CN117642502A - 病毒的回收方法 - Google Patents
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Abstract
一种病毒的回收方法，其包括：使培养液中的细胞的存活率降低的步骤；以及，使用中空纤维膜将包含细胞所产生的病毒的培养液过滤，并回收病毒的步骤，中空纤维膜具有平均孔径在膜厚方向上从一次侧朝向二次侧变小的倾斜结构。
Description
技术领域
本发明涉及过滤方法。
背景技术
细胞培养技术在包含病毒载体的病毒、抗体、生长激素和胰岛素等各种生物药品的制造中是必要技术，其对近年来医疗的进步作出重大贡献。在生物药品之中，尤其是病毒制剂、病毒疫苗备受关注。通过将病毒产生细胞加以培养来高效且稳定地生产病毒制剂、病毒疫苗在工业上是重要的课题之一(例如参照专利文献1～4)。
在制造用于生物药品的病毒时，需要将产生病毒的细胞加以培养，并从细胞培养液中去除产生病毒的细胞来纯化病毒。作为从细胞培养液中去除细胞的现有方法，可列举出凝胶过滤法、离心分离法、吸附分离法、沉淀法和膜过滤法。但是，凝胶过滤法存在纯化对象物质被用于凝胶过滤的溶剂稀释的问题、不适合大量处理等问题，难以进行工业利用。离心分离法仅可应用于溶液粘度小的情况，难以实现大规模的设备导入。沉淀法存在无法独立完全去除细胞的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2018-076291号公报
专利文献2：日本特许6530171号公报
专利文献3：国际公开第2010/035793号
专利文献4：国际公开第2020/023612号
发明内容
发明要解决的问题
利用精滤膜、超滤膜进行的膜过滤法容易去除细胞，且能够连续对大量的溶液加以处理，因此适合于工业利用。但是，以往的膜过滤法存在下述问题：在膜面上形成细胞、细胞的碎片的浓缩层，膜面堵塞，发生过滤压力的上升和过滤速度的经时性减少。尤其在细胞培养液所包含的细胞的存活率低、细胞培养液包含大量死细胞的情况下，存在下述问题：细胞培养液中存在大量细胞碎片，细胞碎片堆积于膜表面、膜内部，妨碍纯化对象物的透过，纯化对象物的回收率降低。
另外，根据本发明人等的见解，细胞的存活率随着培养时间的经过而降低。但是，细胞所产生的物质量随着培养时间的经过而增加。进而，细胞在存活率降低的时刻，产生物质的量有时也可能会增加。另外，根据本发明人等的见解，在产生物质蓄积于细胞内部的情况下，例如，因长时间培养而导致细胞的存活率降低，能够使产生物质释放至细胞外。但根据本发明人等的见解，包含存活率低的细胞的细胞培养液与包含存活率高的细胞的细胞培养液相比，存在过滤的处理量降低、即过滤效率降低的问题。
另外，以往的过滤膜若持续使用，则存在纯化对象物质的透过性降低的问题。若过滤膜中的纯化对象物的透过性降低，则可能纯化对象物的回收率降低、蛋白质的聚集体等杂质的比例增加。纯化对象物的回收率降低可能导致以细胞的产生物质为原料的药品的制造成本高涨和医疗费用高涨。
因而，本发明的目的之一在于，提供回收率高的病毒的回收方法。例如，本发明的目的之一在于，提供病毒透过率良好的包含病毒的培养液的过滤方法。
用于解决问题的方案
本发明的方式所述的病毒的回收方法包括：使培养液中的细胞的存活率降低的步骤；以及，使用中空纤维膜将包含细胞所产生的病毒的培养液过滤，并回收病毒的步骤，中空纤维膜具有平均孔径在膜厚方向上从一次侧朝向二次侧变小的倾斜结构。过滤可以为切向流过滤。
上述病毒的回收方法中，可以在过滤中去除细胞。
上述病毒的回收方法中，可以在过滤中去除细胞的碎片。
上述病毒的回收方法中，中空纤维膜的一次侧的孔径可以为20μm以上且100μm以下。
上述病毒的回收方法中，中空纤维膜所具有的孔的阻止孔径可以为0.05μm以上且20μm以下。
上述病毒的回收方法中，中空纤维膜可以包含合成高分子。
上述病毒的回收方法中，合成高分子可以为聚砜。
上述病毒的回收方法中，中空纤维膜可以具有粗大层和致密层。
上述病毒的回收方法中，在使细胞的存活率降低的步骤中，可以通过化学处理或物理处理而使细胞的存活率降低。
上述病毒的回收方法中，在使细胞的存活率降低的步骤中，可以使细胞接触化学物质。
上述病毒的回收方法中，化学物质可以为表面活性剂、酸性物质或碱性物质。
上述病毒的回收方法中，可以利用表面活性剂使细胞溶解。
上述病毒的回收方法中，表面活性剂可以为非离子性表面活性剂或两性离子表面活性剂。
上述病毒的回收方法中，培养液中的非离子性表面活性剂的浓度可以为0.005％以上、0.01％以上、0.02％以上、0.03％以上、0.04％以上、0.05％以上、0.06％以上、0.07％以上、0.08％以上、0.09％以上或0.1％以上。
上述病毒的回收方法中，培养液中的非离子性表面活性剂的浓度可以为1％以下、0.9％以下、0.8％以下、0.7％以下、0.6％以下、0.5％以下、0.4％以下、0.3％以下、0.2％以下或0.1％以下。
上述病毒的回收方法中，培养液中的两性离子表面活性剂的浓度可以为0.01％以上、0.02％以上、0.04％以上、0.06％以上、0.08％以上、0.1％以上、0.2％以上、0.3％以上、0.4％以上或0.5％以上。
上述病毒的回收方法中，培养液中的两性离子表面活性剂的浓度可以为2.0％以下、1.8％以下、1.6％以下、1.4％以下、1.2％以下、1.0％以下、0.8％以下、0.6％以下或0.5％以下。
上述病毒的回收方法中，在使细胞的存活率降低的步骤中，可以将化学物质转染至细胞。
上述病毒的回收方法中，物理处理可以包括将细胞破碎的步骤。
上述病毒的回收方法中，使细胞的存活率降低后的细胞的存活率可以为60％以下。
上述病毒的回收方法中，使细胞的存活率降低后的细胞的存活率可以为30％以下。
上述病毒的回收方法中，使细胞的存活率降低之前的培养液中的细胞的密度可以为1.0×105cells/mL以上、2.0×105cells/mL以上、4.0×105cells/mL以上、6.0×105cells/mL以上、8.0×105cells/mL以上或1.0×106cells/mL以上。
上述病毒的回收方法中，使细胞的存活率降低之前的培养液中的细胞的密度可以为1.0×108cells/mL以下、8.0×107cells/mL以下、6.0×107cells/mL以下、4.0×107cells/mL以下、2.0×107cells/mL以下、1.0×107cells/mL以下、8.0×106cells/mL以下、6.0×106cells/mL以下、4.0×106cells/mL以下或2.0×106cells/mL以下。
上述病毒的回收方法中，细胞可以为基因重组细胞。
上述病毒的回收方法中，病毒可以为非包膜病毒。
上述病毒的回收方法中，病毒可以为细小病毒。
上述病毒的回收方法中，病毒可以为腺相关病毒。
上述病毒的回收方法中，病毒可以为包膜病毒。
上述病毒的回收方法中，病毒可以为逆转录病毒。
上述病毒的回收方法中，病毒可以为慢病毒。
上述病毒的回收方法中，在进行过滤之前，可以实质上不包括用沉淀剂将细胞和/或细胞的碎片去除的步骤。
发明的效果
根据本发明，可提供回收率高的病毒的回收方法。
附图说明
图1是表示实施例所述的AAV透过率的图。
图2是表示实施例所述的HCP透过率的图。
具体实施方式
以下，针对本发明的方式(以下，在本说明书中有时简写为“实施方式”)，进行具体说明。需要说明的是，以下示出的实施方式例示出用于细化本发明的技术思想的方法等，但不限定于这些例示。
实施方式所述的病毒的回收方法包括：使培养液中的细胞的存活率降低的步骤；以及，使用中空纤维膜将包含细胞所产生的病毒的培养液过滤，并回收病毒的步骤，中空纤维膜具有平均孔径在膜厚方向上从一次侧朝向二次侧变小的倾斜结构。
使细胞的存活率降低的工序只要是通过积极行为而使细胞培养液中的细胞的存活率降低的工序，就没有特别限定，例如是通过化学处理或物理处理而使细胞的存活率降低的工序。例如，细胞的单纯的长时间培养不包括化学处理或物理处理，不符合使细胞的存活率降低的积极行为。另一方面，例如，转染是通过使细胞产生可能具有细胞毒性的物质而使细胞的存活率降低的、积极降低细胞存活率的工序，可例示为通过化学处理而使细胞的存活率降低的工序的一个方式。细胞的破碎处理是能够对细胞膜造成损伤的化学处理或物理处理。使存活率降低的方法可以为物理处理和化学处理中的任一者，优选为容易进行批量放大的化学处理。
