TW202216992A - 從細胞培養物中製備純化之桿狀病毒之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於上游及下游處理領域，且提供一種從細胞培養物中製備純化之桿狀病毒之方法，該純化之桿狀病毒較佳地為純化之溶瘤桿狀病毒且特定言之為水皰性口炎病毒，包括包含該桿狀病毒之醫藥組合物。

Description

從細胞培養物中製備純化之桿狀病毒之方法
本發明係關於上游及下游處理領域，且提供一種從細胞培養物中製造、製備及/或純化桿狀病毒之方法及製程，該桿狀病毒較佳地為溶瘤桿狀病毒且特定言之為水皰性口炎病毒，包括包含桿狀病毒之醫藥組合物。
溶瘤病毒之製造製程設計需要考慮最終原料藥及藥物產品之若干關鍵品質屬性。其中含有每體積高感染性病毒含量，以及產品相關及相關雜質之低接受水準。藥物產品中每體積之病毒含量可在每劑量10 9至10 12個感染性或基因體單元之範圍內，且在下游純化期間需要至少一個數量級之活性病毒濃度。典型的生物製劑之可接受雜質臨限值仍可適用作例如10奈克/劑量之宿主細胞DNA (WHO限值)，且當與所需之高產品含量組合時造成另一關鍵挑戰。兩種限制通常比用於醫藥用途之其他活性病毒產品(例如，病毒疫苗)中所發現的限制強若干數量級。因此，商業規模之製造程序需要出於此給定目的進行最佳化及新近研發。特定言之，需要用於從細胞培養物中製造、製備或純化桿狀病毒之改良方法。
舉例而言，WO2007/123961揭示一種從細胞培養物中分離純化之水皰性口炎病毒之純化製程。在此製程中，在澄清且過濾之後在陰離子交換膜吸附劑上裝載細胞培養物，且接著溶離病毒，隨後進行進一步純化及過濾步驟。
本發明藉由提供一種從細胞培養物中獲得純化之桿狀病毒(諸如水皰性口炎病毒)之方法及製程來解決以上需求。
應理解，與特定態樣相關之任何實施例亦可與亦與彼特定態樣相關之另一實施例組合，甚至在包含彼特定態樣之若干實施例的多個層級及組合中。
在第一態樣中，本發明係關於一種在細胞培養物中製備桿狀病毒之方法，其包含以下步驟： (i)        藉由以下從該細胞培養物中獲得桿狀病毒收穫物： a.    向該細胞培養物中直接添加病毒釋放劑，隨後較佳地經由深度過濾、切向流過濾或離心來澄清該細胞培養物，以及回收上清液中之該桿狀病毒收穫物， 或 b.    使該細胞培養物經受過濾步驟，較佳為深度過濾，隨後用病毒釋放劑沖洗過濾器，較佳為深度過濾器，以及回收該上清液中之該桿狀病毒收穫物。
在與第一態樣相關的一個實施例中，該桿狀病毒為水皰病毒，較佳為水皰性口炎病毒。在另一相關實施例中，該水皰性口炎病毒之醣蛋白G係經淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換。
在與第一態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，步驟(ia)中之該病毒釋放劑為固體鹽或鹽水溶液，且步驟(ib)中之該病毒釋放劑為鹽水溶液。在另一相關實施例中，在步驟(ia)中，該細胞培養物中之鹽濃度增加了至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或0.5 M，且步驟(ib)中之該鹽水溶液之濃度為至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或0.5 M。在另一相關實施例中，在步驟(ia)中，該細胞培養物中之鹽濃度增加，且在步驟(ib)中，該鹽水溶液之濃度為約0.01 M至約5 M、約0.05 M至約5 M、約0.1 M至約5 M、約0.15 M至約5 M、約0.2 M至約5 M、約0.25 M至約5 M、約0.3 M至約5 M、約0.35 M至約5 M、約0.4 M至約5 M、約0.45 M至約5 M、或約0.5 M至約5 M。
在與第一態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，該鹽為NaCl、KCl、MgCl 2、CaCl 2、NH 4Cl、硫酸銨、乙酸銨或碳酸氫銨。
在與第一態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，該病毒釋放劑為胺基酸，較佳為極性、酸性或鹼性胺基酸，更佳為精胺酸。
在與第一態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，該病毒釋放劑為硫酸化多醣，較佳為硫酸葡聚糖。
在與第一態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，在步驟(ia)中，藉由向該細胞培養物中添加該病毒釋放劑，使該細胞培養物之離子強度較佳地增加了至少大致0.01 M、或至少大致0.05 M、或至少大致0.1 M、或至少大致0.15 M、或至少大致0.2 M、或至少大致0.25 M、或至少大致0.3 M、或至少大致0.35 M、或至少大致0.4 M、或至少大致0.45 M、或至少大致0.5 M、或約0.01 M至約5 M、或約0.05 M至約5 M、或約0.1 M至約5 M、或約0.15 M至約5 M、或約0.2 M至約5 M；且在步驟(ib)中，用含病毒釋放劑之水溶液沖洗該過濾器，該水溶液之離子強度為至少大致0.01 M、或至少大致0.05 M、或至少大致0.1 M、或至少大致0.15 M、或至少大致0.2 M、或至少大致0.25 M、或至少大致0.3 M、或至少大致0.35 M、或至少大致0.4 M、或至少大致0.45 M、或至少大致0.5 M、或約0.01 M至約5 M、或約0.05 M至約5 M、或約0.1 M至約5 M、或約0.15 M至約5 M、或約0.2 M至約5 M。
在與第一態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，該桿狀病毒係在哺乳動物宿主細胞、較佳地HEK293細胞中製備。在另一相關實施例中，該哺乳動物宿主細胞係在懸浮液中培養。
在與第一態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，在細胞培養物中製備桿狀病毒之方法進一步包含以下步驟： (ii)      (視情況選用)較佳地藉由稀釋、透濾或透析來降低在步驟(ia)或(ib)之後獲得的收穫物之鹽濃度， (iii)    (視情況選用)用DNA降解核酸酶，較佳用苯甲酶或鹽活性核酸酶處理該桿狀病毒收穫物， (iv)     藉由在陽離子交換劑上裝載在步驟(i)至(iii)中之任一者之後獲得的溶液來捕獲該桿狀病毒， (v)       溶離該桿狀病毒且回收該溶離液， (vi)     (視情況選用)較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉步驟(vii)之該桿狀病毒溶離液， (vii)   (視情況選用)較佳地經由超濾及透濾或透析來交換經精煉桿狀病毒溶離液之緩衝液， (viii)  (視情況選用)無菌過濾桿狀病毒。
在一相關實施例中，該陽離子交換劑為單石(monolith)、樹脂或膜。在另一相關實施例中，該陽離子交換劑為單石吸附劑。
在與第一態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，將該桿狀病毒調配至醫藥組合物中。
在第二態樣中，本發明係關於一種從感染有桿狀病毒之細胞培養物中純化該桿狀病毒之方法，其包含以下步驟： (i)        藉由以下從該細胞培養物中獲得桿狀病毒收穫物： a.    向該細胞培養物中直接添加病毒釋放劑，隨後較佳地經由深度過濾、切向流過濾或離心來澄清該細胞培養物，以及回收上清液中之該桿狀病毒收穫物， 或 b.    使該細胞培養物經受過濾步驟，較佳為深度過濾，隨後用病毒釋放劑沖洗過濾器，較佳為深度過濾器，以及回收該上清液中之該桿狀病毒收穫物。
在與第二態樣相關的一個實施例中，該桿狀病毒為水皰病毒，較佳為水皰性口炎病毒。在另一相關實施例中，該水皰性口炎病毒之醣蛋白G係經淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換。
在與第二態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，步驟(ia)中之該病毒釋放劑為固體鹽或鹽水溶液，且步驟(ib)中之該病毒釋放劑為鹽水溶液。在另一相關實施例中，在步驟(ia)中，該細胞培養物中之鹽濃度增加了至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或0.5 M，且步驟(ib)中之該鹽水溶液之濃度為至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或0.5 M。在另一相關實施例中，在步驟(ia)中，該細胞培養物中之鹽濃度增加，且在步驟(ib)中，該鹽水溶液之濃度為約0.01 M至約5 M、約0.05 M至約5 M、約0.1 M至約5 M、約0.15 M至約5 M、約0.2 M至約5 M、約0.25 M至約5 M、約0.3 M至約5 M、約0.35 M至約5 M、約0.4 M至約5 M、約0.45 M至約5 M、或約0.5 M至約5 M。
在與第二態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，該鹽為NaCl、KCl、MgCl 2、CaCl 2、NH 4Cl、硫酸銨、乙酸銨或碳酸氫銨。
在與第二態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，該病毒釋放劑為胺基酸，較佳為極性、酸性或鹼性胺基酸，更佳為精胺酸。
在與第二態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，該病毒釋放劑為硫酸化多醣，較佳為硫酸葡聚糖。
在與第二態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，其中在步驟(ia)中，藉由向該細胞培養物中添加該病毒釋放劑，使該細胞培養物之該離子強度較佳地增加了至少大致0.01 M、或至少大致0.05 M、或至少大致0.1 M、或至少大致0.15 M、或至少大致0.2 M、或至少大致0.25 M、或至少大致0.3 M、或至少大致0.35 M、或至少大致0.4 M、或至少大致0.45 M、或至少大致0.5 M、或約0.01 M至約5 M、或約0.05 M至約5 M、或約0.1 M至約5 M、或約0.15 M至約5 M、或約0.2 M至約5 M；且在步驟(ib)中，用含病毒釋放劑之水溶液沖洗該過濾器，該水溶液之離子強度為至少大致0.01 M、或至少大致0.05 M、或至少大致0.1 M、或至少大致0.15 M、或至少大致0.2 M、或至少大致0.25 M、或至少大致0.3 M、或至少大致0.35 M、或至少大致0.4 M、或至少大致0.45 M、或至少大致0.5 M、或約0.01 M至約5 M、或約0.05 M至約5 M、或約0.1 M至約5 M、或約0.15 M至約5 M、或約0.2 M至約5 M。
在與第二態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，該桿狀病毒係在哺乳動物宿主細胞、較佳地HEK293細胞中製備。在另一相關實施例中，該哺乳動物宿主細胞係在懸浮液中培養。
在與第二態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，從感染有桿狀病毒之細胞培養物中純化該桿狀病毒之方法進一步包含以下步驟： (ii)      (視情況選用)較佳地藉由稀釋、透濾或透析來降低在步驟(ia)或(ib)之後獲得的收穫物之鹽濃度， (iii)    (視情況選用)用DNA降解核酸酶，較佳用苯甲酶或鹽活性核酸酶處理該桿狀病毒收穫物， (iv)     藉由在陽離子交換劑上裝載在步驟(i)至(iii)中之任一者之後獲得的溶液來捕獲該桿狀病毒， (v)       溶離該桿狀病毒且回收該溶離液， (vi)     (視情況選用)較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉步驟(vii)之該桿狀病毒溶離液， (vii)   (視情況選用)較佳地經由超濾及透濾或透析來交換經精煉桿狀病毒溶離液之緩衝液， (viii)  (視情況選用)無菌過濾桿狀病毒。
在一相關實施例中，該陽離子交換劑為單石、樹脂或膜。在另一相關實施例中，該陽離子交換劑為單石吸附劑。
在與第二態樣或其實施例中之任一者相關的一個實施例中，將該桿狀病毒調配至醫藥組合物中。
在第三態樣中，本發明係關於一種水皰性口炎病毒，其中該水皰性口炎病毒之醣蛋白G係經淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換、根據前述態樣或實施例中之任一者之方法製備或根據前述態樣或實施例中之任一者之方法純化。在與第三態樣相關的實施例中，根據前述態樣或實施例中之任一者之方法製備或根據前述態樣或實施例中之任一者之方法純化的水皰性口炎病毒之RNA基因體由與SEQ ID NO: 12至少98%、至少99%或100%一致的編碼序列組成。在與第三態樣或其實施例中之任一者相關的另一實施例中，如藉由TCID 50/mL所量測，感染性粒子之量為至少約1×10 9、2×10 9、3×10 9、4×10 9、5×10 9、6×10 9、7×10 9、8×10 9、9×10 9個或至少約1×10 10個。
在以下詳細描述中，闡述諸多特定細節以提供對本發明之充分理解。然而，一般熟習此項技術者將顯而易見，可在無此等特定細節中之一些的情況下實踐本發明技術。在其他情況下，並未詳細展示熟知結構及技術以免混淆本發明。僅為方便起見包括標題以輔助閱讀，且不應理解為將本發明限於特定態樣或實施例。
