CN116529382A - 由贴壁细胞在生物反应器中产生病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于由贴壁细胞产生病毒的方法。该方法包括从生物反应器中生长的贴壁宿主细胞中释放病毒，以及通过超滤和/或透析过滤纯化所释放的病毒。该方法可用于制造病毒，包括用于临床应用，与传统的病毒制造方法相比，成本降低。

Description

由贴壁细胞在生物反应器中产生病毒
相关申请
本申请的主题与获许的发明人Joseph Cappello和Richard J.Aguilar于2018年6月27日提交的题为“(由贴壁细胞在生物反应器中产生病毒)”的美国申请系列No.16/020,850有关。在允许的情况下，该申请的主题通过引用全文并入本文。
技术领域
本发明提供了由贴壁细胞产生病毒的方法。
背景技术
病毒用作治疗手段。这些用途包括用作疫苗、基因治疗载体和病毒治疗剂。出于这些目的的病毒的制造包括在合适的宿主细胞中复制病毒，以及之后纯化来自宿主细胞的病毒。用于病毒复制的宿主细胞要么在锚定依赖性贴壁培养条件下生长，要么在悬浮培养条件下培养。悬浮培养的优点在于细胞可以在单个生物反应器中大体积培养。然而，有些病毒在悬浮培养的细胞中不能很好地复制。
病毒在其中复制较好的锚定依赖性细胞通常在滚瓶中进行培养，这需要大量的瓶子才能获得足够的数量。因此，这些工艺难以规模化，并且较为昂贵。在任何一种情况下，无论是使用贴壁培养条件还是悬浮培养条件，都是从一个或多个培养容器(生物反应器或滚瓶)中收获感染了病毒的细胞，并使其裂解以释放病毒。使用许多不同的步骤从宿主细胞衍生的全部组分中纯化病毒，包括均化、超声处理、离心、过滤、亲和纯化、色谱法和密度梯度超速离心中的一个或多个。病毒制造中涉及的培养条件和纯化步骤增加了制造工艺的复杂性和成本，并且可能导致低产量。因此，需要更简单且可规模化的病毒制造方法。
发明内容
本发明提供了用于以高产率制造病毒的简化的可规模化方法。这些方法使用病毒感染的锚定依赖性细胞。根据这些方法，病毒从宿主细胞中释放出来，而宿主细胞组分基本上保持附着在培养表面上。宿主细胞衍生的组分与细胞残留物保持在一起，而病毒被释放到细胞培养基中，通过简化的、具有成本效益的超滤或透析过滤一步工艺或超滤和透析过滤两步工艺对病毒进行纯化。纯化工艺产率高，并且可以在一天或更短的时间内进行。该工艺可以用在适合培养锚定依赖性细胞的生物反应器中生长的细胞进行，从而将简化的纯化方法与生物反应器放大的优点相结合。可以感染并在可以以贴壁形式生长的细胞中生长的任何病毒，特别是包膜病毒，都可以通过这些方法制造。
在这些方法/工艺中包括从在生物反应器中培养的贴壁细胞中产生病毒的方法/工艺。这些方法包括在生物反应器中从贴壁宿主细胞中释放病毒，并通过超滤和/或透析过滤纯化所释放的病毒。本文描述了此类方法的各种实例和方面。
本发明提供了用于产生病毒的方法(工艺)。该方法包括以下步骤：a)在生物反应器中培养包含病毒的宿主细胞，其中该生物反应器含有用于生长贴壁细胞或贴壁细胞捕获在其中的基质，其中该基质是生物相容的；细胞被捕获在基质中和/或粘附在基质上；并且基质的密度使得细胞在裂解和处理以释放病毒的条件下保持粘附，并且细胞培养基在基质中的流动足以使细胞生长；b)处理细胞，以使其裂解，并将病毒释放到生物反应器中的培养基中；然后c)在无需进一步处理的情况下，仅以一个或仅以两个步骤纯化从细胞培养基中释放的病毒。该一个步骤是超滤或透析过滤；而该两个步骤是超滤和透析过滤。不采用其它纯化步骤。因此，使细胞裂解并从细胞中释放病毒后进行的纯化仅通过超滤和/或透析过滤来实现。纯化仅以一个步骤或两个步骤实现。纯化可以在1天或更短的时间内完成。
生物反应器含有贴壁细胞粘附在其上，而悬浮细胞捕获在其中的基质或表面。基质(或大载体(macrocarrier)或基底或表面)可以是非固定的附着表面。该基质或表面可选自但不限于悬浮的微载体珠、纤维或编织网。该基质或表面可以是固定附着表面。该生物反应器可以是，例如，填充床生物反应器。本领域技术人员可以选择其它配置，只要生物反应器含有用于在生长和裂解过程中保留细胞的基质或表面即可。
宿主细胞是粘附在基质上或捕获在基质中的细胞，包括通常悬浮生长的细胞，因此在处理细胞和培养基时，细胞不会被释放。一般来说，该宿主细胞是贴壁细胞。该细胞可以是原代细胞，也可以是细胞系。特定的细胞是那些适合生长特定病毒的细胞。细胞系是已知的细胞系，例如CV-1细胞、KB细胞、Vero细胞、CHO细胞等。细胞包括但不限于哺乳动物细胞，包括人类和其它灵长类动物细胞；人细胞包括例如人成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞。
如本文所例举的，例举的细胞是CV-1细胞，并且病毒是痘苗病毒，例如治疗性痘苗病毒。在纯化之前，可以收获细胞加工培养基。任选地，可以储存该培养基。用于产生病毒的方法可以仅包括上述步骤a)、b)和c)，或者可以在纯化步骤(纯化仅包括超滤和/或透析过滤中的一个或两个步骤)之前包括其它步骤。
病毒的释放包括处理，例如冷冻/解冻和/或用低渗介质进行处理和/或使用洗涤剂进行处理，以裂解细胞。通过用蛋白酶和/或核酸酶进行处理，病毒从裂解的细胞中释放到培养基中。蛋白酶通常是非特异性蛋白酶，例如消化酶，如胰蛋白酶。核酸酶是DNase或RNase，例如来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸内切酶，以商标销售。核酸酶处理是可选的。裂解和酶处理可以依次进行或一起进行。裂解应在蛋白酶或核酸酶处理之前进行，或与蛋白酶或核酸酶处理一起进行。蛋白酶和核酸酶处理可以一起进行或以任何顺序进行。
病毒可以是任何感兴趣的病毒，例如治疗性病毒，包括溶瘤病毒、疫苗、基因治疗载体和用于递送基因产物的病毒。通常，由于纯化是用所释放的病毒进行的，并且释放可包括核酸酶处理，因此该病毒是包膜病毒。病毒包括但不限于：痘病毒，例如痘苗病毒、粘液瘤病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、腺病毒、腺相关病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)和塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus)，以及它们的经修饰以含有编码异源基因产物的核酸的衍生物。该病毒可以是溶瘤病毒，例如痘苗病毒(例如GL-ONC1、Pexa-Vec、vvDD、JX-929和WO-12)、水疱性口炎病毒(例如VSV-IFNβ-NIS、VSV-E6/7、VSV-GFP)、麻疹病毒(例如MV-NIS、MV-Edm、MV-NPL)、塞内卡谷病毒(例如SVV-001和NTX-010)、呼肠孤病毒(例如Reolysin)、腺病毒(例如CGTG-102、Oncos-102、NG-348、NG-350、NG-347、NGaFAB、NG-aEpCAM、ONYX-015、CG7870、VCN-01、LOAd703、Ad5、Ad3/5、CRAd-CXCR4-5/3、OvAd1、dI1520)、细小病毒(例如H1-PV)、马拉巴病毒(例如MG1MA3、MG1-HPV和MB1-新抗原)、新城疫病毒(例如NDV-HUJ)、逆转录病毒(例如Toca511)、克沙奇病毒(例如CAVATAK)和疱疹病毒(例如HSV-1716、NV1020、Imlygic(T-Vec)、ONCR-1/-2和HSV-1716)。该病毒可以是减毒的和/或修饰的。溶瘤性痘苗病毒包括但不限于李斯特菌(例如LIVP菌株及其克隆菌株)、西储(WR)、哥本哈根(Cop)、伯尔尼、巴黎、塔什干、天坛、惠氏(DRYVAX)、IHD-J、IHD-W、布莱顿、安卡拉、CVA382、修饰的痘苗安卡拉(MVA)、大连I、LC16m8、LC16m0、LIVP、ACAM2000、WR 65-16、康诺特、纽约市卫生局(NYCBH)、EM-63和NYVAC菌株，以及改良型惠氏菌株JX-594。该病毒的溶瘤性LIVP菌株的示例是命名为GLV-1h68的菌株(也称为GL-ONC1)。病毒中包括编码异源基因产物(包括治疗产物)和报告基因和其它可检测标记物的修饰病毒。
病毒通过超滤和/或透析过滤进行纯化。本领域技术人员可以选择合适的超滤膜形式和超滤方式。例如，超滤可以使用，例如，标称分子量截留300至750千道尔顿之间或标称孔隙率在0.05至0.2μm之间的膜。它可以使用含有聚醚砜的膜。该构件可以是扁平膜，或者可以是中空纤维膜。超滤可以以切向流模式、横向流模式或本领域技术人员选择的其它模式进行。超滤之后可以进行透析过滤，也可以在不进行超滤的情况下进行透析过滤。所处理的释放病毒的回收率大于50％，并且可高达90％、95％或更高。
附图说明
本申请包括至少一个以彩色绘制的附图。基于本申请的任何专利或任何出版物的副本，以及彩色附图，将由专利局在收到要求并支付必要费用后提供。
图1示出了示例性生物反应器ATMINano生物反应器和控制/数据管理系统。
图2示出了下文Nano生物反应器实验6中结晶紫染色载体的显微图像。
图3示出了Nano生物反应器载体在感染治疗性LIVP株痘苗病毒GLV-1h68(也称为GL-ONC1)前后的荧光显微图像。
图4示出了生物反应器实验1和滚瓶对照的CV-1细胞(广泛可用的知名细胞系，例如，/>CCL-70)的生长曲线和病毒扩增。
图5示出了生物反应器实验2和滚瓶对照的CV-1生长曲线和病毒扩增。
图6示出了生物反应器实验3和滚瓶对照的CV-1生长曲线和病毒扩增。
图7示出了生物反应器实验4和滚瓶对照的CV-1生长曲线和病毒扩增。
图8示出了生物反应器实验5和滚瓶对照的CV-1生长曲线和病毒扩增。
图9示出了生物反应器实验6和滚瓶对照的CV-1生长曲线和病毒扩增。
图10示出了生物反应器Nano实验2至6的个体生长曲线。
图11示出了生物反应器实验2至6中CV-1细胞在整个生长阶段的汇编生长数据。
图12示出了生物反应器实验2至6中CV-1细胞在150小时生长阶段的汇编生长数据。
图13示出了实验1至6的滚瓶对照中CV-1细胞在300小时生长阶段的汇编细胞密度数据。
图14示出了实验1至6的滚瓶对照中CV-1细胞在150小时生长阶段的汇编细胞密度数据。
图15示出了生物反应器Nano实验1和3至6在感染GLV-1h68之后的个体生长曲线。
