CN109563488B - 夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法 - Google Patents

夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其包括如下工序：将夹杂猪环状病毒的溶液的pH调节为3.0～7.0的工序；和用针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜对调节了pH的溶液进行处理的工序。

Description

夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法
技术领域
本发明涉及夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法。
背景技术
针对在血浆分级制剂、生物药品的制造工序中混入的病毒的对策为病毒的检测、失活和去除。
使病毒失活的方法有加热处理法、化学药品处理法(例如，Solvent/Detergnt：S/D处理)等。已知这些方法是对人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus；HIV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus；HCV)等包膜病毒特别有效的失活处理方法。
然而，人细小病毒B19(Human parvovirus B19；B19)、甲型肝炎病毒(Hepatitis Avirus；HAV)等非包膜病毒针对上述病毒失活方法具有耐药性，无法期待对包膜病毒那样的效果。
病毒去除的方法中有膜过滤法等。膜过滤法根据颗粒的大小进行分离操作，因此可认为其具有无论所分离的对象的化学特性、热性质如何均能仅利用大小去除病毒这样的优点。因此，近些年，通常采用利用病毒去除膜进行的膜过滤法。另外，由于纤维素系病毒去除膜的材料为亲水性的天然材料，因此吸附在膜上的蛋白制剂少，而广泛用于制剂的制造中。
对于作为非包膜病毒的细小病毒而言，例如有B19、小鼠微小病毒(Minute virusof mice；MVM)、猪细小病毒(Porcine parvovirus；PPV)等。
B19是属于细小病毒科(Parvoviridae)的直链单链DNA病毒，其大小约为18～24nm。
作为针对细小病毒等的牢固性高的病毒去除方法，还普及了利用病毒去除膜的膜过滤法。该膜过滤法的基本原理通过设定如下条件而实现：根据所使用的病毒去除膜的孔径，使目标蛋白质通过病毒去除膜，但病毒无法通过。
专利文献1中公开了一种方法，其对于B19的去除，通过将氨基酸溶液调节为pH4～8而使B19聚集，使膜捕捉B19。
另外，专利文献2中公开了一种去除蛋白质溶液中的病毒的方法，其特征在于，通过将蛋白质溶液调节至pH低于6且电导率为7mS/cm以下并加以保持而使B19聚集，接着使该蛋白质溶液透过具有大于单分散状态的病毒直径的膜孔径的亲水性膜。
猪环状病毒(Porcine Circovirus；以下有时称为“PCV”。)是目前已知的最小的病毒，其颗粒直径为16～20.7nm。PCV属于环状病毒科，例如分类为PCV1、PCV2等。PCV是混入生物药品的制造工序的风险较高的病毒之一，2010年报道了混入事例。PCV对于低pH处理、加热处理也具有耐性，根据非专利文献1中的研究，对于在单分散了PCV的溶液中的病毒去除膜的去除率，仅能得到用Planova20N为0.1-0.7log、用Planova15N为1.3-1.8log的低病毒去除性能，无法在大多数生物药品的制造工序中导入的病毒去除膜进行去除。
另一方面，虽然非专利文献1中公开了通过离子交换体处理能够吸附去除PCV，但一直以来不能说更有效地去除PCV的方法的研究是充分的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-339079号公报
专利文献2：日本特开2006-151840号公报
非专利文献
非专利文献1：Yan B，et al.，Porcine Circovirus(PCV)removal by Qsepharose fast flow chromatography.Biotechnol.Prog.2013；29：1464-1471.