本發明人出人意料地發現，相較於熟習此項技術者已知之方法及製程，藉由遵循根據本發明之方法或製程，桿狀病毒從細胞培養物中之回收及/或純化得到顯著改良。本發明人已發現，藉由在開始收穫程序之前，向感染有桿狀病毒之細胞培養物中直接添加病毒釋放劑且特定言之鹽或硫酸鈉，極大地提高了可在後續步驟中從細胞培養物中回收的桿狀病毒之量。此外，藉由在陽離子交換劑上捕獲桿狀病毒進一步改良桿狀病毒之回收及/或純化。可例如藉由使用史丕曼-卡伯(Spearman-Kärber)方法或基於由qPCR測定之粗製上清液中之基因體複本/毫升測定每總TCID 50或TCID 50/mL中之感染性病毒濃度來定量經回收之桿狀病毒。
在最廣泛意義上，本發明提供一種製造桿狀病毒且特定言之水泡性口炎病毒的方法。在一個態樣中，執行根據本發明之方法或製程允許較佳地在cGMP條件下製造、製備及/或純化桿狀病毒，從而使得總感染性病毒或每體積感染性病毒之含量較高。在一相關態樣中，執行根據本發明之方法或製程允許足以用於商業目的製造、製備及/或純化桿狀病毒，亦即以滿足商業規模上的需求。根據此態樣，根據本發明之方法/製程較佳地利用細胞培養物執行，該細胞培養物之細胞培養物體積為至少2 L、5 L、10 L、20 L、30 L、40 L、50 L、60 L、70 L、80 L、90 L、100 L、110 L、120 L、130 L、140 L、150 L、160 L、170 L、180 L、190 L或至少200 L。進一步與此態樣相關，經回收之桿狀病毒之總量可至少大致在由TCID 50所量測的約10 8至10 14個感染性粒子之範圍內。特定言之，由TCID 50所量測的至少約10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13或10 14個感染性粒子。較佳地，感染性粒子之量為如由TCID 50所量測的至少約10 13個。進一步與此態樣相關，經回收之桿狀病毒之量可至少大致在由TCID 50/mL所量測的約10 8至10 11個感染性粒子之範圍內。特定言之，由TCID 50/mL所量測的至少約10 8、10 9、10 10或10 11個感染性粒子。較佳地，感染性粒子之量為如由TCID 50/mL所量測的至少約1×10 9、2×10 9、3×10 9、4×10 9、5×10 9、6×10 9、7×10 9、8×10 9或至少約9×10 9個。更佳地，感染性粒子之量為如由TCID 50/mL所量測的至少約10 10個。
在另一態樣中，執行根據本發明之方法或製程將使得宿主細胞DNA含量為宿主細胞DNA含量之＜10奈克/劑量、＜9奈克/劑量、＜8奈克/劑量、＜7奈克/劑量、＜6奈克/劑量、＜5奈克/劑量、＜4奈克/劑量、＜3奈克/劑量、＜2奈克/劑量或＜1奈克/劑量，其中該劑量為1×10 11個總TCID 50病毒。較佳地，每劑量宿主細胞DNA含量為＜1奈克/劑量，其中該劑量為1×10 11個總TCID 50病毒。
在另一態樣中，執行根據本發明之方法或製程將使得宿主細胞蛋白質含量為宿主細胞蛋白質之＜10微克/劑量、＜9微克/劑量、＜8微克/劑量、＜7微克/劑量、＜6微克/劑量、＜5微克/劑量、＜4微克/劑量、＜3微克/劑量、＜2微克/劑量或＜1微克/劑量，其中該劑量為1×10 11個總TCID 50病毒。較佳地，每劑量宿主細胞蛋白質含量為＜1微克/劑量，其中該劑量為1×10 11個總TCID 50病毒。
在另一態樣中，如根據總TCID 50所量測，執行根據本發明之方法或製程將使得感染效價之原料藥產量為至少1 × 10 12TCID 50、2 × 10 12TCID 50、3 × 10 12TCID 50、4 × 10 12TCID 50、5 × 10 12TCID 50、6 × 10 12TCID 50、7 × 10 12TCID 50、8 × 10 12TCID 50、9 × 10 12TCID 50、1 × 10 13TCID 50、1.5 × 10 13TCID 50、2 × 10 13TCID 50、2.5 × 10 13TCID 50、3 × 10 13TCID 50或3.5 × 10 13TCID 50。較佳地，在200 L上游規模下執行根據本發明之方法或製程將產生至少1×10 13TCID 50之感染效價之原料藥產量，如根據TCID 50所量測。
在第一步驟中，宿主細胞感染有桿狀病毒，較佳地感染有水皰性口炎病毒。宿主細胞之感染係藉由熟習此項技術者常規可用之技術進行且通常包括以某一感染倍率用桿狀病毒種子接種細胞培養物。較佳地，感染係在1.0至2.0 × 10 6個細胞/毫升範圍內之活細胞密度下進行。接著將細胞培養物培養一段時間以允許足夠的桿狀病毒複製，亦即在允許複製桿狀病毒之條件下。允許複製桿狀病毒之確切條件係由熟習此項技術者根據特定宿主細胞株來選擇。較佳地，使用主種子病毒(Master Seed Virus)以例如0.0005之低感染倍率(或每10,000個細胞5個感染性粒子)來感染細胞。因此，熟習此項技術者應理解，在第一步驟中根據本發明之方法將包含用桿狀病毒感染適合的宿主細胞且在允許複製桿狀病毒之條件下培養所感染之宿主細胞。
宿主細胞可具有任何來源且可以經分離細胞形式或以包含於細胞群體中之細胞形式存在。較佳地，製備桿狀病毒之宿主細胞為哺乳動物細胞。替代地，宿主細胞可為人類細胞、猴細胞、小鼠細胞或倉鼠細胞。熟習此項技術者知道適用於測試給定細胞是否製備病毒且因此特定宿主細胞是否可用於本發明之範疇內的方法。在此態樣中，由宿主細胞製備的病毒之量不受特定限制。在沒有進一步下游處理的情況下，在感染之後，給定細胞培養物之粗製上清液中之較佳病毒效價為≥1 × 10 7個TCID 50/ml或≥1 × 10 8個基因體複本/毫升。
在一個實施例中，哺乳動物細胞為多能成人祖細胞(MAPC)、神經幹細胞(NSC)、間充質幹細胞(MSC)、HeLa細胞、HEK細胞、任何HEK293細胞(例如，HEK293F或HEK293T)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、幼倉鼠腎(BHK)細胞或Vero細胞或骨髓衍生之腫瘤浸潤細胞(BM-TIC)。較佳地，例如若宿主細胞尚未在懸浮液中自然生長，則通過使宿主細胞適應在懸浮液中生長而在懸浮液中培養宿主細胞。在一較佳實施例中，宿主細胞為源自人胚腎(HEK) 293細胞株之HEK293F或HEK293T細胞。較佳地，在無動物組分及化學成分確定之條件下在攪拌槽或波生物反應器系統內以懸浮分批模式培養HEK293F/HEK293T細胞。
本發明含義中之宿主細胞包括用於從不可複製型載體中製備桿狀病毒的經典封裝細胞以及用於從能夠複製之載體中製備桿狀病毒的生產細胞。封裝細胞通常包含一或多個用於表現在待封裝之各別載體中缺乏及/或為製備病毒所必需之必需基因的質體。此類細胞為可選擇適合於所要目的之適當細胞株的熟習此項技術者已知。
在一個實施例中，宿主細胞為HEK293細胞。如本文中所使用之術語「HEK293細胞或HEK293細胞株」係指源自人胚腎且最初在1973年藉由整合4 kbp包括染色體19處之E1A及E1B基因的腺病毒5 (ad5)基因體片段而永生化的黏附人類細胞株(Graham等人, J. Gen. Virol. (1977) 36: 59-72；Malm等人，Nature research, Scientific Reports(220) 10: 18996)。此細胞株例如可獲自ATCC及DSMZ (ATCC-CRL-1573; DSMZ No: ACC305; RRID:CVCL_0045)。特定言之，為實現生物反應器中之治療蛋白或病毒之大規模培養及生物生產，親本HEK293細胞株亦已適於在無血清培養基中高密度懸浮生長。此等包括但不限於工業上相關之懸浮細胞株HEK293-F、HEK293-H及FreeStyle HEK293-F細胞。FreeStyle HEK293-F細胞適於在FreeStyle TM293表現培養基中懸浮培養，且例如可獲自ThermoFisher (R79007；RRID:CVCL_D603)。HEK293-F及HEK293-H細胞係由來自HEK293細胞之純系選擇來製造，用於在無血清培養基(SFM)中快速生長、優良的轉染效率及高蛋白質表現量，且例如可獲自ThermoFisher (HEK293-F: 11625019, RRID:CVCL_6642；HEK293-H: 11631017, RRID:CVCL_6643)。HEK293-H菌株為變異體，其在補充血清之培養基中生長時在單層培養物中顯示較佳黏著性且易於用於斑塊檢定(plaque assay)及其他貼壁依賴性應用。HEK293-F及HEK293-H提供為適於Gibco® CD 293培養基。其他HEK293細胞株(不限於此)為例如HEK293.2sus (ATCC CRL-1573.3)、HEK293-SF-3F6 (ATCC CRL-12585；RRID:CVCL_4V94)、Expi293F (Thermofischer A14527/A14528/100044202 (cGMP儲備)；RRID:CVCL_D615)及HEK293-S (Ximbio 154155；RRID:CVCL_A784)。適於懸浮生長之HEK293細胞株亦可稱為「適應SFM的293細胞」。
對於HEK293細胞培養，細胞在化學成分確定之培養基中以依序分批模式接種物階段傳代，直至獲得足夠的細胞，以接種例如攪拌槽反應器。在用種子病毒接種之前，在攪拌槽中執行若干批次傳代，而溶解氧、pH及溫度從攪拌槽接種直至病毒收穫均得到控制。細胞質量累積期間之溫度可不同於在接種有種子病毒之後使用的溫度且通常為約37℃。在一較佳實施例中，溫度在感染之後從37℃轉變至32℃至36℃之範圍且更佳地轉變至34℃。
一般而言，根據本發明之方法或製程適用於製造、製備或純化任何桿狀病毒。在一較佳實施例中，根據本發明之方法或製程用於製造、製備或純化水皰病毒。尤其較佳的為水皰性口炎病毒之製造、製備或純化。
桿狀病毒家族包括18個屬及134個物種，具有大致10至16 kb之反義單股RNA基因體(Walke等人, ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhabdoviridae, Journal of General Virology, 99:447-448 (2018))。
桿狀病毒家族之成員之表徵特徵包括以下中之一或多者：子彈狀或桿狀粒子，長度為100至430 nm且直徑為45至100 nm，包含由基質層及脂質包膜包圍之螺旋核衣殼，其中一些桿狀病毒具有非包膜絲狀病毒；10.8至16.1 kb之反義單股RNA，其大部分未分段；基因體，其編碼至少5個編碼結構蛋白核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)及醣蛋白(G)之基因。
如本文中所使用，桿狀病毒可屬於以下之屬：硬膜炎病毒(almendravirus)、庫里歐病毒(curiovirus)、質型桿狀病毒(cytorhabdovirus)、雙角病毒(dichorhavirus)、暫時熱病毒(ephemerovirus)、哈帕病毒(Hapavirus)、萊達特病毒(ledantevirus)、狂犬病毒(lyssavirus)、諾拉桿狀病毒(novirhabdovirus)、核型桿狀病毒(nucleorhabdovirus)、佩桿狀病毒(perhabdovirus)、西格馬病毒(sigmavirus)、鯉春病毒(sprivivirus)、思瑞普病毒(sripuvirus)、蒂布魯病毒(tibrovirus)、土帕病毒(tupavirus)、巨脈病毒(varicosavirus)或水皰病毒。
在本文中所提及之屬內，桿狀病毒可屬於所列舉物種中之任一者。硬膜炎病毒屬包括：樹木硬膜炎病毒(arboretum almendravirus)、巴沙木硬膜炎病毒(balsa almendravirus)、庫特灣硬膜炎病毒(Coot Bay almendravirus)、普埃爾托阿爾門德拉斯硬膜炎病毒(Puerto Almendras almendravirus)、里約奇科硬膜炎病毒(Rio Chico almendravirus)；庫里歐病毒屬包括：庫里歐諾波里斯庫里歐病毒(curionopolis curiovirus)、伊里里庫里歐病毒(Iriri curiovirus)、伊塔卡尤納斯庫里歐病毒(Itacaiunas curiovirus)、羅尚博庫里歐病毒(Rochambeau curiovirus)；質型桿狀病毒包括：苜蓿矮小型桿狀病毒(Alfalfa dwarf cytorhabdovirus)、大麥黃色條紋花葉桿狀病毒(Barley yellow striate mosaic cytorhabdovirus)、花椰菜壞死黃色桿狀病毒(Broccoli necrotic yellows cytorhabdovirus)、疣狀結腸病相關桿狀病毒(Colocasia bobone disease-associated cytorhabdovirus)、羊茅葉條紋桿狀病毒(Festuca leaf streak cytorhabdovirus)、萵苣壞死黃色桿狀病毒(Lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus)、萵苣黃色斑點桿狀病毒(Lettuce yellow mottle cytorhabdovirus)、北方穀物花葉桿狀病毒(Northern cereal mosaic cytorhabdovirus)、苦苣菜桿狀病毒1 (Sonchus cytorhabdovirus 1)，草莓皺桿狀病毒(Strawberry crinkle cytorhabdovirus)、小麥美洲條紋花葉桿狀病毒(Wheat American striate mosaic cytorhabdovirus)；雙角病毒屬包括：咖啡環斑雙角病毒(Coffee ringspot dichorhavirus)、蘭花斑點雙角病毒(Orchid fleck