CN113913397A - 一种溶瘤病毒的纯化方法 - Google Patents

一种溶瘤病毒的纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113913397A
CN113913397A CN202111390344.4A CN202111390344A CN113913397A CN 113913397 A CN113913397 A CN 113913397A CN 202111390344 A CN202111390344 A CN 202111390344A CN 113913397 A CN113913397 A CN 113913397A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
oncolytic virus
purification
purifying
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111390344.4A
Other languages
English (en)
Inventor
赵星
何志旭
汪显耀
龙世棋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou Medical University
Original Assignee
Guizhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou Medical University filed Critical Guizhou Medical University
Priority to CN202111390344.4A priority Critical patent/CN113913397A/zh
Publication of CN113913397A publication Critical patent/CN113913397A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2531/00—Microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种溶瘤病毒的纯化方法，涉及病毒纯化技术领域。本发明采用微载体法培养后的细胞与溶瘤病毒液共培养，经细胞裂解，去除病毒外的核酸和蛋白质，纯化后的病毒可以保持较为完整的衣壳，从而保证了纯化产物具有较高的活力，也即具有较高的病毒滴度。该方法可以快速得到较高纯度的溶瘤病毒。本发明提供的纯化方法有助于促进溶瘤病毒更为广泛的临床治疗应用。

Description

一种溶瘤病毒的纯化方法
技术领域
本发明涉及病毒纯化技术领域，具体而言，涉及一种溶瘤病毒的纯化方法。
背景技术
由于生活环境和生活方式的变化，以及人口的老龄化、生存压力的增大等客观因素的影响，导致我国恶性肿瘤的发病率不断上升，成为第一位致死疾病。根据国家癌症中心统计的最新癌症报告显示，2014年全国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例，平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症。按发病例数排位，肺癌位居全国发病首位，每年发病约78.1万，其后依次为胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。而肺癌和乳腺癌分别位居男女性发病的首位。
目前，肿瘤的治疗主要以手术、放疗、化疗及药物治疗为主。其中，手术无法完全清除肿瘤组织，而放疗及化疗存在对人体伤害大的副作用。而抗癌药物尤其是进口抗癌药物的价格居高不下，对于普通家庭的癌症患者经济负担巨大。综上，肿瘤的总体缓解率和生存率尚未得到根本性的突破。
近年来，溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)治疗肿瘤的特殊机制和疗效引起了人们的普遍兴趣，成为临床医生和科学家关注的焦点。溶瘤病毒特指可以感染肿瘤细胞并致其死亡而对正常组织没有影响的非致病性病毒颗粒，它可通过在肿瘤细胞内大量复制增殖来溶破肿瘤细胞，也可通过产生继发性免疫反应杀伤肿瘤，而对正常细胞无破坏作用。溶瘤病毒中呼肠孤病毒(reovirus)比较特殊，野生型呼肠孤病毒即能发挥显著的溶瘤效应，这样能避免因为基因改造所带来的争议，使得它在溶瘤病毒的临床应用研究中一路领先。但是，如何快速得到纯度高、滴度高的病毒一直是制约呼肠孤病毒临床治疗的关键因素。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种溶瘤病毒的纯化方法以快速得到纯度高、滴度高的病毒，为临床的及时治疗提供方便。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种溶瘤病毒的纯化方法，其包括如下步骤：采用微载体法培养细胞，加入溶瘤病毒液培养后，将培养液进行细胞裂解处理，进行纯化。
发明人发现，采用微载体法培养后的细胞与溶瘤病毒原液共培养，经细胞裂解，去除核酸，纯化后可以快速得到较高活力的溶瘤病毒，溶瘤病毒保持较高的纯度。
发明人首次将微载体培养应用到溶瘤病毒扩增纯化方法中，经过微载体培养可以快速实现细胞的放大，且重现性好，劳动强度小，单位体积培养液的细胞产率高。
