KR0123538B1 - 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸우말라바이러스, 벨그라드바이러스 및 호왕바이러스 항원을 이용한 유행성출혈열 혼합백신 및 혼합진단제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유행성출혈열의 원인 바이러스인 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸우말라바이러스, 벨그라드바이러스 및 호왕바이러스 항원의 제조방법과 그 제조방법에 의하여 얻어지는 항원을 함유한 유행성출혈열 혼합백신과 혼합혈청진단제를 개시한다. 상세히는 랫트, 마우스 또는 햄스타에서 선택된 설치류 뇌세포에 순화하여 잘 증식되도록 적응한 한탄바이러스, 호왕바이러스, 푸우말라바이러스, 벨그라드바이러스, 서울바이러스로부터 선택된 1종 또는 1종 이상의 유행성출혈열 바이러스를 설치류의 뇌내에 접종하여 뇌염증세를 나타낸 동물의 뇌를 채취하여 믹서와 소니케이터를 이용하여 바이러스를 추출한 후 바이러스를 불활화하는 것을 특징으로 하는 유행성출혈열 바이러스 항원의 제조방법 및 이 제조방법에 의해 얻어진 항원을 함유한 유행성출혈열 혼합백신과 혼합혈청진단제를 개시한다.

Description

한탄바이러스, 서울바이러스, 푸우말라바이러스, 벨그라드바이러스 및 호왕바이러스 항원을 이용한 유행성출혈열 혼합백신 및 혼합진단제

제 1 도는 PCR로 증폭한 33개 한탄바이러스 cDNA 산물의 제한 엔도뉴클레아제 Nco I 및 Alu I로 절단한 패턴을 나타낸다.

제 2 도는 PCR로 증폭한 33개 한탄바이러스 cDNA 산물의 제한 엔도뉴클레아제 Mbo II 및 Pst I로 절단한 패턴을 나타낸다.

제 3 도는 쥐 뇌조직에서의 한탄바이러스의 중심곡선을 나타낸다.

제 4 도는 햄스타 뇌조직에서의 푸우말라바이러스의 중식곡선을 나타낸다.

제 5 도는 조직배양 Vero E6 세포에서의 한탄바이러스의 중식곡선을 나타낸다.

제 6 도는 모르못트에 각각 접종한 병원성 한탄바이러스의 항체반응을 나타낸다.

제 7 도는 모르못트에 포르말린 불활화 백신을 각각 접종한 후의 항체반응을 나타낸다.

제 8 도는 포르말린 불활화 혼합백신(한탄바이러스백신, 서울바이러스백신 및 푸우말라바이러스백신)을 모르못트 근육에 주사한 후의 항체반응을 나타낸다.

제 9 도는 포르말린 불활화 혼합백신(호왕바이러스백신 및 푸우말라바이러스백신)을 모르못트 근육 주사한 후의 항체반응을 나타낸다.

본 발명은 유행성출혈의 원인 바이러스인 한탄바이어스, 서울바이러스, 푸우말라바이러스, 벨그라드바이러스 및 호왕바이러스 항원의 제조방법과 그 제조방법에 의하여 얻어지는 항원을 함유한 유행성출혈열 혼합백신과 혼합혈청진단제에 관한 것이다.

상세히는 유행성출혈의 새로운 혼합백신과 5가지 바이러스 항원을 함유한 진단용 혼합항원을 제조하는 방법을 적용한 것이다. 특히 유행성출혈에 대한 광범한 효과를 지닌 새로운 혼합백신을 대량 제조하는 방법과 현재까지 발견된 5개의 바이러스에 대한 종합적인 혈청진단제를 제공한 것이다.

유행성출혈열은 80년 전부터 러시아와 중국에서 환자가 발생하였으나, 한국에서는 1951년 한국전쟁시 처음부터 이 병이 발생하여 한국형출혈열 또는 유행성출혈열이라 불렀고, 중국과 일본에서는 유행성출혈열, 러시아에서는 유행성신우신장염, 그리고 유럽에서는 유행성신염으로 불렀다. 1976년 세계최초로 유행성출혈열의 병원체가 한국에서 발견되어 한탄강의 이름을 따 한탄바이러스(Hantann virus)라 명명한 후 1982년 세계보건기구는 세계 여러지역에서 발생하는 한국형출혈열과 임상적으로 유사한 상기 질병들이 한탄바이러스 또는 이와 유사한 바이러스에 의하여 발생된다고 유사한 상기 질병들이 한탄바이러스 또는 이와 유사한 바이러스에 의하여 발생된다는 사실이 증명됨에 따라 이들 질병의 이름을 신증후출혈열로 통일하였다. 우리 나라에서는 아직도 유행성출혈열이라는 병명이 신증후출혈이라는 병명보다 더 잘 알려져 있으며 제2종 법정전염병으로 지정되어 있다.

유행성출혈은 급성 전염성 질환으로 병원체는 한탄바이러스(Hantavirus)속에 속하는 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸우말라바이러스, 벨그라드바이러스 및 호왕바이러스이며 사망율은 1∼7%에 달한다. 메년 세계에서는 약 20만명의 환자가 발생하고 있는데 중국에서 약 10∼15만명, 한국에서 약 2,000명, 일본에서 수백명, 동남아시아에서 수십명, 러시아에서 수천명 내지 수만명, 북유럽에서 수천명, 서유럽에서 수백명 그리고 아프리카 및 미국에서도 환자가 발생하여 약 1만명이 사망하고 있다.