dichorhavirus)；暫時熱病毒屬包括：阿德萊德河暫時熱病毒(Adelaide River ephemerovirus)、貝里瑪暫時熱病毒(Berrimah ephemerovirus)、牛發熱暫時熱病毒(Bovine fever ephemerovirus)、金伯利暫時熱病毒(Kimberley ephemerovirus)、庫爾平耶暫時熱病毒(Koolpinyah ephemerovirus)、科湯卡恩暫時熱病毒(Kotonkan ephemerovirus)、奧博第安暫時熱病毒(Obodhiang ephemerovirus)、雅塔暫時熱病毒(Yata ephemerovirus)；哈帕病毒屬包括：法蘭德斯哈帕病毒(Flanders hapavirus)、格雷洛奇哈帕病毒(Gray Lodge hapavirus)、哈特公園哈帕病毒(Hart Park hapavirus)、喬木卡卡哈帕病毒(Joinjakaka hapavirus)、卡梅斯哈帕病毒(Kamese hapavirus)、拉霍亞哈帕病毒(La Joya hapavirus)、蘭德幾亞哈帕病毒(Landjia hapavirus)、馬尼托巴哈帕病毒(Manitoba hapavirus)、馬可哈帕病毒(Marco hapavirus)、莫斯奎羅哈帕病毒(Mosqueiro hapavirus)、莫蘇里爾哈帕病毒(Mossuril hapavirus)、恩蓋恩加哈帕病毒(Ngaingan hapavirus)、奧德河哈帕病毒(Ord River hapavirus)、帕里克里克哈帕病毒(Parry Creek hapavirus)、旺加貝爾哈帕病毒(Wongabel hapavirus)；萊達特病毒屬包括：巴魯萊達特病毒(Barur ledantevirus)、菲基里尼萊達特病毒(Fikirini ledantevirus)、福岡萊達特病毒(Fukuoka ledantevirus)、卡尼亞瓦拉萊達特病毒(Kanyawara ledantevirus)、克恩峽谷萊達特病毒(Kern Canyon ledantevirus)、凱拉利巴萊達特病毒(Keuraliba ledantevirus)、科倫特萊達特病毒(Kolente ledantevirus)、庫馬西萊達特病毒(Kumasi ledantevirus)、丹特克萊達特病毒(Le Dantec ledantevirus)、埃爾貢山蝙蝠萊達特病毒(Mount Elgon bat ledantevirus)、西室萊達特病毒(Nishimuro ledantevirus)、恩科比遜萊達特病毒(Nkolbisson ledantevirus)、大分萊達特病毒(Oita ledantevirus)、武漢萊達特病毒(Wuhan ledantevirus)、永嘉萊達特病毒(Yongjia ledantevirus)；狂犬病毒屬包括：阿拉萬狂犬病毒(Aravan lyssavirus)、澳大利亞蝙蝠狂犬病毒(Australian bat lyssavirus)、波克羅蝙蝠狂犬病毒(Bokeloh bat lyssavirus)、杜文哈格狂犬病毒(Duvenhage lyssavirus)、歐洲蝙蝠1狂犬病毒(European bat 1 lyssavirus)、歐洲蝙蝠2狂犬病毒(European bat 2 lyssavirus)、甘諾魯瓦蝙蝠狂犬病毒(Gannoruwa bat lyssavirus)、伊科馬狂犬病毒(Ikoma lyssavirus)、伊爾庫特狂犬病毒(Irkut lyssavirus)、庫賈德狂犬病毒(Khujand lyssavirus)、拉各斯蝙蝠狂犬病毒(Lagos bat lyssavirus)、萊里達蝙蝠狂犬病毒(Lleida bat lyssavirus)、莫科拉狂犬病毒(Mokola lyssavirus)、狂犬病狂犬病毒(Rabies lyssavirus)、希莫尼蝙蝠狂犬病毒(Shimoni bat lyssavirus)、西高加索蝙蝠狂犬病毒(West Caucasian bat lyssavirus)；諾拉桿狀病毒屬包括：比目魚諾拉桿狀病毒(Hirame novirhabdovirus)、魚類諾拉桿狀病毒(Piscine novirhabdovirus)、鮭科魚諾拉桿狀病毒(Salmonid novirhabdovirus)、黑魚諾拉桿狀病毒(Snakehead novirhabdovirus)；核型桿狀病毒包括：曼陀羅黃脈核型桿狀病毒(Datura yellow vein nucleorhabdovirus)、茄斑駁矮小核型桿狀病毒(Eggplant mottled dwarf nucleorhabdovirus)、玉米細紋核型桿狀病毒(Maize fine streak nucleorhabdovirus)、玉米伊朗花葉核型桿狀病毒(Maize Iranian mosaic nucleorhabdovirus)、玉米花葉核型桿狀病毒(Maize mosaic nucleorhabdovirus)、馬鈴薯黃矮胞型桿狀病毒(Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus)、水稻黃萎核型桿狀病毒(Rice yellow stunt nucleorhabdovirus)、苦苣菜黃網核型桿狀病毒(Sonchus yellow net nucleorhabdovirus)、芥菜黃脈核型桿狀病毒(Sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus)、芋頭脈退綠核型桿狀病毒(Taro vein chlorosis nucleorhabdovirus)；佩桿狀病毒屬包括：鰻魚佩桿狀病毒(Anguillid perhabdovirus)、鱸魚佩桿狀病毒(Perch perhabdovirus)、海鱒魚佩桿狀病毒(Sea trout perhabdovirus)；西格馬病毒屬包括：親果蠅西格馬病毒(Drosophila affinis sigmavirus)、嗜鳳梨果蠅西格馬病毒(Drosophila ananassae sigmavirus)、伊米果蠅西格馬病毒(Drosophila immigrans sigmavirus)、黑腹果蠅西格馬病毒(Drosophila melanogaster sigmavirus)、暗果蠅西格馬病毒(Drosophila obscura sigmavirus)、三叉果蠅西格馬病毒(Drosophila tristis sigmavirus)、廄腐蠅西格馬病毒(Muscina stabulans sigmavirus)；鯉春病毒屬包括：鯉魚鯉春病毒(Carp sprivivirus)、梭子魚魚苗鯉春病毒(Pike fry sprivivirus)；思瑞普病毒屬包括：阿爾皮瓦爾思瑞普病毒(Almpiwar sripuvirus)、查可思瑞普病毒(Chaco sripuvirus)、尼亞哈思瑞普病毒(Niakha sripuvirus)、塞納馬杜雷拉思瑞普病毒(Sena Madureira sripuvirus)、斯里普爾思瑞普病毒(Sripur sripuvirus)；蒂布魯病毒屬包括：下剛果熱蒂布魯病毒(Bas-Congo tibrovirus)、比阿特麗斯山蒂布魯病毒(Beatrice Hill tibrovirus)、沿海平原蒂布魯病毒(Coastal Plains tibrovirus)、埃波馬1蒂布魯病毒(Ekpoma 1 tibrovirus)、埃波馬2蒂布魯病毒(Ekpoma 2 tibrovirus)、斯威特沃特分支蒂布魯病毒(Sweetwater Branch tibrovirus)、蒂布羅加根蒂布魯病毒(tibrogargan tibrovirus)；土帕病毒屬包括：達勒姆土帕病毒(Durham tupavirus)、克拉馬斯土帕病毒(Klamath tupavirus)、圖帕亞土帕病毒(Tupaia tupavirus)；巨脈病毒屬包括：萵苣巨脈相關巨脈病毒(Lettuce big-vein associated varicosavirus)；水皰病毒屬包括：阿拉戈斯水皰病毒(Alagoas vesiculovirus)、美國蝙蝠水皰病毒(American bat vesiculovirus)、卡拉加斯水皰病毒(Carajas vesiculovirus)、昌迪普拉水皰病毒(Chandipura vesiculovirus)、科卡爾水皰病毒(Cocal vesiculovirus)、印地安那水皰病毒(Indiana vesiculovirus)、伊斯法罕水皰病毒(Isfahan vesiculovirus)、尤羅娜水皰病毒(Jurona vesiculovirus)、馬爾佩斯泉水皰病毒(Malpais Spring vesiculovirus)、馬拉巴水皰病毒(Maraba vesiculovirus)、莫雷頓水皰病毒(Morreton vesiculovirus)、新澤西州水皰病毒(New Jersey vesiculovirus)、佩里內水皰病毒(Perinet vesiculovirus)、皮理水皰病毒(Piry vesiculovirus)、拉迪水皰病毒(Radi vesiculovirus)、於格博格達諾瓦茨水皰病毒(Yug Bogdanovac vesiculovirus)或穆薩病毒(Moussa virus)。
較佳地，根據本發明之方法或製程製造、製備或純化之桿狀病毒為溶瘤桿狀病毒。就此而言，溶瘤具有此項技術中已知之其常規含義且係指桿狀病毒感染及裂解(分解)癌細胞但不感染及裂解正常細胞(至任何顯著程度)的能力。較佳地，溶瘤桿狀病毒能夠在癌細胞內複製。可在熟習此項技術者已知之不同分析系統中測試溶瘤活性(例示性活體外分析由Muik等人, Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014描述)。應理解，溶瘤桿狀病毒可能僅感染及裂解特定類型之癌細胞。此外，溶瘤效果可視癌細胞之類型而變化。
在一較佳實施例中，桿狀病毒屬於水皰病毒屬。水皰病毒物種已主要藉由血清學手段聯合基因體之譜系學分析定義。諸如宿主範圍及傳輸機制之生物學特性亦用於區分屬內之病毒物種。因而，水皰病毒屬形成由根據完整L序列推斷之最大似然樹(Maximum Likelihood tree)充分支持的獨特單系群組。
水皰病毒屬內指派至不同物種之病毒可具有以下特性中之一或多者：A) L中最小胺基酸序列分異度為20%；B) N中最小胺基酸序列分異度為10%；C) G中最小胺基酸序列分異度為15%；D)可在血清學測試中進行區分；及E)佔據不同生態位，如藉由宿主及或節肢動物載體中之差異所證實。
較佳的為水皰性口炎病毒(VSV)。在一最佳實施例中，本發明之方法或製程用於製造、製備或純化水皰性口炎病毒，其中用淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、較佳菌株WE-HPI之醣蛋白GP置換水皰性口炎病毒之醣蛋白G。此VSV (具有LCMV之GP的重組體)例如描述於WO2010/040526中且命名為VSV-GP。
淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP可為GP1或GP2。亦包括來自不同LCMV菌株之醣蛋白。特定言之，LCMV-GP可來源於LCMV野生型或LCMV菌株LCMV-WE、LCMV-WE-HPI、LCMV-WE-HPlopt。在一較佳實施例中，編碼LCMV之醣蛋白GP的基因編碼具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的蛋白質，同時包含編碼如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列之醣蛋白GP的重組桿狀病毒之功能特性得以維持。
水皰性口炎病毒在其基因體中通常至少編碼水皰性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)及醣蛋白(G)。
在一較佳實施例中，水皰性口炎病毒在其基因體中至少編碼以下水皰性口炎病毒蛋白：核蛋白(N)，其包含如SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO:2至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之功能變體；磷蛋白(P)，其包含如SEQ ID NO:3中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO:3至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之功能變體；大蛋白(L)，其包含如SEQ ID NO:4中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO:4至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之功能變體；及基質蛋白(M)，其包含如SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO:5至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之功能變體。
熟習此項技術者應理解，可對水皰性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)或醣蛋白(G)序列進行修飾而不失去彼等蛋白質之基本功能。如本文中所使用之此類功能變體保留其基本功能或活性之全部或部分。舉例而言，蛋白質L為聚合酶且在病毒之轉錄及複製期間具有必需功能。其功能變體必須保留此能力之至少部分。保留基本功能性或活性之良好指示係仍能夠複製及感染腫瘤細胞之病毒(包括此等功能變體)之成功製備。可在熟習此項技術者已知之不同分析系統中測試病毒製備及腫瘤細胞中之感染及複製測試(一例示性活體外分析由Muik等人, Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014描述)。