若采用细胞培养工厂，则需要较大的培养空间，且耗费的时间和人力较大。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述纯化为层析纯化或超速离心纯化。层析纯化是采用Capto core 700纯化柱进行柱层析；超速离心纯化是采用氯化铯密度梯度超速离心进行纯化。
发明人发现，经过柱层析后的产物可以去除大量的细胞碎片、核酸分子、培养基等杂质，柱层析有助于提升溶瘤病毒的纯度。此外柱层析可以保持溶瘤病毒的内衣壳蛋白和外壳蛋白的完整性，从而保证了纯化获得的溶瘤病毒具有较高的活力，也即具有较高的病毒滴度。
此外，也可以利用氯化铯密度梯度的介质进行超速离心实现溶瘤病毒的纯化。
层析纯化包括：将Capto core 700纯化柱连接至AKTA蛋白纯化系统上，使用乙醇和病毒稀释缓冲液进行柱平衡，上样层析。
优选地，收集出现第一个峰后的液体，待峰下降后并有平稳的趋势时停止收集。发明人发现：收集第一个峰后直至峰下降并趋于平稳趋势阶段的液体，制得的病毒纯度和滴度保持较高水平。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述纯化的方法包括将细胞裂解处理后的病毒液进行浓缩，浓缩完成后去除病毒外的核酸和蛋白质。通过浓缩以提高产物的纯度。
在一种实施方式中，上述浓缩是采用切向流超滤系统进行浓缩。进行浓缩时的切向速度为20-40mL/min，进液压力控制在2.5bar以内。可选的，设置浓缩时的切向速度为25-40mL/min，进液压力控制在0.5-2.5bar。浓缩至原体积的四十分之一至五十分之一。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述去除核酸是指将核酸酶与浓缩后的病毒液进行孵育处理。通过核酸酶酶切，以去除病毒液中残留的核酸分子，以便于后续的层析柱或超速离心实现核酸与病毒的分离，进而提高制得的病毒液的纯度。
优选地，孵育是在0-8℃下孵育6-18h。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述微载体法培养细胞包括如下步骤：
按照3.0×105-5.0×105个细胞/载体的细胞量将细胞添加至载体上，培养直至80％-90％的细胞附着在载体表面，然后扩大培养。
微载体可以是液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等，只要能满足细胞的贴附和悬浮培养均在本发明的保护范围之内。
微载体上特殊的几何设计和表面处理增强了液体混合和固定的效率，并可提供剪切力的保护以及在细胞培养期间进行营养物质的转移。
微载体的大小为每片5毫米×10毫米，孔径50–200μm，增大单位体积内表面积(S/F)对细胞的生长极为有利。
微载体培养细胞时，控制搅拌速率为4-6rpm/分钟。
在一种可选的实施方式中，扩大培养的培养条件是37-38℃，以5％-6％的CO2摇床培养。
在本发明应用较佳的实施方式中，待70-80％的细胞贴壁生长后，加入溶瘤病毒液进行培养。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述溶瘤病毒液的感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)为1-5。
优选地，加入溶瘤病毒原液进行培养的时间为20-40h。可选的，采用台盼蓝染色以确定细胞病变的数量，待细胞病变达到80％时候收集细胞悬液进行后续的裂解。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述溶瘤病毒为呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒或水疱性口炎病毒。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述微载体法培养的细胞为L929细胞。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述细胞裂解是通过反复冻融或与裂解缓冲液混合孵育实现的细胞裂解；
上述反复冻融是在30～40℃和-80℃～-70℃之间反复冻融；反复冻融的次数至少为2次。
在一种可选的实施方式中，上述反复冻融是在3次37℃和-80℃条件下的反复冻融。
上述裂解缓冲液由如下组分组成：含1％吐温-20的20mM Tris、0.25M NaCl和1mMMgCl2；孵育时间为20-30min。
可选的，经过细胞裂解后进行离心以去除细胞碎片，并收集上清液进行过滤以便于后续的浓缩纯化。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种溶瘤病毒的纯化方法，该方法采用微载体法培养后的细胞与溶瘤病毒液共培养，经细胞裂解，去除核酸，纯化后的病毒可以保持较为完整的衣壳，从而保证了纯化产物具有较高的活力，也即具有较高的病毒滴度。该方法可以快速得到较高纯度的溶瘤病毒。发明人将微载体培养应用到溶瘤病毒扩增纯化方法中，经过微载体培养可以快速实现细胞的放大，且重现性好，劳动强度小，单位体积培养液的细胞产率高。本发明提供的纯化方法有助于促进溶瘤病毒更为广泛的临床治疗应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为病毒纯化峰图；
图2为SDS-PAGE检测纯化产物的蛋白；
图3为L929细胞验证病毒活性实验结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
如下为所使用的培养基的组成：
