)，注射后用本发明制备的「抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY乳膏」揉摸2分钟。试验开始时，30个牧场全面进行注射；以后每三个月注射一次。

试验一年，参加试验的30个牧场的奶牛的鲜奶体细胞数平均下降了25万/ml，达到了国际优质奶标准，每头奶牛产奶量平均增加了450公斤/年，每头奶牛净增加收入为1650元/年。

实验例1

抗牛乳房炎致病细菌、真菌和霉形体及病毒特异性IgY纯品中的IgY含量检测应用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯凝胶)电泳测定法，对按以上方法所制取的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY和抗牛乳房炎致病霉形体特异性复合TgY以及抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY粗品进行检测，结果含IgY 45～52％。将这四种IgY粗品经二次过柱纯化后，得到纯IgY。经SDS-PAGE分析，纯度达到PAGE纯，如下表所示：

IgY纯品	IgY含量
		抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY纯品	99.99％
抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY纯品	99.99％
		抗牛乳房炎致病霉形体特异性复合TgY纯品	99.99％
抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY纯品	99.99％

实验例2

检测抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY和抗牛乳房炎致病霉形体特异性复合TgY以及抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY四种复合IgY对所对应的抗原的抗体结合效价。

结果如下表

抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY效价检测结果

注：测试样本中的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY浓度均为1mg/mL。

抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY效价检测结果

注：测试样本中的抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY浓度均为1mg/mL。

抗牛乳房炎致病霉形体特异性复合TgY效价检测结果

注：测试样本中的抗牛乳房炎致病霉形体特异性复合TgY浓度均为1mg/mL。

抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY效价检测结果

注：测试样本中的抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY浓度均为1mg/mL。

从以上检测结果可看出，所制备的抗牛乳房炎致病细菌特异性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY和抗牛乳房炎致病霉形体特异性IgY以及抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY对所对应的抗原都有很高的抗体结合效价。试验结果证明，本发明所采用的特殊的免疫激活技术对提高所制备的IgY的抗体效价产生了理想的效果。

实验例3

检测抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY注射剂对有代表性的六种牛乳房炎致病真菌的抑菌和杀菌效果。

(一)试验材料、设备

1、(1)抑菌、杀菌实验材料：抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY注射剂，隐球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、烟曲霉菌、酵母菌、白色念珠菌，营养琼脂，营养肉汤，5％羊血营养肉汤。

(2)实验仪器、设备：培养箱，721分光光度计，生理盐水，吸管，天平等。

(二)试验方法

(1)抑菌(MIC)实验方法：取9支无菌试管，每支试管中加入1ml营养肉汤或1ml 5％牛血清营养肉汤和1ml已调整好浓度的真菌液(隐球菌OD600＝0.3；奴卡氏菌OD600＝0.2；毛孢子菌OD600＝0.2；烟曲霉菌OD600＝0.2；酵母菌OD600＝0.2；白色念珠菌OD600＝0.2)。然后第一支试管加入1mL抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY注射剂悬浮液，待充分混匀后吸出1ml液体加入第二管，充分混匀后吸出1ml液体加入第三管......，依次倍比稀释，稀释比为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32......。第十管不加本悬浮液，作为阳性对照。将试管放置培养箱，35℃培养过夜。第二天观察试管培养液澄清度，最高稀释度的澄清管为抑菌管，计算抑菌浓度(MIC)。

(2)杀菌(MBC)实验方法：将上述培养过夜的试管中液体摇匀，从试管中取一接种环液体接种于血营养琼脂平板上作次代培养。将血营养琼脂平板放置培养箱，35℃培养过夜，第二天观察结果，杀菌(MBC)的培养皿无菌落生长。

(三)结果

(1)抑菌(MIC)观察：培养24小时后最高稀释度的澄清管为抑菌管，此管的稀释度为抑菌的稀释比。

(2)杀菌(MBC)观察：血营养琼脂平板培养24小时后观察菌落，最高稀释度的无细菌生长的培养皿为杀菌稀释比。

抑菌(MIC)表：

杀菌(MBC)表：

实验结果：

(1)对隐球菌，抑菌浓度为1/2916，杀菌浓度为1/40。

(2)对奴卡氏菌，抑菌浓度为1/2916，杀菌浓度为1/40。

(3)对毛孢子菌，抑菌浓度为1/2916，杀菌浓度为1/20。

(4)对烟曲霉菌，抑菌浓度为1/2916，杀菌浓度为1/20。

(5)对酵母菌，抑菌浓度为1/2916，杀菌浓度为1/20。

(6)对白色念珠菌，抑菌浓度为1/2916，杀菌浓度为1/40。

实验例4

检测抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY中和牛乳房炎致病病毒之一——“牛疱疹性乳头炎病毒”的中和病毒效价。

一、试验材料

1、抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY抗体，蛋白含量40mg/m12份，

2、HRP酶标兔抗鸡IgG

3、阴性对照：牛血浆蛋白，蛋白含量60mg/ml

4.病毒：牛疱疹性乳头炎病毒分离株，向美国ATCC购买(编号：VR-845)

5.细胞：非洲绿猴肾传代细胞，向美国ATCC购买(编号：VERO E6)。

二、试剂及器材

1、酶联免疫IgG抗体检测试剂盒。

2、酶标仪BIO-TEK INSTRUMENTS。

丙稀酰胺(Bebco公司)，N，N-亚甲双丙丙稀酰胺(Bebco公司)，Tris(益利精细化学品公司)，SDS(SERVA)，甲醇(北京化工厂)，过硫酸胺(沈阳化工二厂)，TEMED(益利精细化学品公司)，甘氨酸(北京化工厂)，溴酚蓝(益利精细化学品公司)，甘油(北京红星化工厂)，DTT(益利精细化学品公司)，盐酸(北京化工厂)，脱脂奶(安伊公司)，过氧化氢(北京化工厂)，二氨基联苯胺(北京化工厂)，Tween-20(北京红星化工厂)

辣根过氧化物酶标记的抗鸡IgG

仪器：硝酸纤维素滤纸电泳仪(君意东方)，电泳糟(Bio-rad)，转移电泳槽(Bio-rad)

三、试验方法

以VERO E6细胞培养，检测抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY抗体试验

四、实验目的

在VERO E6细胞养内，采用中和试验法测定抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY抗体；选取牛疱疹性乳头炎病毒分离株，以Reed-Muench法计算50％抗体中和终点

五、固定病毒稀释抗体法

将上述抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY抗体、牛血浆蛋白，分别在56℃灭活1小时后，分别用Egale，S液2倍稀释9个浓度，既1∶8-1∶1024与100TCID50牛疱疹性乳头炎病毒悬液混合37℃水浴1小时后，接种VERO E6细胞96孔培养板，每浓度4孔，同时设抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY抗体、牛血浆蛋白对照，病毒对照、正常细胞对。37℃5％CO2孵箱培养5天，每天在倒置显微镜下观察病毒(CPE)，以25％以下形态变化为“+”，26％-50％形态变化为“++”，51％-75％形态变化为“+++”，76％-100％形态变化为“++++”，以病毒对照出现+++++++时结束试验。用Reed-Muench法，计算50％抗体中和终点。

六、中和试验检测结果

抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY抗体标本：1∶512的抗体可保护50％细胞不产生细胞病变。

牛血浆蛋白：不能中和牛疱疹性乳头炎病毒。

七、结论

本发明所制备的抗牛乳房炎致病病毒特异性IgY抗体，经采用中和病毒试验，用牛疱疹性乳头炎病毒株鉴定，表明有较高的抗病毒活性。

实验例5

抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY对中性粒细胞吞噬功能影响的实验

一、实验材料

1、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY。

2、肝素抗凝的静脉血。

3、菌液：隐球菌。

4、瑞姬氏染色液，载玻片。

5、光学显微镜。

二、方法

1、菌液的制备：取在琼脂平板上培养24小时的隐球菌，用无菌生理盐水洗2次，每次2,000RPM离心10分钟。用比浊法将菌液调整成5X107个/ml，然后100℃，15’灭菌，置4℃备用。

2、肝素抗凝外周血白细胞分离：取静脉血2ml，置于加入肝素(30μ/ml)的小试管中，轻轻混匀，将试管直立静置于37℃培养箱中1h或室温静置1h，待红细胞自然沉降后，此时可见试管中的悬液分三层，上层淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈灰白色的白细胞层，用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，置于青霉素小瓶备用。

3、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY抗体与隐球菌和白细胞共同培养：

(1)IgY抗体用10％的牛血清生理盐水稀释成9mg/ml、4.5mg/ml、0mg/ml等不同的浓度。

(2)将上述三个不同浓度的IgY抗体各30μl分别与静脉外周血白细胞30μl、隐球菌菌液30μl混匀于青霉素小瓶内，斜放于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养30min，每10min轻摇一次，每个IgY浓度组均做复孔；

4、制片和染色：用小吸管混匀培养细胞后，取一滴悬液置于玻片一端，推片(每孔推2张片)，干燥后瑞姬氏染色。加瑞姬氏染液3滴，染色1min，加沙黄分色液5滴，染色5min，水冲洗，干燥。

5、光学显微镜观察和计数：400倍的高倍镜下计数200个嗜中性粒细胞，记下吞噬隐球菌的细胞数及每个中性粒细胞吞入的真菌数，按下式计算：

(1)细胞吞噬率(％)＝吞噬细菌的细胞数/200X100％。

(2)吞噬指数＝200个中性粒细胞吞噬的细菌总数/200。

6、统计学分析。

三、结果

1、3mg/ml的IgY抗体组细胞吞噬率为81.63％±1.70％，吞噬指数为2.19±0.12。

2、1.5mg/ml的IgY抗体组细胞吞噬率为77.25％±3.01％，吞噬指数为1.98±0.15。

3、无IgY抗体对照组细胞吞噬率为63.13％±2.78％，吞噬指数为1.42±0.07。

4、3mg/ml的IgY抗体组细胞吞噬率和吞噬指数与无IgY抗体对照组相比，P值分别为0.003和0.0004，分别为：P＜0.002和P＜0.0005。

5、1.5mg/ml的IgY抗体组细胞吞噬率和吞噬指数与无IgY抗体对照组相比，P值分别为0.016和0.007，分别为：P＜0.02和P＜0.01。

6、3mg/ml的IgY抗体组细胞吞噬率和吞噬指数与1.5mg/ml的IgY抗体组相比，P值分别为0.021和0.070，分别为：P＜0.03和P＞0.05。

统计学分析

	细胞吞噬率(％)	吞噬指数
			1、：3t-Test	0.003	0.0004
1、：2t-Test	0.021	0.070
			2、：3t-Test	0.016	0.007

四、结论

1、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY抗体有明显地促进静脉血白细胞增加对相应的隐球菌的吞噬作用，故增强了白细胞的吞噬功能(P＜0.005和P＜0.03)。

2、抗牛乳房炎致病真菌特异性IgY特异性IgY抗体的浓度越高促进白细胞增加，对隐球菌的吞噬作用越强。

以上是对本发明抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法进行了阐述，用于帮助理解本发明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，任何未背离本发明原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(S1)、制取不同类的牛乳房炎致病微生物抗原：分别按致病微生物的分类培养并纯化任意一种或任意几种同类不同种的致病微生物，按任意比例混合均匀，然后加以超声粉碎；最后按重量1-10∶10-1的重量比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，重复上述方法分别制得各类不同类的致病微生物抗原；

(S2)、制取免疫蛋：采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类，再分别采用上一步骤制备不同类的致病微生物抗原对高免疫应答能力的选择产蛋禽类进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫的母鸡所产免疫蛋，并进行编码标记；

(S3)、制取抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY粗提物干粉：根据免疫所用不同类的致病微生物抗原，将免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用苏打水消毒，打蛋机打碎免疫蛋，筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄液体积的4-6倍加入蒸馏水稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.0，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-60℃，静置12小时-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清液置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入2.0％海藻酸钠水溶液，稀释至0.1％的浓度，搅拌至出现浑浊；再加入2.0％CaCl2液，稀释至0.1％的浓度，搅拌均匀，40℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清液；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；使用除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥，即分别制得不同类的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY粗提物干粉；最后，将所制备的对应不同致病微生物抗原的特异性TgY粗提物进行编码标记；

(S4)、制取抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品：将同类的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY粗提物干粉分别经过蛋白层析装置进行纯化处理，制得不同类的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品；

(S5)、制取抗牛乳房炎致病微生物特异性復合IgY：将所制备的不同类的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品混合，充分搅拌均匀，即制得抗牛乳房炎致病微生物特异性復合IgY。

2.根据权利要求1所述的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述步骤(S4)后为：

步骤(S41)、制取纳米化抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品：对各类所述抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品进行纳米化处理，制得不同类的纳米化抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品；

步骤(S42)、制取纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品：对各类所述纳米化抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品进行脂质体化处理，制得不同类的纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品；

所述步骤(S5)更换为步骤(S50)、制取纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY：将所制备的不同类的纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY纯品混合，充分搅拌均匀，即制得纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性復合IgY。

3.根据权利要求1所述的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述致病微生物包括致病细菌、致病真菌、致病霉形体以及病毒。

4.根据权利要求3所述的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述致病细菌包括致病细菌包括无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及乳房链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、星形诺卡氏菌、化脓链球菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、爱德华氏菌、肠杆菌、结核杆菌、多杀性巴氏杆菌和绿脓杆菌中的任意一种或任意几种组合；所述致病真菌包括隐球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、烟曲霉菌、酵母菌和白色念珠菌中的任意一种或任意几种组合；所述致病霉形体包括牛霉形体、牛生殖道霉形体和产碱霉形体中的任意一种或任意几种组合；所述病毒包括口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛瘟病毒、牛疱疹性乳头炎病毒和牛传染性鼻气管炎病毒中的任意一种或任意几种组合。

5.根据权利要求4所述的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述步骤(S1)中制备牛乳房炎病毒复合抗原，将所培养并纯化的口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛瘟病毒、牛疱疹性乳头炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒按重量10-1∶10-1∶10-1∶1-10∶1-10比例混合均匀得到病毒混合物，然后采用以下病毒裂解法进行裂解：

分别取上述提纯的病毒混合物加入20％十二烷基硫酸钠，最终浓度为2.0％，裂解30分钟，即得到病毒裂解液，再将所得的病毒裂解液按重量1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得病毒复合抗原。

6.根据权利要求1所述的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述步骤(S5)后增加步骤(S6)、制备组合制剂：将制得的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY加工成针剂或加入乳膏辅料加工成乳膏。

7.根据权利要求1所述的抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述步骤(S50)后增加步骤(S60)、制备组合制剂：将制得的纳米脂质体抗牛乳房炎致病微生物特异性IgY加工成针剂或加入乳膏辅料加工成乳膏。