图16示出了来自Nano实验1和3至6的病毒扩增数据。
图17示出了生物反应器实验7、8和9的CV-1生长曲线。
图18示出了对生物反应器载体的病毒提取条件的评估(试验4)。
图19示出了TrypLE中病毒稳定性的评估(试验8)。
图20示出了在生物反应器收获步骤期间病毒的回收率。通过各种溶液和处理介质的循环，依次对生物反应器进行处理。病毒的回收率通过病毒蚀斑测定法检测所收集的循环溶液来定量。结果表明，在用1X TrypLE处理并用10mM Tris-Cl洗涤后，大部分病毒从生物反应器中释放出来。用PBS和1M NaCl洗涤不会导致大量额外的病毒回收。收获后提取生物反应器大载体(基质)显示没有大量病毒残留，这证明了收获流程的效率。
上述附图是以代表而非限制的方式提供的。
概要
A.定义
B.概述
C.生物反应器和基质
D.细胞和生长
E.病毒和接种
F.细胞裂解和病毒释放到加工培养基中
G.对加工培养基进行透析过滤和超滤以纯化病毒
H.实施例
具体实施方式
A.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。除非另有说明，否则在本文的整个公开中提及的所有专利、专利申请、已公开的申请和出版物、序列、数据库、网站和其它已发表的材料均以引用的方式全文并入本文。如果本文中的术语有多个定义，则以本节中的定义为准。在提及URL或其它此类标识符或地址时，应理解此类标识符可能会发生变化，互联网上的特定信息可能会来来去去，但可以通过搜索互联网找到等效信息。对上述材料的引用证明了此类信息的可获得性和公开传播性。
如本文所使用的生物反应器是指细胞培养装置。为了在本文的方法中使用，生物反应器含有用于培养贴壁细胞的基质。该基质是一种保留细胞的基质，使得细胞在裂解时不会释放到细胞培养基中。示例性生物反应器是以生物反应器商标销售的生物反应器。该生物反应器由ATMI Life Sciences开发，可从PALL Biosciences获得。
如本文所使用的“载体”或替代的“基底”是指在培养中提供贴壁细胞粘附在其上的生物相容性表面的任何固态材料。
如本文所使用的基质型载体包含聚酯纤维，其任选地保持在笼(例如聚丙烯)内以固定纤维。
如本文所使用的加工培养基是指生物反应器中培养细胞并产生病毒的培养基；用于处理细胞并产生病毒的培养基。
如本文所使用的大规模制造是由单个患者剂量和年剂量需求来定义的。它因病毒和治疗而异；但每种大规模制备均提供年剂量的约1/6至1/12，例如约1/10。因此，例如，对于命名为GLV-1h68(GL-ONC1)的痘苗病毒而言，大规模制造每年提供约10000个治疗剂量，单位治疗剂量为约6x 109个空斑形成单位(pfu)，或6x 1013总年pfu剂量。假设每年8-12个生产批次，例如每年10个生产批次，每个大规模批次应生产1000个治疗剂量或约1011至1013pfu，例如约5-6x 1012pfu。示例性病毒GLV1h-68(GLV-ONC1)的示例性pfu和剂量：
滴度(pfu/ml) 剂量@5x109 pfu/剂量
6x107 12
8.6x108 35
1.2x108 80
2.8x108 45
1.7x108 29
1.1x108 108
如本文所使用的“病毒滴度”是指病毒的浓度，并且是单位体积感染的病毒单位量，例如空斑形成单位(pfu)/mL。病毒滴度可以通过对样本进行连续稀释以感染目标细胞来确定，以便量化样本中感染或活性病毒的数量。例如，病毒滴度可以使用噬斑测定法来确定。
如本文所使用的“病毒”或病毒载体是指在没有宿主细胞的情况下无法生长或复制的一大组感染实体中的任何一种。病毒通常含有围绕遗传物质的RNA或DNA核的蛋白质外壳，但没有半透膜，并且只能在活细胞中生长和繁殖。如本文所使用的溶瘤病毒是指在肿瘤受试者的肿瘤细胞中选择性复制的病毒。一些溶瘤病毒可以在肿瘤细胞感染后杀死肿瘤细胞。例如，溶瘤病毒可以通过裂解肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞的细胞死亡来引起肿瘤细胞的死亡。
如本文所使用的治疗性病毒，例如治疗性溶瘤病毒，是用于治疗疾病或病症的病毒。通常情况下，它们不是致病性的，或已被认为是非致病性的。
如本文所使用的术语“痘苗病毒”或“VACV”或“VV”表示一种属于痘病毒家族的大型、复杂的包膜病毒。它具有一个长度约190kb对的线性双链DNA基因组，编码约200种蛋白质。痘苗病株包括但不限于西储(WR)、哥本哈根、塔什干、天坛、Lister、惠氏、IHD-J和IHD-W、布莱顿、安卡拉、MVA、大连I、LIPV、LC16M8、LC16MO、LIVP、WR 65-16、康诺特和纽约市卫生局痘苗病株的菌株、衍生菌株或修饰的形式。
如本文所使用的Lister Strain of the Institute of Viral Preparations(LIVP)或LIVP病株是Institute of Viral Preparations,Moscow,Russia通过适应小牛皮肤而产生的减毒李斯特菌菌株(ATCC目录号VR-1549)(Altshteyn et al.(1985)Dokl.Akad.Nauk USSR 285：696-699)。LIVP菌株可以从例如Institute of ViralPreparations,Moscow,Russia获得(参见例如，Kutinova et al.(1995)Vaccine 13：487-493)；Microorganism Collection of FSRI SRC VB Vector(Kozlova et al.(2010)Environ.Sci.Technol.44：5121-5126)；或者可以从Moscow Ivanovsky Institute ofVirology获得(C0355 K0602；Agranovski et al.(2006)Atmospheric Environment 40：3924-3929)。这也是本领域技术人员所熟知的；它是USSR以及整个Asia和India用于疫苗接种的疫苗菌株。这种菌株是众所周知的(参见例如，Altshteyn etal.(1985)Dokl.Akad.Nauk USSR 285：696-699；Kutinova et al.(1994)Arch.Virol.134：1-15；Kutinova et al.(1995)Vaccine 13：487-493；Shchelkunov et al.(1993)VirusResearch 28：273-283；Sroller et al.(1998)Archives Virology 143：1311-1320；Zinoviev et al.,(1994)Gene147：209-214；and Chkheidze et al.(1993)FEBS 336：340-342)。
如本文所使用的LIVP GLV-1h68(也称为GL-ONC1；参见例如美国专利No.7,588,767和美国专利公开No.US-2016-0339066-A1)是一种LIVP病毒，其包含分别插入F14.5L、J2R(胸苷激酶)和A56R(血凝素)基因座的ruc-gfp(一种荧光素酶与绿色荧光蛋白融合基因(参见例如美国专利No.5,976,796)、β-半乳糖苷酶(LacZ)和β-葡萄糖苷酸酶(gusA)报告基因。GLV-1h68的基因组具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或与共同审理中的公开申请US-2016-0339066-A1的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
如本文所使用的术语“修饰病毒”或“重组病毒”可交替使用，是指与病毒的亲代株相比发生改变的病毒。典型的修饰病毒在病毒基因组中具有一个或多个截短、突变、插入或缺失。修饰病毒可修饰一个或多个内源性病毒基因和/或修饰一个或更多个基因间区域。示例性的修饰病毒可具有一个或多个插入病毒基因组内的异源核酸序列。修饰病毒可包含一个或多个异源核酸序列，其为用于表达异源基因的基因表达盒的形式。
如本文所使用的修饰的LIVP病株是指具有不包含在LIVP中的基因组，而是通过修饰源自LIVP的株的基因组而产生的LIVP病毒。通常，该病毒的基因组通过核苷酸的取代(替换)、插入(添加)或缺失(截短)来修饰。可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行修饰，例如基因工程和重组DNA方法。因此，与亲代病毒的基因组相比，修饰病毒的基因组发生了改变。示例性的修饰病毒具有一个或多个插入病毒基因组内的异源核酸序列。通常，该异源核酸包含编码异源蛋白质的开放阅读框。例如，本文中的修饰病毒可包含一个或多个异源核酸序列，其为用于表达异源基因的基因表达盒的形式。
如本文所使用的当参考基于受试者的质量kg的剂量(例如空斑形成单位(pfu)/kg)时，人类受试者平均被认为具有约70kg-75kg的质量，例如70kg。
为了公开的清楚性而非限制性，将具体实施方式分为以下小节。
B.概述
本发明提供了包括两个阶段的方法/工艺：生产阶段，在该阶段将病毒引入病毒可以进行复制的细胞中，以及在产生病毒的条件下培养细胞。病毒可以是任何合适的病毒，包括包膜病毒，包括但不限于痘病毒，例如痘苗病毒。然后裂解细胞以释放病毒，并且可以用一种或多种酶(核酸酶和/或蛋白酶)对细胞进行处理。在第二个阶段，收获加工培养基，并仅通过超滤或透析过滤或通过超滤和透析过滤来纯化病毒。因此，第二阶段是仅一步或两步的过程，只涉及超滤和/或透析过滤以产生纯化的病毒。
因此，该工艺包括在生物反应器中生长贴壁宿主细胞(通常是细胞系)的步骤，所述生物反应器含有填充的生物相容性编织或纤维基质材料，例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯。基质具有足够的密度，以在细胞裂解时通过粘附和/或捕获来保留细胞以及细胞碎片。
将宿主细胞培养到适当的密度，然后接种病毒，并进行培养以产生病毒。裂解细胞，例如通过冷冻和解冻或暴露于低渗介质或两者，然后用酶(如蛋白酶)进行处理，特别是用非特异性切割的酶(如胰蛋白酶)进行处理。细胞任选地在用蛋白酶处理之前、同时或之后，用核酸酶进行处理。裂解的细胞被基质材料保留。