完全细胞生长养液：含10％FBS的MEM。
实施例1
本实施例提供了一种reovirus的纯化方法，其包括如下步骤：
(1)微载体法大量培养L929细胞
本实施例中的微载体为聚酯纤维(尼龙)无纺布。将BioNOCTMⅡ微载体装在含PBS的50mL离心管中，121℃高压灭菌30分钟。然后无菌转移至50mL离心管中，按3×105个/载体的细胞量将L929细胞加至50mL离心管中的载体上，添加完全细胞生长养液以确保载体完全浸没。倾斜并缓慢旋转离心管2-3次，以使细胞与载体均匀混合。将盖拧松，直立置于37℃，5％的CO2培养箱中3小时。在第一个小时内每隔15分钟倾斜并缓慢旋转离心管2-3次，在接下来的2小时内，以30分钟的间隔倾斜并缓慢旋转离心管2-3次。孵育3小时后，将离心管放入生物安全柜中，轻轻混合培养液并吸取50μL培养液进行细胞计数。当达到90％附着率(即小于10％的细胞残留在培养液中)，用无菌钳将载体从离心管转移至含有18mL新鲜培养液的T75培养瓶中。将T75培养瓶置于37℃，5％CO2的2D摇床上，摇摆速率为4-6rpm/分钟。
每隔一天进行换液，待细胞长至80％后进行病毒扩增。
(2)病毒扩增
上述细胞贴壁率长至80％后，在培养瓶中加入MOI为5的reovirus，(购至美国模式菌种收集中心)，病毒液感染后30小时左右，待细胞病变达到80％时候(台盼蓝染色)收集细胞悬液。
收集细胞悬液进行3次37℃和-80℃的反复冻融，使细胞裂解；裂解得到的产物进行4℃200g离心10min以去除细胞碎片，上清液采用孔径为0.45um的针头滤器过滤后用做后续的病毒浓缩及纯化步骤。或置于-80°冰箱冻存。
在其他实施方式中，也可将上述细胞悬液用含1％吐温-20的20mM Tris+0.25MNaCl+1mM MgCl2(pH＝7.5)的缓冲液作为裂解缓冲液，孵育30min，裂解细胞使病毒释放到裂解缓冲液中。然后进行离心和过滤步骤。
(3)浓缩切向流系统对病毒液进行浓缩。
使用切向流超滤系统(Sartorius Vivaflow 50R型切向流超滤系统)对步骤(2)制备的病毒液进行浓缩，用超纯水冲洗管路，安装100kD的切向流超滤膜包，对步骤(2)所得病毒液进行过滤浓缩(切向速度在20mL/min，进液压力控制在2.5bar)。随后，向悬浮液中加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并重复TFF循环以去除浓缩病毒溶液中残留的可溶性蛋白质。合并浓缩液及洗脱液，从而获得切向流过滤滤液，获得的病毒液最终体积约为10mL(理论上病毒液可浓缩至原体积的1/50)左右。
(4)去除核酸污染
向浓缩后的病毒液加入终浓度为100U/mL的全能核酸酶，4℃过夜酶切，以去除病毒外的核酸。
(5)Capto core 700层析纯化
将Capto core 700纯化柱连接到AKTA蛋白纯化系统(GE Healthcare)上，以20％乙醇平衡后，更换病毒稀释缓冲液(VDB，virus dilution buffer)继续进行平衡。准备VDB(配制：5M NaCl30mL+1M MgCl 15mL+Tris pH7.4 10mL+三蒸水定容至1L，用0.45μm过滤器过滤)，上机操作：
I.开机，先用70％乙醇清洗通道，控制面板上看到有峰出现洗至峰平，设定流速(1mL/min)，使其形成通路；
II.用VDB清洗A泵后换柱子(HiTrap Capto Core 700，1×1mL)；
III.用注射器吸取2mL VDB至加样的地方进行清洗，然后用注射器吸取2mL病毒液分次上样(一般0.3mL/min，仪器不提示报警即可)；
IV.第一个峰出现后用15mL离心管接流出的液体，峰下降后并有平稳的趋势时停止接取；
V.用70％无水乙醇清洗通道，换回原来的柱子，然后用20％乙醇平衡后关机。
步骤IV接取的液体即为纯化后的呼肠孤病毒。
实施例2
与实施例1相比，区别仅在于，步骤(5)的纯化步骤，本实施例采用氯化铯超速离心纯化。
具体包括如下步骤：
通过两次CsCl梯度超离心来纯化浓缩的病毒液。首先，将7mL浓缩的病毒液缓慢加入到已制备的CsCl梯度溶液顶部(分别是2.5mL等体积的1.25g/mL和1.40g/mL的CsCl溶液)，100000×g，4℃离心1-1.5小时。回收梯度界面处的病毒条带，然后，通过等密度CsCl梯度进一步纯化回收的病毒。具体是将病毒液与1.5-2倍体积的1.33g/L的CsCl溶液混合，100000×g，4℃离心16-20小时。用20G针头从底部穿刺收集底部病毒至透析袋中(透析袋使用前用10mM的EDTA－Na2煮沸10min)。在透析缓冲液(20mM Tris，1mM MgCl2，pH7.5)中，4℃搅拌透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。
实施例3
本实施例与实施例1相比，区别仅在于，在步骤(1)中将5MOI呼肠孤病毒加入长成单层L929细胞，然后进行病毒扩增。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于，本实施例步骤(2)细胞悬液经过冻融裂解后，采用Vertrel XF(美国杜邦)超声处理，离心取水相，用做后续的病毒浓缩及纯化步骤。
实验例1
实施例1步骤(5)病毒纯化峰图结果参照图1所示，在出现第一个峰的时候开始收集。
本实验例将纯化后病毒采用SDS-PAGE进行活性和纯度验证，并采用TCID50法进行毒力验证。