한국에서 유행하고 있는 유행성출혈열은 한탄바이어스, 서울바이러스, 호왕바이러스 및 후우말라바이러스가 원인이고 중국에서는 한탄바이러스와 서울바이러스가 원인이며 일본, 미국, 아프리카 및 동남아에서는 서울바이러스에 의하여 환자가 발생한다. 그러나, 유럽에서 유행하는 유행성출혈열의 원인균은 푸우말라바이러스가 주이나, 한탄바이러스 및 벨그라드바이러스에 의한 환자도 있다. 그리고 세계 여러 나라 동물실험실에서 발생한 유행성출혈열 환자는 서울바이러스에 의한 것이 대부분이나, 한탄바이러스 및 푸우말라바이러스에 의한 것도 있다. 한탄바이러스, 호왕바이러스 및 서울바이러스에 의한 환자의 임상증상은 심하여 4∼7% 사망율을 나타내나 푸우말라바이러스에 의한 임상증상은 경하여 사망율도 4% 이하이다. 유해성출혈열의 보균동물은 야서, 집쥐 및 실험용 햄스타 및 실험용 쥐인데 감염된 동물의 배설물 중 특히 뇨, 타액, 변 중에 바이러스가 있으며, 이런 배설물에 오염된 흙, 풀, 고구마, 감자, 콩, 옥수수, 벼, 보리와 같은 곡식 등에 묻어 있던 바이러스가 건조한 먼지와 함께 사람의 호흡기를 통하여 폐로 감염된다. 유행성출혈열 환자는 1∼4주간의 잠복기를 거쳐 오한, 고열, 두통, 구토, 복용, 설사 등의 증상을 나타내며 40℃ 이상의 고열과 함께 전신 여러 장기에 출혈을 일으킨다. 발열기에 신장염의 증상도 나타내며 심한 요통과 함께 더불어 저혈압기에 빠져 신장기능 부진으로 사망하는 경우도 있으나 완전 회복까지는 보통 1∼2개월이 소요된다.

현재까지 한탄바이러스 백신(한탄백신, 녹집자사 )만이 한국에서 제조되고 있으나, 아직까지 서울바이러스, 밸그라드바이러스, 푸우말라바이러스 및 호왕바이러스 항원을 이용한 백신과 진단제는 생산되지 못하고 있다. 그러나, 일본, 중국 및 미국에서도 한탄바이러스 및 서울바이러스에 대한 백신이 연구되고 있다. 유행성출혈을 일으키는 상기한 5종류의 바이러스에 대한 중화항체는 특이하기 때문에 한국 뿐만 아니라 일본, 중국, 러시아 및 유럽 등지에서 유행하는 유행성출혈열을 예방하려면 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸우말라바이러스 및 호왕바이러스 항원이 함유된 혼합백신이 필요하게 된다. 상세히는 한탄바이러스의 분포에 따라 지역마다 요구되는 백신의 종류가 달라지게 된다. 즉, 한국에서는 한탄바이러스 또는 호왕바이러스, 서울바이러스 및 푸우말라바이러스 항원이 포함된 혼합백신이 필요하며, 중국에서는 한탄바이러스와 서울바이러스의 혼합백신이, 러시아에서는 한탄바이러스와 푸우말라바이러스의 혼합백신이, 구라파에서는 푸우말라바이러스와 한탄바이러스 백신이, 그리고 기타지역에서는 서울바이러스 백신이 필요한 것이다. 다행히 한탄바이러스와 호왕바이러스는 혈청학적으로 중화항체가 교차반응을 일으키기 때문에 필요에 따라 한가지 바이러스를 사용할 수 있다. 상기한 바와 같이 지역에 따라 여러 가지 종류의 백신을 각각 제조한다는 것은 경제적으로나 기술적으로 부담이 크기 때문에 이상적인 유행성출혈열 예방백신은 세계적으로 공통된 한탄바이러스나 호왕바이러스, 서울바이러스 및 푸우말라바이러스 항원을 함유한 혼합백신이라 할 수 있다.

현재까지 사람에 사용되고 있는 유행성출혈열 백신은 한탄바이러스 백신(한탄박스)뿐인데, 일본에서는 쥐의 암세포에서 분리한 서울바이러스 B1주를 이용한 백신에 대한 보고가 있으나 아직까지 실용화되지 못하고 있다. 한탄바이러스 백신은 한탄바이러스 84-105주를 생후 1주일된 마우스 뇌내에 접종하여 다량의 한탄바이러스 항원을 생산한 후 일본뇌염백신 제조방법에 준한 방법으로 제조하고 있다. 세계보건기구는 유행성출혈열의 백신은 일본뇌염 백신의 제조기준에 준하라고 추천하고 있으며 공지된 한탄바이러스 백신 제조방법은 다음과 같다(참고. 특허공고번호 90-7952호).