病毒只需通过一或两个步骤即可从培养基中纯化，其中一个步骤是超滤或透析过滤。如果使用两个步骤，则它们是超滤和透析过滤。除了超滤和/或透析过滤之外，不采用其它纯化步骤。
因此，提供了用于生产(也称为制造)纯化病毒，特别是治疗性病毒，例如溶瘤病毒、疫苗和基因治疗载体的可规模化工艺(也称为方法)。因为这些方法可以在生物反应器中进行，所以这些方法很容易按比例扩大。纯化可以提供高产率病毒，可以在一天或更短的时间内完成。所产生的病毒产率高，回收率高达95％或更高，通常为至少50％、60％、70％、80％、90％。
C.生物反应器和基质
生物反应器是一种适合于生长细胞的容器，并且包含编织或非编织纤维、织物或织物条的填充基质基底，其纤维或纤维网使得细胞可以粘附(或捕获)和生长。基质可以在固定床或填充床中，也可以在流化床中。
生物反应器含有微载体珠、编织或非编织纤维、织物或织物条的填充基质，其纤维或纤维网使得细胞可以粘附和生长。基质使得细胞不会通过酶促消化(例如胰蛋白酶消化)从织物上分离或去除。细胞不会通过酶促消化(例如胰蛋白酶)从织物上分离或去除。中空纤维生物反应器将不起作用，因为粘附在中空纤维内表面的细胞将不会被捕获在基质中，并且细胞会能够通过酶促消化(例如胰蛋白酶)而分离。不考虑使用中空纤维生物反应器，因为粘附在中空纤维内表面的细胞不会被捕获在基质中，并且细胞会通过酶促消化(例如胰蛋白酶)而分离。根据本文的工艺，被基质保留在其中的细胞(例如锚定依赖性(“贴壁”)宿主细胞)在生物反应器中生长；细胞被病毒感染并在基质基底上的生物反应器中生长。
生物反应器的示例是以(Pall Life Sciences)商标销售的生物反应器。美国专利No.8,597,939和No.8,986,979描述了此类生物反应器。/>生物反应器是生物反应器平台的典范，包括可扩展的一次性高细胞密度生物反应器，可以实现小规模(以下称为“nano”)到大规模生产。该生物反应器含有医用级聚酯微纤维的预填充固定床，为在紧凑生物反应器体积中的生长提供了较大的表面积。主生物反应器配备有一个内置磁力驱动叶轮，使培养基从底部到顶部通过固定床循环，确保低剪切应力和高细胞活力。在固定床的顶部，培养基以薄膜的形式沿着外壁下落，在那里吸收O2以维持生物反应器中的溶解氧水平。
基质材料
基质材料的示例是细胞可以粘附的材料(粘附材料)，其是生物相容的，使得它们可以用于培养本文所述的细胞。此类材料包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚亚烷基、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、乙酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒和惰性金属纤维。这些材料的纤维可以以编织或非编织的形式使用。例如，在以商标销售并用于本文的工作实例中的生物反应器中，基质材料是聚酯：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。基质可涂敷有促进细胞粘附的材料，例如/>细胞培养基底、细胞外基质组分(例如纤连蛋白、软骨凝集蛋白、层粘连蛋白、/>F)、胶原蛋白或聚左旋乳酸，以提高其生物相容性、细胞粘附性或细胞滞留性。
基质的密度足以使细胞和裂解后的细胞碎片保持被捕获，但不会太高而阻碍细胞培养基流过基质和生物反应器(这是细胞生长所必需的)。基质的密度应使得细胞保持捕获在基质中，但密度不应太高以防止流体流过整个基质。
基质可以是网状物，例如由聚酯纤维组成的网状物。纤维的直径通常为约10至40微米。网状物可以从纺织品制造商处购买，可以是散纤维、非编织网状物或编织织物。一些制造商专门生产用于医疗目的的纤维；并且这些纤维是生物相容的。这种医用级网状物或织物对于本文所述的工艺和方法尤其具有实用性，因为它与用于生物制药的生物反应器中的细胞粘附和生长相容。
这种材料的堆积密度是影响细胞保持捕获在基质中的一个因素。纤维密度越大，填料的过滤效果就越高，因此细胞更有可能被捕获在基质中。然而，填料密度越大对介质流动的限制越大，并且需要更大的搅拌力来实现相同的介质流动。示例性密度为约80-160g/L，例如90-150g/L，例如96g/L-144g/L。该范围可保留细胞；填料密度越大对介质流动的限制就越大，并且需要更大的搅拌力来实现相同的介质流动。
生物反应器系统(例如，见图1)可容纳高达500m2的生长面积。使用25L的固定床体积进行扩大时，病毒(例如痘苗病毒)的预计产量如下：
对于生物反应器，例举了PET的两种堆积密度：96g/L和144g/L。
D.细胞和生长
本文提供了使用生物反应器由贴壁宿主细胞产生病毒的方法。这些方法包括在生物反应器中从贴壁宿主细胞中释放病毒，并通过超滤和/或透析过滤纯化所释放的病毒。该方法可用于制造病毒，包括用于临床应用，与传统的病毒制造方法相比，成本降低。只需要超滤和/或透析过滤的纯化方法减少了纯化时间，并提供了更高的病毒产量。纯化可以在1天或更短的时间内完成。
在生物反应器中培养细胞，所述细胞是贴壁细胞，或适于在基质支撑物中或在基质支撑物上生长的细胞。该宿主细胞可以是任何适于生长病毒的细胞；细胞的选择可取决于特定的病毒。一般来说，该宿主细胞是贴壁细胞。该细胞包括但不限于原始来源的哺乳动物细胞；转化的或以其它方式永生化的细胞；和细胞系。这些细胞的示例是：人成纤维细胞；人上皮细胞；以及人内皮细胞。细胞系包括但不限于：CV-1细胞；Vero细胞；和CHO细胞。这些细胞可以是重组的；和/或遗传修饰的。
将细胞以适当的量接种到反应器中。例如，该量可以是约3-6x 103个细胞/cm2，例如约4-5x 103个细胞/cm2，如4.5x 103个细胞/cm2。使细胞生长足够的时间，根据生长条件，通常为8天至20天，以达到感染病毒的最佳密度，例如约1-3x 105个细胞/cm2，如约1.5x 105个细胞/cm2。本领域技术人员知道或可以凭经验确定特定细胞生长和感染的最佳密度。
在示例性工艺中，将细胞以4.5E3个细胞/cm2接种到反应器中，并生长至1.5E5个细胞/cm2的最佳感染密度(根据生长条件，这可能需要约8天至20天)。在特定MOI(0.2至0.002，例如0.02至0.1)下感染细胞，并且病毒产生进行约96小时。由于纯化只是一个单步步骤(超滤和/或透析过滤)，因此与通常在数天内进行5-7个步骤的传统纯化相比，它可以在一天内进行。
在一些实施方案中，生物反应器可适于贴壁细胞的生长；可以是生物反应器；可包括美国专利8,597,939和8,986,979中公开的元件；可包含贴壁细胞可以粘附在其上的基质或表面；可包含非固定的附着表面，例如悬浮的微载体珠、纤维或编织网；和/或可包含固定附着表面，如在填充床生物反应器中那样。
在一些实施方案中，贴壁宿主细胞在受控条件下在生物反应器中进行培养；在细胞培养基和支持细胞营养需求的培养基添加剂的存在下进行培养；在适合细胞最佳生长的温度下(例如，哺乳动物细胞为37±3℃)下进行培养；在适合细胞最佳生长的pH(例如，哺乳动物细胞的pH为7.3±3)下进行培养；通过搅拌或循环适合细胞最佳生长的培养基或培养物进行培养；在固定床反应器中，在培养基的线性流速为约0.5至5cm/秒下进行培养；在适合细胞最佳生长的溶解氧水平(例如，哺乳动物细胞为50±25％)下进行培养；和/或培养至相对于生物反应器的培养基体积的高细胞密度(例如，≥2x10E6个细胞/mL，或≥1x10E7个细胞/mL)。
E.病毒和接种
本文所设想的病毒包括但不限于治疗性病毒，例如溶瘤病毒、用于疫苗的病毒和用于任何目的的病毒，包括用于重组产生编码产物的病毒。病毒通常是可以释放到细胞培养基中的包膜病毒。
将病毒引入细胞中，然后进行培养，使病毒复制。细胞在特定的感染复数(MOI)(取决于病毒)下被感染。在示例性实施方案中，该病毒是痘苗病毒，并且MOI为约0.002。病毒产生持续一段时间以产生最大量的病毒，例如，对于痘苗病毒，例如命名为GL-ONC1(GLV1h-68)的病毒，持续时间为约72-120小时，例如90-120小时，例如96小时。
宿主细胞可以在被引入生物反应器之前感染病毒，或者贴壁宿主细胞可以在生物反应器中生长时感染病毒。可以在引入感染或未感染的宿主细胞之前或之后调节生物反应器培养基和/或其它培养条件，以优化病毒的感染效率和/或复制。
病毒包括但不限于痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、弹状病毒、人乳头瘤病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、小核糖核酸病毒、辛德毕斯病毒、人乳头瘤病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、克沙奇病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒和塞姆利基森林病毒。
该病毒可以是天然的；野生型的；重组的；或转基因的。该病毒可选自新城疫病毒、细小病毒、痘苗病毒、粘液瘤病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、溶瘤腺病毒、腺相关病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、辛德毕斯病毒和塞内卡谷病毒，或其被修饰为含有编码异源基因产物的核酸的衍生物。该病毒可以是溶瘤病毒。该溶瘤病毒可以是痘苗病毒，其中痘苗病毒选自Lister(李斯特菌)、西储(WR)、哥本哈根(Cop)、伯尔尼、巴黎、塔什干、天坛、惠氏(DRYVAX)、IHD-J、IHD-W、布莱顿、安卡拉、CVA382、JX-594、修饰的痘苗安卡拉(MVA)、大连I、LC16m8、LC16m0、LIVP、ACAM2000、WR 65-16、康诺特、纽约市卫生局(NYCBH)、EM-63和NYVAC菌株。痘苗病毒可以来源于李斯特株病毒：LIVP病毒或LIVP病毒的克隆株。