在一較佳實施例中，水皰性口炎病毒在其基因體中至少編碼水皰性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)及醣蛋白(G)，其中大蛋白(L)包含具有SEQ ID NO:4之≥80%序列一致性的胺基酸序列。
在一較佳實施例中，水皰性口炎病毒在其基因體中至少編碼水皰性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)及醣蛋白(G)，其中核蛋白(N)包含具有SEQ ID NO:2之≥90%序列一致性的胺基酸序列。
在另一較佳實施例中，水皰性口炎病毒在其基因體中至少編碼水皰性口炎病毒核蛋白(N)、大蛋白(L)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)及醣蛋白(G)，其中大蛋白(L)包含具有SEQ ID NO: 4之等於或大於80%序列一致性的胺基酸序列，且核蛋白(N)包含具有SEQ ID NO:2之≥90%序列一致性的胺基酸序列。
在另一實施例中，用丹德農病毒(Dandenong virus) (DANDV)或莫佩亞(Mopeia) (MOPV)病毒之醣蛋白置換水皰性口炎病毒醣蛋白G。丹德農病毒(DANDV)為一種舊世界沙粒狀病毒。迄今為止，熟習此項技術者僅已知單一菌株，其包含醣蛋白且可經使用。水皰性口炎病毒中所包含之DANDV醣蛋白具有超過6個糖基化位點，特定言之7個糖基化位點。一例示性較佳醣蛋白為如可在Genbank編號EU136038下獲得的DANDV中所包含之醣蛋白。在一個實施例中，編碼DNADV之醣蛋白的基因編碼如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO:6之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，同時包含編碼如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之醣蛋白的水皰性口炎病毒之功能特性得以維持。莫佩亞病毒(MOPV)為一種舊世界沙粒狀病毒。熟習此項技術者已知若干菌株，其包含醣蛋白且可用作水皰性口炎病毒中所包含的醣蛋白之供體。水皰性口炎病毒中所包含之MOPV醣蛋白具有超過6個糖基化位點，特定言之7個糖基化位點。一例示性較佳醣蛋白為如可在Genbank編號AY772170下獲得的莫佩亞病毒中所包含之醣蛋白。在一個實施例中，編碼MOPV之醣蛋白的基因編碼如SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO:7之胺基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列，同時包含編碼如SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列之醣蛋白的水皰性口炎病毒之功能特性得以維持。
應理解，根據本發明之方法或製程製造、製備或純化之桿狀病毒且特定言之水皰性口炎病毒可在其基因體中編碼其他基因(重組桿狀病毒)。此等基因通常稱為貨物(cargo)且包含例如腫瘤抗原、趨化介素、細胞介素或其他免疫調節元件。與由桿狀病毒另外表現之貨物類型無關，可根據本發明之方法或製程製造、製備或純化此類表現貨物之桿狀病毒。因此，在一最佳實施例中，根據本發明之方法或製程製造、製備或純化水皰性口炎病毒，其中用淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換水皰性口炎病毒之醣蛋白G。在另一較佳實施例中，根據本發明之方法或製程製造、製備或純化水皰性口炎病毒，其中用淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換水皰性口炎病毒之醣蛋白G，且基因體編碼另一貨物，諸如腫瘤抗原、趨化介素、細胞介素或其他免疫調節元件。較佳地，貨物為CCL21或C端截斷CCL21蛋白質(具有全長CCL21之胺基酸1至79)，其特徵為CCL21蛋白質之延長c端中胺基酸之缺失及/或突變。藉由缺失及/或突變延長c端中之胺基酸，藉此減少與糖胺聚醣(如肝素)之結合。在另一較佳實施例中，貨物為融合蛋白，其包含與IgG1之Fc端融合的CD80之胞外域，從而產生CD80Fc融合蛋白。在一最佳實施例中，貨物為CD80胞外域Fc融合蛋白，其包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或由其組成。在另一較佳實施例中，貨物為CCL21蛋白，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或由其組成。然而，出於本發明方法或製程之目的，本發明人已發現，額外貨物並不影響方法或製程之性能且因此貨物之性質不應視為限制本發明之適用性。
編碼其他基因之桿狀病毒可根據熟習此項技術者已知之方法來製備且包括但不限於：(1)使用轉染至細胞中之cDNA，或(2)轉染至輔助細胞中之cDNA之組合，或(3)轉染至細胞中之cDNA，其進一步經輔助病毒/微型病毒感染，反式提供製備感染性或非感染性重組桿狀病毒所需之剩餘組分或活性。使用此等方法(例如，輔助病毒/微型病毒、輔助細胞株或僅cDNA轉染)中之任一者，所需之最少組分為含有用於以下之順式作用訊號的DNA分子：(1)藉由桿狀病毒N蛋白、P蛋白及L蛋白衣殼化基因體(或反基因體) RNA及(2)複製基因體或反基因體(複製中間體) RNA等效物。
複製元件或複製子為在5'及3'端最少含有桿狀病毒之前導序列及尾隨序列的RNA股。在基因體意義上，前導物位於3'端處且尾隨物位於5'端處。任何位於此兩個複製訊號之間的RNA繼而將經複製。前導區及尾隨區另外必須含有引發轉錄及複製所必需的用於藉由N蛋白衣殼化之目的及用於聚合酶結合的最小順式作用元件。為製造重組桿狀病毒，含有G基因之微型病毒將亦含有前導區、尾隨區及G基因，該G基因具有用於製備G蛋白mRNA之適當起始及終止訊號。若微型病毒進一步包含M基因，則必須亦存在用於製備M蛋白mRNA之適當起始及終止訊號。
對於任何含於重組桿狀病毒基因體內之基因，該基因將側接有將允許表現彼等基因且製備蛋白質產物之適當轉錄起始及終止訊號(Schnell等人, Journal of Virology, 第2318-2323頁, 1996)。為製備「非感染性」重組桿狀病毒，重組桿狀病毒必須具有最小複製子元件及N、P及L蛋白且其必須含有M基因。此製備源自細胞、但為非感染性粒子之病毒粒子。為製備「感染性」粒子，病毒粒子必須另外包含可諸如經由使用附接蛋白或受體配體介導病毒粒子結合及融合的蛋白質。桿狀病毒之天然受體配體為G蛋白。
可使用允許組裝重組桿狀病毒的任何細胞。一種製造感染性病毒粒子之方法包含感染有編碼T7 RNA聚合酶或其他適合噬菌體聚合酶(諸如T3或SP6聚合酶)之質體的適當細胞株。可接著用含有編碼G、N、P、L及M桿狀病毒蛋白之基因的個別cDNA轉染細胞。此等cDNA將提供用於構建重組桿狀病毒粒子之蛋白質。可藉由此項技術中已知之任何方法來轉染細胞。
亦將含有桿狀病毒基因體RNA等效物之「多順反子cDNA」轉染至細胞株中。若感染性重組桿狀病毒粒子意欲在感染細胞中裂解，則必須存在編碼N、P、M及L蛋白之基因以及任何異源核酸區段。若感染性重組桿狀病毒粒子並不意欲裂解，則編碼M蛋白之基因並不包括於多順反子DNA中。「多順反子cDNA」意指至少包含含有編碼N、P及L蛋白之基因之轉錄單元的cDNA。重組桿狀病毒多順反子DNA亦可含有編碼蛋白質變體或其多肽片段之基因或治療性核酸或蛋白質。替代地，可反式供應任何最初與首先製備之病毒粒子締合的蛋白質或其片段。
所考慮之多順反子cDNA可含有編碼蛋白質變體之基因、編碼報導子之基因、治療性核酸及/或N-P-L基因或N-P-L-M基因。生成重組桿狀病毒之第一步驟為表現作為來自cDNA之基因體或反基因體等效物之RNA。接著，該RNA由N蛋白封裝且接著由P/L蛋白複製。可回收由此製備之重組病毒。若G蛋白不存在於重組RNA基因體中，則其通常反式供應。若G蛋白及M蛋白二者皆不存在，則二者皆反式供應。對於製造「非感染性桿狀病毒」粒子，程序可與上文相同，除了轉染至細胞中之多順反子cDNA將僅含有桿狀病毒之N、P及L基因。非感染性桿狀病毒粒子之多順反子cDNA可另外含有編碼蛋白質之基因。
在轉染細胞培養物之後，通常在感染後一至三天之間收穫整個細胞培養物。有利地，根據本發明之方法/製程允許處理全細胞培養物以進行後續收穫步驟。
在第一替代方案中，根據本發明之方法或製程，藉由向細胞培養物中直接添加病毒釋放劑(諸如鹽或硫酸葡聚糖)從細胞培養物獲得桿狀病毒收穫物。已觀察到，儘管如藉由TCID 50所量測的病毒濃度或收穫物之粗製上清液中之每一基因體複本表明足以滿足需求之產量，在收穫之後，存在無法解釋之病毒濃度的大幅損失。假設此可歸因於病毒與細胞、碎片及/或其他細胞培養物組分之相互作用且彼等病毒接著在澄清步驟之後損失，例如深度過濾、離心或TFF。在不受理論束縛之情況下，進一步咸信已源自宿主細胞之病毒粒子可靜電受限於細胞表面。因此，藉由例如用病毒釋放劑增加細胞培養物之離子強度，病毒粒子可從細胞表面釋放。此假設藉由向細胞培養物中添加不同病毒釋放劑來進行測試。
就此而言，術語「病毒釋放劑(viral release agent)」或「病毒釋放劑(viral releasing agent)」係指較佳調配至溶液中之試劑，其在收穫之前施加至細胞培養物且藉此增加釋放至上清液中的病毒之量以進行後續收穫步驟(如藉由TCID 50所量測)。病毒釋放劑之效果及適用性可容易地藉由以下來量測：在收穫之前從細胞培養物獲取例如樣品，用病毒釋放劑處理樣品，且隨後離心經處理樣品且測定經處理樣品之上清液中病毒之量(如藉由TCID 50所量測)且將其與未經處理之樣品進行比較。較佳地，根據本發明之病毒釋放劑不會(永久地)使病毒失活或受損，不會干擾後續方法/製程步驟及/或可在後續方法/製程步驟期間容易地移除。另一態樣為製品成本：較佳的病毒釋放劑為具成本效益的且易於採購。在一個態樣中，相較於未經處理之細胞培養物，從用病毒釋放劑處理之細胞培養物獲得的病毒收穫物(如藉由TCID 50所量測)增加了至少大致5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。較佳地，相較於未經處理之收穫物，從用病毒釋放劑處理之收穫物回收的病毒之量(如藉由TCID 50所量測)增加了至少大致10倍，較佳至少大致25倍，較佳至少大致50倍，較佳至少大致75倍，且更佳至少大致100倍。
出於本發明之目的，實現所要效果所需之量及/或病毒釋放劑之適用性可藉由(i)在向細胞培養物中添加病毒釋放劑之後細胞培養物中離子強度之增加來表現，或可替代地藉由(ii)細胞培養物中病毒釋放劑濃度之增加來表現。對於替代方案(i)，應理解，出於本發明之目的，添加至細胞培養物中之病毒釋放劑將接著在細胞培養物中實現離子強度之適當增加。在此情形下，術語「離子強度之增加」係指在添加病毒釋放劑之後細胞培養物之離子強度之增加。對於替代方案(ii)，僅基於添加至細胞培養物中之特定病毒釋放劑來計算「病毒釋放劑濃度之增加」，且在細節上作必要修改後參考下文術語「增加鹽濃度」，該術語更詳細地描述了鹽作為病毒釋放劑之情況。
因此，在一個態樣中，病毒釋放劑為一種試劑，較佳地在溶液中，其能夠在將其添加至細胞培養物中之後增加細胞培養物之離子強度，諸如如本文中所描述之鹽、胺基酸或硫酸化多醣，且藉此促進病毒粒子之釋放。細胞培養物中離子強度之增加應為至少大致0.01 M或至少大致0.05 M。在另一實施例中，細胞培養物中離子強度之增加為約0.01 M至約1.5 M、或約0.05 M至約1.5 M、約0.1 M至約1.5 M、約0.15 M至約1.5 M、或約0.2 M至約1.5 M。在另一實施例中，細胞培養物中離子強度之增加為約0.01 M至約5 M、0.05 M至約5 M、約0.1 M至約5 M、約0.15 M至約5 M、或約0.2 M至約1.5 M。在一較佳實施例中，細胞培養物中離子強度之增加為至少大致0.1 M或更佳的至少大致0.2 M。視桿狀病毒之類型而定，可實現離子強度之甚至更高增加，只要桿狀病毒不永久地失活或受損即可。因此，細胞培養物中可實現高達約2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M或5 M的離子強度之增加。
已知溶液之離子強度為溶液中離子濃度之量度。離子化合物溶解於水中，解離成離子且產生溶液之離子強度，該離子強度是所存在之所有離子之濃度的函數：
Figure 02_image001
在此等式中，c為離子i之莫耳濃度(M，mol/L)，z為彼離子之電荷數，且對溶液中之所有離子n進行求和。對於氯化鈉，離子強度等於濃度，但對於鹽，諸如MgSO 4，離子強度高四倍，使得多價離子對離子強度有很大貢獻。此外，亦已知可如何調節(鹽)溶液(例如緩衝液)之所要離子強度；可視所存在之試劑(諸如鹽)之濃度及離子效能進行(鹽)溶液之離子強度之設定。此外，大量公開案及專利文獻存在於先前技術中，使得可在手冊、專論或類似物中查找離子強度之特定值或範圍。因此，熟習此項技術者能夠提供一種(鹽)溶液，其具有所需離子強度來實現細胞培養物中離子強度之所需增加。
較佳地，藉由向細胞培養物中添加病毒釋放劑，細胞培養物之離子強度增加了至少大致0.01 M、或至少大致0.05 M、至少大致0.1 M、或至少大致0.2 M、或至少大致0.25 M、或至少大致0.3 M、或至少大致0.35 M、或至少大致0.4 M、或至少大致0.45 M、或至少大致0.5 M、或約0.01 M至約1.5 M、或約0.05 M至約1.5 M、或約0.1 M至約1.5 M、或約0.15 M至約1.5 M、或約0.2 M至約1.5 M。在一些情況下，細胞培養物中可實現高達約2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M或5 M的離子強度之增加。應理解，前述下限及範圍中之任一者可與較高限值或範圍中之任一者組合。
應理解，術語「細胞培養物」包含宿主細胞、桿狀病毒及細胞培養基。病毒釋放劑且特定言之鹽或硫酸葡聚糖之體積及/或濃度主要視細胞培養物之體積及細胞培養物中待實現之最終濃度或離子強度而定。鹽可以固體鹽形式或以鹽水溶液形式添加至細胞培養物中。對於鹽溶液，在一些情況下，添加具有較小體積之高度濃縮的鹽溶液可為適當的，而在其他情況下，可能需要添加較大體積之具有較低鹽濃度的鹽溶液。鹽溶液可隨時間推移連續地添加或其可一次性全部添加至細胞培養物中。在一個實施例中，鹽溶液在4 M之儲備溶液內以1:20之稀釋度添加至培養物中，使得直接在收穫之前增加額外0.2 M NaCl之濃度。對於硫酸葡聚糖，添加具有較小體積之高度濃縮的硫酸葡聚糖溶液可同樣為適當的，而在其他情況下，可能需要添加較大體積之具有較低濃度的硫酸葡聚糖溶液。硫酸葡聚糖溶液可隨時間推移連續地添加或其可一次性全部添加至細胞培養物中。在一個實施例中，在收穫培養物之前直接添加硫酸葡聚糖溶液，使得細胞培養物中之濃度為100 µg/mL。然而，在一些情況下，可能需要向細胞培養物中添加具有更低或更高濃度之硫酸葡聚糖。
如先前所解釋，熟習此項技術者可容易地測定病毒釋放劑及所需濃度之效果及適用性。
明顯地，細胞培養物中之病毒釋放劑且特定言之鹽或硫酸葡聚糖有助於溶解可在培養期間形成的桿狀病毒之聚集體且亦支持從宿主細胞或宿主細胞膜釋放桿狀病毒。因此，藉由添加病毒釋放劑且特定言之鹽或硫酸葡聚糖，將更大量的可回收桿狀病毒釋放至上清液中或從可在後續步驟中捕獲及回收的細胞釋放。
應理解，其他硫酸化多醣，接著硫酸葡聚糖亦為較佳的。具有較高硫酸化程度之硫酸化多醣可為較佳的。硫酸化多醣可包括但不限於硫酸葡聚糖、多硫酸戊聚糖、褐藻糖膠及角叉菜膠(carrageenan)及其各別鹽。
亦觀察到，藉由使用精胺酸作為病毒釋放劑，可改良釋放於上清液中的桿狀病毒之量。因此，在一個實施例中，病毒釋放劑為含有精胺酸之溶液。較佳地，細胞培養物中之精胺酸濃度或細胞培養物中之離子強度藉由添加溶液增加了至少大致0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或至少大致0.5 M。亦考慮使用其他胺基酸及其各別鹽，且在一個態樣中，胺基酸及其各別鹽適用作病毒釋放劑，較佳為極性胺基酸，更佳為鹼性或酸性胺基酸。最佳的胺基酸包括但不限於天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、組胺酸、離胺酸或酪胺酸。較佳地，細胞培養物中之胺基酸濃度或細胞培養物中之離子強度藉由添加胺基酸增加了至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或至少大致0.5 M。
出於本發明之目的，重要的是，藉由向細胞培養物中添加鹽，實現了鹽濃度之增加。
在此情形下，術語「增加鹽濃度」始終係指添加至細胞培養物中之特定鹽及此特定鹽之濃度是否增加。
應理解，細胞培養物可能已在培養基中包含某一水準之鹽濃度。細胞培養物中可能已包含之鹽及添加至細胞培養物中以進行收穫之鹽可為相同的鹽或可為不同的鹽。若細胞培養物中之鹽及添加至細胞培養物中之鹽相同，則熟習此項技術者將瞭解，考慮到培養基中之現有鹽，必須製造充分濃縮之鹽或鹽溶液以實現鹽濃度之增加。舉例而言，為在已包含0.1 M之NaCl濃度(在細胞培養物中產生0.3 M之NaCl最終濃度)之細胞培養物中實現0.2 M NaCl之增加，考慮到培養基中之現有NaCl濃度，必須製造充分濃縮之NaCl鹽溶液。
另一方面，若細胞培養物不包含任何鹽或包含與待添加至細胞培養物中之鹽不同的鹽，則鹽濃度之增加將僅基於將添加至細胞培養物中之鹽。因此，在兩種此類情況(無鹽或不同鹽)中，鹽濃度之增加僅基於添加至細胞培養物中之特定鹽，亦即鹽濃度之增加將僅基於添加至細胞培養物中之特定鹽來計算。
細胞培養物中鹽濃度之增加應為至少大致0.01 M或至少大致0.05 M。在另一實施例中，細胞培養物中鹽濃度之增加為約0.01 M至約1.5 M、約0.05 M至約1.5 M、約0.1 M至約1.5 M、約0.15 M至約1.5 M、或約0.2 M至約1.5 M。
在一較佳實施例中，細胞培養物中鹽濃度之增加為至少大致0.1 M或更佳的至少大致0.2 M。在對桿狀病毒無任何不利影響之情況下，本發明人測試了高達1.5 M之濃度增加。視桿狀病毒之類型而定，可實現甚至更高的鹽濃度，只要桿狀病毒不因鹽濃度而永久地失活或受損即可。因此，細胞培養物中可實現高達約2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M或5 M的鹽濃度之增加。
適合的鹽包括有機鹽以及無機鹽。無機鹽根據本發明不受限制，可採用可溶於水溶液且不會永久地損壞細胞培養物及/或病毒的任何無機鹽。無機鹽例如選自由硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、鹵化物、硼酸鹽、矽酸鹽及類似物之鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽組成之群。若必須提供醫藥學上可接受之產物，則無機鹽以及有機鹽應選自本身已知之醫藥學上可接受之鹽的群。舉例而言，醫藥學上可接受之無機鹽係選自：鈉鹽，諸如鹵化鈉，較佳為氯化鈉、硫酸鈉、硼酸鈉；鈣鹽，諸如鹵化鈣，較佳為氯化鈣、硫酸鈣、硼酸鈣；鎂鹽，諸如鹵化鎂，較佳為氯化鎂、硫酸鎂、硼酸鎂；及其組合；以及其他醫藥學上可接受之無機鹽。
醫藥學上可接受之鹽之其他實例包括但不限於：鹼性殘基(諸如胺)之無機或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼金屬或有機鹽；及類似物。舉例而言，此類鹽包括來自以下之鹽：苯磺酸、苯甲酸、檸檬酸、乙磺酸、反丁烯二酸、龍膽酸、氫溴酸、氫氯酸、順丁烯二酸、蘋果酸、丙二酸、杏仁酸、甲磺酸、4-甲基-苯磺酸、磷酸、水楊酸、丁二酸、硫酸及酒石酸。可與來自氨、L-精胺酸、鈣、2,2'-亞胺雙乙醇、L-離胺酸、鎂、N-甲基-D-葡糖胺、鉀、鈉及參(羥甲基)-胺基甲烷之陽離子形成其他醫藥學上可接受之鹽。
較佳的鹽包括但不限於NaCl、KCl、MgCl 2、CaCl 2、NH 4Cl、硫酸銨、乙酸銨或碳酸氫銨。在一最佳實施例中，使用NaCl鹽溶液。鹽溶液可包含緩衝液且較佳為具有約5至約9、理想地約6.5至約8.5之pH的緩衝液。
應理解，在添加病毒釋放劑之後，細胞培養物之pH維持在保持細胞及/或更重要地病毒之完整性的範圍內，例如在約pH 5至9或更佳地約6.5至8.5之範圍內。此外，在一些情況下，視病毒釋放劑之性質而定，可能需要將pH調節至某一範圍以影響病毒釋放劑之電荷且藉此促進其作為病毒釋放劑之特性。
在將病毒釋放劑且特定言之鹽或硫酸葡聚糖添加至細胞培養物中以在細胞培養物中實現所要濃度或離子強度之後，未預見特定保持或培育時間。因此，在細胞培養物中已實現所要濃度或離子強度之後，將在下一步驟中進一步處理全細胞培養物。可能需要攪拌或移動細胞培養物以實現細胞培養物中病毒釋放劑之均勻分佈。歸因於添加病毒釋放劑且特定言之鹽或硫酸葡聚糖並將細胞培養物製造或移動至下一製程步驟的技術問題，固有地實現與病毒釋放劑一起的某一培育時間。在一些情況下，可能需要在添加病毒釋放劑之後培育細胞培養物持續某一時段。此培育時間可為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h、12 h、13 h、14 h、15 h、16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h或24 h。
根據本發明之方法或製程，使細胞培養物接著經受澄清步驟。由於桿狀病毒分泌至上清液中，此澄清步驟用於從含有桿狀病毒之上清液分離儘量多的微粒物質，亦即細胞及細胞碎片。熟習此項技術者可利用不同方法以從細胞培養上清液移除細胞，較佳地，澄清包括以下方法中之一或多者：深度過濾、切向流過濾及/或離心。在彼等澄清方法中之每一者中，上清液從細胞及細胞碎片分離且收集具有桿狀病毒之上清液以進行進一步處理。熟習此項技術者已知用於從上清液分離顆粒物質之其他方法可同樣應用於此澄清步驟中。在一較佳實施例中，細胞培養物經由微過濾藉由交叉流、更佳地藉由使用0.65 µm截斷中空纖維澄清。在另一較佳實施例中，經由深度過濾器澄清細胞培養物。在一些情況下，為防止可能的生物負荷污染，將0.45 µm/0.2 µm過濾串聯連接至深度過濾器。
在第二替代方案中，根據本發明之方法或製程，藉由首先經由過濾步驟、較佳為深度過濾澄清細胞培養物，隨後用病毒釋放劑、特定言之鹽水溶液或硫酸葡聚糖沖洗過濾器、較佳為深度過濾器而從細胞培養物獲得桿狀病毒收穫物。若使用鹽水溶液，則此鹽溶液具有至少大致0.01 M或0.05 M之濃度或離子強度，或約0.01 M至約1.5 M、或約0.05 M至約1.5 M之濃度或離子強度。接著回收上清液(或在此替代方案中，濾液)及沖洗溶液，兩者皆含有桿狀病毒收穫物。
因此，在此替代方案中，病毒釋放劑，特定言之鹽溶液或硫酸葡聚糖不直接添加至細胞培養物中，但細胞培養物首先經由過濾步驟、較佳為深度過濾澄清，且用病毒釋放劑(較佳為鹽溶液或硫酸葡聚糖)沖洗過濾器、較佳為深度過濾器。細胞及細胞碎片係藉由過濾器、較佳為深度過濾器保留，且病毒釋放劑主要支持從藉由過濾器、較佳為深度過濾器保留之細胞或細胞膜中釋放桿狀病毒。因此，在此替代方案中，添加病毒釋放劑之效果與第一替代方案相同，亦即釋放及收集可在後續步驟中捕獲及回收的更大量之可回收桿狀病毒。應理解，熟習此項技術者可選自將允許移除細胞及細胞碎片之一系列不同過濾器且將選擇適當過濾器。
此外，視桿狀病毒之類型而定，可施加甚至更高的例如鹽濃度，只要桿狀病毒不因鹽濃度而永久地失活或受損即可。適合的鹽包括有機鹽以及無機鹽。無機鹽根據本發明不受限制，可採用可溶於水溶液且不會干擾細胞培養物及/或病毒的任何無機鹽。無機鹽例如選自由硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、鹵化物、硼酸鹽、矽酸鹽及類似物之鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽組成之群。若必須提供醫藥學上可接受之產物，則無機鹽以及有機鹽應選自本身已知之醫藥學上可接受之鹽的群。舉例而言，醫藥學上可接受之無機鹽係選自：鈉鹽，諸如鹵化鈉，較佳為氯化鈉、硫酸鈉、硼酸鈉；鈣鹽，諸如鹵化鈣，較佳為氯化鈣、硫酸鈣、硼酸鈣；鎂鹽，諸如鹵化鎂，較佳為氯化鎂、硫酸鎂、硼酸鎂；及其組合；以及其他醫藥學上可接受之無機鹽。
較佳的鹽同樣包括但不限於NaCl、KCl、MgCl 2、CaCl 2、NH 4Cl、硫酸銨、乙酸銨或碳酸氫銨。在一最佳實施例中，使用NaCl鹽溶液。鹽溶液可包含緩衝液且較佳為具有約5至約9、理想地約6.5至約8.5之pH的緩衝液。對於硫酸葡聚糖，添加具有較小體積之高度濃縮的硫酸葡聚糖溶液可同樣為適當的，而在其他情況下，可能需要添加較大體積之具有較低濃度的硫酸葡聚糖溶液。如先前所解釋，熟習此項技術者可容易地測定所需濃度。
同樣地，在第二替代方案中，精胺酸可用作病毒釋放劑。因此，在一個實施例中，病毒釋放劑為含有精胺酸之溶液。較佳地，溶液之精胺酸濃度或溶液之離子強度為至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或至少大致0.5 M。亦考慮使用其他胺基酸及其各別鹽，且在一個態樣中，胺基酸適用作病毒釋放劑，較佳為極性胺基酸，更佳為鹼性或酸性胺基酸。最佳的胺基酸包括但不限於天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、組胺酸、離胺酸或酪胺酸。較佳地，溶液之胺基酸濃度或溶液之離子強度為至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或至少大致0.5 M。
在另一實施例中，第一替代方案及第二替代方案可經組合，亦即藉由向細胞培養物中直接添加病毒釋放劑且特定言之鹽或硫酸葡聚糖，隨後對細胞培養物進行深度過濾且接著用病毒釋放劑(較佳為鹽溶液或硫酸葡聚糖)沖洗深度過濾器而從細胞培養物中獲得桿狀病毒收穫物。
視情況，在一些情況下，可能有必要從所獲得之桿狀病毒收穫物減少或移除病毒釋放劑以不干擾後續方法/製程步驟或原料藥。舉例而言，有可能鹽濃度干擾後續捕獲步驟、DNA降解步驟，或若培育較長時段，則鹽濃度可使桿狀病毒受損或失活。減小鹽濃度可較佳地藉由稀釋、透濾及/或透析來實現。在彼等方法中之每一者中的任何情況下，鹽濃度減小且接著根據本發明之方法或製程進一步處理鹽濃度減小之桿狀病毒收穫物。可同樣應用熟習此項技術者已知的適合於減小桿狀病毒收穫物中之鹽濃度的其他方法。
進一步視情況，在一些情況下，可能需要用諸如苯甲酶之DNA降解核酸酶處理桿狀病毒收穫物。在一較佳實施例中，DNA降解核酸酶為鹽活性核酸酶，諸如SAN-HQ。
接著藉由將收穫物裝載於陽離子交換劑上使澄清步驟之後回收的桿狀病毒收穫物經受另一純化步驟。收穫物可緊接在澄清步驟之後裝載於陽離子交換劑上。在一些情況下，將所回收之收穫物儲存一段時間，例如隔夜，且接著次日施加至陽離子交換劑。在一個實施例中，陽離子交換劑之材料為單石、樹脂、纖維或膜。在一較佳實施例中，陽離子交換劑為單石吸附劑。發現，相較於例如陰離子交換，藉由使用陽離子交換劑捕獲桿狀病毒更加有效。較佳地，藉由單片陽離子交換層析以結合/溶離模式執行此捕獲及純化步驟。
