CN1314449C - 乙型脑炎病毒疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗组成的联合疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由乙型脑炎病毒疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗制备的联合疫苗及其制备方法。将乙型脑炎病毒经过细胞培养、收获、灭活、超滤浓缩、纯化获得的乙型脑炎病毒原液，再与纯化的A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白进行化学偶联而形成的结合物原液，配制成一种乙型脑炎和脑膜炎联合疫苗。这种联合疫苗可以分别预防婴幼儿、儿童、青少年及成人因乙型脑炎病毒和A、B、C群脑膜炎球菌感染引起的脑炎和脑膜炎及败血症疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种由乙型脑炎病毒疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗组成的联合疫苗。具体而言，本发明涉及一种乙型脑炎病毒纯化原液和A、C群脑膜炎球菌多糖抗原与一蛋白载体偶联原液共同配制成一种新型联合疫苗。更具体而言，本发明涉及的乙型脑炎病毒原液是乙型脑炎病毒经过Vero细胞培养、收获、灭活、超滤浓缩、纯化获得的乙型脑炎病毒原液。本发明涉及的脑膜炎球菌多糖蛋白结合原液是纯化的A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白进行化学偶联而形成的结合物原液。两种原液经加入一定浓度的适宜保护剂和/或佐剂配制成预防乙型脑炎和脑膜炎的联合疫苗。本发明还涉及这种联合疫苗的制备方法。
背景技术
乙型脑炎疾病及其病原体：
乙型脑炎是中枢神经系统急性病毒感染的疾病，在流行地区年发病率高达10～100/10万，近30亿人口生活在乙型脑炎流行区，该地区每年新生儿就超过7千万。在亚洲的病毒性脑炎中，乙型脑炎是最严重的疾病。每年至少引起50,000临床病例和10,000例病死，绝大多数发生于儿童中。在最近几十年中，乙型脑炎的数起暴发流行均发生于过去是非流行的地区，同时伴随很高的病死率和严重的持久性神经系统后遗症，因而在亚洲很多国家和地区，乙型脑炎成为严重的公共健康问题。
流行性乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)简称乙脑病毒，病毒颗粒呈二十面体对称结构，直径45-50nm，有包膜。属黄病毒的一种，基因为正链单股RNA，RNA包被于单股多肽的衣壳C中，组成病毒颗粒的核心，其包膜中有糖基化蛋白E和非糖基化蛋白M。
在乙型脑炎传染途径中蚊子是乙脑病毒的主要传播媒介，猪是主要中间宿主。人因被带病毒的蚊虫叮咬而感染。
目前还没有治疗乙型脑炎疾病的药物，也没有从环境方面控制其传播的有效方法。乙型脑炎疫苗的免疫接种是控制乙型脑炎疾病最为重要的措施。
流行性脑膜炎疾病及病原体：
脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病是世界范围内引起严重疾病和高死亡率的一个重要因素。在磺胺和抗菌素发明以前，脑膜炎球菌疾病病死率约为70％。今天，尽管有良好的治疗措施，即使在发达国家中该病的病死率仍可高达10％，并且其引发的败血症病死率更可超过50％。奈瑟氏脑膜炎球菌每年在全球引起了500,000病例和50,000例死亡。