该病毒可以是痘苗病毒，例如重组痘苗病毒。治疗性痘苗病毒的示例是经修饰的LIVP菌株病毒，例如在美国专利No.7,588,767、No.8,857,927、No.9,005,602、No.8,323,959和No.7,754,221中描述的那些，特别是命名为GLV-1h68(GL-ONC1)的病毒，以及在美国公开No.US-2012-0308484-A1中所描述的克隆株，以及经修饰的惠氏株痘苗病毒，例如命名为JX-594的病毒(也称为Pexa-Vec，Sillajen Biotherapeutics)，其是一种具有复制能力的惠氏菌株痘苗病毒(其被修饰以使胸苷激酶基因失活)，并且病毒编码和表达人GM-CSF和LacZ基因。
病毒可以是含有编码异源基因产物的核酸的修饰的形式，其中该异源基因产物是治疗性基因产物或报告基因产物。该异源基因产物选自抗癌剂、抗转移剂、抗血管生成剂、免疫调节分子、抗原、细胞基质降解基因、用于组织再生和将人体细胞重编程为多能性的基因、修饰底物以产生可检测产物或信号或可由抗体检测的酶、可以结合造影剂的蛋白质、用于光学成像或检测的基因、用于PET成像的基因和用于MRI成像的基因。该异源基因产物可以是选自激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、共刺激分子、核酶、转运蛋白、单链抗体、反义RNA、前药转化酶、siRNA、微小RNA、毒素、抗肿瘤寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管生成抑制剂、肿瘤抑制因子、细胞毒性蛋白、细胞抑制蛋白和组织因子的治疗剂。这些病毒可以编码异源基因产物，如果需要，还可以表达异源基因产物。这些产物包括可以由病毒递送的治疗性产物。此类产物的示例是抗癌剂、抗转移剂、抗血管生成剂、免疫调节分子和抗原。其它示例性产物包括但不限于选自激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、共刺激分子、核酶、转运蛋白、单链抗体、反义RNA、前药转化酶、siRNA、微小RNA、毒素、抗肿瘤寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管生成抑制剂、肿瘤抑制因子、细胞毒性蛋白、细胞抑制蛋白和组织因子的治疗剂。病毒还可以传递编码基因的核酸，例如细胞基质降解基因、组织再生基因和将人类体细胞重新编程为多能性的基因。病毒可以编码可检测的报告产物，例如但不限于修饰底物以产生可检测产物或信号或可被抗体检测的酶、可以结合造影剂的蛋白质、用于光学成像或检测的基因、用于PET成像的基因和用于MRI成像的基因。
F.细胞裂解和将病毒释放到加工培养基中
在该工艺的生产阶段，生物反应器中的细胞被裂解，并进行处理以释放病毒。根据本文的方法，病毒可以从宿主细胞中释放出来，而无需进行大量机械均质。
这可以通过任何合适的裂解细胞的方法来实现。裂解方法应使细胞保持粘附或捕获在基质中。例如，通过冷冻和解冻来裂解细胞。任选地，低渗休克可以提高病毒的释放和回收率。这可以通过例如向冷冻/解冻的生物反应器中加入总离子强度小于约0.05M(例如0.01M或更小，或例如0.001M)的水溶液来实现。
通过所选择的基质，细胞和裂解的细胞碎片保持粘附/捕获在基质中，并且不会释放或基本上不释放到具有病毒的细胞培养基中。病毒从捕获/粘附的细胞中释放出来是通过合适的方法来实现的，以实现裂解，例如生物反应器的冷冻/解冻和/或暴露于低渗介质，并且用酶(例如蛋白酶和任选的核酸酶)进行酶促消化。蛋白酶包括胰蛋白酶和其它通常用于分离细胞但由于基质的作用而不会分离细胞的蛋白酶。此类蛋白酶的示例是胰蛋白酶(猪胰腺来源)、TrypLE(具有胰蛋白酶样酶活性的重组细菌产生的酶)、溶液(Sigma Aldrich；蛋白水解酶和胶原水解酶活性的混合物)、蛋白酶-K、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶、其它具有非特异性切割位点以消化蛋白质的此类蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶(ficain)等。
病毒可以通过冷冻/解冻的过程从宿主细胞中释放出来。例如，病毒可以在固定床反应器中从细胞中释放出来，在该过程中，去除培养基，并将生物反应器在约≤10℃下冷冻≥60分钟，或在<-60℃下冷冻≥15分钟，或<-120℃下冰冻≥1分钟，或其它合适的温度组合。生物反应器可以被冷冻，例如，通过将其放入冷冻机中，通过夹套式制冷、通过浸入干冰中、通过浸入液氮中、通过注入液氮蒸汽，或其它此类方法。生物反应器可以通过合适的方法解冻，例如暴露于室温空气、通过添加液体介质(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))，或通过本领域技术人员已知的其它此类方法。例如，可以在选定的温度下将液体介质添加到生物反应器中，以最大限度地提高细胞裂解，同时优化病毒的稳定性(例如，≤50℃或37±3℃)。
任选地，如果使用冷冻/解冻，则低渗休克可以提高病毒的释放和回收率。低渗休克可以通过例如向冷冻/解冻的生物反应器中加入总离子强度小于约0.05M(例如0.01M或更小，或例如0.001M)的水溶液来实现。病毒可以通过暴露于低渗介质而从宿主细胞中释放出来。在一些实施方案中，该低渗介质可以是离子强度≤50mM的水或水性缓冲液。低渗条件可以通过用低渗溶液(例如水)稀释生物反应器培养基以达到≤50mM的最终离子强度来实现。例如，在固定床生物反应器中，可以去除培养基，并用离子强度≤50mM的低渗介质代替。在一些实施方案中，可以对低渗介质进行搅拌或循环。
任选地，可以通过在冷冻/解冻和/或低渗休克期间或之后或在合适的缓冲液中用具有DNase和/或RNase活性的酶进行处理来提高病毒的释放和回收率。核酸酶的示例是以商标核酸内切酶销售的核酸内切酶，或具有DNase和/或RNase活性的其它酶。消化天然或热变性DNA和RNA的/>核酸酶(Millipore销售；参见，例如，Franke etal.,(1998)FEBS Letters 425：517-522)是粘质沙雷氏菌的基因工程内切酶。本领域技术人员已知的是沙雷氏(Serratia)核酸酶，它是具有两个必需二硫键的30kDa亚基的蛋白质二聚体。
可以选择从宿主细胞释放病毒的条件以最大限度地进行细胞裂解，同时优化病毒的稳定性。例如，温度可以≤50℃；pH值可以≥4且≤10；并且/或者通过填充床生物反应器的线性流速可以≥2cm/sec。
病毒可以通过暴露于含有洗涤剂的介质而从宿主细胞中释放出来。洗涤剂可以是离子型、阳离子型或阴离子型的。洗涤剂的浓度可以是例如，≤1％。
如上所述，在用冷冻/解冻和可选的低渗介质和其它这样的处理后，用蛋白酶对细胞进行处理。病毒可以通过一种或多种酶的消化而从宿主细胞中释放出来。将细胞暴露于具有对所选消化酶最佳的离子强度和pH的消化介质中。示例性消化介质可以在pH≤8下缓冲，例如在7和8之间的中性pH，例如pH 7.4，例如可以是PBS。消化介质含有钠盐；和/或含有镁盐。消化酶可以是如上所述的蛋白酶，例如胰蛋白酶或重组胰蛋白酶(TrypLE)。蛋白酶处理可以与核酸酶(例如以销售的来自粘质沙雷氏菌的核酸内切酶)有效结合或替代。消化可以顺序地或组合地使用核酸酶和蛋白酶。可以将消化温度设置为优化酶促消化和优化病毒的稳定性(例如，37℃)。可以将消化时间设置为优化酶促消化和优化病毒的稳定性(例如，≥1小时)。可以通过去除消化介质并从中纯化病毒来收获病毒。
所释放的病毒可以用所选择的介质进行冲洗，以优化病毒回收率和/或病毒稳定性。例如，冲洗介质可以是水；可以是具有低离子强度的缓冲剂；可以是具有高离子强度的缓冲剂；pH值可≥9；和/或可以是pH为9.0的10mM Tris-Cl。
G.对加工培养基进行透析过滤和超滤以纯化病毒
从细胞中释放病毒并进行酶促消化后的纯化过程是超滤或透析过滤或两者兼有的单一(或双重)步骤。不采用或不需要其它纯化步骤。纯化可以在一天内进行。常规的现有技术纯化通常采用5至7个步骤，在数天内进行。由于本文提供的纯化方法，不仅减少了时间、节省了成本并提高了产率，而且步骤更少、时间更短，减少了在处理过程中随着时间的推移而发生的病毒的降解和失活。
所释放的病毒在培养基中通过超滤或透析过滤或两者进行纯化。不采用其它纯化步骤。所释放的病毒可以通过超滤进行纯化。本领域技术人员可以选择合适的过滤膜和过滤方案。在一些实施方案中，过滤介质可以选择以优化杂质的去除并优化病毒的稳定性；可以是水；可以是水性缓冲液；可以是高离子强度；可以是低离子强度；可以是生理离子强度；和/或可以适用于使动物或人类施用。处理后所释放的病毒的回收率可大于50％；大于70％；大于80％；大于90％；或大于95％。
超滤
病毒可以使用通常用于从生物制药制剂中去除污染病毒的大孔隙率超滤膜而进行纯化。此类膜通常具有大于或等于300000道尔顿分子量截留的孔隙率，使得蛋白质产物可以通过膜而保留病毒。以相反的模式(切向流或横向流过滤模式，而不是单次通过模式)使用这些“病毒清除”膜，可以保留和纯化病毒，同时去除蛋白质、核酸和其它杂质。
例如，可以选择超滤膜以最小化病毒结合并最大限度地保留病毒。超滤膜可以是具有孔隙的超滤膜，其渗透性被切断以防止病毒通过孔隙。例如，该超滤膜的标称分子量截留在300至750千道尔顿之间，或者标称孔隙率在0.05至0.2μm之间；该超滤膜包含聚醚砜(PES)；该超滤膜可以是，例如，扁平膜或中空纤维膜；超滤可以以切向流或横向流模式进行；超滤可以在优化病毒滞留率和优化病毒稳定性的条件下进行；并且/或者超滤可以在≤10℃下进行。
可使用平板膜过滤器和中空纤维过滤器进行超滤。由病毒结合低的材料构成的膜适合于高病毒回收率。此类膜的实例包括但不限于Centramate T系列盒式平板膜(300kdmwco，PALL Life Sciences,Inc.)和MidiKros中空纤维膜滤芯(500或750kd mwco，Spectrum Laboratories,Inc.)，其均由聚醚砜(PES)构成。
透析过滤
超滤之后可以用高离子强度、中性pH和/或低离子强度、高pH过滤溶液进行透析过滤。如本文所公开的，此类方法能够以高纯度从裂解的细胞中回收大于90％的病毒。
在一些实施方案中，所释放的病毒可以通过透析过滤来纯化。在一些实施方案中，透析过滤可以用被选择为使病毒结合最小化和使病毒滞留率最大化的膜进行；透析过滤膜可以是与用于超滤相同的膜；透析过滤可以通过向超滤渗余物中添加过滤介质来进行；并且/或者透析过滤可以通过添加≥5个过滤体积来进行，每个过滤体积相当于渗余物体积。
可以回收多达95％的病毒。由此产生的病毒是任何感兴趣的病毒，尤其是痘苗病毒。该病毒可具有生物活性，可用于感染细胞，可用于表达同源或异源基因或蛋白质，和/或可用于引发免疫应答。
本领域技术人员可以在本公开发明的范围和精神内设计许多修改和其它实施方案。事实上，在不改变所公开发明的基本方面的情况下，所描述的材料、方法、附图、实验实例和实施方案的变化可以由技术人员进行。所公开的实施方案中的任何一个都可以与任何其它所公开的实施方案组合使用。
H.实施例
以下实施例并不旨在限制本公开或权利要求的范围，也不旨在表示以下实验是所有或仅进行的实验。已经努力确保所用数字(例如量、温度等参数)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。应当理解，可以在不改变实验和实施例所示的基本方面的情况下对所描述的方法进行改变。
实施例1
一般方法
CV-1细胞培养。这些实验中使用的所有CV-1细胞均来源于CV-1Working CellBank(WuXi Apptec Acc#09-002346,Lot#090170885,6.0x106 cells/vial in 1.0mL,Freeze date 09DEC2009,Passage 45)。这些细胞进一步扩增并在第55代时冷冻保存。使用这些细胞的等分试样进行生物反应器Nano实验。将Cv-1细胞在补充有10％FBS的DMEM中在T形瓶和滚瓶中在37℃、5％Co2培养箱中进行培养。
感染GLV-1h68。使生物反应器Nano实验培养物感染GLV-1h68(这是一种源自LIVP菌株的重组痘苗病毒)。GLV-1h68 P3 2-28-14用于Nano实验1-6的感染，GLV-1h68P3 8-28-14用于Nano实验7-11的感染。根据感染时的细胞数、种子病毒的滴度和指定的MOI，计算种子病毒的用量。
生物反应器Nano生物反应器流程。/>生物反应器Nano生物反应器按照制造商推荐的流程进行设置和操作(“Integrity/>bioreactor Nano Bioreactorwith Control System User Guide”-Document reference USG_nano_mycontrol_01,version 01,February 2014.)。
分析。在感染了GLV-1h68的生物反应器和纯化样品上进行病毒蚀斑测定(VPA)。取出反应器培养基样品，并在-20℃下冷冻。将含有1或2个载体的生物反应器中的大载体(基质)样品从生物反应器取出，并放入含有1mL新鲜DMEM-10％FBS培养基的微型离心管中，并在-20℃下冷冻。在测试之前，将培养基和载体样品在室温或37℃下解冻，在DMEM-2％FBS中稀释，并在CV-1细胞上铺板以形成蚀斑。载体的胰蛋白酶化是通过将一个载体放入0.5mL0.05％Trypsin/0.53mM EDTA或1x TrypLE in PBS中，并在37℃下用间歇涡流混合孵育60分钟进行的。通过加入1.0mL DMEM-10％FBS而对样品进行稀释。将纯化样品储存在冰上，并在不进行事先冷冻的情况下进行测试。根据24孔多孔板，使用CV-1细胞进行VPA。通过结晶紫染色观察到病毒蚀斑。
对反应器培养基和大载体的样品进行β-葡萄糖醛酸苷酶测定(GUS-A)，在DMEM-2％FBS中稀释并进行测试。荧光底物Cl-MUGlcU(二甲基亚砜中的储备溶液：36.5mM)用于由含有2％FBS的磷酸盐缓冲盐水溶液组成的测定缓冲液中。在96孔多孔板中进行分析，并使用SoftMaxPro v5.4.4软件在M5读板器中读取。
分别使用Quant-iT Protein Assay Kit(Invitrogen)和Quant-iT dsDNA AssayKit(高灵敏度，Invitrogn)测量蛋白质和DNA含量。在96孔多孔板中进行分析，并使用SoftMaxPro v5.4.4软件在M5读板器中读取。
实施例2
Nano生物反应器中CV-1细胞培养工艺的研究
所有实验的接种密度均为4.5x104个细胞/cm2，与滚瓶中CV-1细胞的接种密度相匹配。感染的目标细胞密度为1.0至2.0×105个细胞/cm2。
通过无菌打开生物反应器并在培养过程中的不同时间移除载体来评估培养进度。将粘附在载体上的细胞裂解，并使用血球计数板对细胞核进行计数。还通过结晶紫染色在显微镜下观察载体上的细胞。实验6的染色载体的显微图像如图2所示。在细胞接种之前，载体纤维的直径看起来是均匀的，并且没有明显的染色。接种后，载体似乎已经积聚了附着在单个纤维上和纤维束之间的间隙中的染色物质。染色材料构成了在纤维繁殖时附着在纤维上并相互附着的细胞。感染GLV-1h68后，对载体进行了显微荧光成像，以评估GFP表达的量和分布。图3示出了感染前、感染后24小时和收获后的载体。感染后24小时，强烈的绿色GFP荧光与纤维均匀结合，这一点非常明显。在更高的放大倍数下，在与细胞位置相对应的纤维上观察到了单独的荧光中心。荧光显著降低。
在感染期间和感染后，评估病毒滴度，以确定病毒扩增量以及病毒在细胞和培养基之间的分布。从反应器中取样载体，并在新鲜培养基中进行冷冻-解冻，以通过VPA进行测定。同时对来自反应器的培养基进行取样，并通过VPA直接测定。病毒量以表面积PFU/cm2、PFU/细胞(感染时测定的细胞数)或反应器中的总PFU(载体相关或培养基中)表示。
Nano实验1
用第71代的CV-1细胞以4.5x104个细胞/cm2接种反应器，在24小时时，3.4x104个细胞/cm2粘附在生物反应器上(76％)。培养物的搅拌速率设定为在细胞接种期间产生1.6cm/sec的线性流速，并在第10天提高至2.5cm/sec。流速在第10天降低至1.6cm/sec，在第14天降低至1.0cm/sec，并且在第16天降低至0.5cm/sec。接种后，体积培养基从600mL增加至762mL，并在第3天增加至2286mL。在第3、6、10、14和16天更换培养基。在第21天，在600mLDMEM-2％FBS培养基中以0.07(1.12x108 pfu)的MOI用GLV-1h68感染培养物。流速保持在0.5cm/sec。在感染后72小时，收获培养物。同时，将CV-1细胞接种到滚瓶中，并定期进行细胞计数。滚瓶在标准实验室条件下进行培养，而无需更换培养基。图6示出了培养物的细胞密度分布。
结果表明，接种到生物反应器中的CV-1细胞在整个生长期内的生长与滚瓶对照相当。反应器中的CV-1培养物达到目标1.6x105个细胞/cm2(约2个细胞群倍加数)，这表明生物反应器可以支持细胞生长至这个密度。搅拌速率的变化和培养基的更换都不会显著影响细胞的总体生长速率。在生长阶段中，观察到培养基变得浑浊，这表明细胞可能从反应器中分离。较低的搅动降低了这一点。/>
在第21天用GLV-1h68感染培养物导致在感染后第1天的病毒滴度立即增加，并在第2天达到最大值。在整个72小时的扩增期内，病毒与载体(即细胞)相关，在培养基中检测到的游离病毒很少。在感染后的一段时间里，载体的细胞数量有所减少，但这种减少与培养基中病毒滴度的增加并不一致。在感染后的第1天，培养物已酸化至pH 6.2，培养基变得浑浊，且细胞密度下降。为了抵消这种影响，使用碱泵将氢氧化钠溶液输送到生物反应器中。这用于所有随后的生物反应器实验中。
Nano实验2
Nano实验2是通过在细胞接种后立即降低流速来进行的。将第76代CV-1细胞以4.5x104个细胞/cm2在600mL培养基中以1.6cm/sec的线性流速接种到反应器中。1小时后，培养基的体积增加至1342mL，线性速度提高至2.5cm/sec。24小时后，粘附的细胞密度为3.5x104个细胞/cm2(78％)。在第1天，培养基的体积增加至2286mL，流速降低并保持在0.5cm/sec。在第5天更换培养基。
在第10天，达到1.7x105个细胞/cm2(超过2个细胞群倍加数)。将培养物以0.1的MOI(1.48x108 pfu)用GLV-1h68感染，并且在感染后第3天流速降至零。在生物反应器中，无论是在载体上还是在培养基中，病毒水平都迅速下降，低于初始感染的水平。在感染后第4-8天，线性速度恢复，但仅恢复到非常低的水平(最高0.3cm/sec)，以便将营养物质循环到细胞中，但生物反应器中的病毒水平仍然非常低。通过培养基的循环，在搅拌的情况下实现了病毒在生物反应器中的有效感染和传播，因此随后的实验以0.5-2.5cm/sec之间的线性速度进行。
Nano实验3
Nano实验3是实验2的重复，不同之处在于第1天之后的线性流速进一步降低至0.44cm/sec。用第78代的CV-1细胞以4.5x104个细胞/cm2接种反应器，24小时后，粘附3.9x104个细胞/cm2(接种率87％)。
在第10天，细胞密度达到1.7x105个细胞/cm2。在第11天，用MOI为0.1(1.74x108pfu)的GLV-1h68感染培养物。流速增加保持在0.5cm/sec。载体上的病毒立即增加，而培养基中的病毒仍然很低。故意将病毒扩增延长至感染后第8天，以检查完整的扩增谱。病毒在感染后第2天增加，然后在第6天保持相对稳定，在第7天和第8天显著减少。这种减少与培养基中病毒的增加并不一致。
Nano实验4
在Nano实验4中，用第81代的CV-1细胞以4.5x104个细胞/cm2接种反应器，在24小时时，细胞密度为4.5x104个细胞/cm2(100％接种率)。24小时后，流速设定为0.44cm/sec，培养基体积增加至2286mL。第7天进行一次培养基更换。在第10天，流速增加并保持在1.5cm/sec。
在该实验中，生物反应器中的细胞密度稳定增加，直到第8-10天。在第11天，线性速度增加至1.5cm/sec，细胞生长恢复，在第12天达到1.9x105个细胞/cm2的最大细胞密度(超过2个细胞群倍加数)。
在第14天感染生物反应器(MOI＝0.13，1.72x108 pfu)，感染后的第1天产生最大的病毒扩增。这种病毒几乎只与载体有关。载体上的病毒在感染后第4天和第5天下降，培养基中的病毒相应上升。
Nano实验5
在Nano实验5中，第58代的CV-1细胞直接来自冷冻保存。细胞从与先前实验中使用的CV-1细胞相同的工作细胞库中繁殖。
Nano实验5以4.5x104个细胞/cm2接种，并在24小时时，粘附4.7x104个细胞/cm2(接种率104％)。培养基的体积增加至2286mL，并且线性流速设置为0.44cm/sec。在第4天更换一次培养基，在第9天流速增加至0.9cm/sec。