发明内容
发明要解决的问题
本发明要解决的课题是提供夹杂猪环状病毒的溶液的新型的处理方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现可以提供一种新型的处理方法，作为夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，用特定的滤膜对调节至特定的pH的夹杂猪环状病毒的溶液进行处理，完成了本发明。
本发明如下所述。
(1)一种夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其包括如下工序：
将夹杂猪环状病毒的溶液的pH调节为3.0～7.0的工序；和
用针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜对调节了pH的溶液进行处理的工序。
(2)根据(1)所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，前述调节了pH的溶液包含0.50M以下的甘氨酸。
(3)根据(2)所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，包含0.010～0.40M的甘氨酸。
(4)根据(2)所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，包含0.20～0.35M的甘氨酸。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，前述夹杂猪环状病毒的溶液包含5.0w/v％以下的蛋白质。
(6)根据(5)所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，前述夹杂猪环状病毒的溶液的蛋白质浓度低于0.10w/v％时，将前述夹杂猪环状病毒的溶液的pH调节为3.0～6.0。
(7)根据(5)所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，前述夹杂猪环状病毒的溶液的蛋白质浓度为0.10～1.5w/v％时，将前述夹杂猪环状病毒的溶液的pH调节为3.8～7.0。
(8)根据(5)～(7)中任一项所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，前述蛋白质为IgG。
(9)根据(1)～(8)中任一项所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，以50～100L/m2对前述调节了pH的溶液进行处理。
(10)根据(1)～(9)中任一项所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，针对猪环状病毒的LRV为2以上。
(11)一种溶液的处理方法，其包括如下工序：
将被处理溶液的pH调节为3.0～7.0的工序；和
用针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜对调节了pH的溶液进行处理的工序。
发明的效果
根据本发明，可以提供夹杂猪环状病毒的溶液的新型的处理方法。
附图说明
图1是示出实施例1中，确认了使用0.30M甘氨酸缓冲液并在pH 3.0～8.0的条件下的PCV去除能力的变化的结果的图。
图2是示出实施例2中，确认了在0.10～2.0M甘氨酸缓冲液(pH 4.0)的条件下的PCV去除能力的变化的结果的图。
图3是示出实施例3中，确认了在0.10％IgG和0.10M甘氨酸条件下的pH对PCV去除产生的影响的结果的图。
图4是示出实施例4中，确认了在0.10％IgG和pH 6.0条件下的甘氨酸浓度对PCV去除产生的影响的结果的图。
图5是示出实施例5中，确认了在0.30M甘氨酸缓冲液(pH 6.0)条件下的IgG浓度对PCV去除产生的影响的结果的图。
图6是示出实施例6中，确认了在含有1.0％IgG的0.30M甘氨酸(pH 6.0)条件下的通过P-15和P-20过滤后的IgG回收率的结果的图。
具体实施方式
以下对用于实施本发明的方式(以下称为“本实施方式”。)进行说明。本发明不限定于以下的实施方式，可以在其主旨的范围内进行各种变形来实施。
本实施方式的夹杂猪环状病毒(PCV)的溶液的处理方法包括如下工序：
将夹杂猪环状病毒的溶液的pH调节为3.0～7.0的工序；和
用针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜对调节了pH的溶液进行处理的工序。
供于本实施方式的处理方法的试样为夹杂PCV的溶液。
本说明书中“夹杂PCV的溶液”可以是PCV存在于溶液中的溶液，包括可能夹杂PCV的溶液。
作为可能夹杂PCV的溶液，无需实际上夹杂了PCV，可以是在制作溶液的过程中可能夹杂PCV的溶液。作为可能夹杂PCV的溶液，不是妨碍夹杂PCV的溶液。
作为夹杂PCV的溶液，例如可以是包含可能夹杂PCV的蛋白质的溶液，可以是可能夹杂PCV而不包含蛋白质的溶液，可以是夹杂PCV且包含蛋白质的溶液，还可以是夹杂PCV而不包含蛋白质的溶液。
作为夹杂PCV的溶液，例如可列举出：作为人、哺乳动物等的体内液体成分的体液等，作为体液的具体例子，没有特别限定，可列举出：血液(血清和血浆)、唾液、汗、尿、鼻涕、精液、血浆、淋巴液、酶和组织液等。
作为夹杂PCV的溶液，可以是将这些体液等作为原料进行纯化而得到的溶液，还可以是含有将体液等稀释而得到的体液等的溶液。
夹杂PCV的溶液可以是细胞培养后的培养基、细胞培养后的培养上清液等，作为细胞可以是用于基因重组技术的细胞。
作为夹杂PCV的溶液，可以是将这些培养基等作为原料进行纯化而得到的溶液，还可以是含有将培养基等稀释而得到的培养基等的溶液。
作为夹杂PCV的溶液，可以是通过细胞培养而制成的疫苗、抗体药物、基因重组制剂等。另外，还可以是在其制造工序中使用了源自生物体组织的酶那样的制剂等。
本说明书中，夹杂PCV的溶液可以包含蛋白质也可以不包含蛋白质，优选包含5.0w/v％以下的蛋白质，即包含0～5.0w/v％的蛋白质。
本实施方式中将体液、培养基等作为原料进行纯化而得到的溶液中包含蛋白质。
本实施方式中，作为夹杂PCV的溶液中所含的蛋白质，没有特别限定，例如可列举出：抗体、促红细胞生成素、血小板生成素、组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶原、血栓调节蛋白、抗凝血酶III、蛋白C、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血酶原复合物、纤维蛋白原、白蛋白、促性腺激素、促甲状腺激素、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角质细胞生长因子、活化素、成骨因子、G-CSF、M-CSF等干细胞因子(SCF)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素2、白介素6、白介素10、白介素11、可溶性白介素4受体、肿瘤坏死因子α、脱氧核糖核酸酶(Dnasel)、半乳糖苷酶、α葡萄糖苷酶、葡萄糖脑苷脂酶、血红蛋白、转铁蛋白等蛋白质、以及这些蛋白质的部分片段。
本实施方式中，作为夹杂PCV的溶液中所含的蛋白质，还可以是使放射性同位元素、低分子的药剂、高分子的药剂、或者不同的蛋白质或其蛋白质的部分片段等与上述的蛋白质或该蛋白质的部分片段化学或基因工程地结合而成的蛋白质或该蛋白质的部分片段。
作为夹杂PCV的溶液中所含的蛋白质，优选免疫球蛋白等抗体，免疫球蛋白中IgG是适宜的。
夹杂PCV的溶液中含有蛋白质时，作为夹杂PCV的溶液的具体例子，没有特别限定，可列举出在抗体制剂的制造工序中得到的溶液。
抗体的分离纯化工序中，通过适宜地组合原料血浆的离子浓度、醇浓度、反应温度和蛋白浓度，来控制原料血浆中包含的蛋白质的溶解度，使特定的蛋白沉淀。然后，利用高速离心分离器使已沉淀的蛋白质与上清液分离，然后采集所需的沉淀物或上清液。然后，对于该得到的沉淀物或上清液，通过适宜设定与前述条件不同的条件而使其它蛋白质沉淀。通过重复以上的工序而依次从原料血浆中去除杂质，可以得到含高纯度抗体的溶液。在抗体的分离纯化工序中得到的任意溶液均能作为本实施方式中的夹杂PCV的溶液使用。
作为抗体，例如可列举出：人抗体、人嵌合抗体和人互补决定区移植抗体等人源抗体、以及它们的抗体片段等。
抗体由可变区(V区域)和恒定区(C区域)构成，将重链的可变区称为VH、将轻链的可变区称为VL、将重链的恒定区称为CH、将轻链的恒定区称为CL。
人嵌合抗体是指由除人以外的动物的抗体的VH和VL及人抗体的CH和CL构成的抗体。人嵌合移植抗体可以通过如下方式制造：对编码除人以外的动物的抗体的VH和VL的cDNA进行设计、构建，分别插入具有编码人抗体的CH和CL的cDNA的动物细胞用表达载体中来构建人嵌合移植抗体表达载体，导入动物细胞中并使之表达。
作为人嵌合抗体的CH，只要属于人免疫球蛋白(以下记为hIg)则可以是任意的CH，hIgG类的CH是适宜的，进而还可以使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4这样的亚类中的任一种。另外，作为人嵌合抗体的CL，可以是属于hIg中的任一种，可以使用κ类或λ类的CL。
除人以外的动物是指：小鼠、大鼠、仓鼠、兔子等。另外，已知通过IgG的共存而抑制MVM、PPV的聚集。
作为抗体的片段，可列举出：包含Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、双体抗体(diabody)、dsFv和CDR的肽等。