收集到实施例1的纯化后的产物，以95℃变性10min，SDS-PAGE检测蛋白条带。参照图2所示，纯化后可以检测到病毒的关键元件内衣壳蛋白(σ2、λ1)和外衣壳蛋白(σ3、μ1C)，结果发现纯化后病毒关键元件蛋白均存在(图2所示)。图2中的裂解液组(Lysate)为病毒原液裂解组，而三氯乙烯组是病毒液裂解后加入三氯乙烯处理，离心萃取获得的产物。图2中1-5编号指代层析回收时峰图所对应的产物编号。
将纯化后的病毒以0.22μm微孔滤膜过滤除菌后接种L929细胞，验证病毒活性(图3所示)，对照图为没有加病毒的正常生长的L929细胞。病毒活性检测结果发现，纯化后得到的病毒具有使L929细胞病变的能力。纯化产物以100μL体系分装，-80℃保存。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用微载体法培养细胞，加入溶瘤病毒液培养后，将培养液进行细胞裂解处理，进行纯化。
2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述纯化为层析纯化或超速离心纯化；所述层析纯化是采用Capto core 700纯化柱进行柱层析；所述超速离心纯化是采用氯化铯密度梯度超速离心进行纯化；
优选地，将Capto core 700纯化柱连接至AKTA蛋白纯化系统上，使用乙醇和病毒稀释缓冲液进行柱平衡，上样层析；
优选地，收集出现第一个峰后的液体，待峰下降后并有平稳的趋势时停止收集。
3.根据权利要求1或2所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述纯化的方法包括将细胞裂解处理后的病毒液进行浓缩，浓缩完成后去除病毒外的核酸和蛋白质；
优选地，进行浓缩是采用切向流超滤系统进行浓缩；
优选地，进行浓缩时的切向速度为20-40mL/min，进液压力控制在2.5bar以内；
优选地，浓缩至原体积的四十分之一至五十分之一。
4.根据权利要求3所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述去除核酸是指将核酸酶与浓缩后的病毒液进行孵育处理；
优选地，所述孵育是在0-8℃下孵育6-18h。
5.根据权利要求1所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述微载体法培养细胞包括如下步骤：
按照3.0×105-5.0×105个细胞/载体的细胞量将所述细胞添加至载体上，培养直至80％-90％的细胞附着在载体表面，然后扩大培养；
优选地，所述扩大培养的培养条件是37-38℃，以5％-6％的CO2摇床培养。
6.根据权利要求5所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，待70-80％的细胞贴壁生长后，加入溶瘤病毒液进行培养。
7.根据权利要求6所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述溶瘤病毒液的感染复数为1-5；
优选地，加入溶瘤病毒原液进行培养的时间为20-40h。
8.根据权利要求6所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述溶瘤病毒为呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒或水疱性口炎病毒。
9.根据权利要求1所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述微载体法培养的细胞为L929细胞。
10.根据权利要求1所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述细胞裂解是通过反复冻融或与裂解缓冲液混合孵育实现的细胞裂解；
优选地，所述反复冻融是在30～40℃和-80℃～-70℃之间反复冻融；优选地，所述反复冻融是在3次37℃和-80℃条件下的反复冻融；
优选地，所述裂解缓冲液由如下组分组成：含1％吐温-20、20mM Tris、0.25M NaCl和1mM MgCl2；所述孵育时间为20-30min。
CN202111390344.4A 2021-11-23 2021-11-23 一种溶瘤病毒的纯化方法 Pending CN113913397A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111390344.4A CN113913397A (zh) 2021-11-23 2021-11-23 一种溶瘤病毒的纯化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111390344.4A CN113913397A (zh) 2021-11-23 2021-11-23 一种溶瘤病毒的纯化方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113913397A true CN113913397A (zh) 2022-01-11

Family

ID=79247668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111390344.4A Pending CN113913397A (zh) 2021-11-23 2021-11-23 一种溶瘤病毒的纯化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113913397A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101098959A (zh) * 2004-10-22 2008-01-02 昂科利蒂克斯生物科技公司 改进的病毒纯化方法