在该实验中，细胞密度在第7天达到最大1.0x105个细胞/cm2(约1.5个细胞群倍加数)，此后下降。在第9天流速的增加并没有明显提高生长速率。培养物在第12天以0.1的MOI(8.26x107 pfu)感染GLV-1h68，并且流速增加至2.5cm/sec。病毒在感染后的第1天积聚，但随后下降。病毒几乎只与载体有关，培养基中的病毒没有明显增加。
Nano实验6
Nano实验6用第62代的CV-1细胞进行，继续实验5中使用的细胞的传代。重复实验5的流程，不同之处在于在接种后24小时流速降至0.44cm/sec后的生长阶段没有发生流速变化，并且直到第6天才更换一次培养基。以4.5x104个细胞/cm2接种反应器，并在24小时时，5.3x104个细胞/cm2粘附在反应器上(接种率118％)。
在该实验中，在第11天实现了1.5x105个细胞/cm2(大约2个细胞群倍加数)。培养物在第12天感染GLV-1h68(MOI＝0.1，1.40x108 pfu)，直到感染后第3天才检测到少量病毒扩增，并且在感染后第6天出现另一个峰值。同样，在培养基中检测到的病毒非常少。
Nano实验1-6中CV-1细胞生长阶段的分析
在Nano实验2-6中检测了CV-1细胞生长。个体生长曲线如图12所示。
将这5个实验的生长数据进行组合，并生成总体生长曲线。图13示出了拟合指数方程的数据，时间依存系数为0.005。根据生物反应器中生长的CV-1细胞的生长曲线方程计算的群体倍增时间(PDT)为140小时。
当来自实验2-6的生长数据在接种后150小时被截断时，PDT为99小时。
Nano实验1-6中GLV-1h68感染阶段的分析
在感染后24至48小时内，生物反应器中的细胞密度下降，并在整个感染期持续下降。除了实验1培养物在感染后24小时突然发生酸化之外，在任何pH得到充分控制的生物反应器实验中都没有证据表明存在广泛的细胞裂解。除实验6外，感染后24小时下降并不明显。
生物反应器中的病毒产量是通过在感染后每24小时从反应器中取样一次载体和培养基来评估的。通过病毒蚀斑分析(VPA)直接测定培养基的病毒滴度，而将载体在新鲜培养基中冷冻/解冻，然后再进行滴度测定。结果显示，病毒在感染后72小时在生物反应器中积累，然后下降。基于该分析，从生物反应器中收获病毒的目标时间是感染后72小时。
生物反应器中GLV-1h68的产生
进行了三次连续的生物反应器实验(Nano实验7、8和9)。实验7和8是在同一工作细胞库(WCB)原液瓶中连续扩增的CV-1细胞，但随后进行了线性传代。实验9从不同的瓶中展开，但用的是相同的WCB原液。实验7、8和9在生长阶段的线性流速也略有变化(分别为0.44cm/sec、0.56cm/sec和0.67cm/sec)。实验7、8和9的细胞生长在感染前进行到略微不同的终点(分别为1.6x105个细胞/cm2、1.8x105个细胞/cm2和1.5x105个细胞/cm2)。实验7、8和9与之前的Nano实验1-6的不同之处在于，GLV-1h68感染在MOI 0.2下进行(Nano实验7、8和9分别为3.1x108 pfu、3.7x108 pfu和3.1x108 pfu)，并在感染后扩增72小时。最后，对载体进行最小采样，以最大限度地减少对培养物的干扰，并减少生物反应器中载体的消耗。
生物反应器实验7、8和9中CV-1细胞的生长特性如图28所示。每个反应器以4.5x104个细胞/cm2接种。实验7、8和9的细胞分别为第65、77和59代。24小时后，实验7具有4.6x104个细胞/cm2(102％的接种率)，实验8具有5.8x104个细胞/cm2(127％的接种率)，实验9具有4.4x104个细胞/cm2(98％的接种率)。实验8的生长速率大于实验7和9的生长速率。实验8在第8天达到1.8x105个细胞/cm2的感染密度(在其培养基的预定更换之前)，因此培养基没有更换。培养基实验7和9分别在第10天和第12天更换。实验7在第13天获得1.6x105个细胞/cm2的感染密度，实验9在第15天获得1.5x105个细胞/cm2的感染密度。实验8计算的群体倍增时间(PDT)为87小时。
实施例3
从生物反应器载体中提取病毒的方法研究
各种病毒提取方法的汇编结果表明，方法极大地影响了结果(图24)。通过改变提取流程，病毒收获的有效性几乎有60倍的差异。评估了时间、温度和搅拌对从载体中提取病毒的影响。当通过低渗休克裂解细胞并使用1mM Tris pH 9.0进行冷冻/解冻时，病毒产量不超过约3pFU/细胞。对载体上细胞的显微镜检查表明，细胞已经裂解，但没有释放出来病毒。病毒通过直接与载体表面结合或间接与细胞成分结合，而与载体保持结合。处理后对染色载体的显微镜检查表明，载体上残留有大量细胞碎片。
研究了胰蛋白酶处理从通过低渗休克进行裂解的生物反应器载体(裂解后载体)中提取病毒。试验1比较了提取介质PBS、胰蛋白酶/EDTA(猪胰蛋白酶)、TrypLE(重组胰蛋白酶)或水的效果。此外，还评估了冷冻/解冻和超声处理的效果。结果表明，每种提取方法都是成功的，其中用TrypLE获得了最有效的提取，并增加了仅冷冻/解冻或冷冻/解冻和超声处理的益处。提取的病毒为7.2PFU/细胞。通过冷冻/解冻和超声处理，在PBS中提取了3.3PFU/细胞。试验2重复了TrypLE在进行和不进行冷冻/解冻和超声处理的情况下的比较。冷冻/解冻和超声处理的TrypLE提取了7.0PFU/细胞。
试验3比较了胰蛋白酶/EDTA、TrypLE和1mm Tris pH 9.0在进行和不进行冷冻/解冻和超声处理的情况下无需预先裂解而提取生物反应器载体(裂解前载体)。冷冻/解冻和超声处理的TrypLE提取了9.1PFU/细胞。
用在感染后24、48和72小时从生物反应器中获得的载体重复评估，这些载体已经进行冷冻和解冻，但之前没有裂解。试验4比较了PBS、胰蛋白酶/EDTA和TrypLE在进行和不进行冷冻/解冻和超声处理的情况下对72hpi载体的提取(图25)。胰蛋白酶/EDTA产生了19PFU/细胞，而TrypLE产生了60PFU/细胞。所有这些结果都是在提取后通过载体的冷冻/解冻和超声处理获得的。仅在冷冻/解冻的情况下，PBS产生了2.7PFU/细胞，胰蛋白酶/EDTA产生了17.5PFU/细胞，TrypLE产生了40.4PFU/细胞。使用相同的条件对试验4中使用的载体进行了第二次提取。在这种情况下，TrypLE、冷冻/解冻的TrypLE和冷冻/解冻和超声处理的TrypLE各自提取的PFU/细胞均少于1.3。
以48hpi采样的载体的提取产生的病毒少于72hpi的载体。仅TrypLE、冷冻/解冻的TrypLE，以及冷冻/解冻和超声处理的TrypLE分别提取了12.2PFU/细胞、25.1PFU/细胞和22.1PFU/细胞。在这三种方法下，在24小时采样的载体分别提取了13.7PFU/细胞、18.3PFU/细胞和19.8PFU/细胞。
将已知滴度的病毒等分试样在TrypLE中在21℃或37℃下孵育5、10、15、30、45或60分钟。在任何一种温度下，病毒滴度都没有显著降低。如果有的话，病毒滴度随着TrypLE的孵育而增加。
实施例4
病毒感染、扩增和收获
通过增加时间或增加体积来增加反应器载体与收获溶液的接触。
实验7、8和9在600mL感染培养基中以0.2的MOI感染GLV-1h68，以实现细胞的快速有效感染。所有这三个实验的扩增时间均设定为72小时。感染后细胞密度迅速下降，可以明显看出这一结果(图27)。在感染后72小时，通过排出培养基并用PBS进行冲洗来收获反应器。立即收获实验7的生物反应器。冷冻实验8和9的生物反应器，随后再进行处理。将TrypLE溶液加入PBS中的反应器中，并通过搅拌进行循环。采集所收获的体积，并用额外的体积冲洗反应器。对收获和冲洗体积进行取样，并通过VPA分析病毒含量。
将实验7在21℃下用300mL 1x TrypLE收获45分钟，然后用300或500mL 10mMTris-HCL pH 9.0连续冲洗9次。在收获之前，不对反应器进行冷冻。对收获和漂洗级分的病毒含量的分析表明，在整个过程中，病毒是从生物反应器中连续收获的。病毒含量最高的第三次漂洗级分仅占所收获总病毒的16％。事实上，最后一次漂洗级分仍占总病毒收获量的4％。回收了1.3x1010 pfu的GLV-1h68。
表1：Nano实验7的病毒收获率
实验8是在生物反应器冷冻/解冻后收获的。TrypLE(通过将10倍TrypLE在PBS中稀释至300mL而制备)在21℃下持续45分钟，然后每次用300mL 10mM Tris-HCL pH9.0连续冲洗10次。前5次冲洗是在连续最大搅拌的情况下进行的，后面的冲洗使用多次间歇性猛烈搅拌。与实验7相比，第二冲洗级分具有最大的病毒含量，收获了总病毒的20％。连续冲洗的级分具有相当多的病毒，并且最后的冲洗级分仍具有收获的总病毒的5％。收获的总病毒量为1.7x1010 pfu GLV-1h68。
表2：Nano实验8的病毒收获率
在实验9中，在37℃下用500mL TrypLE(通过在PBS中稀释10倍TrypLE而制备)冷冻/解冻60分钟后进行收获，然后每次用500mL的10mM Tris-HCL pH 9.0冲洗2次，用PBS冲洗两次，最后用含有1M NaCl的PBS冲洗2次。全程使用最大的持续搅拌。具有10mM Tris-HClpH 9.0的第二次冲洗级分再次含有最大的病毒含量，然而总收获量的相对比例大于之前的收获率(32％)。此外，TrypLE收获级分和第一次冲洗都含有大量的病毒级分(分别为27％和29％)。随后用PBS冲洗的病毒含量降低(9.4％和1.9％)，最后用含有1M NaCl的PBS冲洗病毒含量显著降低(0.5％和0.2％)。从实验9中收获的总病毒量为7.3x1010 PFU。
减少病毒收获的总体积可有助于下游的处理步骤。因此，在每个步骤中提高病毒释放的效率是有利的。
载体在收获后从生物反应器中取样、提取并通过VPA进行测试。载体含有4.9x106PFU/载体，收获时整个生物反应器含有914个载体，表明收获后残留病毒含量为4.5x109PFU或收获总病毒的6％。因此，在收获过程中，病毒的回收率估计至少为94％。在感染时，生物反应器中含有1.5x109个细胞。因此，特异性病毒生产率为[7.3x1010+(7.3x1010x0.06)]PFU/1.5x109个细胞＝52PFU/细胞。
表3：Nano实验9的病毒收获率
实施例5
生物反应器中收获的GLV-1h68的纯化
使用五次生物反应器实验(Nano实验7、8、9、10和11)来评估在切向流(即横向流)模式下使用超滤的病毒纯化过程。将Nano实验7的病毒收获物(总共3500mL)在-20℃下以等分试样冷冻。对于每个实验，在使用前，将病毒收获物的等分试样在4℃和/或室温下解冻。对于其它实验，病毒收获物通过UF/DF直接纯化，而无需事先冷冻。
使用Centramate LV 300千道尔顿截止(kdco)过滤器UF/DF纯化的Nano实验8的病毒收获物
从3.5L Nano实验8生物反应器中收获病毒。使用Centramate LV 300kdco过滤器以9.1L/min/M2的初始流速进行超滤，直到渗余物体积减少至900mL。将渗余物在-20℃下储存过夜。继续UF，直至渗余物体积减少至500mL。通过加入连续七个透析过滤体积(diavolume)的PBS进行透析过滤。将最终的渗余物和过滤洗涤液合并，总体积为300mL。通过VPA测定样品的病毒滴度，通过蛋白质和DNA测定法测定蛋白质和DNA含量。
结果表明，超滤后的病毒回收率为80％，透析过滤后的病毒回收率为36％。UF渗余物的蛋白质含量为21.3mg/109pfu，DNA含量为455μg/109pfu。透析过滤后，DF渗余物的蛋白质含量降至9.0mg/109pfu(减少2.4倍)，DNA含量降至17μg/109pfu(减少26倍)。
表4：使用Centramate LV 300kdco过滤器UF/DF纯化Nano实验8的病毒收获物
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表5：使用Centramate LV 300kdco过滤器UF/DF纯化的Nano实验8的病毒收获物的蛋白质和DNA分析
使用Centramate LV 300kdco过滤器UF/DF纯化的Nano实验7的病毒收获物
使用Centramate LV 300kdco过滤器浓缩Nano实验7生物反应器的病毒收获物的等分试样(1000mL)。然后将UF渗余物(200mL)首先用10个透析过滤体积(2000mL)的PBS进行透析过滤，然后通过10个透析过滤体积的低离子强度和高pH缓冲液(10mM Tris CL pH9.0)进行透析过滤。
从1000ml到200ml的病毒收获物的初始浓缩后的病毒回收率为67％。用PBS透析过滤后，病毒回收率为16％。随后用10mM Tris-CL，pH 9.0透析过滤后，病毒回收率恢复至81％。
表6：使用Centramate LV 300kdco过滤器UF/DF纯化的Nano实验7的病毒收获物
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1未检测到。
使用Centramate LV 300kdco过滤器UF/DF纯化的Nano实验9的病毒收获物
从3.5L的Nano实验9生物反应器中收获病毒。使用Centramate LV 300kdco过滤器以4.4L/min/M2的初始流速进行超滤，直至渗余物体积减少至200mL。通过添加连续5个透析过滤体积的PBS(每个200mL)进行透析过滤，然后添加连续五个透析过滤体积的10mM Tris-CL，pH 9.0(每个200ml)进行透析过滤。UF和DF的渗余物和渗透物级分的样品通过VPA测试病毒滴度，并通过蛋白质和DNA测定法测试蛋白质和DNA含量。
结果表明，超滤后渗余物中的病毒回收率为88％，PBS透析过滤后的病毒回收率为67％。在用10mM Tris-CL，pH 9.0透析过滤后，渗余物级分中的病毒回收率为107％。UF渗余物的蛋白质含量为1.3mg/109pfu，DNA含量为20μg/109pfu。透析过滤后，DF渗余物的蛋白质含量降至0.6mg/109pfu(减少1.4倍)，DNA含量降至16μg/109pfu(减少0.8倍)。
表7：使用Centramate LV 300kdco过滤器UF/DF纯化的Nano实验9的病毒收获物
表8：使用Centramate LV 300kdco过滤器UF/DF纯化的Nano实验9的病毒收获物的蛋白质和DNA分析
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使用MidiKros中空纤维滤芯通过UF/DF进行病毒收获物的纯化。
Centramate LV使用平板膜过滤器。MidiKros过滤器是由孔隙率分别为500kdco和750kdco的中空纤维组装而成的滤芯。用这些滤芯评估病毒收获物的UF/DF纯化，以确定过滤器几何形状和孔隙率增加的影响。将在-20℃下储存的来自Nano实验7的病毒收获物的等分试样解冻并用于UF/DF纯化。使用MidiKros 500kdco中空纤维过滤器将500mL病毒收获物浓缩至100mL的体积，然后用10个透析过滤体积的10mM Tris-Cl，pH 9.0进行透析过滤(CFF12)。通过VPA、蛋白质和DNA含量测试起始材料、UF和DF渗透物和渗余物级分样品的滴度。结果显示，UF后的病毒回收率为79％，DF后的病毒回收率为68％。在UF或DF过程中，在渗透物级分中均未检测到病毒。类似地，使用MidiKros 750kdco中空纤维过滤器通过UF/DF纯化500mL病毒收获物(CFF 13)。UF后的病毒回收率为66％，DF后的病毒回收率为43％。起始材料的蛋白质和DNA含量分别为5.1mg/109pfu和400μg/109pfu。UF/DF后，MidiKros 500kdco过滤器的渗余物的蛋白质和DNA含量分别为1.3mg/109pfu和90μg/109pfu(分别减少4.0倍和4.5倍)。UF/DF后，MidiKros 750kdco过滤器的渗余物的蛋白质和DNA含量分别为1.9mg/109pfu和63μg/109pfu(分别减少2.7倍和6.4倍)。
表9：使用MidiKros 500kdco中空纤维过滤器UF/DF纯化的Nano实验7的病毒收获物
1未检测到。
表10：使用MidiKros 750kdco中空纤维过滤器UF/DF纯化的Nano实验7的病毒收获物
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1未检测到。
表11：使用MidiKros 500 kdco和750 kdco中空纤维过滤器UF/DF纯化的Nano实验7的病毒收获物的蛋白质和DNA分析
通过使用MidiKros 750 kdco中空纤维过滤器进行UF/DF纯化的Nano实验10的病毒收获物
通过使用MidiKros 750 kdco中空纤维滤芯进行UF/DF来纯化来自Nano实验10的病毒收获物。通过超滤将3.5 L的病毒收获物浓缩至200 mL，然后对10个透析过滤体积的10mM Tris-Cl，pH 9.0进行透析过滤(每个200 mL)。通过VPA和蛋白质和DNA含量测试渗透物和渗余物级分样品的病毒滴度。UF浓缩后的病毒回收率为112％，透析过滤后的病毒回收率为97％。UF起始材料的蛋白质含量为4.0 mg/109 pfu，DNA含量为166μg/109 pfu。透析过滤后，渗余物为1.0 mg/109 pfu(比起始材料减少4倍)，DNA含量为15μg/109 pfu(比起始材料减少11.1倍)。
表12：通过使用MidiKros 750 kdco中空纤维过滤器进行UF/DF纯化的Nano实验10的病毒收获物
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1未检测到。
表13：通过使用MidiKros 750kdco中空纤维过滤器进行UF/DF纯化的Nano实验10的病毒收获物的蛋白质和DNA分析
通过使用MidiKros 500kdco中空纤维过滤器进行UF/DF纯化的Nano实验11的病毒收获物
通过使用MidiKros 500kdco中空纤维滤芯进行UF/DF来纯化来自Nano实验11的病毒收获物。通过超滤将2.5L的病毒收获物浓缩至200mL，然后用10个透析过滤体积的10mMTris-Cl，pH 9.0进行透析过滤(每个200mL)。通过VPA和蛋白质和DNA含量测试渗透物和渗余物级分样品的病毒滴度。UF浓缩后的病毒回收率为147％，透析过滤后的病毒回收率为105％。UF起始材料的蛋白质含量为5.1mg/109pfu，DNA含量为166μg/109pfu。超滤浓缩后，渗余物为1.1mg/109pfu(比起始材料减少4.9倍)，DNA含量为22μg/109pfu(比起始材料减少7.4倍)。透析过滤后，渗余物为1.4mg/109pfu(比起始材料减少3.8倍)，DNA含量为25μg/109pfu(比起始材料减少6.5倍)。
表14：通过使用MidiKros 500kdco中空纤维过滤器进行UF/DF纯化的Nano实验11的病毒收获物
1未检测到。
表15：通过使用MidiKros 500kdco中空纤维过滤器进行UF/DF纯化的Nano实验11的病毒收获物的蛋白质和DNA分析
通过使用MidiKros 500kdco中空纤维过滤器进行UF/DF纯化的Nano实验12的病毒收获物
通过加入500mL 10mM Tris-HCl、2mM MgCl2，pH 9.0解冻所冷冻的生物反应器，从Nano实验12中收获病毒。加入(Recombinant />Speed BioSystems,Inc.)至100U/mL，并在37℃搅拌培养60分钟。去除/>核酸酶消化培养基，用500mL含有1x TrypLE的PBS代替，并在37℃搅拌下进一步孵育60分钟。移除TrypLE收获培养基，并用500mL 10mM Tris-HCl，pH 9.0冲洗生物反应器两次，每次在37℃下搅拌10分钟。将TrypLE收获物和这两种冲洗体积合并作为病毒收获物(1.5L)。通过VPA进行的病毒滴度分析表明，TrypLE病毒收获级分含有80.1％的病毒，第一次10mM Tris-HCl冲洗含有16.3％的病毒，第二次冲洗含有2.4％的病毒。因此，98.8％的病毒从生物反应器中释放出来，并收集在病毒收获物中。/>核酸酶消化级分含有0.4％的病毒，收获后的大载体含有不到0.1％的病毒。