在一個態樣中，前述純化步驟亦用於濃縮桿狀病毒收穫物之目的。就此而言，(所澄清)病毒收穫物(如藉由TCID 50/mL所量測)濃縮了至少大致5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。較佳地，病毒濃縮了(如藉由TCID 50/mL所量測)至少大致10倍、較佳地至少大致25倍、較佳地至少大致50倍、較佳地至少大致75倍且更佳地至少大致100倍。舉例而言，濃度為1×10 9TCID 50/mL之10 L病毒溶液之濃度乘以10將使得1 L病毒溶液具有1×10 10TCID 50/mL病毒之濃度。
選擇用於在陽離子交換劑上施加桿狀病毒收穫物之緩衝液一般為熟習此項技術者所熟知。選擇將引起桿狀病毒與陽離子交換劑之最大結合的條件。較佳地，收穫物在將其施加至陽離子交換劑之前用調節緩衝液稀釋。在一個實施例中，調節緩衝液包含Tris緩衝液，更佳地，調節緩衝液包含用HCl調節至pH 7.5的100 mM Tris緩衝液。較佳地，收穫物及調節緩衝液在施加至陽離子交換劑之前以至少1:1或至少1:2之比率稀釋。
接著從陽離子交換劑溶離所捕獲之桿狀病毒。通常藉由以線性升高的鹽濃度將溶離緩衝液施加至陽離子交換劑或藉由使用單一步驟溶離製程來進行溶離。在一較佳實施例中，溶離緩衝液進一步包含精胺酸。
接著收集且合併如此純化之溶離液。此桿狀病毒溶離液已經高度純化，但視桿狀病毒溶離液之預期進一步用途而定，可用桿狀病毒溶離液進行以下視情況選用之處理步驟中之一或多者：
(i)較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉桿狀病毒溶離液以進一步移除雜質。
在一較佳實施例中，精煉步驟係基於流通模式下的混合模式基於珠粒之尺寸排阻及陰離子交換層析(Capto TMCore)，例如其中排除限制約為700 kD。
(ii)桿狀病毒溶離液或經精煉桿狀病毒之緩衝液變化，較佳地經由超濾及透濾或透析。
在一較佳實施例中，使用超濾/透濾，隨後使用生物負荷過濾進行緩衝液交換，從而產生原料藥。
(iii)無菌過濾桿狀病毒。 醫藥組合物
為在治療中使用，將根據本發明之方法或製程製造、製備及/或純化之桿狀病毒調配至適於促進向動物或人類投與的醫藥組合物中。典型的調配物可藉由使桿狀病毒與生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑以水溶液或水性或非水性懸浮液形式混合來製造。載劑、賦形劑、調節劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下為無毒的。其包括緩衝液系統，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽及其他無機酸或有機酸及其鹽；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨、氯化苯甲烴銨、氯化苯索銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮或聚乙二醇(PEG)；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣、寡醣或多醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、糊精或葡聚糖；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)；及/或離子或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™ (聚山梨醇酯)、PLURONICS™或脂肪酸酯、脂肪酸醚或糖酯。賦形劑亦可具有調節釋放或調節吸收之功能。
在一個實施例中，將桿狀病毒調配至包含Tris、精胺酸及視情況選用之檸檬酸鹽的醫藥組合物中。較佳地以約1 mM至約100 mM之濃度使用Tris。較佳地以約1 mM至約100 mM之濃度使用精胺酸。檸檬酸鹽可以高達100 mM之濃度存在。較佳的調配物包含約50 mM Tris及50 mM精胺酸。
醫藥組合物可以液體、冷凍液體或以凍乾形式提供。冷凍液體可儲存在約0℃與約-85℃之間的溫度下，包括-70℃與-85℃之間的溫度及約-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、-20℃、-21℃、-22℃、-23℃、-24℃或約-25℃之溫度。
桿狀病毒或醫藥組合物無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之重組抗體之量、病症或治療之類型及如上文所論述之其他因素而定。此等一般以相同劑量且以如本文中所描述之投與途徑使用，或以約1至99%的本文中所描述之劑量，或以憑經驗/臨床上確定為適當之任何劑量及任何途徑使用。
為預防或治療疾病，桿狀病毒或醫藥組合物(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)之適當劑量將視待治療之疾病類型、桿狀病毒之類型、疾病之嚴重程度及病程、桿狀病毒係出於預防性抑或治療性目的投與、先前療法、患者之臨床病史及對桿狀病毒之反應及主治醫師之判斷而定。本發明之桿狀病毒或醫藥組合物適合一次性或經一連串治療投與至患者。
視疾病之類型及嚴重程度而定，藉由桿狀病毒之TCID 50量測的約10 8至10 13個感染性粒子可為用於投與至患者之初始候選劑量，無論例如藉由一或多次單獨投與抑或藉由連續輸注。對於歷經數日或更長時間之重複投與，視病狀而定，治療通常將持續直至出現疾病症狀之所要抑制為止。桿狀病毒之一種例示性劑量將在約10 8至10 13個由TCID 50量測之感染性粒子的範圍內。因此，可向患者投與約10 8、10 9、10 10、10 11、10 12或10 13個由TCID 50量測之感染性粒子之一或多種劑量(或其任何組合)。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如，使得患者接受約二至約二十或例如約六個劑量的重組桿狀病毒)。可投與初始較高負荷劑量，隨後可投與一或多種較低劑量，或反之亦然。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進展易於藉由習知技術及分析來監測。
視所涉及之特定疾病而定，可使用任何適合的活體外分析、基於細胞之分析、活體內分析及/或本身已知的動物模型或其任何組合來測試桿狀病毒之功效及包含其之組合物之功效。適合的分析及動物模型對熟習此項技術者將為清楚的，且例如包括以下實例中所用之分析及動物模型。
當然實際醫藥學上之有效量或治療劑量將視熟習此項技術者已知之因素而定，諸如患者年齡及體重、投與途徑及疾病之嚴重程度。在任何情況下，桿狀病毒將以允許基於患者之獨特病狀遞送醫藥學上有效量之劑量及方式投與。
替代地，視待治療之區域之大小、所用病毒效價、投與途徑及方法之所要效果而定，本發明之桿狀病毒或醫藥組合物可以約50 µl至約100 ml (包括該範圍內之所有數目)之體積遞送。
對於瘤內投與，體積較佳地在約50 µL與約5 mL之間，包括約100 µL、200 µL、300 µL、400 µL、500 µL、600 µL、700 µL、800 µL、900 µL、1000 µL、1100 µL、1200 µL、1300 µL、1400 µL、1500 µL、1600 µL、1700 µL、1800 µL、1900 µL、2000 µL、2500 µL、3000 µL、3500 µL、4000 µL或約4500 µL之體積。在一較佳實施例中，體積為約1000 µL。
對於全身性投與，例如藉由輸注桿狀病毒，體積可自然地更高。替代地，桿狀病毒之濃縮溶液可在輸注之前直接稀釋於較大體積之輸注溶液中。
特定言之，對於靜脈內投與，體積較佳地在1 mL與100 mL之間，包括約2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、10 mL、11 mL、12 mL、13 mL、14 mL、15 mL、16 mL、17 mL、18 mL、19 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL、45 mL、50 mL、55 mL、60 mL、70 mL、75 mL、80 mL、85 mL、90 mL、95 mL或約100 mL之體積。在一較佳實施例中，體積在約5 mL與15 mL之間，更佳地，體積為約6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、10 mL、11 mL、12 mL、13 mL或約14 mL。
較佳地，相同調配物用於瘤內投與及靜脈內投與。瘤內投與與靜脈內投與之間的劑量及/或體積比可為約1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或約1:20。舉例而言，1:1之劑量及/或體積比意謂瘤內以及靜脈內投與相同劑量及/或體積，而例如約1:20之劑量及/或體積比意謂比瘤內投與劑量及/或體積高二十倍的靜脈內投與劑量及/或體積。較佳地，瘤內投與與靜脈內投與之間的劑量及/或體積比為約1:9。
桿狀病毒之有效濃度理想地介於約10 8與10 14個載體基因體/毫升(vg/mL)之間的範圍內。感染性單位可如McLaughlin等人, J Virol.;62(6):1963-73 (1988)中所描述量測。較佳地，濃度為約1.5×10 9個至約1.5×10 13個，且更佳地為約1.5×10 9個至約1.5×10 11個。在一個實施例中，有效濃度為約1.5×10 9個。在另一實施例中，有效濃度為約1.5×10 10個。在另一實施例中，有效濃度為約1.5×10 11個。在又另一實施例中，有效濃度為約1.5×10 12個。在另一實施例中，有效濃度為約1.5×10 13個。在另一實施例中，有效濃度為約1.5×10 14個。可能需要使用最低有效濃度以便降低非所要效果之風險。可考慮所治療之個體(較佳為人類)之身體狀態、個體之年齡、癌症之特定類型及癌症(若有進展)發展之程度由主治醫師來選擇此等範圍內之另外其他劑量。
桿狀病毒之有效目標濃度可用TCID 50表示。TCID 50可例如藉由使用史丕曼-卡伯方法來測定。理想地，範圍包括1×10 8個/毫升與1×10 14個/毫升TCID 50之間的有效目標濃度。較佳地，有效目標濃度為約1×10 9個/毫升至約1×10 12個/毫升，且更佳為約1×10 9個/毫升至約1×10 11個/毫升。在一個實施例中，有效目標濃度為約1×10 10個/毫升。在一較佳實施例中，目標濃度為5×10 10個/毫升。在另一實施例中，有效目標濃度為約1.5×10 11個/毫升。在一個實施例中，有效目標濃度為約1×10 12個/毫升。在另一實施例中，有效目標濃度為約1.5×10 13個/毫升。
桿狀病毒之有效目標劑量亦可用TCID 50表示。理想地，範圍包括1×10 8與1×10 14TCID 50之間的目標劑量。較佳地，目標劑量為約1×10 9個至約1×10 13個，且更佳為約1×10 9個至約1×10 12個。在一個實施例中，有效濃度為約1×10 10個。在一較佳實施例中，有效濃度為約1×10 11個。在一個實施例中，有效濃度為約1×10 12個。在另一實施例中，有效濃度為約1×10 13個。
當然實際醫藥學上之有效量或治療劑量將視熟習此項技術者已知之因素而定，諸如患者年齡及體重、投與途徑及疾病之嚴重程度。在任何情況下，桿狀病毒將以允許基於患者之獨特病狀遞送醫藥學上有效量之劑量及方式投與。
一般而言，對於治療及/或緩解本文中所提及之疾病、病症及病狀且視待治療之特定疾病、病症或病狀、特定桿狀病毒之效能、特定投與途徑及特定醫藥調配物或組合物而定，桿狀病毒將通常例如一週兩次、每週一次或以每月一次劑量投與，但可顯著地變化，尤其視之前所提及之參數而定。因此，在一些情況下，使用小於上文給出之最小劑量可為足夠的，而在其他情況下可能必須超過上限。當投與較大量時，在一天內將其分成多個較小劑量可為可取的。
應理解，熟習此項技術者能夠在無不當負擔的情況下選擇及組合根據本發明之方法或製程內之不同替代方案。舉例而言，熟習此項技術者可按需要自由執行視情況選用之製程步驟且將其在不同設置中組合，諸如與不同宿主細胞、特定桿狀病毒或澄清細胞培養物之特定方法組合。在下文中，描述一些較佳實施例，然而，本發明之方法及製程不應視為受此等實施例限制。
在一個實施例中，根據本發明之方法或製程允許在細胞培養物中/從細胞培養物中製造、製備及/或純化水皰病毒，較佳為水皰性口炎病毒，更佳為水皰性口炎病毒，其中用淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換水皰性口炎病毒之醣蛋白G，且包含以下步驟： (i)        藉由以下從細胞培養物中獲得病毒收穫物： a.    向細胞培養物中直接添加病毒釋放劑，隨後較佳地經由深度過濾、切向流過濾或離心來澄清細胞培養物，以及回收上清液中之病毒收穫物， 或 b.    使細胞培養物經受過濾步驟，較佳為深度過濾，隨後用病毒釋放劑沖洗過濾器，較佳為深度過濾器，以及回收上清液中之病毒收穫物。
在另一實施例中，根據本發明之方法或製程允許在細胞培養物中/從細胞培養物中製造、製備及/或純化水皰病毒，較佳為水皰性口炎病毒，更佳為水皰性口炎病毒，其中用淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換水皰性口炎病毒之醣蛋白G，且包含以下步驟： (i)        藉由以下從細胞培養物中獲得病毒收穫物： a.    向細胞培養物中直接添加病毒釋放劑，其中病毒釋放劑為固體鹽或鹽水溶液，隨後較佳地經由深度過濾、切向流過濾或離心來澄清細胞培養物，以及回收上清液中之病毒收穫物， 或 b.    使細胞培養物經受過濾步驟，較佳為深度過濾，隨後用病毒釋放劑沖洗過濾器，較佳為深度過濾器，其中病毒釋放劑為鹽水溶液，以及回收上清液中之病毒收穫物。