즉, 한탄바이러스에 감염된 마우스의 뇌조직을 무균적으로 적출하여 20% 용액을 pH 7.6의 PBS 희석액으로 만든 다음, 4℃에서 3,000rpm 30분간 원침하고, 그 상측액을 프로타민 술페이트 0.2mg/ml로 처리한다. 4℃에서 6,000rpm 30분간 원침한 상층액을 40% 에틸 알코올을 처리하고, 4℃에서 6,000rpm 30분간 원침한 후, 침전물을 옴니믹서에서 분쇄하여 용액으로 만든 다음, 다시 프로타민 술페이트 0.5mg/ml을 가한 후, 원침하여 뇌세포 조직성분을 제거한 다음 순수한 한탄바이러스 항원을 얻는다. 이 중간 바이러스 원료중의 단백질 양을 마이크로킬달(Micro-Kehdal)법으로 측정하는데 만일 단백질 양이 50μg/ml 이상일 때는 다시 프로타민 술페이트 용액으로 처리한다. 즉, 바이러스 용액에 0.05μg/ml의 프로타민 술페이트 용액을 가하고 잘 혼합한 후 즉시, 4℃에서 6000rpm 30분 원침하여 상층액을 딴다. 대량 제조된 바이러스 항원은 ELISA 방법으로 항원의 양을 측정한 다음, 0.05% 포르말린으로 4℃에서 2주간 바이러스를 불활화한다. 불활화된 바이러스 항원은 여과기를 통과시킨 후, 멸균성과 안정성 검사를 하고 알룸겔 500μg/ml로 10일간 4℃에서 바이러스 항원을 처리한 후, 백신으로 사용한다. 진단시약용 항원은 포르말린으로 불활성화된 한탄바이러스 항원을 투석한 다음 여과하여 각종 항원항체검사용 항원으로 사용한다.

1) 백신용 바이러스 항원과 혼합백신의 제조

한탄바이러스, 서울바이러스 및 벨그라드바이러스는 생후 1일된 마우스 뇌조직에서 다량의 바이러스 항원을 생산할 수 있으나, 푸우말라바이러스는 생후 1일된 햄스타의 뇌조직에서만 다량의 바이러스 항원을 배양할 수 있다. 호왕바이러스는 젖먹이 마우스 뿐만 아니라 20∼30일된 마우수의 뇌조직에서도 다량의 바이러스 항원을 얻을 수 있다.

본 발명에서는 처음으로 호왕바이러스 항원을 생후 20일된 마우스 뇌조직에서 대량 생산하고 푸우말라바이러스는 생후 1일된 햄스타의 뇌조직에서 대량 배양하는 기술을 이용하여 생후 1일된 마우스의 뇌내에서 배양한 한탄바이러스 및 서울바이러스 항원과 일정한 비율로 혼합하여 유행성출혈열에 대한 효과적인 혼합백신을 만드는 것이다. 또 베로 E6 세포에서 배양한 호왕바이러스, 한탄바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스 및 푸우말라바이러스 항원을 불활화한 후 백신 및 진단용 항원으로 사용하는 것이다.

한탄바이러스와 혈청학적으로 유사하나 분자생물학적으로 다른 호왕바이러스를 처음으로 생후 20-30일 된 마우스 뇌조직에서 대량 생산할 수 있게 되어 단시간내에 경제적으로 대량의 바이러스 항원을 용이하게 생산할 수 있게 되었다. 항원성이 우수한 대량의 푸우말라바이러스 항원을 생후 1일된 햄스타 뇌조직에서 처음으로 배양할 수 있게 되었으면 또 대량의 서울바이러스 항원을 생후 1일된 마우스나 랫트 뇌조직에서 얻을 수 있게 되었다. 이와 같이 얻은 바이러스 항원의 역가를 ELISA 방법으로 측정한 결과 8,000∼16,000unit/0.1ml이라는 고역가의 바이러스 항원을 생산할 수 있게 되어 효과적인 혼합백신 및 진단용 시약을 만들 수 있게 되었다. 상기한 바이러스 항원은 0.04∼0.05% 포르말린으로 불활화한 다음 항원의 역가를 측정한 후, 실험동물에서 항원성을 확인하고 일정한 비율로 혼합하여 혼합백신으로 사용하게 됨으로서 세계 여러 지역에서 발생하는 유행성출혈열을 동시에 예방할 수 있게 하였다. 한탄바이러스, 호왕바이러스, 서울바이러스 및 푸우말라바이러스 항원의 정제 및 불활화 공정은 한탄바이러스 백신공정과 유사하나, 대량의 바이러스 항원을 얻는 과정에서 세포파괴용 소니케이터(Ultrasonic W-370)를 사용하였으며 또 순수한 바이러스 항원을 얻는 과정에서 초고속원심침전기를 이용하였다. 백신 및 진단제 제조공정을 요약하면 다음과 같다.

한탄바이러스와 벨그라바이러스는 생후 1일된 마우스의 뇌내에, 호왕바이러스는 생후 20일된 마우스 뇌내에, 서울바이러스는 생후 1일된 마우스와 랫트 뇌내에, 푸우말라바이러스는 생후 1일된 햄스타 뇌내에 접종하며 통상 바이러스 접종 약 7∼14일 후 접종한 동물의 과반수가 마비되거나 뇌염의 증상을 나타낼 때 동물을 마취하여 뇌조직을 무균적으로 적출하여 pH 7.6의 인산완충희석액으로 10-20% 용액을 만든 다음 소니게이터로 10분간 뇌세포를 완전히 분쇄한 후 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침한다. 상층액을 0.1-0.3μg/ml 프로타민 술페이트로 1시간 4℃에서 혼합한 후 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침한다. 상층액을 냉온 40% 에탄놀을 가하고 4℃에서 24시간 잘 혼합한 후 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침하여 얻은 침전물을 옴니믹서로 분쇄한 후 용액으로 만든 다음 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침후 상층액을 다시 0.02 - 0.05μg/ml 프로타민 술페이트로 1시간 4℃에서혼합한 후 9,000rpm 30분간 원침한다. 상층액을 4℃에서 20,000-40,000rpm 10-12시간 초고속원침하여 순수한 바이러스 밴드를 얻는 다음 항원의 역가를 측정한 후 바이러스 용액을 만들고 0.04-0.05% 포르말린으로 4℃에서 2주일간 불활화한다. 불활성화된 바이러스 용액은 투석한 후 0.4μ 여과기를 통과시키고 멸균성과 안정성을 검사한다. 이와 같이 불활화한 바이러스 항원의 용액은 백신과 유행성출혈열 진단제로 사용한다. 백신에는 ELISA 법으로 바이러스 항원이 1,000unit/0.1ml이 되도록 희석하여 알룸겔 500μg/ml을 가하여 4℃에서 10일간 흡착한 후 백신으로 사용한다. 혼합백신에는 한탄 또는 호왕바이러스 항원이 3,000unit/0.3ml, 서울바이러스 항원이 3,000unit/0.3ml, 그리고 푸우말라바이러스 항원이 3,000unit/0.3ml 합계 15,000unit의 바이러스 항원이 0.9-1.0ml의 용액중에 함유되도록 한다. 필요에 따라 상기한 바이러스 항원외에 벨그라드바이러스 항원도 같은 양을 배합할 수 있다. 즉 각종 바이러스 항원을 2가지 또는 3가지 또는 4가지 종류를 필요에 따라 배합할 수 있는데 예를들어 상세히 설명하면 한탄바이러스 또는 호왕바이러스 항원 5,000unit/0.5ml에 푸우말라바이러스 항원 5,000unit/0.5ml을 가하여 2가지 바이러스 혼합백신으로 사용할 수 있으며, 또 서울바이러스 5,000unit/0.5ml에 푸우말라바이러스 항원 5,000unit/0.5ml을 배합한 혼합백신도 만들 수 있다.

2) 진단용 항원

유행성출혈열 혈청진단용 바이러스 항원은 상기한 바와 같이 화학적으로 순수한 바이러스 용액을 포르말린으로 불활화한 각종 바이러스의 항원을 사용한다. 필요에 따라 바이러스 항원을 일정한 비율로 적절하게 혼합하여 혼합바이러스 항원으로 사용할 수 있으며 보통 ELISA 검사용 항원으로는 4-8unit/0.1ml, 혈구응집저지항체검사용 항원으로는 50-100unit/0.1ml, 그리고 고농도입자응집반응용 항원으로는 10-100unit/0.1ml의 항원을 고농도 입자에 흡착시킨 후 사용한다.

이하 실시예로서 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예에 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

1) 바이러스의 취득

가) 한탄바이러스

본 발명자가 발견한 i) 등줄쥐에서 분리한 한탄바이러스 76-118(ATCC VR-938)과 ii) 유행성출혈열 환자 혈액에서 분리한 한탄바이러스 84-105주(ATCC VR 2250)

나) 호왕바이러스

본 발명자가 최근 유행성출혈열 환자에서 분리한 새로운 호황바이러스 90-90주(한국종균협회 기탁거부서 1933년 4월 23일).

다) 서울바이러스

본 발명자가 분리한 3주의 서울바이러스 i) 서울시내 집쥐에서 발견한 서울바이러스 80/39주, ii) 인천집쥐에서 분리한 I/RN/82/3 및 iii) 스리랑카 집쥐에서 분리한 서울바이러스 스리랑카주(참고문허 1 및 기탁거부서 참조)

라) 세계보건기구 유행성출혈열 바이러스 연구협력쎈타에 보관된 i) 푸우말라바이러스 소트카모(Sotkamo) 주와 ii) 푸우말라바이러스 K27주(기탁거부서 1993년 4월 23일).

상기 바이러스중, 한탄바이러스 76-118주(ATCC VR-938)와 84-105주(ATCC VR-2250), 서울바이러스 80/39주. 푸우말라바이러스 소트카모주는 미국 아르보바이러스 카다로그(1985)에 등록된 바이러스이나, 호왕바이러스 90/90주, 서울바이러스 I/RN/82/3주, 서울바이러스 스리랑카주 및 푸우말라바이러스 K-27주는 발명자가 관리하고 있는 고대 바이러스병 연구소내 세계보건기구 유행성출혈열 연구협력쎈타에 보관되어 있으며 한국종균협회에 위탁하여 하였으나 병원성균이라는 이유로 거부되었다(1933년 4월 23일).

2) 바이러스의 분자생물학적 특성과 혈청학적 관계

상기한 바이러스들의 분자생물학적 특성은 표 1,2,3과 제 1 도 및 제 2 도에 표시하였고 혈청학적 특성은 신증후출혈열과 한탄바이러스의 지역별 분포, 이호왕의 3인, Arch, Virol Suppl. 1:5-18, 1990에 나타나 있다.

[표 1] 한탄바이러스의 물리화학적 성상

상기 식 중, HTNV는 한탄바이러스를, Howang은 호왕바이러스를, SEOV는 서울바이러스를, SEOV/Sri LanKa는 서울바이러스 스리랑카주를, PUUV/Sotkamo는 푸우말라바이러스 소트카모주를, PUUV/K27은 푸우말라바이러스 K27주를 PHV는 프로스펙트힐바이러스를, Belgrade는 벨그라드바이러스를 나타낸다.

[표 2] 한탄바이러스와 속-특이반응 프라이마의 시퀀스 비교

[표 3] PCR방법으로 제조한 한탄바이러스 cDNA를 제한효소로 절단한 cDNA 단면의 비교.

주: *1)은 소련에서 채취한 서울바이러스와 유사한 균주로서 본 출원인이 보관.

*2)는 타이렌드에서 채취한 서울바이러스와 유사한 균주로서 본 출원인이 보간.

*3)은 프로스펙트힐 균주.

상기 균주는 본 발명의 구성과는 직접적인 관계는 없으나, 본 발명의 균주와 비교하기 위해 기재한 것임.

3) 바이러스의 배양

가) 생후 1일된 마우스 뇌조직에서의 한탄바이러스, 호왕바이러스, 서울바이러스 및 벨그라드바이러스의 증식:

하기 표 4에 나타난 바와 같이 한탄바이러스 2종, 호왕바이러스, 서울바이러스 3종 및 벨그라드바이러스의 10배 희석 뇌조직 사이드 바이러스를 10-20수의 1일된 ICR 마우스의 뇌내에 0.01ml을 접종하고 약 7-10일 후 뇌염으로 사망한 쥐의 LD₅₀을 리드엔머취(Reed Munch)방법으로 계산하여 배양된 바이러스의 양을 계산하였다. 모든 바이러스들이 1일된 마우스 뇌조직에서 잘 증식하여 LD₅₀가 10⁸⁴-10⁹²/ml라는 높은 역가의 바이러스를 쉽게 생산할 수 있었다. 제 3 도는 쥐뇌에서의 한탄바이러스의 증식곡선을 나타내고 있다.

[표 4] 실험동물 뇌조직에서의 한탄바이러스 증식

나) 생후 20일된 마우스에서의 호왕바이러스 증식

현재까지 발견된 한탄바이어스 중 호왕바이러스만이 20일된 ICR 마우스의 뇌에서 증식함을 처음 발견하였다. 10배 희석한 시이드 바이러스의 0.03ml을 쥐의 뇌내에 접종하면 약 7-12일 후 뇌염으로 사망하였는데 LD₅₀은 표 4에 나타난 바와 같이 10^7.8/ml였다.

다) 생후 1일된 시리안 햄스타에서의 푸우말라바이러스 증식:

발명자는 처음으로 푸우말라바이러스를 생후 1일된 햄스타의 뇌에서 대량 생산하는데 성공하였다. 10배 희석한 푸우말라바이러스의 시이드 바이러스 용액 0.02ml을 1일된 햄스타의 뇌내에 접종하면 7-14일 후에 뇌염으로 사망하는데 표 4에 나타난 바와 같이 LD₅₀은 10^7.8-10^8.2/ml였으며 증식곡선은 제 4 도에 표시하였다.

라) 베로 E6 세포배양에서의 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸우말라바이러스, 호왕바이러스 및 벨그라드 바이러서의 증식:

베로 E6 세포에 적응한 상기 바이러스의 10배 희석액에 0.01ml을 베로 세포배양 시험관에 접종 10-14일 후에 감염된 세포를 간접혈광항체법으로 염색하여 바이러스 감염세포의 LD₅₀을 리드 앤 뮌히(Reed Munch)법으로 계산하여 표 5에 나타내었다. 한판, 서울, 호왕 및 벨그라드바이러스들의 증식은 빠르기 때문에 바이러스 접종후 10일이면 감염역가를 측정할 수 있었으나 푸우말라바이러스는 증식속도가 늦어 12일 후에야 감염역가를 계산할 수 있었다. 이들 바이러스의 증식곡선은 제 5 도에 표시하였다.

[표 5] 베로 E6 조직배양세포에서의 한탄바이러스 증식

상기한 바이러스들은 각각 다른 실험동물과 조직배향 세포에 10-20대 이상 계대배양하여 잘 증식되도록 순화 적응한 바이러스 시이들이다.

4) 한탄바이러스, 서울바이러스, 호왕바이러스, 푸우말라바이러스 및 벨그라드바이러스는 항원의 정제

상기한 바이러스를 대량 배양한 중간원료인 바이러스 항원은 단백질 흡착제나 침전제를 사용하는 방법과 초고속원심침전 후 여과, 전기영동, 크로마토그래피 등 정제용 장치를 사용하여 바이러스 항원을 정제하는데 이중에서 각 바이러스 정제에 적절한 방법을 선택하며 효율을 높이기 위하여 이들 방법을 교합하여 사용할 수 있다. 구체적으로 접착제로 단백질을 제거한 후 초고속원심침전법과 여과법을 교합하는 방법인데, 프로타민 술페이트로 뇌단백질을 제거한 후 고원심분리기에 의한 바이러스 항원의 분액채취 또는 항원의 투석과 농축에 의한 정제를 행한다. 밀도컬럼 물질로는 세슘클로라이드, 보롬화칼륨, 설탕용액, 그리세린, 피콜 등을 사용하며 당의 경우는 농도 50-60용적%가 되도록 한다. 초고속원심침전은 4℃에서 20,000-40,000rpm 12-15시간 행하는데 필요에 따라 2회 이상 반복하여 고도로 순수한 바이러스 항원을 얻을 수 있다. 이상과 같이 정제 농축한 바이러스 항원은 백신원액 및 혈청진단용 항원으로 사용한다.

5) 바이러스 항원의 불활화

이상과 같이 동물과 조직배양세포에서 배양한 바이러스들은 정제과정을 거쳐 0.04-0.05% 포름알데하이드로 4℃에서 15일간 불활화된다. 이들 바이러스 항원의 불활화 과정은 제 6 도에 표시하였다. 상기한 모든 바이러스들은 0.05% 포르말린을 4℃에서 처리시 4일 이내에 완전히 불활화됨을 알 수 있었다(표 6). 백신제조에는 절대적인 안정성이 요구됨으로 일본 뇌염 백신 제조기준에 따라 4℃에서 15일간 불활화한 후 사용하였다.

[표 6] 한탄바이러스를 4℃에서 0.05% 포르말린 처리시의 불활화

6) 백신의 제조방법 및 조성

2항에서 상세히 기술한 바와 같이 한탄바이러스, 서울바이러스, 벨그라바이러스는 1일된 마우스와 베로 E6 세포에서 호왕바이러스 20일된 마우스와 베로 E6 세포에서 그리고 푸우말라바이러스는 1일된 햄스타와 베로 E6 세포에서 배양한 후, 프로타민 술페이트, 에탄올, 초고속원침, 여과, 포르말린처리, 아드주반트추가 등을 거쳐 백신을 제조하였다. 제조된 백신은 안정성과 독성검사를 거쳐 사용하게 되는데 혼합백신의 조성은 표 7과 같이 필요에 따라 여러 가지 배합을 할 수 있다. 백신의 접종량은 성인에 5,000단위의 바이러스항원 7세미만 어린이에는 2,500단위의 항원을 2회-3회 피하에 접종한다.

[표 7] 유행성출혈열 혼합백신의 조성

7) 백신의 안정성 실험

본 발명의 백신 0.01-0.02ml을 1일된 마우스나 1일된 햄스타의 뇌에 직접 접종한 후 21일간 건강상태를 관찰한다. 아무이상이 없어도 쥐를 마취후 해부하여 뇌를 적출한 후 간접형광항체법으로 뇌조직중에 있는 바이러스 항원을 검사하며, 또 뇌의 10% 용액을 만든 후 베로 세포에 7-14일 간격으로 3대계대 후 상층액 중의 바이러스 항원의 유무를 세포를 검사하여 결정한다. 최종결정은 백신을 계대배양한 재료를 접종한 동물의 혈액을 채취 항체형성유무로 판정을 내린다.

8) 백신의 항우너성과 항체생산

포르말린 용액으로 불활화한 바이러스 백신을 모르못트에 접종한 후 항체반응을 조사하기 위한 대조실험으로 불활화하지 않은 생균 시이드 바이러스 용액 0.2ml을 모르못트 2수의 근육에 접종한 후 2개월간 각 바이러스에 대한 형광항체반응을 조사하여 제 6 도에 표시하였다. 각종 바이러스에 대한 항체가는 모르못트 2수의 평균항체가를 표시하였다. 5종의 바이러스를 각각 주시하고 15일 간격으로 항체가를 측정하였는데 바이러스 접종 15일 후 모든 바이러스에 대한 항체가 증명되고 접종 30일 후에 최고치에 달하고 60일 후 까지도 높은 항체가를 유지하고 있었다. 제 7 도에 포르말린 용액으로 불활화한 각종 바이러스 백신 3,000 ELISA 단위/0.3ml을 3회(0, 15, 30일) 모르못트의 근육에 접종한 후 한탄바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스, 호왕바이러스 및 푸우말라바이러스에 대한 항체를 각각 측정한 것이다. 항체가는 2수의 모르못트의 항체가를 평균한 것이다. 1차 접종 15일 후에 512∼2,048의 항체가를 나타내었고, 2차 접종 15일 후에 1,024∼16,384이라는 최고치에 달한 후 3차 접종후에는 그 이상 항체가 상승하지 않았다. 백신을 2회 접종하면 생균 바이러스를 접종하였을 보다 높은 항체가를 얻을 수 있다. 그러나 중화상태를 검사한 결과, 백신 2회 접종후 항체가는 10-40이었고, 3회 접종후 항체가가 40∼120에 달하였다. 이상의 결과는 2회 백신접종이 면역유지에 유리함을 나타낸 것이다. 동량의 항원을 혼합한 혼합백신(한탄바이러스 백신 3,000단위, 서울바이러스 백신 3,000단위, 푸우말라바이러스 백신 3,000단위) 0.9ml을 모르못트의 근육에 15일 간격으로 3회 주사한 후의 항체반응 곡선을 제 8 도에 표시하였다. 각 백신을 단독으로 주사하였을 때나, 혼합하여 혼합백신으로 동시에 주사하였을 때나, 항체가에는 변동이 없었다. 이 결과는 한탄바이러스에 속하는 유사한 바이러스의 불활화백신을 혼합하여 사용함으로서 각 바이러스에 대한 면역효과를 동시에 얻을 수 있다는 사실을 증명하였다. 3회 주사후 각 바이러스에 대한 중화항체가도 80-160이었다. 포르말린 불활화한 호왕바이러스 백신 3,000단위/0.3ml과 푸우말라바이러스 백신 3,000단위/0.3ml을 혼합하여 모르못트에 주사한 후 항체반응을 조사하여 제 9 도에 표시하였는데 제 8 도의 결과와 동일하게 각 바이러스에 대한 높은 항체가 생산됨을 알 수 있었다.

9) 백신 접종동물의 면역성

가) 등줄쥐 직접공격법:

한탄바이러스, 호왕바이러스, 벨그라드바이러스 백신의 면역효과를 등줄쥐에서 보호실험으로 한다. 상기한 항체측정과 동일한 방법으로 각 백신 희석당 10마리의 등줄쥐에 백신 0.5ml을 2주일 간격으로 2회 주사한다. 백신주사후의 항체가는 표 8에 표시하였다. 제2회 주사 10일후에 상기 쥐 10마리를 2군으로 나누어 각군 5마리로 한다. 각군 등줄쥐에 상기한 바이러스 10^5.0LD₅₀을 근육접종하여 공격한다. 공격 14일 후 면역쥐 및 대조쥐의 폐장과 비장을 적출하여 일부조직편은 간접면역형광항체법으로 바이러스 유무를 검사하고 나머지 장기는 10% 유제로 만든 후 3,000rpm 15분간 원침하고 상층액을 베로세포에서 배양한다. 베양후 기술된 방법에 따라 형광항체법으로 바이러스 감염을 측정한다. 백신 주사군에서는 백신 10배 희석까지 공격바이러스의 감염이 검출되지 않았으며 한탄바이러스와 호왕바이러스 백신은 서로의 공격을 방어하였으며 높은 감연방어효과가 확인되었다(표 9).

[표 8] 백신 접종동물의 항체 반응

[표 9] 호왕바이러스 백신접종 등줄쥐의 면역효과

나) 생쥐 직접공격법:

서울바이러스 백신의 면역효과는 생쥐에서 하였으며 상기한 바와 같이 서울바이러스 백신을 2회 주사한 후 같은 방법으로 감염방어효과를 조사하였다. 서울바이러스 백신을 접종한 쥐는 서울바이러스 뿐만 아니라 한탄바이러스 및 호왕바이러스의 공격도 방어함을 알 수 있었다.

다) 햄스타 직접공격법:

푸우말라바이러스 백신의 면역효과는 햄스타에서 하였으며 상기한 바와 같이 백신을 2회 주사후 같은 방법으로 바이러스 감염방어효과를 조사하였다. 예방주사군에서는 백신 10배 희석까지 공격 바이러스의 감염이 검출되지 않았다(표 10).

[표 10] 푸우말라바이러스 백신 접종 햄스타의 면역효과

10) 진단시약의 제조방법 및 조성

상기한 바이러스들의 혈청진단용 항원은 백신용 바이러스 항원은 제조방법과 동일하게 포름알데히드로 불활화한 바이러스 항원의 용액을 0.4μ 여과기를 통과한 후 투석하고 ELISA 법으로 바이러스 항원의 양을 측정하여 사용한다. 본 발명에서 제조한 항원은 보통 6,000-9,000 ELISA 항원이 0.1ml에 함유되어 있다. ELISA 법에서는 4-8unit, 혈구응집제지반응용 항원으로는 50-100unit/0.1ml의 항원을 그리고 고농도 응집반응용 항원은 10-40unit/0.1ml의 항원을 고농도입자에 부착시킨 후 용액 또는 냉동건조후 분말상태로 사용한다. 진단시약용 바이러스 항원의 조성은 상기한 바이러스 백신의 조성과 동일하다(표 11).

[표 11] 포르말린 불활화 백신중의 바이러스 항원 및 단백질 양

본 발명의 작용 및 효과는 다음과 같이 요약될 수 있다.