使用MidiKros 500kdco中空纤维滤芯通过UF/DF纯化病毒收获物。通过超滤将1.5L的病毒收获物浓缩至200mL，然后用10个透析过滤体积的10mM Tris-Cl，pH 9.0进行透析过滤(每个200mL)。通过VPA和蛋白质和DNA含量测试渗透物和渗余物级分样品的病毒滴度。UF浓缩后的病毒回收率为45％，透析过滤后的病毒回收率为123％。UF起始材料的蛋白质含量为4.3mg/109pfu，DNA含量为38μg/109pfu。超滤浓缩后，渗余物为4.0mg/109pfu(比起始材料减少1.1倍)，DNA含量为5μg/109pfu(比起始材料减少8.7倍)。透析过滤后，渗余物为1.6mg/109pfu(比起始材料减少2.7倍)，DNA含量为1μg/109pfu(比起始材料减少42倍)。
表16：通过使用MidiKros 500kdco中空纤维过滤器进行UF/DF纯化的Nano实验12的病毒收获物
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1未检测到。
表17：通过使用MidiKros 500kdco中空纤维过滤器进行UF/DF纯化的Nano实验12的病毒收获物的蛋白质和DNA分析
实施例6
与现有技术工艺的对比
通过本领域中采用的几种工艺产生病毒，并对结果进行了比较。一个工艺称为“CEF”工艺，是由从鸡蛋中获得、在悬浮培养中生长并感染病毒的原代细胞产生病毒。细胞通过离心进行收获，通过均化进行裂解，通过过滤进行纯化，然后进行两次蔗糖梯度离心，然后进行配制和填充/完成。
“工艺A”是在连续细胞系CV-1中产生病毒，该细胞系在滚瓶中生长(贴壁培养)，感染病毒，用胰蛋白酶将细胞从基质中解离，并通过离心收集。通过冷冻-解冻使细胞裂解，并通过亲和层析从总细胞裂解物中纯化病毒，然后通过离心浓缩，在制剂缓冲液中重悬并填充/完成。
“工艺B”是本文所述的工艺。CV-1细胞在固定床生物反应器中生长(贴壁培养)，感染病毒，排出培养基，并冷冻。用核酸酶，然后用胰蛋白酶处理生物反应器中裂解的贴壁细胞，以释放病毒，使细胞碎片粘附在生物反应器中的基质上。将病毒经过纯化、配制、超滤和透析过滤，并填充/完成。
下表提供了各种现有技术工艺和本文所述工艺(称为“工艺B”)的逐步比较。本文提供的工艺需要的步骤更少，而实现的病毒产率更高。
表18
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表19将即时工艺中裂解后的步骤与现有技术工艺A进行比较
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表20示出了即时工艺的较高产率
实施例7
通过本文所述的方法在生物反应器(例如，333m2 500生物反应器)中生产痘苗病毒的示例性大规模工艺。
表21：
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由于修改对本领域技术人员来说是显而易见的，因此本发明仅受所附权利要求的范围限制。

Claims (49)

1.一种用于产生病毒的方法，其包括：
a)在生物反应器中培养包含病毒的宿主细胞，其中所述生物反应器包含用于生长贴壁细胞的基质，其中：
所述基质是生物相容的，并且所述基质是捕获细胞的密度或所述基质是细胞粘附至其的基质，从而所述细胞被捕获在所述基质中和/或粘附至所述基质；并且
所述基质的密度使得所述细胞保持被捕获和/或所述基质是在细胞被裂解和处理以释放所述病毒的条件下细胞保持附着至其的基质，并且通过所述基质的加工培养基流足以使细胞生长；
b)处理捕获在所述基质中和/或粘附至所述基质的细胞以使其裂解并将所述病毒释放至所述生物反应器中的所述加工培养基中，其中裂解的细胞保持粘附至所述基质和/或被捕获在所述基质中；并且然后
c)在不进一步处理所述加工培养基以去除细胞或细胞碎片的情况下，并且仅在一个或两个步骤中，从所述加工培养基纯化所释放的病毒，其中：
一个步骤是超滤或透析过滤；并且两个步骤是超滤和透析过滤。
2.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是贴壁细胞。
3.权利要求1或2的方法，其中在纯化所述病毒之前收获所述生物反应器中的培养基；并且任选地储存所述培养基。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述病毒的纯化步骤c)在1天或更短时间内实现。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其基本上由步骤a)、b)和c)组成。
6.权利要求1至4中任一项的方法，其由步骤a)、b)和c)组成。
7.权利要求1至5中任一项的方法，其基本上由步骤a)、b)和c)组成，其中裂解步骤b)包括用蛋白酶和/或核酸酶处理以从所述捕获的细胞和/或贴壁细胞中释放病毒。
8.权利要求1至5中任一项的方法，其由步骤a)、b)和c)组成，其中裂解步骤b)包括用蛋白酶和/或核酸酶处理以从所述捕获的细胞和/或贴壁细胞中释放病毒。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述细胞是细胞系。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述细胞是作为细胞系的贴壁细胞。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述病毒是治疗性病毒。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述病毒是包膜病毒。
13.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述病毒选自新城疫病毒、细小病毒、痘苗病毒、粘液瘤病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、腺病毒、腺相关病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、辛德毕斯病毒和塞内卡谷病毒，以及它们的经修饰以含有编码异源基因产物的核酸的衍生物。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述病毒是溶瘤病毒。
15.权利要求14的方法，其中所述溶瘤病毒是痘苗病毒。
16.权利要求15的方法，其中溶瘤性痘苗病毒选自李斯特、西储(WR)、哥本哈根(Cop)、伯尔尼、巴黎、塔什干、天坛、惠氏(DRYVAX)、IHD-J、IHD-W、布莱顿、安卡拉、CVA382、JX-594、修饰的痘苗安卡拉(MVA)、大连I、LC16m8、LC16m0、LIVP、ACAM2000、WR 65-16、康诺特、纽约市卫生局(NYCBH)、EM-63和NYVAC株。
17.权利要求15的方法，其中所述痘苗病毒是李斯特株病毒。
18.权利要求17的方法，其中所述痘苗病毒是LIVP病毒或LIVP病毒的克隆株。
19.权利要求18的方法，其中所述病毒是命名为GLV-1h68的LIVP病毒。
20.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述病毒是含有编码异源基因产物的核酸的修饰的形式。
21.权利要求20的方法，其中所述异源基因产物是治疗性基因产物或报告基因产物。
22.权利要求1至21中任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物细胞是CV-1细胞。
24.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物细胞是Vero细胞。
25.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
26.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物细胞是人成纤维细胞。
27.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物细胞是人上皮细胞。
28.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物细胞是人内皮细胞。
29.权利要求1至28中任一项的方法，其中所述生物反应器含有贴壁细胞附着于其上的基质或表面。
30.权利要求29的方法，其中所述生物反应器中的基质含有非固定的附着表面。
31.权利要求30的方法，其中所述表面为悬浮的微载体珠、纤维或编织网。
32.权利要求29的方法，其中所述生物反应器含有固定的附着表面。
33.如权利要求32的方法，其中所述生物反应器是填充床生物反应器。
34.权利要求1至33中任一项的方法，其中裂解所述细胞并释放所述病毒包括将所述生物反应器暴露于冷冻/解冻。
35.权利要求1至33中任一项的方法，其中裂解所述细胞并释放所述病毒包括将所述细胞暴露于低渗介质。
36.权利要求1至33中任一项的方法，其中裂解所述细胞并释放所述病毒包括将所述细胞暴露于洗涤剂。
37.权利要求1至33中任一项的方法，其中裂解所述细胞并释放所述病毒包括将所述细胞暴露于酶。
38.权利要求37的方法，其中所述酶是蛋白酶。
39.权利要求37的方法，其中所述酶是核酸酶。
40.权利要求37的方法，其中裂解所述细胞并释放所述病毒包括将所述细胞依次或组合暴露于核酸酶和蛋白酶。
41.权利要求1至40中任一项的方法，其中超滤采用标称分子量截留在300至750千道尔顿之间或标称孔隙率在0.05至0.2μm之间的膜。
42.权利要求1至41中任一项的方法，其中超滤采用包含聚醚砜的膜。
43.权利要求1至42中任一项的方法，其中超滤采用扁平膜。
44.权利要求1至42中任一项的方法，其中超滤采用中空纤维膜。
45.权利要求1至44中任一项的方法，其中超滤以切向流模式进行。
46.权利要求1至44中任一项的方法，其中超滤以横向流模式进行。
47.权利要求1至46中任一项的方法，其中超滤后进行透析过滤。
48.权利要求1至47中任一项的方法，其中经加工的释放的病毒是具有生物学活性的。
49.权利要求1至48中任一项的方法，其中经加工的释放的病毒的回收率大于50％。
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