实施方式所述的化学处理包括添加化学物质的步骤。化学物质只要是使存活率降低的物质就没有特别限定。作为化学物质，可例示出在转染时向细胞中导入的产生有用物质的核酸等因子、载体和转染试剂中的至少任一者。另外，作为化学物质的其它方式，可例示出表面活性剂、酸性物质或碱性物质。酸性物质可以溶解于溶剂(可例示出水或醇)而形成酸性溶液。另外，碱性物质可以溶解于溶剂(可例示出水或醇)而形成碱性溶液。作为酸性物质，可例示出盐酸、硫酸、硝酸或乙酸等。另外，作为碱性物质，可例示出氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氨。
细胞可以源自包括人在内的动物，也可以源自微生物。作为动物的例子，可列举出哺乳类、爬行类、鸟类、两栖类、鱼类和昆虫。细胞例如为产生有用物质的细胞，但不限定于此。细胞可以为基因重组细胞。细胞例如为HEK293细胞、HEK911细胞、PER.C6细胞、Sf9细胞和CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)细胞，但不限定于它们。
病毒包含病毒样颗粒(VLP)。病毒包含病毒载体。病毒包含溶瘤性病毒。病毒包含病毒疫苗。病毒疫苗包含生物工程疫苗。病毒中存在从细胞向细胞培养液中释放的病毒和细胞在内部蓄积的病毒。
病毒可以为非包膜病毒，也可以为包膜病毒。作为非包膜病毒的例子，可列举出腺病毒、腺相关病毒(AAV)和细小病毒，但不限定于它们。AAV与腺病毒相比电荷弱，存在容易吸附至中空纤维膜的倾向。作为包膜病毒的例子，可列举出逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒、狂犬病病毒、辛德比斯病毒和单纯疱疹病毒，但不限定于它们。
细胞例如可以被转染。通过转染而向细胞中导入会产生病毒的核酸等因子。在转染时，细胞的存活率降低。核酸等因子为化学物质。基于转染的因子导入包括例如基于电穿孔的因子导入、基于脂质转染的因子导入和基于病毒载体的因子导入。
细胞可以利用附着培养法进行培养，也可以利用悬浮培养法(浮游培养法)进行培养。在附着培养法中，细胞附着于培养槽的内表面。在悬浮培养法中，细胞悬浮在细胞培养液中。
在通过悬浮培养来培养细胞的方法中，例如，在转瓶等培养槽中设置搅拌机构而使细胞浮游。作为搅拌机构，可以使用磁力搅拌器或机械驱动的轴状叶轮等。在悬浮培养中，在将新鲜培养基供给至培养槽中的同时，边将包含培养抑制物质等杂质的旧细胞培养液排出至培养槽外边培养细胞的方法被称为连续培养。
培养方法可以为分批培养方法、流加培养方法或连续培养方法。分批培养方法是指不向培养槽内供给新细胞培养液的培养方法。流加培养方法是指向培养槽内供给新细胞培养液的培养方法。连续培养方法是指：边将培养槽内的细胞培养液的量保持为规定值，边向培养槽内供给新细胞培养液且从培养槽排出旧细胞培养液的培养方法。使存活率降低的工序可以在培养后进行，也可以在培养中进行。过滤操作可以在培养后进行，也可以在培养中连续进行。
从细胞中回收病毒时，可以将细胞破碎。通过将细胞破碎，从而细胞内部的病毒扩散至细胞培养液中。在将细胞破碎时，细胞的存活率降低。可以向细胞中添加表面活性剂、酸性物质和碱性物质等化学物质而进行使细胞溶解的化学处理。其中，包膜病毒在细胞外产生，因此，也可以不将细胞溶解。另外，非包膜病毒通常在细胞内产生，但腺相关病毒(AAV)根据AAV8和AAV9等血清分型(血清型)的差异而在细胞外产生。在该情况下，可以不将细胞溶解。
表面活性剂可以为非离子性表面活性剂，也可以为两性离子表面活性剂。也可以将非离子性表面活性剂和两性离子表面活性剂以适当的浓度进行混合。表面活性剂可以存在于适当的溶剂中。非离子性和两性离子表面活性剂通常存在与离子性表面活性剂相比不易使蛋白质改性的倾向。
作为非离子性表面活性剂的例子，可列举出Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween-20、Tween-80、辛基葡糖苷和辛基硫代葡糖苷，但不限定于它们。
作为两性离子表面活性剂的例子，可列举出CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]丙磺酸盐)和CHAPSO(3[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)，但不限定于它们。
将细胞破碎前的细胞培养液中的细胞密度例如为1.0×105cells/mL以上、2.0×105cells/mL以上、4.0×105cells/mL以上、6.0×105cells/mL以上、8.0×105cells/mL以上或1.0×106cells/mL以上，且为1.0×108cells/mL以下、8.0×107cells/mL以下、6.0×107cells/mL以下、4.0×107cells/mL以下、2.0×107cells/mL以下、1.0×107cells/mL以下、8.0×106cells/mL以下、6.0×106cells/mL以下、4.0×106cells/mL以下或2.0×106cells/mL以下。细胞培养液中的细胞密度可利用细胞数自动测量装置(GE Healthcare公司制、CYTORECON)进行测量。
在细胞培养液中的细胞密度为上述的情况下，细胞培养液中的非离子性表面活性剂的浓度例如优选为0.005％以上，从使细胞内的物质释放的观点出发，更优选为0.01％以上、0.02％以上、0.03％以上、0.04％以上、0.05％以上、0.06％以上、0.07％以上、0.08％以上、0.09％以上或0.1％以上。进一步优选为1％以下，从能够去除在下游的纯化工序中使用的表面活性剂的观点出发，更优选为0.9％以下、0.8％以下、0.7％以下、0.6％以下、0.5％以下、0.4％以下、0.3％以下、0.2％以下或0.1％以下。
在细胞培养液中的细胞密度为上述的情况下，细胞培养液中的两性离子表面活性剂的浓度例如优选为0.01％以上，从使细胞内的物质释放的观点出发，更优选为0.02％以上、0.04％以上、0.06％以上、0.08％以上、0.1％以上、0.2％以上、0.3％以上、0.4％以上或0.5％以上。进一步优选为2.0％以下，从去除在下游的纯化工序中使用的表面活性剂的观点出发，更优选为1.8％以下、1.6％以下、1.4％以下、1.2％以下、1.0％以下、0.8％以下、0.6％以下或0.5％以下。
将细胞破碎的方法不限定于化学处理。例如，可以利用酶将细胞破碎。或者，可通过对细胞施加压力的机械处理或物理处理而将细胞破碎。也可以使用高压均化器、磨机等机械将细胞破碎。压力可以为基于超声波、气蚀或渗透压的压力。或者，可通过对细胞施加热的加热处理而将细胞破碎。或者，可利用冻结熔融法对细胞施加热冲击而将细胞破碎。在将细胞破碎后，可通过不向培养槽内供给新细胞培养液的分批培养来保持细胞。
在某一形态中，细胞产生物质(病毒)的制造可以按照细胞培养、转染、细胞培养、细胞的表面活性剂处理、细胞培养液的分批过滤的顺序来进行。另外，在其它形态中，细胞产生物质的制造也可以按照细胞培养、转染、细胞培养、细胞培养液的分批过滤的顺序来进行。进而，在其它形态中，细胞产生物质的制造也可以按照细胞培养、转染、连续培养的顺序来进行。
细胞的存活率是指溶液中的存活细胞数相对于总细胞数的比例。在某一形态中，使细胞的存活率降低的一个工序之前的细胞的存活率例如为60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或99％以上，使细胞的存活率降低的一个工序后且即将过滤之前的细胞的存活率例如为50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下或5％以下。此处，使细胞的存活率降低的1个工序例如为上述转染，但不限定于此。
在某一形态中，使细胞的存活率降低的1个工序前的细胞的存活率例如为30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上或70％以上，使细胞的存活率降低的1个工序后且即将过滤之前的细胞的存活率例如为25％以下、20％以下、15％以下、10％以下或5％以下。此处，使细胞的存活率降低的1个工序例如为将上述细胞破碎的处理，且是转染后的工序，但不限定于此。
