CN1305526C - 乙型脑炎病毒裂解疫苗及其制备方法 - Google Patents
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本发明涉及一种乙型脑炎病毒裂解疫苗及其制备方法。该方法包括将经过细胞培养获得的乙型脑炎全病毒颗粒用化学方法进行裂解，提取和纯化含有病毒包膜和刺突的片段，再加入铝佐剂配制成一种乙型脑炎病毒裂解疫苗。这种病毒裂解疫苗可以预防婴幼儿、儿童、青少年及成人因乙型脑炎病毒感染引起的乙型脑炎疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种乙型脑炎病毒裂解疫苗。具体而言，本发明涉及一种乙型脑炎全病毒颗粒经化学裂解后，提取的含有病毒包膜和刺突的片断，再加入铝盐等佐剂配制成一种乙型脑炎病毒裂解疫苗。这种病毒裂解疫苗可以预防婴幼儿、儿童、青少年及成人因乙型脑炎病毒感染引起的乙型脑炎疾病。本发明还涉及这种病毒裂解疫苗的制备方法。
背景技术
乙型脑炎是中枢神经系统急性病毒感染的传染性疾病，在流行地区年发病率高达10～100/10万，近30亿人口生活在乙型脑炎流行区，该地区每年新生儿就超过7千万。在亚洲的病毒性脑炎中，乙型脑炎是最严重的疾病。每年至少引起50,000临床病例和10,000例病死，绝大多数发生于儿童中。在最近几十年中，乙型脑炎的数起暴发流行均发生于曾经是非流行的地区，同时伴随很高的病死率和严重的持久性神经系统后遗症，因而在亚洲很多国家和地区，乙型脑炎成为严重的公共健康问题。
流行性乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)简称乙脑病毒，病毒颗粒呈二十面体对称结构，直径45-50nm，病毒颗粒由核心、包膜和刺突组成，属黄病毒的一种。基因为正链单股RNA，RNA包被于单股多肽的衣壳C中，组成病毒颗粒的核心。其包膜中有糖基化蛋白E和非糖基化蛋白prM/M。
在乙型脑炎传染途径中蚊子是乙脑病毒的主要传播媒介，猪是主要中间宿主，人因被带毒的蚊虫叮咬而感染。目前还没有治疗乙型脑炎疾病的特效药物，从环境方面控制其传播的效果不理想。乙型脑炎疫苗的免疫接种是控制乙型脑炎疾病最为经济有效的措施。
乙型脑炎疫苗有3类在大规模应用，经鼠脑组织制备的灭活疫苗、地鼠肾原代细胞或Vero细胞培养制备的灭活疫苗和地鼠肾原代细胞培养的减毒活疫苗。
由于乙型脑炎疫苗基础免疫始于两岁以下儿童，就要求疫苗在安全前提下保证更高的效力。上述乙型脑炎疫苗无论采用何种病毒培养体系，最终均是经适宜方法制成含全病毒颗粒的疫苗。这类疫苗的缺点在于无法进一步增加抗原含量从而在人体中产生更高的免疫应答反应、提供更高、更久的免疫保护。其原因为如进一步增加病毒抗原含量时，病毒颗粒中与保护性抗原无关的病毒内源性毒性成份，如杂蛋白、病毒核酸及脂质等也随之增加，因此疫苗副反应就加大。例如，经鼠脑组织培养的灭活疫苗以疼痛、发红、肿胀的局部副反应约为20％，包括头疼、发热、肌痛、不适和胃肠道症状的全身性反应为10～30％。1989年和1990年在丹麦及澳大利亚还分别发现31例和7例荨麻疹和血管性水肿的严重变态反应。经地鼠肾细胞培养的灭活疫苗超过38℃的发热高达12％，在减少了牛血清残留量后，超过38℃的发热减至6％(Tsai，Theodore F，Japanese encephalitis vaccines，www.cdc.gov.publication date：01/01/1990)。而减毒活疫苗是用非清洁级地鼠原代肾细胞作为疫苗培养基质，这难以避免鼠源的外源因子的污染，这种可能造成的污染又是难以用现行生物学方法检出。因此，不能为世界卫生组织疫苗制造检定规程所接纳(迮文远，计划免疫学，上海科学技术文献出版社，2001年，484页)。
鉴于上述原因，需要对现有全病毒疫苗进行革命性地改造，而非仅限于病毒表达体系的改变(Vero传代细胞替代地鼠肾原代细胞)和制造工艺的改进(进一步纯化)，才能满足两岁以下婴幼儿预防乙型脑炎病毒的感染。
已证实，存在于乙型脑炎病毒包膜和刺突的E蛋白、prM/M蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合性、保护性免疫、产生血凝抗体和特异性中和抗体密切相关。E蛋白在病毒分类和致病机理上起重要作用，是病毒颗粒表面的重要成份。