脑膜炎奈瑟氏球菌俗名为脑膜炎球菌，学名为Neisseriameningitidis，有时也称为奈瑟氏脑膜炎球菌。脑膜炎奈瑟氏球菌为需氧菌，革兰氏阴性有荚膜常成双排列，故又称为双球菌。由于无荚膜菌株几乎不引起临床疾病，因此荚膜在细菌毒力方面扮演了重要作用。根据荚膜多糖特性的不同至少可分为13个血清群：A、B、C、D、E29、H、I、K、L、W135、X、Y、Z。但只有属于A，B，C，Y和W135这5个群中的任一群才会致病，90％的脑膜炎球菌疾病是由A、B、C三群引起的。
脑膜炎奈瑟氏球菌是全世界细菌性脑膜炎中主要的病原体。世界唯一能引起脑膜炎大规模爆发流行细菌。即使有良好的医疗条件，急性脑膜炎球菌经常可于发病后一二天内产生死亡或留下严重后遗症。化学药品对于控制疾病爆发流行几乎没有价值。更为重要的是，随着抗菌素大量使用和/或滥用，在世界许多地方包括中国在内的脑膜炎球菌对抗菌素的耐药性大量增加，就使得通过免疫接种疫苗来预防和控制该病成为紧迫的任务。
现有乙型脑炎疫苗状况：
乙型脑炎疫苗有3类在大规模应用，经鼠脑组织繁殖病毒并纯化制备的灭活疫苗、经细胞(地鼠肾原代细胞或Vero传代细胞)培养的灭活疫苗和经细胞(地鼠肾原代细胞)培养的减毒活疫苗。经鼠脑组织繁殖病毒并纯化的灭活疫苗，虽然经过纯化处理，但仍残有极微量的鼠脑组织成份，是发生过敏反应的主要因素之一。用地鼠肾细胞制备的灭活疫苗和减毒活疫苗，由于所用地鼠不是SPF(无特定病原体)级，这难以避免外源因子污染，这种可能的污染又是难以用现行生物学方法检出。因此，不能为世界卫生组织疫苗制造检定规程所接纳(迮文远，计划免疫学，上海科学技术文献出版社，2001年，476～495页)。而经Vero细胞培养制备的灭活纯化疫苗在安全性和效力方面较其它疫苗更为理想。首先，疫苗毒种种子库是经Vero细胞传代制备，完全避免了其它疫苗因用鼠脑组织传代制备种子，残留微量的鼠脑组织成份。其次，病毒种子经Vero细胞繁殖制备疫苗，避免了用鼠脑组织或地鼠肾细胞繁殖病毒造成的外源因子污染。
现有脑膜炎球菌疫苗状况：
脑膜炎球菌疫苗有两大类，一类是用脑膜炎球菌荚膜多糖抗原制备的单价、二价和四价多糖抗原，另一类是用脑膜炎球菌夹膜多糖抗原和一蛋白载体相偶联制备的结合疫苗。由于多糖抗原是T细胞非依赖性抗原，因此多糖疫苗在两岁以下儿童中无保护作用。而结合疫苗则将多糖抗原从T细胞非依赖性抗原改变为T细胞依赖性抗原，使得结合疫苗在两岁以下儿童中能产生良好的免疫记忆反应和保护作用。我们研究开发的用A、C群脑膜炎球菌多糖和B群外膜蛋白偶联的结合疫苗经动物试验证明具有良好的免疫原性和免疫回忆反应。
本发明的理论基础：
联合疫苗一直是WHO鼓励的发展目标，近年来上市的甲肝乙肝联合疫苗、麻疹腮腺炎风疹联合疫苗、百白破乙肝Hib联合疫苗等均表明了联合疫苗是疫苗发展的重要趋势。联合疫苗的优势在于减少了接种对象被注射次数，降低了副反应发生率，提高疫苗接种率，节约了社会资源。而研究开发联合疫苗必须遵循下述原则；联合后副反应不得增加，不同抗原之间不得有干扰，免疫原性和保护效力不得被降低，稳定性不得减弱，对已进入免疫程序的其它疫苗不得有干扰作用。本发明的脑炎和脑膜炎联合疫苗正是继承了上述联合疫苗的优点和遵循了上述联合疫苗的原则。
关于脑炎和脑膜炎联合疫苗，本领域技术人员认为现有乙型脑炎灭活疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗是无法制成联合疫苗。其理由为：第一，两种疫苗的免疫程序不同。乙型脑炎灭活疫苗的免疫程序是0、7天接种两剂，第二年加强一剂。脑膜炎球菌结合疫苗的免疫程序是0、1、2月接种三剂。第二，现在大规模使用的乙型脑炎疫苗是鼠脑组织灭活疫苗、地鼠肾细胞培养的灭活疫苗和地鼠肾细胞培养的减毒活疫苗，这些疫苗自身的安全性均亟待提高。第三，现行脑膜炎球菌多糖疫苗对两岁以下儿童无保护作用。
本发明则认为乙型脑炎灭活疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗是可以制成联合疫苗。其理由为：第一，现行乙型脑炎灭活疫苗因为副反应缘故，每剂抗原含量较低，故基础免疫间隔较短为7天。本发明所用乙型脑炎灭活疫苗是病毒经Vero细胞培养、灭活、超滤浓缩、纯化制成，加大了每剂病毒抗原含量，提高疫苗免疫原性而不增加副反应，使得基础免疫间隔可延长至一个月。再综合脑膜炎球菌结合疫苗的免疫程序，联合疫苗的免疫程序为0、1、6～12月。第二，经Vero细胞制备的乙型脑炎灭活纯化疫苗和用B群脑膜炎球菌外膜蛋白作载体的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗均已解决了自身的免疫效力和安全性，使配制联合疫苗成为可能。第三，联合疫苗不同抗原之间无干扰现象，不同抗原的免疫原性和保护效力不但没被降低，反而出现了增强彼此免疫效力的效应。
鉴于上述原因，将经Vero细胞制备的乙型脑炎灭活纯化疫苗和用B群脑膜炎球菌外膜蛋白作载体的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗进行配制成联合疫苗，用以预防婴幼儿、儿童、青少年及成人因乙型脑炎病毒和A、B、C群脑膜炎球菌感染引起的脑炎和脑膜炎及败血症疾病。因此，本发明的目的在于提供一种由乙型脑炎病毒疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗制备的联合疫苗及其制备方法。
发明内容
本发明提供了一种联合疫苗，其特征在于包括乙型脑炎病毒疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗，其中所述的脑膜炎球菌结合疫苗是一种由A群脑膜炎球菌荚膜多糖、C群脑膜炎球菌荚膜多糖分别与蛋白载体偶联的结合疫苗，所述蛋白载体选自B群脑膜炎球菌外膜蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素或无毒性白喉变异株毒素CRM197中任一种。
为了完成本发明的目的，本发明提供一种联合疫苗，其特征在于包括乙型脑炎病毒疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗。
本发明中，所述的乙型脑炎病毒疫苗是一种由乙型脑炎病毒经细胞培养、收获、灭活、超滤浓缩、纯化获得的完整病毒颗粒制备的疫苗。
为进一步消除全病毒颗粒中的内源性毒性成份，所述的乙型脑炎病毒疫苗还可以是完整的病毒颗粒再经化学裂解剂裂解，提取包含病毒外膜和刺突的片段，制成的乙型脑炎病毒裂解疫苗。
所述的乙型脑炎病毒疫苗是由SA14病毒株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株中任一病毒株制备的。
本发明中，所述的脑膜炎球菌结合疫苗是一种由A群脑膜炎球菌荚膜多糖和C群脑膜炎球菌荚膜多糖分别与蛋白载体偶联的结合疫苗。所述的A群脑膜炎球菌多糖来自菌株CMCC(B)29201，所述的C群脑膜炎球菌多糖来自菌株CMCC(B)29205，以及所述的B群脑膜炎球菌外膜蛋白来自菌株CMCC(B)29356和/或CMCC(B)29361。
所述的脑膜炎球菌结合疫苗还可是一种由A群、C群、W135群和Y群脑膜炎球菌荚膜多糖分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白相偶联的结合疫苗。
所述的蛋白载体选自B群脑膜炎球菌外膜蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、无毒性白喉变异株(CRM197)毒素。
另外，本发明联合疫苗含有氢氧化铝和/或磷酸铝等铝佐剂或其它本领域技术人员公知的佐剂。
本发明的乙型脑炎病毒疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗制备的联合疫苗中，每剂人用联合疫苗，含有乙型脑炎病毒蛋白5～50μg、A群脑膜炎球菌多糖5～50μg、C群脑膜炎球菌多糖5～50μg、B群脑膜炎球菌外膜蛋白30～300μg。换言之，本发明提供了一种经Vero传代细胞培养制备的灭活纯化乙型脑炎病毒疫苗，再将该病毒疫苗和以B群脑膜炎球菌外膜蛋白为载体的并分别与A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖形成共价偶联的双价结合疫苗配制成一种新的联合疫苗，用以预防婴幼儿、儿童、青少年及成人因乙型脑炎病毒和A、B、C群脑膜炎球菌感染引起的脑炎和脑膜炎及败血症疾病。本发明还提供了用乙型脑炎病毒经Vero细胞培养、收获、灭活、超滤浓缩、纯化获得的乙型脑炎病毒原液，再与A，C群脑膜炎球菌多糖纯化后分别与作载体的B群脑膜炎球菌外膜蛋白进行化学偶联再混合成的两价结合物原液，经配制成一种新的联合疫苗的方法。
本发明中重点引入的概念和方法是，对经Vero细胞培养制备的乙型脑炎病毒灭活纯化疫苗和用A、C群脑膜炎球菌多糖与B群脑膜炎球菌外膜蛋白偶联形成的结合疫苗，再经配制成为一种新的联合疫苗。
本发明的显著特点在于联合疫苗的免疫增强效应。乙型脑炎和脑膜炎联合疫苗，不是将两种疫苗进行简单的混合。经配制后的联合疫苗副反应没有增加，各种抗原彼此没有干扰，却表现出抗原彼此协同效果。不同抗原的抗原性和免疫原性不仅没有被降低，反而出现免疫增强效应。联合后乙型脑炎病毒抗原中和抗体滴度(1∶40)和保护效力(1.827)显著高于联合前的中和抗体滴度(1∶20)和保护效力(1.618)，联合后A群脑膜炎球菌抗原的免疫原性(GMT 8792)显著高于联合前的免疫原性(GMT 5861)，联合后C群脑膜炎球菌抗原的免疫原性(GMT7952)显著高于联合前的免疫原性(GMT 5353)。
本发明所用乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)毒种购买于中国药品生物制品检定所。毒种名称为：SA14、SA14-14-2、P3、Nakayama株。
中国药品生物制品检定所负责制备和发放上述病毒毒种，公众可以购买。
在本发明的一个实施方案中，乙型脑炎病毒培养可采用上述毒种SA14、SA14-14-2、P3、Nakayama株中的任何一株。如果满足需要，也可采用其它合适的毒种，此处给出的毒种仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明所用脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)菌株购买于中国医学细菌保藏中心(CMCC)，其菌株号为；CMCC(B)29201 A4株、CMCC(B)29205 C11株、CMCC(B)29356 B4株、CMCC(B)29361B15株。
中国医学细菌保藏中心的全称为医学微生物菌种保藏管理中心，上述菌株保藏在该中心所属单位：中国药品生物制品检定所，北京(NICPBP)。该机构生产、销售这些菌株，公众可以购买。
在本发明的一个实施方案中，A群脑膜炎球菌多糖制备时可采用的菌株为CMCC(B)29201，C群脑膜炎球菌多糖制备时可采用的菌株为CMCC(B)29205，而B群脑膜炎球菌外膜蛋白制备时可采用的菌株为CMCC(B)29356和/或CMCC(B)29361。如果满足需要，也可采用其它合适的菌株，这里给出的菌株仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明的乙型脑炎病毒培养体系是Vero细胞，也可是人二倍体细胞、鸡胚细胞、地鼠肾细胞。如果满足需要，也可采用其它合适的细胞，此处给出的细胞仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明的联合疫苗中，乙型脑炎病毒抗原每剂人用免疫剂量为含有病毒蛋白5～50μg，A和C群脑膜炎球菌荚膜多糖在所述结合疫苗的每剂人用免疫剂量中各有5～50μg。至于用量的上限，本领域的技术人员可以根据联合疫苗人体临床试验数据而最终确定。
本发明的联合疫苗中可以进一步添加佐剂，例如氢氧化铝和/或磷酸铝等铝佐剂。使用时，可以对本发明的联合疫苗进行稀释，合适的稀释液的不限定的实例有磷酸盐缓冲液稀释液。
本发明的联合疫苗的免疫程序不同于现行乙型脑炎疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗的免疫程序，联合疫苗的免疫程序是0、1、6～12月接种3针，第一针在儿童3～6月龄时接种。
总之，目前还没有一种新的将经Vero细胞制备的乙型脑炎灭活纯化疫苗和用B群脑膜炎球菌外膜蛋白作载体的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗进行配制成联合疫苗。该联合疫苗用以预防婴幼儿、儿童、青少年及成人因乙型脑炎病毒和A、B、C群脑膜炎球菌感染引起的脑炎和脑膜炎及败血症疾病。
具体实施方式
下面结合实施例描述本发明；
实施例1
乙型脑炎病毒疫苗原液和脑膜炎球菌多糖与蛋白结合疫苗原液的制备及联合疫苗的配制。
乙型脑炎病毒疫苗原液制备：Vero细胞经连续传4代，37℃培养。第4代细胞培养72小时后，用磷酸缓冲液淋洗，接种病毒滴度为7.96PFU/ml的乙型脑炎病毒SA14株病毒，并加入细胞维持液于35℃，培养24小时。换入新鲜细胞维持液，按上述条件继续培养72小时，细胞病变(CPE)++～+++，收获、合并病毒液。留样后，加入20％的甲醛，使其终浓度为0.05％，置22℃、8天灭活病毒。经灭活试验验证合格后，用300KD滤膜超滤浓缩。于浓缩后的病毒液中加入10mg/ml的硫酸鱼精蛋白，使其终浓度为0.1mg/ml，8,000rpm离心后，除菌过滤。再经Sepharose 4FF凝胶柱层析，收集病毒峰液体，加入适量人白蛋白作为保护剂，贮存于2～8℃。经无菌试验、残余牛血清测定、效力试验等项目测定合格后即为乙型脑炎病毒疫苗原液。
脑膜炎球菌多糖与蛋白结合疫苗原液的制备：(1)B群脑膜炎球菌外膜蛋白的制备：启开B群脑膜炎球菌菌株接种于半综合斜面，扩菌传至第五代液体罐培养，连续离心收集菌体，用0.3～0.6M LiCl和0.2～0.5M CH3COONa混合物提取外膜蛋白。35～45℃振荡1～3小时。离心4000～8000转/分×1小时，收集上清，继而加乙醇浓度至60～80％沉淀外膜蛋白。用注射溶液复溶后，通过超滤收集400KD过滤液，再经30KD超滤膜浓缩。用SDS-PAGE检测所需1、2类或1、3类外膜蛋白含量。Sephacryl S 200-400层析，收集所需1、2类或1、3类外膜蛋白。检测蛋白含量(Lowry法)、主要成份及1、2类或1、3类外膜蛋白的纯度(SDS-PAGE法)和内毒素含量(鲎试剂法)、无菌试验。(2)A群脑膜炎球菌荚膜多糖偶联原液：A群脑膜炎球菌多糖的制备方法的细节，参见《中国生物制品规程》(化学工业出版社，2000年，80～85页)。A群脑膜炎球菌荚膜多糖稀释至4mg/ml加溴化氰活化多糖，23±3℃下作用1～1.5小时，调pH并维持pH9～11，继后加已二酰肼2.5～5mg/mgps，维持pH8～10作用10～30分钟，在2～8℃搅拌10～20小时，透析去除小分子物质，取样测溴化氰残余量，已二酰肼衍化率。加等量B群脑膜炎球菌外膜蛋白与多糖混合，加碳二亚胺15～25mg/ml混合物，5～15℃作用1～1.5小时，调整PH5～7。偶联原液透析去除小分子物质。300KD膜包超滤浓缩，经Sepharose CL-4B柱层析，收集高分子量的偶联化合物，除菌过滤检测磷含量，蛋白含量，计算多糖和蛋白比值，分子量测定及KD0.3回收率，多糖蛋白鉴别试验、内毒素含量、无菌试验各项检验合格后，为A群脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白偶联原液。(3)C群脑膜炎球菌荚膜多糖偶联原液：C群脑膜炎球菌多糖的制备细节与A群脑膜炎球菌多糖的制备方法相同。C群脑膜炎球菌荚膜多糖稀释至4mg/ml，加溴化氰(CNBr)活化多糖，20～30℃下作用1～1.5小时，调PH并维持PH9～11，继后加已二酰肼(ADH)2.5～5mg/mg多糖，维持PH8～10，反应30分钟，在2～8℃搅拌10～20小时，透析去除小分子物质。取样测CNBr残余量，ADH衍化率。加等量B群脑膜炎球菌外膜蛋白与多糖混合，加碳二亚胺(EDAC)15～25mg/ml混合物，5～15℃反应1～1.5小时，调PH5～7。偶联原液透析去除小分子物质，300KD膜包超滤浓缩，经SepharoseCL-4B柱层析，收集高分子量的偶联化合物，除菌过滤，检测唾液酸含量，蛋白含量计算多糖和蛋白比值，分子量测定及KD0.3回收率，多糖、蛋白鉴别试验、内毒素含量、无菌试验各项检定合格后，为C群脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白偶联原液。
联合疫苗的配制：将上述乙型脑炎病毒疫苗原液、A群脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白偶联原液和C群脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白偶联原液用磷酸缓冲液进行配制，使每剂抗原终浓度分别为：乙型脑炎病毒蛋白10μg、A群脑膜炎球菌多糖5μg、C群脑膜炎球菌多糖5μg、B群脑膜炎球菌外膜蛋白30μg。每剂再加入抗原稳定剂人血白蛋白0.12％、硫柳汞0.005％、调pH6.5，按0.5/剂分装即为联合疫苗。
实施例2
乙型脑炎病毒疫苗原液和脑膜炎球菌多糖与蛋白结合疫苗原液的制备及联合疫苗的配制。
重复实施例1中所述的步骤，不同的是在联合疫苗的配制时，将上述乙型脑炎病毒疫苗原液、A群脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白偶联原液和C群脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白偶联原液用磷酸缓冲液进行配制，使每剂抗原终浓度分别为：乙型脑炎病毒蛋白20μg、A群脑膜炎球菌多糖20μg、C群脑膜炎球菌多糖20μg、B群脑膜炎球菌外膜蛋白150μg。每剂再加入抗原稳定剂人血白蛋白0.12％、硫柳汞0.005％、调pH7.5，按0.5/剂分装即为联合疫苗。
实施例3
乙型脑炎和脑膜炎联合疫苗的安全性试验
对乙型脑炎和脑膜炎联合疫苗的安全性进行考核，分别采用小鼠、豚鼠异常毒性试验法考核其安全性。选用250～350g清洁级豚鼠，腹腔接种10个人用剂量的乙型脑炎和脑膜炎联合疫苗，分别于注射前、注射后7天称体重，并随时观察接种反应。选用18～22g清洁级级Balb/c品系小鼠，腹腔接种1个人用剂量乙型脑炎和脑膜炎联合疫苗，分别于注射前、注射后7天称体重，并随时观察接种反应。试验结果列于表1。
表1.乙型脑炎和脑膜炎联合疫苗的安全性试验
| 动物 | 接种前体重(g) | 观察期接种反应 | 接种后7天体重(g) | 结论 |
| 豚鼠 | 315 | 豚鼠健存无异常反应 | 354 | 合格 |
| 豚鼠 | 306 | 豚鼠健存无异常反应 | 345 | 合格 |
| 小鼠 | 19.8 | 小鼠健存无异常反应 | 21.5 | 合格 |
| 小鼠 | 20.2 | 小鼠健存无异常反应 | 22.3 | 合格 |
| 小鼠 | 20.0 | 小鼠健存无异常反应 | 22.8 | 合格 |
| 小鼠 | 20.6 | 小鼠健存无异常反应 | 21.6 | 合格 |
| 小鼠 | 21.O | 小鼠健存无异常反应 | 22.5 | 合格 |
动物安全性试验表明，乙型脑炎和脑膜炎联合疫苗中没有外源性毒性物质的污染、没有意外的不安全因素，可以保证人体使用的安全。
实施例4
联合疫苗中乙型脑炎病毒抗原对脑膜炎球菌抗原免疫原性的干扰和影响
选用6周龄BALB/C小鼠，分成联合疫苗组、AC群脑膜炎球菌结合疫苗组和对照组。每组10只小鼠，每只小鼠皮下注射含A、C群脑膜炎球菌多糖各2.5μg的联合疫苗和AC群脑膜炎球菌多糖结合疫苗，初次免疫2周后加强免疫1次，未次免疫后7天采血，采用间接ELISA法检测小鼠血清抗体滴度(GMT)，ELISA法检测小鼠血清1∶100阳性率不低于80％，对照组为生理盐水，每只小鼠皮下注射0.5ml，以对照组小鼠血清(1∶100)平均吸光值的2.1倍为阳性判断标准。结果见表2。
表2.联合疫苗中脑膜炎球菌抗原的免疫原性
| 疫苗种类 | A群抗原 | C群抗原 | ||
| GMT | 阳转率％ | GMT | 阳转率％ | |
| AC群结合疫苗 | 5861 | 100 | 5353 | 100 |
| 联合疫苗 | 8792 | 100 | 7952 | 100 |
上述结果表明，联合疫苗和AC群脑膜炎球菌结合疫苗分别在A、C群多糖抗原的阳转率方面没有显著性差异，但在GMT方面确有显著性差异。A、C群脑膜炎球菌结合疫苗联合前的GMT分别为5861、5353，联合后的GMT则分别为8792、7952，表明A、C群多糖抗原的免疫原性在与乙型脑炎疫苗联合后有显著性提高(P＜0.01)。进一步说明，联合后A、C群多糖抗原的免疫原性不仅没有受到乙型脑炎病毒抗原的干扰，反而得到乙型脑炎病毒抗原协同作用，联合疫苗中脑膜炎抗原的免疫原性出现了增强效应。
实施例5
联合疫苗中脑膜炎球菌抗原对乙型脑病毒炎抗原免疫原性的干扰和影响
每种疫苗选12～14g小鼠20只，每只腹腔分别免疫Vero细胞乙型脑炎灭活纯化疫苗和联合疫苗0.5ml，免疫两次，间隔7天。初免15天后采血，2～8℃过夜。次日分离血清，56℃30分钟灭活。用蚀斑减少中和实验测定中和抗体滴度，中和病毒株为SA14株和P3株，试验结果见表3。
表3.联合疫苗中乙型脑炎病毒抗原的免疫原性
| 疫苗种类 | 中和抗体滴度 | |
| 中和病毒SA14 | 中和病毒P3 | |
| 乙脑灭活纯化疫苗 | 1∶20 | 1∶20 |
| 联合疫苗 | 1∶40 | 1∶40 |
上述结果表明，联合疫苗和Vero细胞乙型脑炎灭活纯化疫苗在中和抗体滴度方面有显著性差异，乙型脑炎病毒抗原的中和抗体滴度在联合后显著性提高(P＜0.01)。进一步说明，联合后乙型脑炎病毒抗原的免疫原性不仅没有受到脑膜炎球菌抗原的干扰，反而得到脑膜炎球菌抗原的协同作用，联合后乙型脑炎病毒抗原的免疫原性表现出增强效应。
实施例6
联合疫苗中脑膜炎球菌抗原对乙型脑病毒炎抗原保护效力的干扰和影响
采用免疫小白鼠中和抗体测定法。中和抗体测定采用蚀斑减少试验。参考疫苗(RA和RB)及中和试验阳性血清购自中国药品生物制品检定所。将Vero细胞培养制备的灭活纯化疫苗(T1)、联合疫苗(T2)和参考疫苗(R)均分别稀释1∶32，分别腹腔免疫体重12～14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天。第2次免疫后7天采血，分离血清，同组小鼠血清等量混合，于56℃灭活30分钟，稀释阳性血清、T1血清、T2血清和R血清，分别与稀释好的病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合。