在另一實施例中，根據本發明之方法或製程允許在細胞培養物中/從細胞培養物中製造、製備及/或純化水皰病毒，較佳為水皰性口炎病毒，更佳為水皰性口炎病毒，其中用淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換水皰性口炎病毒之醣蛋白G，且包含以下步驟： (i)        藉由以下從細胞培養物中獲得病毒收穫物： a.    向細胞培養物中直接添加病毒釋放劑，其中病毒釋放劑為固體鹽或鹽水溶液且細胞培養物中之鹽濃度增加，隨後較佳地經由深度過濾、切向流過濾或離心來澄清細胞培養物，以及回收上清液中之病毒收穫物， 或 b.    使細胞培養物經受過濾步驟，較佳為深度過濾，隨後用病毒釋放劑沖洗過濾器，較佳為深度過濾器，其中病毒釋放劑為鹽水溶液，以及回收上清液中之病毒收穫物。
在另一實施例中，根據本發明之方法或製程允許在細胞培養物中/從細胞培養物中製造、製備及/或純化水皰病毒，較佳為水皰性口炎病毒，更佳為水皰性口炎病毒，其中用淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換水皰性口炎病毒之醣蛋白G，且包含以下步驟： (i)        藉由以下從細胞培養物中獲得病毒收穫物： a.    向細胞培養物中直接添加病毒釋放劑，其中病毒釋放劑為固體鹽或鹽水溶液且細胞培養物中之鹽濃度增加了至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或0.5 M，隨後較佳地經由深度過濾、切向流過濾或離心來澄清細胞培養物，以及回收上清液中之病毒收穫物， 或 b.    使細胞培養物經受過濾步驟，較佳為深度過濾，隨後用病毒釋放劑沖洗過濾器，較佳為深度過濾器，其中病毒釋放劑為濃度為至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或0.5 M之鹽水溶液，以及回收上清液中之病毒收穫物。
在另一實施例中，根據本發明之方法或製程允許在細胞培養物中/從細胞培養物中製造、製備及/或純化水皰病毒，較佳為水皰性口炎病毒，更佳為水皰性口炎病毒，其中用淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換水皰性口炎病毒之醣蛋白G，且包含以下步驟： (i)        藉由以下從細胞培養物中獲得病毒收穫物： a.    向細胞培養物中直接添加病毒釋放劑，其中病毒釋放劑為固體鹽或鹽水溶液且細胞培養物中之鹽濃度增加了約0.01 M至約5 M、約0.05 M至約5 M、約0.1 M至約5 M、約0.15 M至約5 M、約0.2 M至約5 M、約0.25 M至約5 M、約0.3 M至約5 M、約0.35 M至約5 M、約0.4 M至約5 M、約0.45 M至約5 M、或約0.5 M至約5 M，隨後較佳地經由深度過濾、切向流過濾或離心來澄清細胞培養物，以及回收上清液中之病毒收穫物， 或 b.    使細胞培養物經受過濾步驟，較佳為深度過濾，隨後用病毒釋放劑沖洗過濾器，較佳為深度過濾器，其中病毒釋放劑為濃度為約0.01 M至約5 M、約0.05 M至約5 M、約0.1 M至約5 M、約0.15 M至約5 M、約0.2 M至約5 M、約0.25 M至約5 M、約0.3 M至約5 M、約0.35 M至約5 M、約0.4 M至約5 M、約0.45 M至約5 M、或約0.5 M至約5 M之鹽水溶液，以及回收上清液中之病毒收穫物。
在另一較佳實施例中，前述實施例中之任一者可進一步包含以下步驟： (ii)      (視情況選用)較佳地藉由稀釋、透濾或透析來降低在步驟(ia)或(ib)之後獲得的收穫物之鹽濃度， (iii)    (視情況選用)用DNA降解核酸酶，較佳用苯甲酶或鹽活性核酸酶處理該桿狀病毒收穫物， (iv)     藉由在陽離子交換劑，較佳為單石、樹脂或膜上裝載在步驟(i)至(iii)中之任一者之後獲得的溶液來捕獲該桿狀病毒， (v)       溶離該桿狀病毒且回收該溶離液， (vi)     (視情況選用)較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉步驟(vii)之該桿狀病毒溶離液， (vii)   (視情況選用)較佳地經由超濾及透濾或透析來交換經精煉桿狀病毒溶離液之緩衝液， (viii)  (視情況選用)無菌過濾桿狀病毒。
在另一相關實施例中，前述實施例中之任一者可進一步包含以下步驟： (ii)      (視情況選用)較佳地藉由稀釋、透濾或透析來降低在步驟(ia)或(ib)之後獲得的收穫物之鹽濃度， (iii)    用DNA降解核酸酶，較佳用苯甲酶或鹽活性核酸酶處理該桿狀病毒收穫物， (iv)     藉由在陽離子交換劑，較佳為單石、樹脂或膜上裝載在步驟(i)至(iii)中之任一者之後獲得的溶液來捕獲該桿狀病毒， (v)       溶離該桿狀病毒且回收該溶離液， (vi)     (視情況選用)較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉步驟(vii)之該桿狀病毒溶離液， (vii)   (視情況選用)較佳地經由超濾及透濾或透析來交換經精煉桿狀病毒溶離液之緩衝液， (viii)  (視情況選用)無菌過濾桿狀病毒。
在另一相關實施例中，前述實施例中之任一者可進一步包含以下步驟： (ii)      (視情況選用)較佳地藉由稀釋、透濾或透析來降低在步驟(ia)或(ib)之後獲得的收穫物之鹽濃度， (iii)    用DNA降解核酸酶，較佳用苯甲酶或鹽活性核酸酶處理該桿狀病毒收穫物， (iv)     藉由在陽離子交換劑，較佳為單石、樹脂或膜上裝載在步驟(i)至(iii)中之任一者之後獲得的溶液來捕獲該桿狀病毒， (v)       溶離該桿狀病毒且回收該溶離液， (vi)     較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉步驟(vii)之該桿狀病毒溶離液， (vii)   (視情況選用)較佳地經由超濾及透濾或透析來交換經精煉桿狀病毒溶離液之緩衝液， (viii)  (視情況選用)無菌過濾桿狀病毒。
在另一相關實施例中，前述實施例中之任一者可進一步包含以下步驟： (ii)      (視情況選用)較佳地藉由稀釋、透濾或透析來降低在步驟(ia)或(ib)之後獲得的收穫物之鹽濃度， (iii)    用DNA降解核酸酶，較佳用苯甲酶或鹽活性核酸酶處理該桿狀病毒收穫物， (iv)     藉由在陽離子交換劑，較佳為單石、樹脂或膜上裝載在步驟(i)至(iii)中之任一者之後獲得的溶液來捕獲該桿狀病毒， (v)       溶離該桿狀病毒且回收該溶離液， (vi)     較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉步驟(vii)之該桿狀病毒溶離液， (vii)   較佳地經由超濾及透濾或透析來交換經精煉桿狀病毒溶離液之緩衝液， (viii)  (視情況選用)無菌過濾桿狀病毒。
在另一相關實施例中，前述實施例中之任一者可進一步包含以下步驟： (ii)      (視情況選用)較佳地藉由稀釋、透濾或透析來降低在步驟(ia)或(ib)之後獲得的收穫物之鹽濃度， (iii)    用DNA降解核酸酶，較佳用苯甲酶或鹽活性核酸酶處理該桿狀病毒收穫物， (iv)     藉由在陽離子交換劑，較佳為單石、樹脂或膜上裝載在步驟(i)至(iii)中之任一者之後獲得的溶液來捕獲該桿狀病毒， (v)       溶離該桿狀病毒且回收該溶離液， (vi)     較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉步驟(vii)之該桿狀病毒溶離液， (vii)   較佳地經由超濾及透濾或透析來交換經精煉桿狀病毒溶離液之緩衝液， (viii)  無菌過濾桿狀病毒。
在另一相關實施例中，前述實施例中之任一者可進一步包含以下步驟： (ii)      較佳地藉由稀釋、透濾或透析來降低在步驟(ia)或(ib)之後獲得的收穫物之鹽濃度， (iii)    用DNA降解核酸酶，較佳用苯甲酶或鹽活性核酸酶處理該桿狀病毒收穫物， (iv)     藉由在陽離子交換劑，較佳為單石、樹脂或膜上裝載在步驟(i)至(iii)中之任一者之後獲得的溶液來捕獲該桿狀病毒， (v)       溶離該桿狀病毒且回收該溶離液， (vi)     較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉步驟(vii)之該桿狀病毒溶離液， (vii)   較佳地經由超濾及透濾或透析來交換經精煉桿狀病毒溶離液之緩衝液， (viii)  無菌過濾桿狀病毒。
進一步與前述特定實施例中之任一者相關，較佳地在細胞培養物中/從細胞培養物中製造、製備或純化水皰病毒，較佳為水皰性口炎病毒，更佳為水皰性口炎病毒，其中用淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換水皰性口炎病毒之醣蛋白G，該細胞培養物包含哺乳動物宿主細胞，較佳為在懸浮液中培養之哺乳動物宿主細胞且更佳為HEK293細胞。
在與前述特定實施例中之任一者相關之一較佳實施例中，水皰性口炎病毒之RNA基因體由與SEQ ID NO:12至少98%、至少99%或100%一致的編碼序列組成。 實例
實例 1 ： 原料藥上游製造製程
概述及分批定義
基於一個解凍之HEK293細胞小瓶(UPS01)，將細胞擴增且在較大搖瓶容量中培養(UPS02-UPS06)。在UPS06之後，接種第一個生物反應器(UPS07)，隨後將細胞培養且擴增至第二個種子生物反應器(UPS08)及最終製備生物反應器(UPS09)中。藉由在接種製備生物反應器後48 h或56 h感染細胞而以分批模式製備一批次含有原料藥之粗製收穫物(UPS10)。在感染時，培養溫度保持恆定(製程變體1，48 h)或從37.0℃轉變至34.0℃ (製程變體2，56 h)。用VSV-GP執行感染(其中用淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)或VSV-GP-貨物(亦即編碼另一轉基因，尤其截斷CCL21 (1-79)蛋白質或CD80-Fc融合蛋白之VSG-GP)之醣蛋白GP置換水皰性口炎病毒之醣蛋白G)。在下文中，所有製程均用VSV-GP以及不同VSV-GP-貨物變體(CCL21 (1-79)及CD80-Fc融合體)執行且為易於閱讀將用單一術語VSV-GP(-貨物)提及。在感染之後34±2 h進行收穫(UPS11)。隨後，使大致200 L之整個工作體積經受下游處理。
UPS01 - 細胞解凍
將來自一個主細胞庫(master cell bank；MCB)或工作細胞庫(working cell bank；WCB)小瓶之HEK293細胞在加熱塊中解凍且調節至培養基。在離心步驟之後，將所得細胞沈澱物再懸浮於培養基中且在125 mL搖瓶中培育。
UPS02-UPS06 - 搖瓶中進行之細胞擴增
將HEK293細胞在搖瓶中在五個轉種階段內繁殖。當達到接種標準時，開始下一階段。此處，下一較高搖瓶容量用於各新轉種階段。若超出最大培養體積，則丟棄剩餘細胞。對於UPS07，視需要/需求使用多達2000 mL搖瓶來涵蓋波混合生物反應器之接種標準。
UPS07 - (第一個種子)生物反應器中進行之細胞擴增(視情況選用)
最後一個搖瓶轉種(UPS06)用於接種第一個種子生物反應器以供以分批模式進行進一步細胞擴增。波生物反應器或攪拌槽反應器適用於細胞擴增。在接種之前及期間，藉由經由頂部空間向生物反應器中添加CO 2來控制pH值。在整個培養期間，存在具有空氣之頂部空間通氣。在級聯調節模式下使用先進控制器藉由吹氣及吹氧來控制溶解氧值。視UPS06結束時活細胞濃度而定，計算接種物體積以及必須添加之培養基體積。生物反應器填充有經計算之培養基體積。將培養基在不具有通氣及pH控制劑之生物反應器內調節至少2 h。僅在接種之前，開始通氣且使培養基保持在具有活性pH控制劑之生物反應器內。總調節時間不可超過24 h。一旦滿足接種生物反應器所需之條件，細胞懸浮液即經由泵送轉移至生物反應器中。若在接種期間未完全使用細胞懸浮液，則丟棄剩餘細胞。
UPS08 - 種子生物反應器中進行之細胞擴增
將50 L單次使用攪拌槽生物反應器用於培養。在接種之前及期間，藉由經由鼓泡器及頂部空間向生物反應器中添加CO 2來控制pH值。在接種之後，藉由鹼添加活化低側pH控制劑。
作為替代方案，使用玻璃生物反應器進行培養。在接種之前及期間，藉由經由鼓泡器及頂部空間向生物反應器中添加CO 2來控制pH值。在接種之後，藉由鹼添加活化低側pH控制劑。在整個培養期間，存在具有空氣之頂部空間通氣。DO百分比係藉由浸沒氧輸入來控制且藉由先進控制器來調節。
對於接種，測定波混合生物反應器中所含的細胞懸浮液之活細胞濃度。根據生物反應器中之所需細胞濃度，計算接種物體積以及必須添加之培養基體積。生物反應器填充有經計算之培養基體積。使培養基在不具有通氣及pH控制劑之種子生物反應器內調節至少2 h。在細胞接種時，開始通氣且使培養基保持在具有活性pH控制劑之種子生物反應器內。總調節時間不可超過24 h。一旦滿足接種生物反應器所需之條件，細胞懸浮液即經由泵送轉移至生物反應器中。若在接種期間未完全使用細胞懸浮液，則丟棄剩餘細胞。
消泡策略(視情況選用)：為防止在培養期間形成泡沫，可使用時間相依泵送曲線將消泡劑添加至培養物中，其恰好在接種之後開始。因此，每六小時將消泡劑直接投配至細胞懸浮液中且泵每次運行一秒。藉由製程控制系統記錄消泡劑之添加體積。
UPS09 - 製備生物反應器中進行之細胞擴增
將200 L單次使用攪拌槽生物反應器用於製備。在接種之前及期間，藉由經由鼓泡器及頂部空間添加CO 2來控制pH值。在接種之後，藉由鹼添加活化低側pH控制劑。在整個培養期間，存在具有空氣之頂部空間通氣。溶解氧百分比將藉由浸沒氧輸入來控制且藉由四種氣體混合模組使用先進控制器來調節。