Fab是：利用蛋白水解酶木瓜蛋白酶对IgG型抗体分子进行处理而得到的片段中(被H链的第224位的氨基酸残基切断)、H链的N末端侧约一半和整个L链通过二硫键键合而成的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。Fab可以通过如下方式来制造：通过用蛋白水解酶木瓜蛋白酶对抗体进行处理、或者通过将编码该抗体的Fab的DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该载体导入原核生物或真核生物中。
本实施方式中，将夹杂PCV的溶液的pH调节为3.0～7.0的工序通过测定夹杂PCV的溶液的pH，并将pH调节为3.0～7.0来进行。
夹杂PCV的溶液的蛋白质浓度低于0.10w/v％时，优选将夹杂PCV的溶液的pH调节为pH3.0～6.0。
夹杂PCV的溶液的蛋白质浓度为0.10～1.5w/v％时，优选将夹杂PCV的溶液的pH调节为3.8～7.0、更优选调节为pH5.5～6.5。
pH调节可以使用碱、酸和缓冲液来进行。作为碱，例如可列举出氢氧化钠，作为酸，可以使用无机酸和有机酸中的任一种，例如可列举出盐酸，作为缓冲液，例如可列举出乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和磷酸缓冲液等。
从病毒去除的观点出发，调节pH而得到的溶液优选包含甘氨酸。
调节了pH的溶液中的甘氨酸浓度优选为0.50M以下、即0～0.50M、更优选为0.010～0.40M、进一步优选为0.20～0.35M。
夹杂PCV的溶液的蛋白质浓度为0.10～1.5w/v％时，优选将调节了pH的溶液中的甘氨酸浓度调节为0.010～0.50M、更优选调节为0.010～0.30M。
夹杂PCV的溶液中含有蛋白质时，调节了pH的溶液中的甘氨酸浓度、pH还可通过该蛋白质的浓度进行适宜调节。
对于本实施方式，通过调节pH，从而能够在对目标蛋白质的性质和收率不产生影响的前提下通过过滤有效地去除PCV。另外，通过将甘氨酸浓度调节为适合的范围，从而能够更有效地去除PCV。
虽然不受理论束缚，但可认为其原因在于由于试样中夹杂的PCV聚集，聚集的PCV变得比试样中所含的目标蛋白质的分子还大，从而得以有效地去除。
本实施方式中，用针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜对调节了pH的溶液进行处理的工序通过将调节了pH的溶液通过针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜来进行。
对于本实施方式，通过用针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜进行处理而能够有效地去除PCV。
针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜是指：对于使用的滤膜，在以50L/m2负载了包含噬菌体PP7的溶液时的LRV为4以上的膜。作为包含噬菌体PP7的溶液，可使用1mg/mL的BSA溶液(PBS缓冲液、pH 7.4)中将噬菌体PP7浓度调节为107pfu/mL的溶液。
使用的滤膜的形状没有特别限定，例如可以是平膜，还可以是中空纤维膜。使用平膜时，可以利用一张进行过滤，还可以重叠多张进行过滤。
通过将调节了pH的溶液通过该针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜来进行过滤，从而使调节了pH的溶液利用针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜进行处理。
过滤方法可以通过总过滤来进行，还可以以交叉流过滤方式进行。
在用针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜进行处理之前，还可以用平均孔径大于20nm的孔径的膜预先进行处理。
作为针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜的具体例子，可列举出由纤维素构成的PlanovaTM15N(旭化成医疗(Asahi Kasei Medical)株式会社制)和PlanovaTM20N(旭化成医疗(Asahi Kasei Medical)株式会社制)、由亲水化PVDF构成的PlanovaTMBioEX(旭化成医疗(Asahi Kasei Medical)株式会社制)和Pegasus SV4(Pall公司制)、以及由亲水化PES构成的Virosart CPV(Sartorius公司制)和Viresolve Pro(Millipore公司制)等。
作为针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜，由纤维素构成的病毒去除膜的情况，还可以通过病毒去除膜所具有的空孔的平均孔径来限定优选的膜。病毒去除膜所具有的空孔的平均孔径例如为13nm以上且21nm以下。
空孔的平均孔径可以参考国际公开第2015/156401号中记载的方法，利用以下的计算式算出。
平均孔径(nm)＝2×103×√(V·d·μ/P·A·Pr)
此处，V表示透水量(mL/分)、d表示膜厚(μm)、μ表示水的粘度(cp)、P表示压力差(mmHg)、A表示膜面积(cm2)、Pr表示空孔率(％)。
对于透水量，捆扎10根纤维，以有效长度为16cm的方式制成模块，将得到的模块的一端封闭，对另一端施加200mmHg的压力，在37℃下使水通过。测定此时通过膜后出来的水量作为透水量。
膜面积通过测定干燥状态下的内径而算出。另外，膜厚是指干燥状态下的膜厚。
空孔率利用以下的计算式算出。
空孔率(％)＝(1-ρa/ρp)×100
中空纤维的表观密度ρa利用以下的计算式算出，ρp是指纤维素的密度(g/cm3)。
中空纤维的表观密度(g/cm3)＝Wd/Vw＝4Wd/πl(Do2-Di2)
此处，Wd是指中空纤维的绝干重量(g)、Vw是指中空纤维的表观体积(cm3)，l是指中空纤维的长度(cm)、Do是指中空纤维的外径(cm)、Di是指中空纤维的内径(cm)。
本实施方式中，LRV是指病毒对数下降值(Log Reduction Value)，是用对数表示的病毒的减少程度，还称为对数下降值。
LRV利用以下的计算式求出。
LRV＝Log[(V1×T1))]/[(V2×T2))]
V1：病毒去除处理工序前的试样的容量
T1：病毒去除处理工序前的病毒量(效价)
V2：病毒去除处理工序后的试样的容量
T2：病毒去除处理工序后的病毒量(效价)
噬菌体PP7的病毒量没有特别限定，可以利用噬菌斑测定法(Plaque assaymethod)来测定。
噬菌斑测定法可以依据Journal of Pharmaceutical Science andTechnology2008；Supplement Volume 62No.S-4中记载的方法来实施。
将包含噬菌体PP7的溶液样品梯度稀释，将各样品与绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)混合后，加入软琼脂。将混合溶液注入琼脂平板上，经固化后在37℃下培养一天。第二天用肉眼测量噬菌斑个数，利用下述式计算出原本溶液中所含的噬菌体浓度pfu(噬菌斑形成单位：plaque forming unit)/mL。
(噬菌斑数×稀释倍率)pfu/样品量(mL)pfu/mL
对于本实施方式，作为本实施方式中基于处理方法的PCV去除的指标，可以利用LRV加以确认。
针对PCV的LRV在上述式中可以通过PCV的病毒量测定求出。
PCV的病毒量没有特别限定，可以利用定量PCR(定量聚合酶链反应，Quantitativepolymerase chain reaction：Q-PCR)来测定。
定量PCR法可以依据Yang等人的方法(记载于非专利文献1)来实施。此时，作为引物，使用PCV-1TM Fwd.：AGAAAGGCGGGAATTGAAGATAC(序列号1)、PCV-1TM Rev.：CACACCCCGCCTTCAGAA(序列号2)，作为探针，使用TaqMan探针：6FAM-CGTCTTTCGGCGCCATCTGTAACG-TAMRA(序列号3)。
对于本实施方式，在测定PCV的LRV时，为2以上的情况可以判断为有效地去除了PCV。
本实施方式中，对于调节了供于针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜的pH的溶液，作为病毒去除膜单位面积的过滤液量，以50～100L/m2进行处理是适宜的。
通过以50～100L/m2进行处理，从而能够在病毒去除膜不发生蛋白质等的堵塞的前提下有效地过滤试样。
以过滤面(一次侧的表面)的面积的形式计算病毒去除膜面积。平膜的情况，是由2边的长度算出的面积，中空纤维膜的情况，是中空纤维的内侧(内表面)的面积。
对于过滤液量，在一定的过滤压力条件下的过滤中，可以通过过滤时间来调节。
利用本实施方式的夹杂PCV的溶液的处理方法，通过对包含PCV的溶液进行溶液制备而成规定的pH，而能使小于通常的病毒去除膜的孔径的PCV聚集，并利用病毒去除膜去除。另外，利用本实施方式的夹杂PCV的溶液的处理方法，可以得到能确保对于可能夹杂PCV的溶液(包括未夹杂的情况)的安全性这样的效果。
因此，对于本实施方式，还提供溶液的处理方法，其包括如下工序：将被处理溶液的pH调节为3.0～7.0的工序；和用针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜对调节了pH的溶液进行处理的工序。
本实施方式的夹杂PCV的溶液含有蛋白质时，通过用病毒去除膜进行处理，从而能够同时满足安全性和蛋白质透过性。另外，本实施方式的夹杂PCV的溶液不含有蛋白质时，通过用病毒去除膜进行处理，从而能够去除PCV。
即，通过利用本实施方式的处理方法，使用LRV4以上的膜从包含PCV的溶液中进行过滤，从而能够从溶液中去除PCV，另外，对于可能夹杂PCV的溶液，通过进行过滤而能够确保安全性。此外，通过利用本实施方式的处理方法，无论是否含有蛋白质均能利用该方法去除PCV，另外，若为含有蛋白质的液体，则能够同时满足高的透过性·安全性。
如以下的实施例所示，对于一些方式，根据本实施方式的处理方法，目标蛋白质的回收率为80％以上。即，利用本实施方式的处理方法，可以提供去除了PCV的安全性高的产品。
实施例
为了有助理解本发明，以下示出实施例来对本发明进行具体地说明，但不用说本发明不限定于本实施例。
(实施例1)在甘氨酸缓冲液条件下的最佳pH的研究
使用0.30M甘氨酸缓冲液，并通过LRV确认了在pH 3.0～8.0的条件下的PCV去除能力的变化。
1.材料/使用
·病毒株(PCV)：PCV的病毒源使用猪肾脏来源株化细胞(PK(15)细胞：ATCCNo.CCL-33)的培养液。将PK(15)细胞、1.0x105个细胞/mL接种/培养于含5％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中(37℃、5％CO2)，将培养第4天的培养上清液作为病毒源使用。病毒源的保存在-80℃下进行。病毒源的基因组浓度为10.17Log拷贝(copies)/mL。
·甘氨酸缓冲液：对于1.2L的纯水，加入27.0g的甘氨酸(购入制造商：WAKO)，利用搅拌器进行搅拌使其溶解。甘氨酸完全溶解后，边利用搅拌器进行搅拌边加入0.50M的盐酸或氢氧化钠水溶液而调节为目标pH。
·使用滤膜：使用Asahi Kasei Medical Co.,Ltd.制的Planova15N(以下称为“P-15”)、Planova20N(以下称为“P-20”)、Planova35N(以下称为“P-35”)。膜面积为0.001m2，针对PP7的LRV为：P-15和P-20为＞6.5，P-35为0。
·PCR用试剂：QuantiTect探针PCR试剂盒、获取源QIAGEN
·IgG：献血免疫球蛋白IH(日本血液制剂机构)、浓度10％、生物物种人
2.方法
在调节至pH 3.0～8.0的0.30M甘氨酸缓冲液0.1L中分别加入PCV 1mL(相当于1/100量)。对于这些试样，以相对于使用滤膜、过滤压0.08MPa、处理溶液量0.03L的条件进行终端过滤。
滤膜：实施例使用P-15、P-20，比较例使用P-35。利用Q-PCR法测定过滤前后的PCV基因组量，计算出LRV。
将结果示于图1和表1。
3.PCV去除能力基于由以下的式子计算出的对数下降值(LRV)进行判断。
LRV＝Log[(V1×T1))]/[(V2×T2))]
V1：病毒去除处理工序前的试样的PCV基因组容量
T1：病毒去除处理工序前的PCV基因组量
V2：病毒去除处理工序后的试样的PCV基因组容量
T2：病毒去除处理工序后的PCV基因组量
4.结果
确认了：在上述浓度的、甘氨酸缓冲液存在下用病毒去除膜pH依赖性地去除了PCV。pH 4.0下的P-15和P-20的LRV为≥5.0(表1/图1)。pH 4.0下的P-35的LRV为3.8。需要说明的是，图1所示的箭头的位置表示病毒减少至检测界限值以下。
[表1]
pH 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
P-15 2.8 ≥5.0 4.4 3.3 2.7 1.5
P-20 3.8 ≥5.0 4.3 2.8 2.4 1.0
P-35 1.4 3.8 2.6 1.3 1.0 0.2
(实施例2)最佳甘氨酸浓度的研究
本实施例中，确认了在0.10～2.0M甘氨酸缓冲液(pH 4.0)的条件下的PCV去除能力的变化。将甘氨酸缓冲液的pH固定于4，将甘氨酸浓度设为0.1～2.0M条件，除此以外与实施例1同样地制备了各试样。对于各试样利用与实施例1相同方法进行过滤，计算出LRV。将结果示于图2和表2。
[表2]
甘氨酸浓度(M) 0 0.10 0.30 0.50 2.0
P-15 ≥4.8 ≥4.5 ≥5.0 4.2 4.1
P-20 ≥4.8 ≥4.5 ≥5.0 3.9 2.2
P-35 ≥4.8 4.5 3.8 2.5 1.2
在使用P-15、P-20中任一种的情况下，甘氨酸浓度0.10M、0.30M时的LRV分别为≥4.5、≥5.0。甘氨酸浓度为0.50M时，LRV分别为4.2、3.9。使用P-35时，甘氨酸浓度0.10M、0.30M时的LRV分别为4.5、3.8(表2)。需要说明的是，图2所示的箭头的位置表示病毒减少至检测界限值以下。
在0.10M甘氨酸缓冲液(pH 4.0)的条件下时，在IgG浓度较低的条件下病毒去除能力高。
(实施例3)在0.10％IgG和0.10M甘氨酸条件下的最佳pH的研究
本实施例中，确认了在0.10％IgG和0.10M甘氨酸条件下的pH对PCV去除产生的影响。在0.10M甘氨酸缓冲液(pH 3.5～6.0)中添加0.10％IgG，除此以外与实施例1同样地制备了各试样。使用P-15在与实施例1相同条件下进行各试样的过滤，计算出LRV。将结果示于图3和表3。
[表3]
pH 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0
P-15 1.7 2.6 2.9 3.2 3.7
(实施例4)在0.10％IgG和pH 6.0条件下的最佳甘氨酸浓度的研究
本实施例中，确认了在0.10％IgG和pH 6.0条件下的甘氨酸浓度对PCV去除产生的影响。在0.10～0.50M的甘氨酸缓冲液(pH 6.0)中添加0.10％IgG，除此以外与实施例1同样地制备了各试样。使用P-15和P-20并以与实施例1相同条件进行各试样的过滤，计算出LRV。将结果示于图4和表4。
[表4]
甘氨酸浓度(M) 0.10 0.30 0.50
P-15 3.7 3.7 3.9
P-20 3.4 3.1 3.3
(实施例5)在0.30M甘氨酸和pH 6.0条件下的蛋白质浓度的研究
本实施例中，确认了在0.30M甘氨酸缓冲液(pH 6)条件下的IgG浓度对PCV去除产生的影响。在0.30M甘氨酸缓冲液(pH 6)中添加0.10～5.0％IgG，除此以外与实施例1同样地制备了各试样。在IgG浓度1.0％的条件下，分别使用P-15和P-20各2根，除此以外的IgG浓度使用P-20，在与实施例1相同条件进行各试样的过滤，计算出LRV。将结果示于图5和表5。
[表5]
IgG浓度(％) 0.10 0.50 1.0 1.5 2.0 5.0
P-15 NT NT 2.2/2.3 NT NT NT
P-20 3.1 2.5 2.3/2.3 1.9 1.0 1.0
(实施例6)基于在含有1％IgG的0.30M甘氨酸(pH 6.0)条件下的过滤的蛋白质回收率
本实施例中，确认了在含有1％IgG的0.30M甘氨酸(pH 6.0)条件下通过P-15和P-20过滤后的IgG回收率。过滤后的IgG的回收率利用吸光光度计进行了测定(A280nm)。在对P-15和P-20负载150mL和53mL的试样液量时，过滤后的回收液量为147.6mL和50.7mL。回收率(％)表示将各负载的样品的IgG量设为100％时的过滤后样品的IgG量。P-20为98％、P-15为94％的回收率(图6)。
本申请基于2016年8月9日申请的日本专利申请(特愿2016-156506号)，请将其内容作为参照引入至此。
产业上的可利用性
本发明的方法尤其在制造血浆分级制剂、生物药品时是有用的。
序列表独立文本
序列号1表示引物(PCV-1TM Fwd.)的碱基序列。
序列号2表示引物(PCV-1TM Rev.)的碱基序列。
序列号3表示探针(TaqMan探针)的碱基序列。
Figure IDA0001977131490000011
Figure IDA0001977131490000021

Claims (5)

1.一种夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其包括如下工序：
将夹杂猪环状病毒的溶液的pH调节为3.8～7.0的工序；和
用针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜对调节了pH的溶液进行处理的工序，其中，所述夹杂猪环状病毒的溶液的蛋白质浓度为0.10～1.5w/v％，
所述针对噬菌体PP7的LRV为4以上的滤膜是指：对于使用的滤膜，在以50L/m2负载了包含噬菌体PP7的溶液时的LRV为4以上的膜；所述包含噬菌体PP7的溶液为使用pH 7.4、含1mg/mL的BSA的PBS缓冲液将噬菌体PP7浓度调节为107pfu/mL的溶液，
其中，所述调节了pH的溶液包含0.01～0.50M的甘氨酸，
其中，针对猪环状病毒的LRV为2以上。
2.根据权利要求1所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，包含0.010～0.40M的甘氨酸。
3.根据权利要求1所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，包含0.20～0.35M的甘氨酸。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，所述蛋白质为IgG。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的夹杂猪环状病毒的溶液的处理方法，其中，以50～100L/m2对所述调节了pH的溶液进行处理。
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