同时将稀释好的病毒再1∶2稀释，作为病毒对照，置37℃水浴作用90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，37℃培养90分钟，加入甲基纤维素的培养基覆盖物，于CO2孵箱中培养5天，染色，蚀斑计数，计算T1、T2和R组对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间，合格判定标准为T≥(RA+RB)/2-0.33，结果见表4。
表4.联合疫苗中乙型脑炎病毒抗原的保护效力
| 疫苗种类 | 蚀斑减少率 | 中和指数 | 结论 |
| 乙脑灭活纯化疫苗 | 22.15 | 1.618 | 合格 |
| 联合疫苗 | 31.69 | 1.827 | 合格 |
上述结果表明，联合疫苗和Vero细胞乙型脑炎灭活纯化疫苗在保护效力(中和指数)方面有显著性差异，乙型脑炎病毒抗原的保护效力在联合后被显著性提高(P＜0.01)。进一步说明，联合后乙型脑炎病毒抗原的保护效力没有受到脑膜炎球菌抗原的干扰，反而得到脑膜炎球菌抗原的协同作用，联合后乙型脑炎病毒抗原的保护效力表现出增强效应。
Claims (9)
1、一种联合疫苗，其特征在于包括乙型脑炎病毒疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗，其中所述的脑膜炎球菌结合疫苗是一种由A群脑膜炎球菌荚膜多糖、C群脑膜炎球菌荚膜多糖分别与蛋白载体偶联的结合疫苗，所述蛋白载体选自B群脑膜炎球菌外膜蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素或无毒性白喉变异株毒素CRM197中任一种。
2、根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于所述的乙型脑炎病毒疫苗每剂人用联合疫苗中，含有乙型脑炎病毒蛋白5～50μg、A群脑膜炎球菌多糖5～50μg、C群脑膜炎球菌多糖5～50μg、B群脑膜炎球菌外膜蛋白30～300μg。
3、根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于所述的乙型脑炎病毒疫苗是一种由乙型脑炎病毒经细胞培养、收获、灭活、超滤浓缩、纯化获得的完整病毒颗粒制备的疫苗。
4、根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于所述的乙型脑炎病毒疫苗是将获得的完整病毒颗粒，再经化学裂解剂裂解，提取包含病毒外膜和刺突的片段，制成的乙型脑炎病毒裂解疫苗。
5、根据权利要求3-4任何一项所述的联合疫苗，其特征在于所述的乙型脑炎病毒疫苗是由乙型脑炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株中任一病毒株制备的。
6、根据权利要求3所述的联合疫苗，其特征在于所述的细胞培养中的细胞是Vero细胞、地鼠肾细胞、人二倍体细胞。
7.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于所述的A群脑膜炎球菌多糖来自菌株CMCC(B)29201，所述的C群脑膜炎球菌多糖来自菌株CMCC(B)29205，以及所述的B群脑膜炎球菌外膜蛋白来自菌株CMCC(B)29356和/或CMCC(B)29361。
8.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于联合疫苗含有铝佐剂。
9.根据权利要求8所述的联合疫苗，其特征在于所述的铝佐剂包括氢氧化铝和/或磷酸铝。
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