CN105483092A (zh) * 2015-10-10 2016-04-13 和元生物技术（上海）股份有限公司 一种中试化生产重组腺相关病毒的新技术
CN110241093A (zh) * 2019-06-17 2019-09-17 深圳源兴基因技术有限公司 一种重组痘病毒的纯化方法
CN111662883A (zh) * 2019-03-06 2020-09-15 惠君生物医药科技(杭州)有限公司 一种制备及纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101098959A (zh) * 2004-10-22 2008-01-02 昂科利蒂克斯生物科技公司 改进的病毒纯化方法
CN105483092A (zh) * 2015-10-10 2016-04-13 和元生物技术（上海）股份有限公司 一种中试化生产重组腺相关病毒的新技术
CN111662883A (zh) * 2019-03-06 2020-09-15 惠君生物医药科技(杭州)有限公司 一种制备及纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒
CN110241093A (zh) * 2019-06-17 2019-09-17 深圳源兴基因技术有限公司 一种重组痘病毒的纯化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KEVIN T. JAMES ET AL.: ""Novel High-throughput Approach for Purifiation of Infectious Virions"", 《SCIENTIFIC REPORTS》, vol. 6, pages 1 - 17 *
M. BUTLER ET AL.: ""Application of a Serum-Free Medium for the Growth of Vero Cells and the Production of Reovirus"", 《BIOTECHNOL. PROG. 》, vol. 16, pages 854 - 858, XP001080635, DOI: 10.1021/bp000110+ *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102257134B (zh) 使用离子交换和凝胶过滤色谱进行痘病毒纯化的方法
KR102015933B1 (ko) 백신 제조를 위한 바이러스의 세포 배양 증폭 시스템 및 방법
CN103732236A (zh) 用于生产痘苗病毒的方法和组合物
JP2009034115A5 (zh)
CN111920944B (zh) 一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法
JP2008067720A (ja) 細胞培養およびウイルス増殖のための方法
CN105012947A (zh) 狂犬病病毒的纯化方法
US10851350B1 (en) Bioreactor production of virus from adherent cells
CN107567496A (zh) 有关病毒的无菌纯化方法
CN107384877A (zh) 一种慢病毒的纯化方法
CN110241093A (zh) 一种重组痘病毒的纯化方法
CN104371982A (zh) 一种慢病毒的纯化方法
RU2099419C1 (ru) Способ выращивания вирусов
ES2341352T3 (es) Procedimiento para la preparacion de material virico.
CN113980916A (zh) 一种慢病毒的纯化方法
CN102180966B (zh) 一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法
US20210268405A1 (en) Method for producing recombinant adenovirus
CN112704733A (zh) 四价流感病毒鸡胚尿囊液纯化工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法
CN105669860B (zh) 一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法
CN115261341B (zh) 一种澄清溶瘤痘苗病毒收获液的方法
CN113913397A (zh) 一种溶瘤病毒的纯化方法
CN116656628A (zh) 一种痘病毒载体疫苗的制备方法
JP2022523462A (ja) 懸濁液中で細胞を培養するためのシステム及び方法
CN114106114B (zh) 利用离子交换层析纯化口蹄疫病毒抗原的方法
CN114645024B (zh) 降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及dna残留的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination