KR20020020260A - 서코바이러스를 생장시키거나 생물학적 물질로부터제거하는 방법 - Google Patents

서코바이러스를 생장시키거나 생물학적 물질로부터제거하는 방법 Download PDF

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Abstract

돼지, 소 또는 사람 세포의 배양물에서 1회 이상의 계대배양한 후에, 감염된 세포 배양물로부터 수득되는 서코바이러스, 특히 돼지 서코바이러스를 생장시키고 중화시키거나 제거하는 방법을 기술한다. 돼지 서코바이러스가 생장하는 경우 세포 배양물에서 세포변성 효과가 나타난다. 서코바이러스는 항체-함유 물질, 예를 들어, 돼지 혈청 또는 사람 면역글로불린으로 처리함으로써 중화시킬 수 있거나 저온살균 방법을 사용하여 제거할 수 있다. 백신, 및 불활성화 또는 무독성 서코바이러스를 함유하는 진단 보조제를 또한 기술한다.

Description

서코바이러스를 생장시키거나 생물학적 물질로부터 제거하는 방법{Method for growing or for removing circoviruses from biological material}
본 발명은 서코바이러스(circoviruses), 특히 돼지 서코바이러스(PCV)를 생장시키고 이에 대한 감염성 또는 항원성 양을 정량하고 이에 대한 항체를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생물학적 물질로부터 약제를 제조하는 방법을 통하여 서코바이러스 및 사람의 서코바이러스 유사 바이러스의 감소를 검출하는 방법에 관한 것이다[참조 문헌:1].
돼지 서코바이러스는 1.76kb의 단일쇄 환상 DNA를 갖는 약 17nm 크기의 등척성 무외피(non-envelope) 바이러스이다. 돼지 서코바이러스에 대한 항체는 간접 면역형광 검출법(IFA) 및 ELISA 방법에 의해 사람, 마우스 및 소의 혈청에서 발견되었다[참조 문헌: 2]. 항체는 도축 돼지중 53% 내지 92%에서 검출된다[참조 문헌: 3]. PCV의 임상적 중요성은 아직 공지되어 있지 않다. 돼지 조직에서 병변을 야기하며 질병 증상과 관련될 수 있는 신규한 유형의 서코바이러스 또는 돼지 서코바이러스가 최근에 검출된 바 있다; 이러한 소위 제2형 서코바이러스(PCV2)는 주로병원성 측면에 있어서 상술한 제1형 서코바이러스(PCV1)와 상이하다[참조 문헌: 3 및 4].
비록 돼지 서코바이러스를 돼지 조직 배양물에서 오염원으로서 검출할 수 있다해도, 현재까지는 실험관내에서 바이러스를 생장시킬 수 없으며, 바이러스 복제 세포에서, 예를 들어, 세포변성 효과(cytopathogenic effect; CPE)를 기초로, 바이러스의 생장 및 정량적 검출을 위한 통상의 시험법이 확립되어 있지 않다[참조 문헌: 2].
그러나, PCV는 림프절, 및 비장, 편도, 간, 심장, 폐, 비강 점막, 신장, 췌장 및 장의 세포에서의 폴리머라제 연쇄반응에 의해 생체내에서 검출된다[참조 문헌: 3]. 돼지 기관은 사람 이식용으로 사용되기 때문에[참조 문헌: 5], 돼지 서코바이러스는 사람에 있어 잠재적인 위험 바이러스로서 간주되어야 한다.
따라서, 본 발명은 돼지 서코바이러스의 감염성을 검사할 수 있도록 이를 실험관내에서 배양하는 방법을 개발하는 것을 목적으로 한다. 추가로, 본 발명은 특이 항원을 사용하여 돼지 서코바이러스를 중화시키며 돼지, 사람 또는 기타 척추 동물의 생물학적 물질로부터 돼지 서코바이러스를 제거함으로써, 이러한 생물학적 물질을 치료학적 목적, 예를 들어, 인슐린, 헤파린, 혈액 및 혈장, 트립신을 포함하는 세포 배양 배지 및 이의 성분의 수득을 위해서 및 재조합 단백질 생산용 세포로서 조건 없이 직접 또는 간접적으로 사용할 수 있는 것을 목적으로 한다. 마지막으로, 본 발명은 또한 세포 배양물에서 PCV를 성공적으로 생장시켜 그 자체로 공지된 방법에 의해 백신을 생산할 수 있도록 하는 것을 목적으로 한다. 이는 (예를 들어, 다양한 세포 배양물에 적응 후 및/또는 감염된 세포를 돌연변이원으로 처리하거나 PCV의 유전적 변형 후 무독성 PCV 균주의 선별을 통하여) 불활성화 PCV 또는 무독성 PCV 균주를 생 백신으로서 사용하는 것과 관련될 수 있다. 또한, 생장시킨 돼지 서코바이러스로부터 수득된 항원 물질을 진단 목적으로도 사용할 수 있다.
이러한 목적은, 감염된 세포 배양물로부터 수득된 서코바이러스를 돼지, 소 또는 사람 세포의 배양물에서 1회 이상 계대배양한 후에 상기 세포의 배양물에서 생장시키는, 서코바이러스, 특히 돼지 서코바이러스(PCV)를 생장시키는 방법에 의해 달성된다.
본 발명의 방법을 위해, PCV로 불현성 감염된 PK15(돼지 신장) 세포 배양물로부터 수득된 돼지 서코바이러스를 또 다른 세포 배양물, 특히 돼지 세포 배양물에서 1회 계대배양한 후에 상기 세포 배양물에서 생장시키는데, 이때 세포변성 효과가 나타난다. 이러한 경우에, 돼지 서코바이러스의 존재는 정착된 특이적인 폴리머라제 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)의 도움으로 확인한다. 이를 위해 하기의 DNA 서열을 갖는 프라이머를 사용한다:
1. PCR 플러스: GAG AGG AAG GTT TGG AAG AGG (946번 내지 966번)
1. PCR 마이너스: CCA CTG GCT CTT CCC ACA ACC (1358번 내지 1338번)
2. PCR 플러스: GGT GAA GTG GTA TTT TGG TGC C (1025번 내지 1046번)
2. PCR 마이너스: CTA TGA CGT GTA CAG CTG TCT TCC (1326번 내지 1303번)
당해 프라이머는 복제 오리진으로부터 선택한다[참조 문헌: 7].
본 발명의 방법을 수행하는 경우, 돼지 서코바이러스는 다양한 포유동물 및 사람 세포의 모든 배양물에서 동일하게 잘 생장될 수 없다는 것이 관찰된다. 생장은 다양한 돼지 기관, 소의 신장, 소의 폐 및 사람의 폐로부터의 세포 배양물에서 성공적이다. 돼지 서코바이러스를 성공적으로 생장시키는데 매우 적합하며 태아 돼지 고환으로부터 개발된 세포 배양물은 제FSHO-DSM ACC2466호로 DSMZ에 기탁되어 있다.
ELISA 방법은 서코바이러스에 대해 혈청속에 존재하는 항원의 정량적 검출에 매우 적합하다. 상기 방법은 서코바이러스를 지지재상에 흡착시킨 후에 조사하려는 혈청과 배양하여 혈청속에 존재하는 1차 항체에 결합시키는 것을 포함한다. 이어서, 1차 항체에 대해 지시된 2차 표지 항체를 1차 항체와 접촉시키고, 결합되지 않은 2차 항체를 세척한 후에 결합된 표지 항체에 의해 방출되는 광 신호(흡광도)을 측정한다. 당해 숙련가에게 공지되어 있는 샌드위치 방법이 서코바이러스 항원에 적합한데, 상기 방법의 경우에는 지지재에 결합되어 있는 서코바이러스에 대한 항체를 조사하려는 혈청속의 항원에 결합시키고, 이어서 서코바이러스 항원에 대해 지시된 (표지) 항체를 서코바이러스 항원에 접촉시키고, 결합되지 않은 항체를 세척한 후에 결합된 표지 항체에 의해 방출되는 광 신호(흡광도)을 측정한다.
돼지 서코바이러스에 대한 중화 항체를 함유하는 혈청은 생물학적 물질중의 서코바이러스를 중화하는데 적합하다. 중화 항체는 돼지 혈청 및 사람 면역글로불린(γ-글로불린)에서 발견되었다. 생물학적 물질중의 서코바이러스를 중화시키는데 특히 적합한 사람 면역글로불린은 일반 공여자보다 2배 내지 3배 이상 높은 특이적 항체 역가를 갖는 고역가 사람 공여자로부터 수득한 면역글로불린이며, 이때 평균 PCV 항체 역가는 1000명 이상의 공여자로부터의 혈청 풀(pool)에 의거하여 측정한다.
생물학적 기원(예를 들어, 사람 혈액/혈장, 세포 배양물, 동물 기관/조직으로부터 유래)의 약제의 바이러스 안정성은 기관(예를 들어, CPMP/BWP/268/95: 바이러스의 불활성화 및 제거를 확인하는 연구의 설계, 기여 및 설명; CPMP/BWP/268/95 개관 3; 혈장 유래된 의약품에 관한 지침)에 의해 요구되는 바와 같이 조사하며, 이러한 소위 바이러스 확인 연구에서, 바이러스를 생물제제의 제조방법의 다양한 제조 단계에서 물질에 의도적으로 첨가하고, 상기 방법의 단계에 의해 바이러스의 제거 및/또는 불활성화를 측정한다. 이러한 조사에 사용되는 바이러스는 생물학적 출발 물질에서 발생할 수 있어야 하거나, 이들 바이러스가 시험관내에서 생장될 수 없는 경우에는 오염 바이러스와 되도록 유사한 물리-화학적 특성을 갖는 모델 바이러스이여야 한다. 사람 서코바이러스 TTV에 대한 모델 바이러스의 예에는 PCV가 있다. 생물학적 물질로부터의 치료학적 조성물의 제조방법(안정화된 수용액 중에서 60℃의 열 처리)의 단계의 조사에서, 돼지 서코바이러스는 불안정하며 수 시간내에 불활성화된다는 것이 드러남으로써 열 처리에 의해 TTV를 불활성화시키는, 생물제제의 제조방법의 능력을 입증할 수 있다. TTV를 제거(예를 들어, 침전, 흡착 또는 크로마토그래피 또는 여과 단계에 의함)하거나 TTV를 불활성화(예를 들어, 핵산내에 삽입되는 카오트로픽 염 또는 물질을 사용하거나 고에너지 선 조사(照射)에 의함)시키는 능력에 대하여 제조 과정의 또 다른 단계를 PCV를 사용하여 유사하게 조사할 수 있다. 약제 제조에서, 예를 들어, 첨가제(예: 재조합 단백질을 제조하기 위한 세포 배양물용 혈청 및 배지의 기타 성분 또는 활성 성분을 정제 및 농축하기 위한 친화성 크로마토그래피용 모노클로날 항체)에 대한 바이러스의 불활성화 및/또는 제거 능력을 추가적으로 입증할 수 있다.
본 발명을 하기 실시예를 통해 상세하게 설명한다.
실시예 1
많은 조직 계대배양 동안 유지되고, 계대배양 5일 후에 PCR에서 PCV에 대하여 양성 신호를 나타낸 PK15 배양물로부터의 배양 상청액은, T25 세포 배양 병에서 새로이 종균배양한 다양한 세포주의 세포 배양물에서 1:100의 비로 아배양한다.
하기 돼지 세포의 영구 배양물을 접종한다:
태아 돼지 신장 = FPK
태아 돼지 갑상선 = FPTh
태아 돼지 고환 = FPTe
태아 돼지 비장 = FPSp
태아 돼지 심장 = FPH
태아 돼지 피부 = FPSk
돼지 신장 = PS
접종 10일 후에, FPTh 및 FPSk 이외의 모든 배양물은 세포변성 효과(CPE)를 나타낸다. 세포 배양물 상청액을 CPE 양성 배양물로부터 수집하고 추가의 실험용으로 사용할 때까지 -80℃에서 저장한다.
CPE-유발제의 두번째 계대배양은 상동성 세포 배양물을 첫번째 계대배양으로부터의 세포 배양물 상청액과 함께 접종시킴으로써 이들 세포 배양물에서 수행한다.
단지 4일 후에, PS 세포에서 명백한 CPE가 나타나며, 또 다른 배양물의 경우에 CPE는 접종한지 6일 후에 최초로 가시화된다. 상술한 프라이머를 사용하는 특이적 PCR을 사용하는 경우에, CPE를 나타내는 PS 세포 배양물에서 PCV를 검출할 수 있는 반면, PK15 세포 배양 상청액의 접종하지 않은 상응하는 대조 세포에서 PCV 신호는 명백하지 않다.
실시예 2
PS 세포 배양물에서 생장시킨 PCV를 저속에서 원심분리하여 수집된 세포 배양 상청액에서 종말점 희석법을 사용하여 정량화한다. 세포 배양 상청액은 10배 희석 단계를 통하여 희석하여 미세역가 플레이트의 PS 세포 배양물로 이전하고 PCV 생장을 세포변성 효과(CPE)로서 평가한다. 당해 시험의 최종 판독은 감염 7일 후에 실시하고, 당해 숙련가에 공지되어 있는 방법을 사용하여 바이러스 역가(log10으로 나타낸 CCID50- 50% 세포 배양물 감염량)를 계산한다[참조문헌: 6]. 세포변성 효과가 세포 배양물에서의 PCV의 생장에 기인한다는 사실을 점검하고 확인하기 위해서는 서코바이러스가 무외피 바이러스이기 때문에 PS 세포 배양물 상청액의 일부를 클로로포름으로 처리하는데, 이러한 방법은 외피 바이러스를 불활성화시키는 방법으로 당해 숙련가에게 공지되어 있다. PS 세포에서의 비처리 바이러스 현탁액 및 클로로포름 처리된 바이러스 현탁액의 비교 역가측정은 역가에 있어 차이가 없음을 나타낸다(표 1). 이러한 결과는 특이적 PCR 결과와 함께 당해 세포 배양물, 특히 돼지 세포에서의 PCV의 생장을 입증한다.
PS 세포에서 생장시킨 PCV의 정량적 측정
바이러스 현탁액 log10CCID50/㎖
PS 세포 배양물 상청액 7.8
클로로포름 처리된 PS 세포배양물 상청액 7.6
실시예 3
실시예 2에서 기술한 바와 같이, PS 세포 배양물의 바이러스 현탁액으로부터 출발하여 T25 세포 배양 병에서 새로이 종균배양한 다양한 세포의 배양물을 감염성 세포 배양물 상청액과 1:100 희석비로 접종한다.
전체적으로, 3회의 적응 계대배양을 수행한다; 즉, 감염 10일 후에, PCV-감염된 배양물 상청액을 동종성 세포 배양물의 새로이 준비된 배양물에 1:100(v/v)으로 첨가한다. 세포변성 효과를 나타내는 배양물을 PCV의 존재를 입증하기 위하여PCR에서 시험한다. 놀랍게도, 이로부터 PCV가 실시예 1에서 나타낸 돼지 세포 배양물에서만이 아니라 특정 소 및 사람 세포에서도 생장하여, 세포변성 효과를 나타낸다는 사실이 명백해진다(표 2).
다양한 포유동물 및 사람 세포의 배양물에서의 PCV 생장의 입증
첫번째 계대배양* 2번째 계대배양* 3번째 계대배양*
CRFK =크란델 고양이 신장 --- --- ---
KFZI=고양이 신장 --- --- ---
MDBK =마딘 다비 소 신장 --- --- ---
BK Cl10=소 신장, 클론 10 --- ? +
BK =소 신장 --- --- ---
FRLu45 =태아 소 폐 --- ? +
FROv =태아 소 난소 --- --- ---
FRMi =태아 소 비장 --- --- ---
FC-01 Ni =태아 사이노몰구스 신장 --- --- ---
FRhK 4 =태아 레수스 신장 --- --- ---
PH-2 =태아 사이노몰구스 신장 --- --- ---
A549 =사람 폐 --- --- ---
Ma23 =사람 폐 --- --- ---
Mabt =사람 폐 ? + +
*CPE의 양상 --- CPE가 나타나지 않음? 확실치 않은 CPE/판단하지 않음+ CPE로 판단함
실시예 4
세포 배양물에서 PCV의 시험관내 생장이 성공한 후에, PCV를 중화시키는 다양한 포유동물로부터의 혈청의 능력을 조사한다. 이러한 조사는, 포유동물 PCV가 생장하고 후속적인 혈청전환(seroconversion)이 이루어지는지 또는 포유동물의 혈청이 PCV와 교차반응하는 항체를 함유하는지를 나타낸다. 그러나, 현재의 실험 설계를 사용하여 상기 두가지 가능성을 확실하게 구별하는 것은 불가능하다.
각각의 동물(개, 고양이, 말, 돼지, 원숭이)로부터의 다양한 혈청 및 일부 동물(소)로부터의 풀링된 혈청 또는 사람 풀링된 혈장으로부터의 면역글로불린 농축물을 중화 시험-항체 희석액 및 일정량의 바이러스(약 100 CCID50)-에서 시험한다. 하기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 돼지 서코바이러스에 대한 중화 항체는 단지 돼지 혈청 및 사람 면역글로불린(예: 베리글로빈(Beriglobin) 7)에서만 검출 가능하다.
다양한 종으로부터의 혈청의 PCV-중화 항체의 검출
종 조사된 혈청의 수 PCV-양성 혈청의 수
베리글로빈*뱃치 24 24
개 10 0
고양이 10 0
말 10 0
소 10 0
돼지 10 10
원숭이 10 0
* 공여된 풀로부터의 정제된 사람 감마-글로불린 농축물0.5보다 큰 NT 지수를 양성으로서 평가한다
실시예 5
PCV-중화 및 비중화 항체는 당해 숙련가에 공지된 또 다른 시험관내 방법,예를 들어, 효소 면역검정법(EIA)을 사용하여 또한 검출할 수 있다. 고체상(예: 폴리스티렌, 나일론 또는 셀룰로스)에 PCV를 흡착시키고, 후속적으로 조사하려는 혈청을 배양하고 혈청속에 존재하는 1차 항체에 대해 지시된 효소 표지된 2차 항체와 추가 배양함으로써 조사하려는 혈청속의 PCV에 대해 지시된 항체를 정량화한다.
PS 세포로부터의 PCV-함유 세포 배양물 상청액을 O.1M의 NaOH속에 1:100으로 예비 희석시키고 피펫을 사용하여 등비적 희석 순서대로 ELISA 미세역가 플레이트로 옮긴다(희석 완충액은 pH 9.6의 0.05M Na2CO3임). 플레이트를 차단하고, 조사하려는 혈청 및 조사하려는 혈청에 대해 지시된 표지 항체와 배양하기 위해 당해 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 발색 강도를 측정한다(표 4). 실시예는, 돼지 서코바이러스에 대한 항체가 단지 돼지 혈청 및 사람 면역글로불린 농축물에서만 검출 가능하다는 것을 나타낸다.
돼지 서코바이러스에 대한 항체를 검출하기 위한 다양한 혈청의 ELISA(흡광도)
바이러스 희석액 사람 면역글로불린 농축물(베리글로빈 P) 돼지 혈청 말 혈청
1:200 >2.000 >2.000 0.386
1:400 1.983 >2.000 0.426
1:800 1.168 1.852 0.189
1:1600 0.726 1.233 0.253
1:3200 0.268 0.706 0.335
1:6400 0.381 0.457 0.129
실시예 6
생물학적 물질로부터 치료학적 조성물 또는 물질을 제조하기 위해 사용하는 것을 목적으로 하는 치료학적 조성물 또는 물질의 제조에서, 잠재적으로 존재하는 바이러스를 불활성화 또는 제거하는 것이 필요하다. 이러한 이유 때문에, 60℃에서 추가적인 일련의 시험(수용액속에서 저온살균)을 통하여 돼지 서코바이러스의 열 안정성을 다음의 다양한 배지에서 시험한다:
(a) 이글 최소 필수 배지(Eagle's minimal essential medium; EME 배지)
(b) 5% 농도의 사람 혈청 알부민 용액(HSA)
(c) 혈액 응고반응(FⅧ) 생성물용 저온 살균 완충액(수크로스 및 글리신을 사용하여 안정화시킨 수용액).
이러한 목적을 위하여, PCV를 실시예 2에서와 같이 제조하고, 상기 기술한 3개의 배지에 1:11(v/v)로 첨가(스파이킹)하고 60℃의 수조에서 가열한다. 언급한 시간 후에, 잔류 바이러스의 역가측정을 위해서 샘플을 취하고 PS 세포에서 역가를 측정한다.
시험을 완료하고 7일 후에, 현미경하에 세포변성 효과를 관찰함으로써 역가를 최종적으로 판독하며, 결과는 표 5에 나타낸다.
결과에 나타난 바와 같이, PCV는 예를 들어, 승온과 같은 물리-화학적 매개변수에 불안정하다. 안정화제를 인자 Ⅷ 생성물용 저온살균 완충액에 첨가하여 저온살균(안정화된 수용액속에서 60℃로 열 처리) 동안 상기 인자를 안정화시키고, 마찬가지로 PCV도 특정 범위까지 안정화시킨다. 따라서, 제조방법의 능력 또는 서코바이러스 또는 관련 바이러스를 불활성화 및/또는 제거하는 진단 보조제의 능력을 조사하는데 서코바이러스를 사용할 수 있다.
60℃에서 다양한 배지에서 PCV를 배양한 후의 바이러스 역가(log10CCID50/㎖)
저온살균 시간[h] 세포 배양 배지속의PCV 5% 사람 혈청 알부민속의 PCV 인자 Ⅷ 저온살균 완충액속의 PCV
0 5.9 5.8 5.8
1 ≤1.5 1.8 4.9
2 ≤1.5 ≤1.5 3.5
4 ≤1.5 ≤1.5 2.9
6 ≤1.5 ≤1.5 1.8
8 ≤1.5 ≤1.5 ≤1.5
본 발명에 의해, 서코바이러스, 특히 돼지 서코바이러스를 생장시키고 중화시키거나 제거하는 방법이 제공된다.
참조문헌

Claims (7)

  1. 감염된 세포 배양물로부터 수득된 서코바이러스(circovirus)를 돼지, 소 또는 사람 세포의 배양물에서 1회 이상 계대배양한 후에 당해 세포의 배양물에서 발육시킴으로써 세포변성 효과를 발현시킴을 포함하는, 서코바이러스, 특히 돼지 서코바이러스(PCV)의 생장방법.
  2. 생물학적 물질을 돼지 혈청 또는 사람 면역글로불린을 포함하는 항체-함유 물질로 처리하거나 이를 저온살균 방법으로 처리함을 포함하는, 서코바이러스를 중화시키거나 생물학적 물질로부터 제거하는 방법.
  3. 서코바이러스를 지지재에 흡착시킨 후에 조사하려는 혈청과 함께 배양함으로써 혈청속에 존재하는 1차 항체에 부착되도록 하는 단계,
    1차 항체에 대해 지시된 2차 표지 항체가 1차 항체에 부착되도록 하는 단계 및
    결합된 표지 항체에 의해 방출되는 신호를 측정하는 단계를 포함하는, ELISA 방법에 의해 서코바이러스에 대해 지시된 항체를 검출 및 정량화하는 방법.
  4. 지지재에 결합되어 있는 서코바이러스에 대한 항체를 서코바이러스 항원에 대하여 조사하려는 혈청과 함께 배양함으로써 당해 항원이 결합되도록 하는 단계,
    항원이 당해 항원에 대해 지시된 표지 항체와 접촉되도록 하는 단계 및
    결합되지 않은 표지 항체를 세척한 후에, 결합된 표지 항체에 의해 방출되는 신호를 측정하는 단계를 포함하는, ELISA 방법에 의해 서코바이러스 항원을 검출 및 정량화하는 방법.
  5. 불활성화되거나 무독성인 서코바이러스를 포함하는 백신.
  6. 불활성화되거나 무독성인 서코바이러스를 포함하는 진단 보조제.
  7. 생물학적 기원의 약제의 제조방법, 약제 제조용 첨가제, 또는 서코바이러스 또는 관련 바이러스를 불활성화시키고/시키거나 제거하는 진단 보조제의 능력을 조사하기 위한 서코바이러스의 용도.
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