在某一形态中，使细胞的存活率降低的1个工序前的细胞的存活率例如为80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或99％以上，使细胞的存活率降低的1个工序后且即将过滤之前的细胞的存活率例如为75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下或5％以下。此处，使细胞的存活率降低的1个工序例如为与连续培养加以组合的上述转染，但不限定于此。
需要说明的是，存在多个使细胞的存活率降低的工序时，上述细胞的存活率是指：最接近使用中空纤维膜并通过过滤将细胞培养液过滤的工序的、使细胞的存活率降低的1个工序前后的细胞的存活率。
细胞的存活率可利用细胞数自动测量装置(Beckman Coulter公司制、Vi-CELLXR)进行测量。
收纳要被过滤的包含细胞的细胞培养液的培养槽可以设置有：用于向中空纤维膜的一次侧表面输送细胞培养液的流出口、以及用于将未透过中空纤维膜内部而通过了中空纤维膜的一次侧表面的细胞培养液返回至该培养槽的流入口。流出口和流入口可以相同也可以不同。
将被供给要被过滤的细胞培养液的面称为中空纤维膜的一次侧。另外，将透过了中空纤维膜的透过液流出的面称为中空纤维膜的二次侧。
在向内周面供给要被过滤的细胞培养液的实施方式中，中空纤维膜的内周面成为一次侧，中空纤维膜的外周面成为二次侧。在向外周面供给要被过滤的细胞培养液的实施方式中，中空纤维膜的外周面成为一次侧，中空纤维膜的内周面成为二次侧。
例如，多个中空纤维膜包含在过滤模块中。过滤模块可以设置有：细胞培养液流入口，其是用于使从培养槽输送的细胞培养液流入的流入口，其与中空纤维膜的一次侧表面连通；以及细胞培养液流出口，其用于将未透过中空纤维膜内部而通过了中空纤维膜的一次侧表面的细胞培养液返回至培养槽。细胞培养液流入口和细胞培养液流出口可以相同也可以不同。另外，过滤模块可以设置有：透过液流出口，其用于使透过中空纤维膜内部且从中空纤维膜的二次侧表面流出的包含病毒的透过液流出。
培养槽和过滤模块利用例如具备流路和泵的送液机构来连接。送液机构可以具备压力计和重量计。作为泵的例子，可列举出隔膜泵、管泵和旋转泵，但不限定于它们。
通过使用中空纤维膜将培养有细胞的细胞培养液进行过滤，从而去除细胞培养液中的细胞，细胞培养液中的病毒会透过中空纤维膜而被纯化。
过滤可以为切向流过滤。切向流过滤(TFF)法是指：在中空纤维膜一次侧表面中，使细胞培养液沿着与中空纤维膜一次侧表面平行的方向流通的过滤法。切向流过滤(TFF)法包括交替切向流过滤(ATF)法。本实施方式中，在简称为切向流过滤(TFF)法的情况下，有时是指：在中空纤维膜的中空部，使细胞培养液沿着一个方向流通的过滤法。交替切向流过滤(ATF)法是指：在中空纤维膜的中空部，以往返的方式使细胞培养液流通的过滤法。
中空纤维膜的多孔结构整体具有倾斜结构。具有倾斜结构的中空纤维膜中，一次侧表面的平均孔径大于二次侧表面的平均孔径，孔径从一次侧表面朝向最小孔径层依次变小。需要说明的是，在一次侧表面与二次侧表面之间，可以存在孔径不发生变化的部分。因此，在具有倾斜结构的中空纤维膜中，在膜厚方向上，孔径的分布不对称。将中空纤维膜的一次侧表面附近的孔径相对较大的层称为粗大层。将中空纤维膜的二次侧表面附近的孔径相对较小的层称为致密层。孔径最小的最小孔径层包括在致密层中。
具有倾斜结构的中空纤维膜中的一次侧表面的平均孔径例如为1μm以上、10μm以上、20μm以上或30μm以上，且为100μm以下、90μm以下或80μm以下。通过使一次侧表面的孔径为1μm以上，从而存在容易得到将去除物保持至膜内部的深层过滤效果的倾向，并且，存在不易因去除物在膜面上的堆积而导致膜孔堵塞的倾向。另外，通过使一次侧表面的孔径为100μm以下，从而存在容易保持中空纤维膜的强度的倾向。
具有倾斜结构的中空纤维膜中的二次侧表面的平均孔径例如为0.1μm以上且20μm以下、0.2μm以上且15μm以下、或者0.3μm以上且10μm以下。
在求出中空纤维膜的表面的平均孔径时，将中空纤维膜冻结干燥，使用电子显微镜(基恩士公司制、VE-9800)，在1个视野内观测10个以上的孔。对观测到的10个孔分别进行圆形拟合处理，计算根据经圆形拟合的10个孔的面积而求出的直径的平均值来作为平均孔径。
具有倾斜结构的中空纤维膜的阻止孔径例如为0.05μm以上、0.1μm以上、0.2μm以上或0.3μm以上。另外，具有倾斜结构的中空纤维膜的阻止孔径例如为20μm以下、10μm以下、5μm以下、3μm以下、1μm以下、0.8μm以下或0.5μm以下。若阻止孔径为0.05μm以上，则存在下述倾向：能够抑制透过阻力，抑制过滤所需的压力，抑制由微生物颗粒的破坏变形导致的膜面堵塞和过滤效率的降低等。另外，若阻止孔径为20μm以下，则存在能够得到充分的分级性的倾向。
使用多孔中空纤维膜将分散有一定孔径的颗粒的颗粒分散液过滤时，阻止孔径例示为该颗粒的透过阻止率为90％时的颗粒的孔径。有时也被称为最小孔径。在确定阻止孔径时，使聚苯乙烯胶乳颗粒(JSR公司制、SIZE STANDARD PARTICLES)以颗粒浓度成为0.01质量％的方式分散于0.5质量％的十二烷基硫酸钠水溶液(和光纯药工业公司制)，制备胶乳颗粒分散液。使用多孔中空纤维膜来进行胶乳颗粒分散液的过滤，测定过滤前后的胶乳颗粒的浓度变化。该测定通过从0.1μm起边以约0.1μm的间隔变更胶乳粒径边进行，制作胶乳颗粒的阻止曲线。由该阻止曲线读取能够阻止90％透过的粒径，将该粒径作为阻止孔径。
具有倾斜结构的中空纤维膜可以在二次侧表面附近包含孔径达到最小的最小孔径层。中空纤维膜中的最小孔径与阻止孔径大致相同。
中空纤维膜的中空部的内径例如为1000μm以上且2000μm以下、1000μm以上且1500μm以下、或者1100μm以上且1400μm以下。若中空部的内径为1000μm以上，则存在中空部的入口不易被细胞堵塞的倾向。若中空部的内径为2000μm以下，则存在如下倾向：构成过滤模块的中空纤维膜的数量变多，每个过滤模块中的有效截面积变大，过滤性能优异。
中空纤维膜的膜厚例如为300μm以上且1000μm以下、350μm以上且800μm以下、或者350μm以上且500μm以下。若膜厚为300μm以上，则存在能够保持膜内部的去除物、容易发挥出深层过滤的效果的倾向。进而，存在容易维持适当的过滤速度的倾向。另外，若膜厚为1000μm以下，则存在如下倾向：构成过滤模块的中空纤维膜的数量变多，每个过滤模块中的有效截面积变大，过滤性能优异。
中空纤维膜的内径(μm)和外径(μm)可通过将中空纤维膜薄薄切成圆管状，并利用光学显微镜(基恩士公司制、VH6100)观察切片来测定。另外，可以使用下述式子，由内径DI和外径DO来计算中空纤维膜的膜厚Th(μm)。
Th＝(DO-DI)/2
病毒的透过率可通过利用定量PCR对过滤工序后的透过液中的病毒浓度和过滤工序前的细胞培养液或细胞溶解液中的病毒浓度进行定量并加以对比来测定。例如，病毒的透过率可以使用下述式来计算。
透过率X＝(透过液中的病毒浓度)/(过滤前的细胞培养液或细胞溶解液中的病毒浓度)×100
病毒浓度可通过测定病毒量来进行。病毒量可利用实时PCR进行测定。在病毒为AAV的情况下，作为测定AAV量的试剂，可以使用AAVpro Titration Kit(Takara Bio公司)。过滤前的细胞培养液、细胞溶解液以300×g离心2分钟后，对上清进行取样。
抗体浓度的HPLC测定利用下述方法来进行。
(1)检测器：紫外吸光光度计(测定波长：280nm)
(2)柱：POROS G 20μm Column、4.6×50mm、0.8mL(Thermo Fisher公司)
(3)柱温度：室温
(4)流动相
流动相A：将磷酸氢二钠(无水)7.098g、氯化钠8.766g溶解于水800mL，添加1mol/L盐酸而将pH调整至7.0后，添加水而制成1000mL。
流动相B：将1mol/L盐酸12mL、氯化钠8.766g溶解于水，制成1000mL。