已经发现，较全病毒的流感疫苗相比，流感裂解疫苗在儿童中一样可产生良好的保护效力，但副反应更低，耐受好于全病毒疫苗(Beyer，W.E.P.Clin Drug Invest 15(1)：1-12，1988)。因而流感裂解疫苗可用于6月龄以上的儿童和成人，全病毒流感疫苗则不可用于低龄儿童。流感裂解疫苗成了流感疫苗中最主流的制品，并在世界范围大规模使用。病毒裂解疫苗的技术和方法在流感疫苗上获得了充分的证实和体现。
进一步发现，为提高疫苗的安全性，在两岁以下儿童中接种的常规疫苗，除减毒活疫苗外，均有非全病毒或非全菌体的发展趋势。如全细胞百日咳疫苗向无细胞百日咳疫苗的过渡，以及上述的流感全病毒疫苗向裂解或亚单位疫苗的过渡。
综上所述，本发明的乙型脑炎裂解疫苗重点解决了，在提高疫苗效力的同时极大地降低了疫苗副反应，保证了疫苗在两岁以下儿童中使用的安全性。
为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种新的乙型脑炎病毒裂解疫苗，及其制备方法。
发明内容
为了完成本发明的目的，本发明提供一种乙型脑炎病毒裂解疫苗，其特征在于，该疫苗含有乙型脑炎全病毒颗粒经裂解后的片段。所述的裂解是乙型脑炎全病毒颗粒被化学法裂解。所述的片段包括乙型脑炎全病毒颗粒的包膜和刺突的片段。
所述的裂解疫苗是由乙型脑炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株中任一株制备的。
在本发明中，乙型脑炎病毒裂解疫苗每剂量为含有病毒蛋白5～90μg。乙型脑炎病毒裂解疫苗每剂所含有的病毒蛋白为分布于乙型脑炎病毒包膜和刺突上的蛋白。
本发明所述的裂解疫苗含有佐剂，优选为铝盐/皂角苷/胞壁酰二肽和三肽/脂质A/百日咳博得特杆菌/细胞因子。
本发明还涉及一种制备乙型脑炎病毒裂解疫苗的方法，该方法的步骤包括：
(1)、将Triton-100按0.2～1.0％终浓度加入纯化后的病毒液中裂解病毒颗粒；
(2)、裂解后的病毒液进行二次纯化，用10～60％蔗糖密度梯度离心或柱层析方法收集病毒包膜片断部分，再次纯化抗原；
(3)、经100KD→300KD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒裂解液；
(4)、经配制、稀释和分装成为成品疫苗。
换言之，本发明提供了将乙型脑炎病毒株经过细胞培养、灭活、纯化获得的乙型脑炎病毒颗粒用化学方法进行裂解，提取和纯化含有保护性抗原的病毒包膜和刺突的片段，配制成一种乙型脑炎病毒裂解疫苗。本发明还提供了制备这种裂解疫苗的方法。这种病毒裂解疫苗可以分别预防婴幼儿、儿童、青少年及成人因乙型脑炎病毒感染引起的乙型脑炎疾病。
本发明中重点引入的概念和方法是对现行的乙型脑炎病毒疫苗进行改造和升级使之达到更好的免疫效果和安全性。本发明是将经纯化后的乙型脑炎病毒加入有机溶剂或裂解剂，对其全病毒颗粒在适宜的条件下进行病毒裂解，再提取和纯化含有病毒包膜和刺突的片段，经配制成为乙型脑炎病毒裂解疫苗。使这种裂解疫苗中，除含有免疫原性的膜抗原存在外，极大地降低了其它有可能性引起不良反应的病毒内源性毒性物质，如病毒核酸及脂质。从而能克服现行的全病毒商品疫苗具有的免疫局限性及接种后的不良反应。
本发明所用乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)毒种购买于中国药品生物制品检定所。毒种名称为：SA14、SA14-14-2、P3、Nakayama。中国药品生物制品检定所负责制备和发放上述病毒毒种。
在本发明的一个实施方案中，乙型脑炎病毒培养可采用上述毒种SA14、SA14-14-2、P3、Nakayama中的任何一株。如果满足需要，也可采用其它合适的毒种，此处给出的毒种仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明的乙型脑炎病毒培养体系是Vero细胞，也可是人二倍体细胞、地鼠肾细胞。如果满足需要，也可采用其它合适的细胞，此处给出的细胞仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明所用的病毒裂解剂为Triton-100(0.2～1.0％终浓度，具体浓度依据病毒量而定)。
本发明提供了乙型脑炎病毒裂解、抗原提取和纯化及疫苗配制的方法。具体而言，根据纯化病毒液的病毒浓度，将Triton-100加入纯化后的病毒液中，使病毒颗粒充分彻底裂解。裂解后的病毒液进行二次纯化，用蔗糖密度梯度离心或柱层析方法，收集含有病毒包膜和刺突的片段。经滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒裂解液。用缓冲液稀释，加入1％硫柳汞，经二次除菌过滤制备出疫苗原液，加入适宜的抗原稳定剂和铝盐等佐剂后，经无菌试验、蛋白浓度及纯度测定、效力试验等检定合格后，分装即为疫苗。
本发明公开的乙型脑炎病毒裂解、抗原提取和纯化及疫苗配制的方法与WO 02/28422 A2和WO 02/28426 A1实施例公开的RSV病毒和PIV病毒裂解方法截然不同。其主要区别点在于裂解剂不同、增加用蔗糖密度梯度离心进行分离和纯化、合并后用滤膜超滤浓缩和透析脱糖、脱裂解剂等。
的每剂量为含有病毒蛋白5～90μg。至于用量的上限，本领域的技术人员可以根据疫苗人体临床试验数据而最终确定。
本发明的疫苗中可以进一步添加吸附剂佐剂，例如氢氧化铝和/或磷酸铝/皂角苷/胞壁酰二肽和三肽/脂质A/百日咳博得特杆菌/细胞因子等其它佐剂。使用时，可以对本发明的乙型脑炎病毒裂解疫苗进行稀释，合适的稀释液的不限定的实例有磷酸盐缓冲液稀释液。
本发明的乙型脑炎病毒裂解疫苗可以和A、C群脑膜炎球菌多糖与一蛋白载体偶联形成的结合疫苗组成乙脑—流脑联合疫苗。
本发明的乙型脑炎病毒裂解疫苗还可进一步和其它疫苗组成联合疫苗，如：无细胞百白破疫苗—灭活脊髓灰质炎病毒疫苗—Hib疫苗—乙型肝炎疫苗—流脑结合疫苗—乙脑裂解疫苗。
本发明提供一种乙型脑炎病毒裂解疫苗的制备方法，并以此制备出更高免疫原性和效力、更安全、更易被接种者接受的一种乙型脑炎病毒裂解疫苗。
具体实施方式
下面结合实施例描述本发明，将获得的纯化乙型脑炎病毒颗粒经裂解剂进行裂解，再提取和纯化出含有病毒包膜和刺突的片段，经适当配制成裂解疫苗。乙型脑炎病毒裂解疫苗经动物试验和实验室检定证实该种裂解疫苗具有可靠的安全性和优良的免疫原性及卓越的保护效力。
实施例1
乙型脑炎病毒颗粒裂解和提取纯化及疫苗配制
乙型脑炎病毒培养采用毒种SA14、P3株。将Vero细胞于37℃培养，并经连续传4代。第4代细胞培养3-5天后，用磷酸缓冲液淋洗，接种病毒滴度为不低于7.5LgLD50/ml的乙型脑炎病毒，并加入细胞维持液于35℃，培养24小时。换入新鲜细胞维持液，按上述条件继续培养2-4天，当细胞病变(CPE)达到++～+++时，收获、合并病毒液。留样后，加入20％的甲醛，使其终浓度为0.05％，置22℃、8天灭活病毒。经灭活试验验证合格后，用100KD滤膜超滤浓缩。于浓缩后的病毒液中加入10mg/ml的硫酸鱼精蛋白，使其终浓度为0.1mg/ml，8,000rpm离心后，上清液除菌过滤。再经Sepharose 4FF凝胶柱层析，收集全病毒峰液体，根据纯化的全病毒液的病毒蛋白浓度，将Triton-100按0.2％终浓度缓慢加入纯化后的全病毒液中并轻微搅拌均匀。于2～8℃温和振荡60分钟，使病毒颗粒充分彻底裂解。裂解后的病毒液进行二次纯化，先用10～60％蔗糖密度梯度离心，收集富有病毒包膜和刺突特异蛋白的液相。再次纯化，用PBS稀释，调pH7.2。经100KD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒包膜和刺突蛋白。用磷酸盐缓冲液稀释，加入1％硫柳汞，经0.45μm和0.22μm二次除菌过滤制备出疫苗原液。经无菌试验、蛋白浓度及纯度测定、血凝素、效力试验等检定合格后，加入抗原稳定剂人血白蛋白，调pH7.0，按每剂含病毒蛋白5μg、0.5ml/每剂，分装即为疫苗。
实施例2
乙型脑炎病毒颗粒裂解和提取纯化及疫苗配制
乙型脑炎病毒培养采用毒种SA14、P3株。将Vero细胞于37℃培养，并经连续传4代。第4代细胞培养3-5天后，用磷酸缓冲液淋洗，接种病毒滴度为不低于7.5LgLD50/ml的乙型脑炎病毒，并加入细胞维持液于35℃，培养24小时。换入新鲜细胞维持液，按上述条件继续培养24天，当细胞病变(CPE)达到++～+++时，收获、合并病毒液。留样后，加入20％的甲醛，使其终浓度为0.05％，置22℃、8天灭活病毒。经灭活试验验证合格后，用300KD滤膜超滤浓缩。于浓缩后的病毒液中加入10mg/ml的硫酸鱼精蛋白，使其终浓度为0.1mg/ml，10000rpm离心后，上清液除菌过滤。再经Sepharose 6FF凝胶柱层析，收集全病毒峰液体，根据纯化的全病毒液的病毒蛋白浓度，将Triton-100按1.0％终浓度缓慢加入纯化后的全病毒液中并轻微搅拌均匀。于2～8℃温和振荡120分钟，使病毒颗粒充分彻底裂解。裂解后的病毒液进行二次纯化，先用10～60％蔗糖密度梯度离心，收集富有病毒包膜和刺突特异蛋白的液相。再次纯化，用PBS稀释，调pH7.6。经100KD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒包膜和刺突蛋白。用磷酸盐缓冲液稀释，加入1％硫柳汞，经0.45μm和0.22μm二次除菌过滤制备出疫苗原液。经无菌试验、蛋白浓度及纯度测定、血凝素、效力试验等检定合格后，加入抗原稳定剂人血白蛋白，调pH8.0，按每剂含病毒蛋白90μg、0.5ml/每剂，分装即为疫苗。
实施例3
铝佐剂吸附的乙型脑炎病毒裂解疫苗的配制
根据乙型脑炎病毒裂解疫苗原液病毒蛋白含量，加入灭菌无热原的氢氧化铝佐剂于疫苗原液中。缓慢加入并充分混匀，使之形成均匀分布的悬浊液，pH7.0～8.0。按每剂含病毒蛋白70μg、氢氧化铝≤0.70mg、0.5ml/每剂，分装即为疫苗。
实施例4
乙型脑炎病毒裂解疫苗的安全性试验
对乙型脑炎病毒裂解疫苗的安全性进行考核，分别采用小鼠、豚鼠异常毒性试验考核其安全性。
选用体重250～350g的清洁级豚鼠，每种疫苗用2只豚鼠，每只腹腔注射5.0ml的乙型脑炎病毒裂解疫苗，分别于免前、免后7天称体重，并随时观察接种反应。
选用体重18～22g的清洁级小鼠，每种疫苗用5只小鼠，每只腹腔注射0.5ml的乙型脑炎病毒裂解疫苗，分别于免前、免后7天称体重，并随时观察接种反应。
试验结果列于表1、表2。
表1.乙型脑炎病毒裂解疫苗豚鼠安全性试验
| 疫苗种类 | 注射前平均体重(g) | 观察期反应 | 注射后7天平均体重(g) | 结论 |
| SA14株裂解疫苗(90μg) | 332 | 全部健存无异常反应 | 360 | 合格 |
| P3株裂解疫苗(90μg) | 339 | 全部健存无异常反应 | 374 | 合格 |
表2.乙型脑炎病毒裂解疫苗小鼠安全性试验
| 疫苗种类 | 注射前平均体重(g) | 观察期反应 | 注射后7天平均体重(g) | 结论 |
| SA14株裂解疫苗(90μg) | 19.5 | 全部健存无异常反应 | 21.8 | 合格 |
| P3株裂解疫苗(90μg) | 19.5 | 全部健存无异常反应 | 22.1 | 合格 |
动物安全性试验表明，不同株病毒制备的乙型脑炎病毒裂解疫苗中没有外源性毒性物质的污染、没有意外的不安全急性毒性因素，可以保证人体使用的安全。
实施例5
乙型脑炎病毒裂解疫苗的免疫原性试验及与全病毒疫苗的比较
每种疫苗选12～14g小鼠20只，每只腹腔免疫0.5ml，免疫两次，间隔7天。初免15天采血，2～8℃过夜。次日分离血清，56℃30分钟灭活。用蚀斑减少中和实验测定中和抗体滴度。乙型脑炎中和病毒株为SA14和P3株。试验结果见表3。
表3.乙型脑炎病毒裂解疫苗中和抗体滴度试验
| 疫苗种类 | 中和抗体滴度 | |
| 中和病毒SA14 | 中和病毒P3 | |
| SA14株裂解疫苗(5μg) | 1∶20 | 1∶20 |
| P3株裂解疫苗(5μg) | 1∶20 | 1∶20 |
| P3株全病毒疫苗 | 1∶10 | 1∶10 |
中和抗体滴度试验表明乙型脑炎病毒裂解疫苗具有良好的免疫原性，并且中和抗体滴度高于全病毒疫苗。
实施例6
乙型脑炎病毒裂解疫苗的保护效力试验及与全病毒疫苗的比较
采用免疫小白鼠中和抗体测定法。中和抗体测定采用蚀斑减少试验。参考疫苗(RA和RB)及中和试验阳性血清购自中国药品生物制品检定所。将裂解疫苗(T1)、全病毒疫苗(T2)和参考疫苗(R)均分别稀释1∶32，分别腹腔免疫体重12～14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天。第2次免疫后7天采血，分离血清，同组小鼠血清等量混合，于56℃灭活30分钟，稀释阳性血清、T1血清、T2血清和R血清，分别与稀释好的病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合。同时将稀释好的病毒再1∶2稀释，作为病毒对照，置37℃水浴作用90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，37℃培养90分钟，加入甲基纤维素的培养基覆盖物，于CO2孵箱中培养5天，染色，蚀斑计数，计算T1、T2和R组对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间，合格判定标准为T≥(RA+RB)/2-0.33，试验结果见表4。
表4.乙型脑炎病毒裂解疫苗保护效力试验
| 疫苗种类 | 中和指数 |
| SA14株裂解疫苗(5μg) | 2.016 |
| P3株裂解疫苗(5μg) | 1.890 |
| P3株全病毒疫苗 | 1.618 |
效力试验表明乙型脑炎病毒裂解疫苗具有良好的保护效力，并且效力中和指数高于全病毒疫苗。
Claims (7)
1、一种乙型脑炎病毒裂解疫苗，其特征在于，该疫苗含有乙型脑炎全病毒颗粒经裂解后的片段，该片段包括乙型脑炎全病毒颗粒的包膜和刺突，且其中乙型脑炎病毒裂解疫苗每剂量为含有病毒蛋白5～90μg。
2、根据权利要求1所述的乙型脑炎病毒裂解疫苗，其特征在于，所述的裂解是乙型脑炎全病毒颗粒被化学法裂解。
3、根据权利要求1所述的乙型脑炎病毒裂解疫苗，其特征在于，所述的裂解疫苗是由乙型脑炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株中任一株制备的。
4、根据权利要求2所述的裂解疫苗，其特征在于，乙型脑炎病毒裂解疫苗每剂所含有的病毒蛋白为分布于乙型脑炎病毒包膜和刺突上的蛋白。
5、根据权利要求1-4任何一项所述的裂解疫苗，其特征在于，所述的裂解疫苗含有佐剂。
6、根据权利要求5所述的裂解疫苗，其特征在于，所述的佐剂包括铝盐、皂角苷、胞壁酰二肽和三肽、脂质A、百日咳博得特杆菌或者细胞因子。
7、权利要求1所述的乙型脑炎病毒裂解疫苗的制备方法，该方法的步骤包括：
(A)、将Triton-100按0.2～1.0％终浓度加入纯化后的病毒液中裂解病毒颗粒；
(B)、裂解后的病毒液进行二次纯化，用10～60％蔗糖密度梯度离心或柱层析方法收集病毒包膜片断部分，再次纯化抗原；
(C)、经100KD→300KD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒裂解液；
(D)、经配制、稀释和分装成为成品疫苗。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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Free format text: FORMER OWNER: XUE PING Effective date: 20050603 Owner name: XUE PING Free format text: FORMER OWNER: ZHANG GUOMING |
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Effective date of registration: 20050603 Address after: Beijing Fengtai District City, the Pearl River Ascot 15 unit 2302 room Applicant after: Xue Ping Address before: Beijing Fengtai District City, the Pearl River Ascot 15 unit 2302 room Applicant before: Zhang Guoming Co-applicant before: Xue Ping |
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Owner name: CHENGDU ANTEJIN BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: XUE PING Effective date: 20131203 |
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 101318 SHUNYI, BEIJING TO: 610041 CHENGDU, SICHUAN PROVINCE |
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Effective date of registration: 20131203 Address after: 610041 No. 88 Park South Road, hi tech Zone, Sichuan, Chengdu Patentee after: CHENGDU ANTEJIN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 101318 Beijing City, Shunyi District Vanke City Garden No. 902 cloud Fengge Patentee before: Xue Ping |
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Denomination of invention: Split encephalitis B virus vaccine and method for preparing the same Effective date of registration: 20191021 Granted publication date: 20070321 Pledgee: Chengdu Branch of China Guangfa Bank Co.,Ltd. Pledgor: CHENGDU ANTEJIN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2019990000366 |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: No.88 Keyuan South Road, high tech Zone, Chengdu, Sichuan 610041 Patentee after: Fosun Antekin (Chengdu) Biopharmaceutical Co.,Ltd. Address before: No.88 Keyuan South Road, high tech Zone, Chengdu, Sichuan 610041 Patentee before: CHENGDU ANTEJIN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20221115 Granted publication date: 20070321 Pledgee: Chengdu Branch of China Guangfa Bank Co.,Ltd. Pledgor: Fosun Antekin (Chengdu) Biopharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2019990000366 |
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Change date: 20221115 Registration number: Y2019990000366 Pledgor after: Fosun Antekin (Chengdu) Biopharmaceutical Co.,Ltd. Pledgor before: CHENGDU ANTEJIN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
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| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20070321 |