1) 호왕바이러스는 한탄바이어스와 혈청학적으로 유사하나 병원성이 다르고, 20-30일된 성숙한 마우스의 뇌에서 잘 증식할 뿐만 아니라 Vero 세포에서도 잘 증식된다. 따라서 호왕바이러스는 한탄바이어스 보다 용이하게 대량의 바이러스 항원을 생산할 수 있기 때문에 경제적이다. 푸우말라바이러스는 생후 1일된 햄스타의 뇌조직에서 대량의 바이러스 항원을 생산할 수 있게 되었다. 또 서울바이러스 항원을 생후 1일된 마우스와 랫트의 뇌조직에서 대량 생산하여 서울바이러스에 대한 백신도 제조할 수 있게 되었다. 세계 여러 지역에서는 그 지역에 분포되어 있는 유행성출혈열의 병원체가 다르기 때문에 이에 해당하는 바이러스 백신이 요구되는 것이다. 따라서 호왕바이러스, 한탄바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스 및 푸우말라바이러스 항원이 적당히 혼합된 백신을 개발함으로써 유행성출혈열에 대한 효과적이고 종합적인 예방백신을 제조할 수 있다.

2) 2-4가지 종류의 바이러스 항원을 적당히 배합한 혼합백신 개발로 각종 바이러스 항원으로는 만든 백신을 여러번 맞지 않아도 되게 되었다.

3) 쥐와 햄스타에서 대량 생산한 한탄바이러스, 호왕바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스 및 푸우말라바이러스 항원으로 폭넓은 스펙트럼을 가진 유행성출혈열 진단용 항원을 제조할 수 있게 되었다. 필요에 따라 항원을 일정한 비율로 혼합하여 일정지역에 필요한 효과적인 혈청진단용 항원을 제조할 수 있게 되었다.

4) Vero 세포에서 한탄바이러스, 호왕바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스 및 푸우말라바이러스 항원을 대량 생산하여 불활화한 다음 이들 바이러스 항원을 제조하게 되었다. 이 방법은 필요에 따라 수시로 소량 생산할 수 있기 때문에 편리하다.

5) 백신제조 작업이 용이하고 고가의 설비나 기계 등을 요하지 않기 때문에 능률적이고 경제적이며 또 품질관리가 용이하기 때문에 안전한 제품을 제공할 수 있다.

6) 포름알데히드에 의한 바이러스의 불활화는 다른 방법에 비하여 확실성이 높기 때문에 안정성이 높은 백신제품을 제공할 수 있으며 특히 대량생산에 적합함으로 능률적이고 경제적이다.

Claims (11)

1. 설치류 뇌세포에 순화하여 잘 증식되도록 적응한 유행성출혈열 바이러스를 설치류의 뇌내에 접종하여 뇌염증세를 나타낸 동물의 뇌를 채취하여 믹서와 소니케이터를 이용하여 바이러스를 추출한 후 바이러스를 불활성화하는 것을 특징으로 하는 유행성출혈열 바이러스 항원의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 설치류가 랫트, 마우스 또는 햄스타인 것이 특징인 방법.
3. 제1항에 있어서, 유행성출혈열 바이러스가 한탄바이러스, 호왕바이러스, 푸우말라바이러스, 벨그라드바이러스, 서울바이러스로부터 선택된 1종 또는 1종 이상인 것이 특징인 방법.
4. 제1항에 있어서, 불활화제로서 포름알데히드를 사용함이 특징인 방법.
5. 제1항에 있어서, 마우스 랫트 또는 헴스타의 뇌조직에서 배양하여 얻는 바이러스를 불활화하여 얻는 후 정제한 바이러스 항원에 면역용 알룸겔을 첨가하는 것을 특징으로 하는 백신.
6. 마우수, 랫트 또는 햄스타의 뇌조직에서 배양하여 얻는 바이러스의 유제를 초고속원심침전하여 상층액 중의 바이러스를 불활화한 바이러스 항원을 항원항체반응용으로 검출할 수 있는 양이 함유되도록 한 진단제.
7. 제6항에 있어서, 바이러스가 한탄바이러스, 호왕바이러스, 푸우말라바이러스, 벨그라드바이러스, 서울바이러스로부터 선택된 1종 또는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 진단제.
8. 한탄바이러스 백신, 호왕바이러스 항원, 푸우말라바이러스 백신 서울바이러스 항원, 벨그라드바이러스, 및 백신으로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상으로 이루어진 유행성출혈열 진단제.
9. 한탄바이러스 항원, 호왕바이러스 항원, 푸우말라바이러스 항원, 벨그라드바이러스, 및 서울바이러스 항원으로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상으로 이루어진 유행성출혈열 혼합백신.
10. Vero 세포에서 배양한 한탄바이러스, 호왕바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스 및 푸우말라바이러스 항원을 정제하여 포르말린으로 불활화한 후 알룸겔을 첨가한 각종 바이러스 백신을 혼합한 것을 특징으로 하는 유행성출혈열 백신의 제조방법.
11. Vero 세포에서 배양한 한탄바이러스, 호왕바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스 및 푸우말라바이러스 항원을 정제하고 포르말린으로 불활화한 항원을 혼합한 항원을 항원항체반응으로 검출할 수 있는 양이 되도록 한 혼합진단제(polyvalent antigen)의 제조방법.