(5)流动相的送液
以2mL/min的流量，如下述表那样地变更流动相A和流动相B的比例，并进行送液。
[表1]
| 试样注入后的时间(分钟) | 流动相A(vol％) | 流动相B(vol％) |
| 0～4 | 100 | 0 |
| 4～11 | 0 | 100 |
| 11～16 | 100 | 0 |
细胞培养液、细胞溶解液在以300×g离心2分钟后，对上清进行取样。利用上述方法，按照上述步骤来输送市售的人免疫球蛋白G(日本血液制剂机构制、献血免疫球蛋白IH5％静注2.5g/50mL)的阶段稀释溶液9系列、以及透过液、细胞培养液上清和细胞溶解液上清。使用人免疫球蛋白G的9个峰面积来制作标准曲线后，根据标准曲线和试样的峰面积来计算各溶液中的抗体浓度。
中空纤维膜包含例如合成高分子膜。合成高分子例如为疏水性。作为合成高分子的例子，可列举出聚砜，但不限定于此。一般来说，细胞培养液中包含的细胞、碎片(细胞片)等夹杂物为疏水性。夹杂物通过疏水性相互作用而被中空纤维膜捕捉。由此，能够将包含有用物质的细胞培养液进行纯化。实施方式所述的中空纤维膜可参考例如国际公开第2010/035793号中记载的方法来制造。
本实施方式所述的病毒的回收方法中，在进行过滤之前，可以包括将细胞和细胞的碎片去除的操作，本实施方式所述的病毒的回收方法能够以高效率来回收病毒，因此，在进行过滤之前，可以实质上不包括将细胞和细胞的碎片去除的操作。作为将细胞和细胞的碎片去除的方法的例子，可列举出：利用沉淀剂将细胞和细胞的碎片去除、通过离心分离将细胞和细胞的碎片去除。在去除细胞和细胞的碎片时，可以一同去除杂质蛋白质和DNA。
溶液中的浊度可利用便携浊度计(FUJITECOM公司、便携浊度计210Q)等进行测定。
虽不受理论束缚，但不易发生中空纤维膜的网眼堵塞时，能够抑制利用中空纤维膜进行过滤的处理量降低。例如，细胞培养液的浊度、细胞培养液中存在的颗粒的粒径有可能干预中空纤维膜的网眼堵塞。某一实施方式中，通过在细胞培养液的过滤前降低细胞培养液的浊度，从而能够抑制利用中空纤维膜进行过滤的处理量降低。另一实施方式中，通过在细胞培养液的过滤前减小细胞培养液中存在的颗粒的粒径，从而能够抑制利用中空纤维膜进行过滤的处理量降低。
实施例
以下，利用参考实施例、参考比较例、实验例、实施例和比较例来详细说明本发明，但本发明不限定于以下的实施例、比较例和实验例。参考实施例、参考比较例、实验例、实施例和比较例的试验方法如下所示。
(参考实施例1)
准备阻止孔径为0.4μm、包含聚砜且具有倾斜结构的中空纤维型微过滤器(旭化成医疗公司制、BioOptimal(注册商标)MF-SL)。以膜面积成为3cm2的方式，制作BioOptimalMF-SL的小型模块。另外，与专利文献1(日本特开2018-076291号公报)同样地测定BioOptimal MF-SL的中空纤维膜的一次侧的孔径、内径、外径和膜厚的结果，一次侧表面的平均孔径为30μm以上且80μm以下，内径为1.4mm，外径为2.3mm，膜厚为0.45mm。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有单克隆抗体产生中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约1.7×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约83％。
向细胞培养液中分别添加最终浓度为0.05％的TritonX-100(Merck公司)、最终浓度为0.2％的Tween20(Promega公司、分子生物学级别)和最终浓度为0.5％的CHAPS(富士胶片和光公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
利用蠕动泵以3000/秒的剪切速度(48.5mL/min)向BioOptimal MF-SL的小型模块中输送水，使用中空纤维膜的1次侧出口的阀，将此时的膜间压差调整至20kPa。维持阀的状态，在维持膜间压差的状态下去除管、模块内部的水后，将细胞培养液和将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液分别输送至小型模块中，在经过90分钟以上后，测定抗体的透过率。抗体的浓度使用Protein G柱(Thermo scientific公司制、PORPS G 20μm)并利用HPLC(岛津公司制、Prominence)进行测定。将结果示于表2。在任意情况下，均显示出抗体的透过率高。
[表2]
(参考实施例2)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有抗体产生中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约2.0×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约57％。
向细胞培养液中添加最终浓度为0.05％的TritonX-100(Merck公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
与参考实施例1同样地，向小型模块中输送将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液，在经过100分钟以上后，测定抗体的透过率。将结果示于表3。显示出抗体的透过率高。
[表3]
(参考实施例3)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有抗体产生中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约2.0×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约42％。
向细胞培养液中添加最终浓度为0.05％的TritonX-100(Merck公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
与参考实施例1同样地，向小型模块中输送将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液，测定经过100分钟以上后的抗体的透过率。将结果示于表4。显示出抗体的透过率高。
[表4]
(参考比较例1)
准备阻止孔径为0.2μm、包含聚偏二氟乙烯(PVDF)且具有均匀结构的中空纤维型微过滤器(旭化成公司制、MICROZA(注册商标)UMP)。以膜面积成为3cm2的方式，制作MICROZA UMP的小型模块。在具有均匀结构的中空纤维膜中，孔径在中空纤维膜的整体中实质均匀，在中空纤维膜的膜厚方向上实质均匀。
准备阻止孔径为0.65μm、包含聚偏二氟乙烯(PVDF)且具有均匀结构的中空纤维型微过滤器(旭化成公司制、MICROZA(注册商标)UJP)。以膜面积成为3cm2的方式，制作MICROZA UJP的小型模块。
与参考实施例2、3同样地，制备细胞培养液以及将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
分别使用MICROZA UMP的小型模块和MICROZA UJP的小型模块，除此之外，与参考实施例2、3同样地，向各个小型模块中输送将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液，测定经过100分钟以上后的抗体的透过率。将结果示于表5。
[表5]
(参考实施例4)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有抗体产生中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约2.2×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约84％。
向细胞培养液中添加最终浓度为0.05％的TritonX-100(Merck公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
边以3000/秒的剪切速度(48.5mL/min)向模块中输送生物医药培养液的溶解液60mL，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，在过滤全部量后测定抗体的透过率。将结果示于表6。
(参考比较例2)
与参考比较例1同样地制作MICROZA UMP和MICROZA UJP的小型模块。
与参考实施例4同样地，制备细胞培养液以及将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
分别使用MICROZA UMP的小型模块和MICROZA UJP的小型模块，除此之外，与参考实施例4同样地，向各个小型模块中输送将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液，测定经过250分钟以上后的抗体的透过率。将结果示于表6。
[表6]
| 溶解前存活率 | 溶解方法 | 溶解后存活率 | 使用膜 | 抗体的透过率[％] |
| 84％ | Triton 0.05％ | 4％ | MF-SL | 100 |
| 84％ | Triton 0.05％ | 4％ | UMP | 73 |
| 84％ | Triton 0.05％ | 4％ | UJP | 74 |
(参考实施例5)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有抗体产生中国仓鼠卵(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约2.2×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约26％。进而，准备相同的培养液，其以约2.0×106cells/mL的密度包含细胞，且细胞的存活率为约13％。
向各种细胞培养液中添加最终浓度为0.05％的TritonX-100(Merck公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
边以3000/秒的剪切速度(48.5mL/min)向模块中输送生物医药培养液的溶解液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，在过滤100分钟以上后，测定抗体的透过率。将结果示于表7。
(参考比较例3)
与参考比较例1同样地制作MICROZA UMP和MICROZA UJP的小型模块。
与参考实施例5同样地，制备细胞培养液以及将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
分别使用MICROZA UMP的小型模块和MICROZA UJP的小型模块，除此之外，与参考实施例5同样地，向各个小型模块中输送将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液，测定经过100分钟以上后的抗体的透过率。将结果示于表7。
[表7]
| 浴解前存活率 | 溶解方法 | 溶解后存活率 | 使用膜 | 抗体的透过率[％] |
| 26％ | Triton 0.05％ | 5％ | MF-SL | 102 |
| 26％ | Triton 0.05％ | 5％ | UMP | 65 |
| 26％ | Triton 0.05％ | 5％ | UJP | 80 |
| 1 3％ | Triton 0.05％ | 5％ | MF-SL | 102 |
| 1 3％ | Triton 0.05％ | 5％ | UMP | 81 |
| 13％ | Triton 0.05％ | 5％ | UJP | 81 |
(参考实施例6)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有中国仓鼠卵(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约2.3×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约69％。
向细胞培养液中添加最终浓度为0.05％、0.1％的TritonX-100(Merck公司)、最终浓度为0.5％、1％的CHAPS(富士胶片和光公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低至15％以下的细胞培养液。
边以3000/秒的剪切速度(48.5mL/min)向模块中输送生物医药培养液的溶解液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，测定经过150分钟以上后的抗体的透过率。将结果示于表8。
[表8]
| 溶解前存活率 | 表面活性剂 | 溶解后存活率 | 使用膜 | 透过率[％] |
| 69％ | Triton 0.05％ | 6％ | MF-SL | 100 |
| 69％ | Triton 0.1％ | 8％ | MF-SL | 99 |
| 69％ | CHAPS 0.5％ | 14％ | MF-SL | 98 |
| 69％ | CHAPS 1％ | 3％ | MF-SL | 100 |
(实验例1)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块，并且，与参考比较例1同样地制作MICROZA UMP和MICROZA UJP的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有人胎儿肾细胞(HEK)293细胞的培养基。
向细胞转染用于产生AAV的质粒DNA，将细胞培养数天后，分别添加TritonX-100、CHAPS，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
边以3000/秒的剪切速度向各个模块中输送生物医药培养液的溶解液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，测定过滤全部量或过滤100分钟以上后的AAV的透过率和溶液处理量。
(实验例2)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块，并且，与参考比较例1同样地制作MICROZA UMP和MICROZA UJP的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有人胎儿肾细胞(HEK)293细胞的培养基。
对细胞转染用于产生AAV的质粒DNA，将细胞培养数天，制备使细胞存活率降低的细胞培养液。
边以3000/秒的剪切速度向各个模块中输送生物医药培养液的溶解液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，测定过滤全部量或过滤100分钟以上后的AAV的透过率和溶液处理量。
(实验例3)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块，并且，与参考比较例1同样地制作MICROZA UMP和MICROZA UJP的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有人胎儿肾细胞(HEK)293细胞的培养基。
对细胞转染用于产生AAV的质粒DNA，将细胞培养数天后，添加酸性物质，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
边以3000/秒的剪切速度向各个模块中输送生物医药培养液的溶解液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，测定过滤全部量或过滤100分钟以上后的AAV的透过率和溶液处理量。
(实施例1)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块，并且，与参考比较例1同样地制作MICROZA UMP和MICROZA UJP的小型模块。
准备稳定地表达腺病毒的E1基因区和Bcl-xL基因的HEK293EB细胞。使用HYPERFlask(Corning)，在混合有10％ FBS和1％青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基(Wako)中培养HEK293EB细胞。在培养4天后，舍弃细胞培养液，对HEK293EB细胞转染用于产生AAV5和荧光蛋白质ZsGreen的质粒DNA。在转染时，准备66.5μg的辅助质粒、33.3μg的Rep/Cap质粒和33.3μgGOI质粒，将它们与399μg的聚乙烯亚胺混合并静置15分钟，制备转染试剂。将转染试剂与添加有1％青霉素-链霉素溶液、1％ GlutaMax、0.1％ NaHCO3、0.1％D-Glucose的DMEM培养基一同投入至HYPERFlask中，对细胞转染质粒DNA。在转染后，将HEK293EB细胞培养5天。培养液中的HEK293EB细胞的存活率降低至35％。
关于4.8×105cells/mL的HEK293EB细胞的培养液，在MF-SL时准备300mL，在UMP、UJP时准备150mL，边以3000/秒的剪切速度输送至各个模块中，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，将培养液过滤。测定培养液的过滤处理量、基于过滤的浓缩率和过滤中的AAV的透过率。此处，浓缩率如下述式所示那样，是过滤后的残留溶液量相对于过滤前的溶液量的比率。浓缩率越高，则溶液越被浓缩。
浓缩率＝(过滤前的溶液量)÷(过滤后的残留溶液量)
其结果，如表9所示那样，使用MF-SL时的培养液的处理量最高，使用MF-SL时的浓缩率最高，使用MF-SL时的AAV的透过率最高。另外，在细胞的存活率低至35％的条件下，能够将细胞的浓度高达4.8×105个/mL的溶液以485L/m2的处理量且96％的AAV透过率进行过滤，因此启示出：即便细胞的浓度高达1×107个/mL左右，也能够以高透过率进行过滤。
[表9]
(实施例2)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
与实施例1同样地培养HEK293EB细胞，转染用于产生AAV1和荧光蛋白质ZsGreen的质粒DNA。在转染后，将HEK293EB细胞培养5天。培养液中的HEK293EB细胞的存活率降低至10％。
向一部分HEK293EB细胞的培养液中添加最终浓度为0.1M的EDTA的二钠盐(2NA(EDTA·2Na)、DOJINDO)和最终浓度为0.05(w/v)％的Triton X-100(SIGMA)，耗用1小时将细胞溶解。在溶解后，培养基中的HEK293EB细胞的存活率降低至6％。
边以3000/秒的剪切速度、48.5mL/分钟的流量向模块中输送未添加最终浓度为0.1M的EDTA和最终浓度为0.05(w/v)％的Triton的8.4×105个/mL的HEK293EB细胞的培养液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，将培养液过滤。测定培养液的过滤处理量、基于过滤的浓缩率和过滤中的AAV的透过率。
边以3000/秒的剪切速度、48.5mL/分钟的流量向模块中输送添加有最终浓度为0.1M的EDTA和最终浓度为0.05(w/v)％的Triton的1.3×106个/mL的HEK293EB细胞的培养液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，将培养液过滤。测定培养液的过滤处理量、基于过滤的浓缩率和过滤中的AAV的透过率。需要说明的是，通过添加EDTA，从而粘附于培养器的细胞在培养液中浮游，因此，培养液中的细胞数上升。
其结果，如表10所示那样，在过滤前用表面活性剂将细胞溶解时，AAV的透过率高。另外，添加表面活性剂时，培养液的处理量降低，但添加表面活性剂时，从细胞内释放出AAV，因此培养液中的AAV浓度高，可以认为：添加表面活性剂时，通过过滤而透过的AAV的量多。另外，在细胞的存活率低至10％的条件下，能够将细胞的浓度高达8.4×105个/mL的溶液以374L/m2的处理量且80％的AAV透过率进行过滤，因此启示出：即便细胞的浓度高达1×107个/mL左右，也能够以高透过率进行过滤。进而，在细胞的存活率低至6％的条件下，能够将细胞的浓度高达1.3×106个/mL的溶液以280L/m2的处理量且117％的AAV透过率进行过滤，因此启示出：即便细胞的浓度高达1×107个/mL左右，也能够以高透过率进行过滤。
[表10]
(实施例3)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
与实施例1同样地培养HEK293EB细胞，转染用于产生AAV1和荧光蛋白质ZsGreen的质粒DNA。在转染后，将HEK293EB细胞培养5天。培养液中的HEK293EB细胞的存活率降低至39％。
向一部分HEK293EB细胞的培养液中添加最终浓度为0.1M的EDTA和0.5(w/v)％的CHAPS，耗用1小时将细胞溶解。在基于0.5(w/v)％的CHAPS的溶解后，培养基中的HEK293EB细胞的存活率降低至13％。
向一部分HEK293EB细胞的培养液中添加最终浓度为0.1M的EDTA和最终浓度为0.05(w/v)％的Triton，耗用1小时将细胞溶解。在基于0.05(w/v)％的Triton的溶解后，培养基中的HEK293EB细胞的存活率降低至19％。
边以3000/秒的剪切速度、48.5mL/分钟的流量向模块中输送未添加EDTA和CHAPS或Triton的8.1×105个/mL的HEK293EB细胞的培养液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，将培养液过滤。测定培养液的过滤处理量、基于过滤的浓缩率和过滤中的AAV的透过率。
边以3000/秒的剪切速度、48.5mL/分钟的流量向模块中输送添加有最终浓度为0.1M的EDTA和最终浓度为0.5(w/v)％的CHAPS的1.3×106个/mL的HEK293EB细胞的培养液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，将培养液过滤。测定培养液的过滤处理量、基于过滤的浓缩率和过滤中的AAV的透过率。
边以3000/秒的剪切速度、48.5mL/分钟的流量向模块中输送添加有EDTA和0.05(w/v)％的Triton的1.4×106个/mL的HEK293EB细胞的培养液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，将培养液过滤。测定培养液的过滤处理量、基于过滤的浓缩率和过滤中的AAV的透过率。
将结果示于表11。添加有表面活性剂时，从细胞内释放出AAV，因此添加有表面活性剂时，培养基中的AAV浓度高，可以认为：添加有表面活性剂时，通过过滤而透过的AAV的量多。另外，在细胞的存活率低至19％的条件下，能够将细胞的浓度高达1.4×106个/mL的溶液以217L/m2的处理量且90％的AAV透过率进行过滤，因此启示出：即便细胞的浓度高达1×107个/mL左右，也能够以高透过率进行过滤。
[表11]
(实施例4)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块，并且，与参考比较例1同样地制作MICROZA UMP和MICROZA UJP的小型模块。
与实施例1同样地培养HEK293EB细胞，转染用于产生AAV2和荧光蛋白质ZsGreen的质粒DNA。在转染后，将HEK293EB细胞培养5天。向HEK293EB细胞的培养液中添加0.05(w/v)％的Triton，耗用1小时将细胞溶解。
边以5000/秒的剪切速度向各个模块中输送HEK293EB细胞的培养液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，将培养液过滤。测定培养液的过滤处理量、基于过滤的浓缩率和过滤中的AAV的透过率。
其结果，如表12所示那样，使用MF-SL时的培养液的处理量最高，使用MF-SL时的浓缩率最高，使用MF-SL时的AAV的透过率最高。
[表12]
(实施例5)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
准备第一深层过滤器和第二深层过滤器。第一深层过滤器的孔径为2μm～20μm，包含纤维素、硅藻土等，膜面积为0.002m2。第二深层过滤器的孔径为0.4μm～1.0μm，包含纤维素，膜面积为0.002m2。
准备稳定地表达腺病毒的E1基因区和Bcl-xL基因的HEK293EB细胞，与实施例1同样地培养HEK293EB细胞，转染用于产生AAV1和荧光蛋白质ZsGreen的质粒DNA。在转染后，将HEK293EB细胞培养5天。
边以3000/秒的剪切速度、48.5mL/分钟的流量向MF-SL的小型模块中输送HEK293EB细胞的培养液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，将培养液过滤。
以3.7mL/分钟向第一深层过滤器与第二深层过滤器的组合中流通HEK293EB细胞的培养液，将培养液分批过滤。
将结果示于表13。需要说明的是，初始量为过滤前的培养液的量。处理时间为进行过滤的时间。过滤量为进行过滤的培养液的量。需要说明的是，过滤液的浊度均为1NTU以下。
[表13]
| 过滤对象 | 初始量 | 处理时间 | 过滤量 | 处理量 | |
| MF-SL | 培养液 | 150g | 120min | 130g | 430L/m2 |
| 深层膜 | 培养液 | 440g | 130min | 440g | 200L/m2 |
如图1所示那样，利用MF-SL的小型模块进行过滤时，与利用深层膜进行过滤相比，AAV的透过率高。另外，如图2所示那样，利用MF-SL的小型模块进行过滤时，与利用深层膜进行过滤相比，作为杂质的宿主细胞来源蛋白质(HCP)的透过率低。这启示出：中空纤维膜与深层膜相比，有可能去除杂质而仅使目标物透过。
(实施例6)
与实施例1同样地培养HEK293EB细胞，转染用于产生AAV1和荧光蛋白质ZsGreen的质粒DNA。在转染后，将HEK293EB细胞培养5天。在培养后，培养液中的HEK293EB细胞的存活率降低至35％。
边以100mL/分钟的流量向中空纤维型微过滤器(旭化成医疗公司制、BioOptimal(注册商标)MF-SL0005(50cm2))中输送7.4×105细胞/mL的HEK293EB细胞的培养液2L，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至10-50kPa，将培养液过滤。在过滤全部量后，为了将残留在中空纤维内、管内的AAV回收，利用缓冲液(50mM HEPES、150mM NaCl、1mM MgCl2)200mL进行挤出清洗。测定培养液的过滤处理量、基于过滤的浓缩率和过滤中的AAV的透过率、包括挤出清洗在内的AAV的回收率。回收率用下述式表示。
回收率X＝{(透过液中的病毒浓度)×透过液量}/{(过滤前的细胞培养液中的病毒浓度)×培养液量}×100
其结果，如表14所示那样，回收率达到100％。通过进行挤出清洗，可回收残留在管内、膜内的AAV。这意味着：AAV未吸附至MF-SL，可显示出良好的回收率，工业利用价值高。
[表14]
(实验例4)
与参考实施例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
与实施例1同样地培养HEK293EB细胞，转染用于产生AAV2和荧光蛋白质ZsGreen的质粒DNA。在转染后，将HEK293EB细胞培养5天。
向培养容器中添加最终浓度为0.1M的EDTA二钠盐(2NA(EDTA·2Na)、DOJINDO)，剥离HEK293EB细胞。将所得细胞溶液进行离心，向经粒料化的细胞中添加最终浓度为0.05(w/v)％的Triton X-100(SIGMA)，耗用1小时将细胞溶解。在溶解后，培养基中的HEK293EB细胞的存活率降低至10％以下。
边以3000/秒的剪切速度、48.5mL/分钟的流量向模块中输送添加有最终浓度为0.1M的EDTA和最终浓度为0.05(w/v)％的Triton的2.0×107个/mL的HEK293EB细胞的培养液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的条件下，将培养液过滤。测定培养液的过滤处理量、基于过滤的浓缩率和过滤中的AAV的透过率。
(参考实验例1)
准备阻止孔径为0.4μm、包含聚砜且具有倾斜结构的中空纤维型微过滤器(旭化成医疗公司制、BioOptimal(注册商标)MF-SL)。以膜面积成为3cm2的方式，制作BioOptimalMF-SL的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约1.7×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约83％。
向细胞培养液中分别添加最终浓度为0.05％的TritonX-100(Merck公司)、最终浓度为0.2％的Tween20(Promega公司、分子生物学级别)和最终浓度为0.5％的CHAPS(富士胶片和光公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
利用蠕动泵以3000/秒的剪切速度(48.5mL/min)向BioOptimal MF-SL的小型模块中输送水，使用中空纤维膜的1次侧出口的阀，将此时的膜间压差调整至20kPa。维持阀的状态，在维持膜间压差的状态下去除管、模块内部的水后，将细胞培养液和使细胞存活率降低的细胞培养液分别输送至小型模块中，根据过滤100分钟时的透过流量来计算单位膜面积的溶液处理量。透过液量利用重量计随时测定。另外，关于溶液的浊度，使用便携浊度计(fujitecom公司、便携浊度计210Q)进行测定。将结果示于表15。即便使细胞的存活率降低，处理量也未显著降低。
[表15]
(参考例1)
在BioOptimal MF-SL为0.005m2、剪切速度为3000/秒、未利用阀等控制膜间压差的条件下，对以约11×106cells/mL～18.5×106cells/mL的密度包含细胞的细胞培养液进行分批过滤时，对于细胞的存活率为99.5％的细胞培养液而言，处理量为约300L/m2，与此相对，对于通过使培养时间长期化而使细胞的存活率降低至26％的细胞培养液而言，处理量显著降低至其六分之一左右的60L/m2。像这样，在参考例1中，因长时间培养而导致细胞培养液的存活率低的情况下，过滤性显著降低。将结果示于表16。其中，能够透过约1×107cells/mL～约2×107cells/mL的细胞。在细胞的存活率低至26％的条件下，能够将细胞的浓度高达约1×107cells/mL～约2×107cells/mL的溶液以60L/m2的处理量进行过滤，因此启示出：即便细胞的浓度高达1×107个/mL左右，MF-SL也能够过滤。
[表16]
(参考实验例2)
与参考实验例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
准备阻止孔径为0.65μm、包含聚偏二氟乙烯(PVDF)且具有均匀结构的中空纤维型微过滤器(旭化成公司制、MICROZA(注册商标)UJP)。以膜面积成为3cm2的方式，制作MICROZA UJP的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约2.0×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约57％。
向细胞培养液中添加最终浓度为0.05％的Triton X-100(Merck公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低至10％的细胞培养液。
以3000/sec的剪切速度(MF-SL：48.5mL/min.UJP：23.5mL/min)向各个模块中输送水，使用中空纤维膜的1次侧出口的阀，将此时的膜间压差调整至20kPa。维持阀的状态，在维持膜间压差的状态下，去除管、模块内部的水后，将使细胞存活率降低的细胞培养液分别输送至小型模块中，根据过滤100分钟时的透过流量来测定单位膜面积的溶液处理量。将结果示于表17。
[表17]
(参考实验例3)
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约2.0×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约42％。
向细胞培养液中添加最终浓度为0.05％的Triton X-100(Merck公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低至7％的细胞培养液。
利用与参考实验例2相同的方法，测定单位膜面积的溶液处理量。将结果示于表18。
[表18]
(参考实验例4)
与参考实验例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约1.3×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约26％。
向细胞培养液中添加最终浓度为0.05％的TritonX-100(Merck公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低至5％的细胞培养液。
边以3000/秒的剪切速度(48.5mL/min)向模块中输送生物医药培养液的溶解液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，根据过滤100分钟时的透过流量来计算单位膜面积的溶液处理量。将结果示于表19。
(参考实验例5)
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约1.3×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约13％。与参考实验例4同样地测定单位膜面积的溶液处理量。将结果示于表19。
[表19]
(参考实验例6)
与参考实验例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约2.3×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约69％。
向细胞培养液中添加最终浓度为0.05％、0.1％的TritonX-100(Merck公司)、最终浓度为0.5％、1％的CHAPS(富士胶片和光公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低至15％以下的细胞培养液。
边以3000/秒的剪切速度(48.5mL/min)向模块中输送生物医药培养液的溶解液，边使用1次侧出口的阀将膜间压差调整至20kPa，在维持膜间压差的状态下，根据过滤150分钟时的透过流量来计算单位膜面积的溶液处理量。将结果示于表20。
[表20]
(参考实验例7)
与参考实验例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。另外，与参考实验例2同样地制作MICROZA UJP的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有中国仓鼠卵巣(CHO)细胞的无血清培养基(Irvine Scientific公司、IS CHO-CD培养基)。细胞培养液以约1.3×106cells/mL的密度包含细胞，细胞的存活率为约13％。
向细胞培养液中添加最终浓度为0.05％的Triton X-100(Merck公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低至10％的细胞培养液。
以3000/sec的剪切速度(MF-SL：48.5mL/min.UJP：23.5mL/min)向各个模块中输送使细胞存活率降低的细胞培养液60ml，使用中空纤维膜的1次侧出口的阀，将此时的膜间压差调整至20kPa。维持阀的状态，在维持膜间压差的状态下，向小型模块中分别输送使细胞存活率降低的细胞培养液，根据过滤全部量时或过滤100分钟时的透过流量来测定单位膜面积的溶液处理量。将结果示于表21。
[表21]
(参考实验例8)
与参考实验例1同样地制作BioOptimal MF-SL的小型模块。另外，与参考实验例2同样地制作MICROZA UJP的小型模块。
作为用于制造药品物质的原料的细胞培养液，准备培养有人胎儿肾细胞(HEK)293细胞(293AAV、Cell Biolabs)的培养基。细胞培养液以约2.0×106cells/mL的密度包含细胞。
向细胞培养液中添加最终浓度为0.05％的Triton X-100(Sigma-Aldrich公司)，在37℃下培育1小时，制备将细胞溶解且使细胞存活率降低的细胞培养液。
使用KrosFlo KR2i TFF System(Repligen)，以3000/sec的剪切速度(MF-SL：48.5mL/min.UJP：23.5mL/min)输送至各个模块，使用中空纤维膜的1次侧出口的阀，将膜间压差调整至20kPa。阀的开关程度以将膜间压差保持在20kPa的方式自动调整。向约100mL小型模块中分别输送使细胞存活率降低的细胞培养液，根据过滤全部量时或过滤120分钟时的透过流量来计算单位膜面积的溶液处理量。MF-SL中，处理量为340L/m2，UJP中，处理量为140L/m2。
Claims (16)
1.一种病毒的回收方法，其包括：
使培养液中的细胞的存活率降低的步骤；以及
使用中空纤维膜将包含所述细胞所产生的病毒的所述培养液过滤，并回收所述病毒的步骤，
所述中空纤维膜具有平均孔径在膜厚方向上从一次侧朝向二次侧变小的倾斜结构。
2.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，所述中空纤维膜的所述一次侧的孔径为20μm以上且100μm以下。
3.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，所述中空纤维膜所具有的孔的阻止孔径为0.05μm以上且20μm以下。
4.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，所述中空纤维膜包含合成高分子。
5.根据权利要求4所述的病毒的回收方法，其中，所述合成高分子为聚砜。
6.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，所述中空纤维膜具有粗大层和致密层。
7.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，在使所述细胞的存活率降低的步骤中，通过化学处理或物理处理而使所述细胞的存活率降低。
8.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，在使所述细胞的存活率降低的步骤中，使所述细胞接触化学物质。
9.根据权利要求8所述的病毒的回收方法，其中，所述化学物质为表面活性剂、酸性物质或碱性物质。
10.根据权利要求9所述的病毒的回收方法，其中，利用所述表面活性剂使所述细胞溶解。
11.根据权利要求9所述的病毒的回收方法，其中，所述表面活性剂为非离子性表面活性剂或两性离子表面活性剂。
12.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，在使所述细胞的存活率降低的步骤中，对所述细胞进行转染。
13.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，使所述细胞的存活率降低后的所述细胞的存活率为60％以下。
14.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，使所述细胞的存活率降低后的所述细胞的存活率为30％以下。
15.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，在进行所述过滤之前，实质上不包括用沉淀剂将所述细胞和/或所述细胞的碎片去除的步骤。
16.根据权利要求1所述的病毒的回收方法，其中，所述病毒为腺相关病毒。
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