對於接種，測定種子生物反應器中所含的細胞懸浮液之活細胞濃度。根據生物反應器中之所需細胞濃度，計算接種物體積以及必須添加之培養基體積。生物反應器填充有經計算之培養基體積。使培養基在不具有通氣及pH控制劑之製備生物反應器內調節至少2 h。僅在接種之前，開始通氣且使培養基保持在具有活性pH控制劑之種子生物反應器內。總調節時間不可超過24 h。一旦滿足接種生物反應器所需之條件，細胞懸浮液即經由泵送轉移至生物反應器中。若在接種期間未完全使用細胞懸浮液，則丟棄剩餘細胞。為防止在培養期間形成泡沫，可使用時間相依泵送曲線將消泡劑添加至培養物中，其恰好在接種之後開始。因此，每六小時將消泡劑直接投配至細胞懸浮液中且泵每次運行一秒。藉由製程控制系統記錄消泡劑之添加體積。
UPS10 - 病毒感染變體I
在製備生物反應器階段之細胞接種後48 h執行VSV-GP(-貨物)感染，從而使得在感染時活細胞濃度在1.0×10 6個細胞/毫升與2.0×10 6個細胞/毫升之間。在經調節細胞培養基中預稀釋病毒。在滿足感染製備生物反應器之標準之後，將對照細胞接種至兩個250 mL搖瓶中，其中細胞懸浮液獲自製備生物反應器。培育搖瓶直至收穫製備生物反應器且以與製備細胞相同之方式操控對照細胞。在感染時，製備生物反應器之培養溫度將在36.0℃至39.0℃之範圍內恆定。
UPS10 - 病毒感染變體II
在最終反應器階段之細胞接種後56 h執行VSV-GP(-貨物)感染，從而使得在感染時活細胞濃度在1.0×10 6個細胞/毫升與2.0×10 6個細胞/毫升之間。在經調節細胞培養基中預稀釋病毒。在滿足感染製備生物反應器之標準之後，將對照細胞接種至兩個250 mL搖瓶中，其中細胞懸浮液獲自製備生物反應器。培育搖瓶直至收穫製備生物反應器且以與製備細胞相同之方式操控對照細胞。在感染時，製備生物感測器之培養溫度從37.0℃轉變至34.0℃。在感染期間形成過多泡沫之情況下，可將消泡劑直接添加至生物反應器中以防止堵塞例如通氣導管。藉由製程控制系統記錄消泡劑之添加體積。
UPS11 - 收穫
在感染之後34±2 h進行收穫。藉由向經感染細胞培養液中添加4 M至5 M NaCl儲備溶液開始收穫程序，從而使得濃度增加大致0.2 M NaCl，隨後為在開始轉移及細胞分離之前的至少10 min至30 min培育期。除非另外陳述，否則在培養期間控制所有參數。在限定培育時間之後，使溫度、DO及pH控制劑失活。然後，轉移經感染細胞培養液以進行下游處理。
製程性能資料
用所描述製程製造之VSV-GP-CCL21 (1-79)收穫物之過程監測及分析型過程內控制之例示性結果概述如下。不同VSV-GP(-貨物)變體(無貨物，CCL21 (1-79)或CD80-Fc融合體)之間的製程性能為相當的。 ●    製備生物反應器中之最大細胞特異性生長速率為µ=0.7 d -1； ●    收穫時總細胞濃度為2-3 × 10 6個細胞/毫升，其中存活率＞90%； ●    最終細胞培養上清液中之感染性病毒含量為約2×10 9TCID 50/mL，細胞培養上清液中之病毒基因體含量為約3-3.5 × 10 10TCID 50/mL。
實例 2 ： 原料藥下游製造製程
概述及分批定義
VSV-GP-(貨物)之製造係基於一個分批製備。所有下游單元操作均在一個週期中進行而無任何分裂及合併步驟。藉由深度過濾或切向流微過濾，隨後藉由核酸酶消化步驟澄清經鹽處理之收穫物(UPS11)。在藉由整體陽離子交換層析純化之前以結合-溶離模式進一步稀釋經澄清收穫物(DPS03)。此時執行保持步驟，其中將中間物儲存隔夜。在第二下游製程日，藉由多模態層析以流通模式純化中間物(DPS04)。收集且藉由超濾/透濾步驟處理流通物(DPS05)。最終過濾及調配步驟(DPS06)產生單一批次，將其等分至細胞培養瓶中、封裝且冷凍於-80℃ (-86℃至-70℃)下。
收穫物變體I - 深度過濾
進行深度過濾步驟以澄清塊狀收穫物。因此，含有粗製收穫物之VSV-GP(-貨物)經由3M™ Zeta Plus™囊封系統深度過濾膠囊從STR® 200生物反應器中泵送至單次使用袋中。壓力最大值為0.9巴。在室溫下進行澄清。3M™ Zeta Plus™囊封系統深度過濾膠囊係藉由0.5M - NaOH消毒，以進行處置。
收穫物變體II - 切向流微過濾
進行切向流微過濾步驟以澄清塊狀收穫物。因此，將單次使用生物感測器連接至裝配有0.65 µm mPES中空纖維膜之微過濾模組，該膜具有41.5 cm之有效長度及0.75 mm之內纖維直徑。在恆定滯留液流動速率下執行過濾，其中剪切速率為2100 s -1且最大跨膜壓力為≤0.7巴。執行微過濾直至入口壓力增加至≥0.7巴。預期2至5公升濃縮細胞懸浮液保留在生物反應器容器中。將滲透液收集於500 L一次性袋中。將溫度及pH控制至37℃、pH 7.1，直至探針不再與收穫物接觸。
DPS02 - 酶消化
製程步驟DPS02為來自DPS01之濾液之酶消化，其藉由SAN-HQ (ArcticZymes®)核酸內切酶執行。在USP部門之層流內，使SAN-HQ核酸內切酶儲備溶液平衡至室溫且稀釋於單獨的單次使用袋中之緩衝液(50 mM Tris，pH 7.5)中。添加氯化鎂作為酶之輔因子。將消化緩衝液連續添加至中間物(經澄清收穫物)。將所得中間物混合＞10 min且在室溫下培育＞20 min。在核酸酶處理之後，用0.1 M Tris緩衝液將中間物1:2稀釋至經限定之pH值及導電值。酶消化步驟之目的為移除存在於懸浮液中之核酸(DNA及RNA)。
經澄清收穫水準下之生物負荷減少策略 - 變體I
為在收穫過程期間減少假定之生物負荷污染，使用0.45 µm/0.2 µm Sartopore® 2 MaxiCaps® Size 1 (過濾器串聯連接)進行生物負荷減少過濾。過濾器可串聯連接至深度過濾器或連接於微過濾系統之滲透埠處。若跨膜壓力為≥0.9巴，則改變過濾器。在過濾之後，從組件中移除0.45 µm / 0.2 µm Sartopore® 2 MaxiCaps® Size1過濾器且測試完整性。
經澄清收穫水準下之生物負荷減少策略 - 變體II
為在收穫過程期間減少假定之生物負荷污染，使用5 µm聚丙烯過濾器Kleenpak Nova 10" Profile II 0.5μm或0.45 µm/0.2 µm Sartopore® 2 MaxiCaps® Size 1進行生物負荷減少過濾。在核酸酶處理之後且在稀釋之後進行過濾。若跨膜壓力為≥0.9巴，則改變過濾器。在過濾之後，從組件移除過濾器且測試完整性。
DPS03 - 陽離子交換層析
製程步驟DPS03為在CIMmultusTM SO 3-單石上用陽離子交換層析執行之捕獲步驟。結合緩衝液含有50 mM Tris，pH 7.5，視情況補充有不同精胺酸濃度。以結合/溶離模式藉由步驟溶離執行層析。在室溫下執行VSV-GP(-貨物)純化。將溶離液收集在一個袋中。以5 CV/h或10 CV/h之流動速率進行裝載。以10 CV或50 CV及5 CV/h或10 CV/h之體積流洗滌單石。以120 CV/h或10 CV/h之流動速率進行溶離。將經收集溶離液儲存於2℃至8℃下隔夜。該步驟之目的為濃縮病毒及移除雜質(尤其殘餘宿主細胞DNA及宿主細胞蛋白質)。
DPS04 - 多模態尺寸排阻層析
製程步驟DPS04為在Äkta TM預備梯度上用ReadyToProcess™ Capto® Core 700執行之多模態層析製程步驟，其中床高20 cm且床體積為2.5 L。以流通模式執行層析。使用陽離子交換層析之溶離緩衝液調節樹脂。在精煉步驟之前，捕獲在室溫下培育至少30 min之溶離液。在室溫下且以42 cm/h之恆定速度進行VSV-GP(-貨物)精煉。將流通物收集在一個袋中。該步驟之目的為最終移除微量雜質(尤其核酸酶殘基，HCP)。
DPS05 - 超濾/透濾
藉由雙步驟透濾執行緩衝液交換步驟。此處，使用截止值為750 kD之超濾模組MiniKros®中空纖維模組(Repligen)。在第一步驟中，進行恆定體積透濾，由此中間物之初始體積以恆定交叉流速度對透濾緩衝液進行6×過濾，此產生3000 s -1之最大剪應力。在步驟2中，以恆定交叉流速度將透濾滯留物濃縮至限定滯留物體積，此產生3000 s -1之最大剪應力。將經濃縮中間物排出至5 L單次使用袋中。該步驟之目的為對透濾緩衝液進行基質交換。
DPS06 - 填充及冷凍
經由0.45 µm/0.2 µm過濾器(Sartopore® MidiCaps®)過濾透濾滯留物且將其收集於袋或瓶中作為懸浮液。最終主封裝材料無菌連接至藉由泵送填充之袋/瓶。接著，將瓶真空密封且封裝在塑膠箔中。此後，將懸浮液冷凍且儲存於-80℃下。0.2 µm過濾器之目的為最終生物負荷減少。冷凍程序允許原料藥懸浮液之儲存條件，直至進一步處理。
製程性能資料
表1及圖2至圖3中概述了VSV-GP(-貨物)收穫物至用所描述製程在任何製程步驟中使用變體I製造之原料藥的過程監控和分析過程內控制的例示性結果。雜質減少匹配溶瘤病毒藥物產品之高要求及標準。從上游到最終原料藥之雜質減少性能對應於宿主細胞蛋白質約3.5 (＜0.4µg/ml)及宿主細胞DNA約5.4(最終濃度＜3 ng/ml)之對數減少值，其遠低於生物製劑研發中一般雜質限制之典型限值(例如，根據W.H.O.指南，每劑量10 ng hcDNA)。即使對於最高要求，總產量亦允許充分高度濃縮之病毒劑量。
表1：製造單元操作中之感染性VSV-GP(-貨物)含量之實例、基於初始培養上清液(離心，經鹽處理)之TCID 50計算之回收率。
製程中間物 體積 (L) 病毒含量 (TCID 50/mL) 總回收率 (%)
培養上清液 198.32 1.49E+09 100%
經澄清收穫物 205.10 1.26E+09 87%
DNA降解 206.25 9.67E+08 67%
捕獲(CEX) 0.84 2.41E+11 69%
保持步驟 0.84 1.98E+11 56%
精煉(CC700) 1.36 1.10E+11 51%
透濾 1.22 4.90E+10 20%
生物負荷過濾 1.69 4.28E+10 24%
實例 3 ： 不同添加劑預收穫之測試
圖4
與非離心收穫材料相比時，藉由離心在澄清之後在上清液中觀察到VSV-GP之低收穫效價。假設VSV-GP與宿主細胞膜片段相互作用且結合。接著使具有結合VSV-GP之此等片段粒化。提議使用添加劑來破壞膜片段之間的相互作用，從而使膜片段粒化且充分澄清上清液中保持『游離』之VSV-GP。在感染後30 h之時間點處，將經澄清收穫材料等分至15 mL級分中且添加添加劑，達圖4中所展示的最終濃度。將含有NaCl、CaCl 2、Tween、Pluronic之樣品在室溫下培育10分鐘且以355 g離心3分鐘。將含有苯甲酶及胰蛋白酶之樣品在37℃下培育30分鐘且以355 g離心3分鐘。將含有硫酸葡聚糖之樣品在培養條件下培育18 h且以355 g離心3分鐘。接著使用TCID 50測試上清液。觀察到兩種濃度的NaCl (0.2 M及1 M)及100 µg/mL硫酸葡聚糖之最高回收率，從而指示此等添加劑成功地將游離病毒粒子釋放至上清液中。其他添加劑在離心之後在效價方面未展示顯著提高。
實施例 4 ： 不同添加劑及濃度之其他測試
圖5
進行其他添加劑測試以探究VSV-GP之效價在收穫時是否可用替代添加劑改良。基於添加劑如何與病毒相互作用來選擇添加劑；氯化鉀用以測試另一單價離子，甘胺酸可增加溶解度且產生排他性壓力，且L-精胺酸緩解疏水相互作用且在中性pH下具有2+/1-電荷。在感染後30 h之時間點處，將經澄清收穫材料等分至15 mL級分中且添加添加劑，達所展示的最終濃度，在室溫下培育10分鐘並以355 g離心3分鐘。接著使用TCID 50及qPCR測試上清液。未經離心之未經處理粗製收穫物展示高效價之感染性VSV-GP，VSV-GP與宿主細胞碎片之相互作用並不抑制VSV-GP感染新細胞的能力，然而，大量碎片為被廣泛觀察到不利地影響後續下游處理步驟之製程性能的雜質。在圖5中測試之所有添加劑中，僅KCl展示出優於NaCl的經改良感染性回收率。亦觀察到，增加KCl之濃度改善了VSV-GP釋放。然而，由於NaCl顯示出VSV-GP之良好釋放且用於陽離子交換捕獲中之溶離，並且將用於其他製程步驟中，因此將其用作VSV-GP收穫之添加劑。
實例 5 ： 最低 NaCl 濃度之測試
圖6
選擇NaCl作為收穫時用於釋放VSV-GP之添加劑，因為其顯示出高感染性回收率且將在整個製程中以不同濃度存在。該研究探究了低於0.2 M之低濃度NaCl是否具有可比的病毒釋放效果，因為這將減少在使用作為鹽敏感處理步驟之陽離子交換層析捕獲VSV-G之前降低饋料之導電性所需的稀釋緩衝液之量。在感染後30 h之時間點處，將經澄清收穫材料等分至15 mL級分中且添加NaCl，達圖6中所展示的最終濃度，在室溫下培育10分鐘並以355 g離心3分鐘。接著使用TCID 50測試上清液。使用0.2 M NaCl之感染性回收率展示為最高，但較低濃度亦在一定程度上起作用。因此，此濃度對於收穫時VSV-GP之高回收率似乎為最有前景的，同時最小化所需之稀釋因子以在後續陽離子交換步驟中實現VSV-GP之捕獲。
實例 6 ： 例示性製程性能資料
圖7A+圖7B
此處，展示如實例1及2中詳細描述的用於用VSV-GP感染細胞且培養體積為50 L (圖7A)或4 L (圖7B)之製程的其他例示性性能資料。簡言之，將細胞在懸浮液中培養48 h，以0.0005之MOI添加VSV-GP，收穫病毒且藉由添加0.2 M NaCL之最終濃度在36 h之TOH下從宿主細胞碎片中解離。使用0.65 µm中空纖維微過濾澄清VSV-GP以移除宿主細胞碎片且用SAN-HQ核酸酶處理以減少hcDNA。在藉由0.5 µm深度過濾進行層析捕獲之前製造饋料且1:2稀釋於結合緩衝液(最終濃度50 mM Tris，pH 7.5)中。捕獲病毒懸浮液且使用陽離子交換單石濃縮，使用鹽步驟實現溶離。在使用多模態尺寸排阻CC700樹脂進行層析精煉之前，使捕獲材料保持隔夜。此步驟進一步純化了捕獲期間未移除之HCP及hcDNA中之VSV-GP。最後，將經精煉溶離液透濾至調配緩衝液中且使用0.2 µm過濾器無菌過濾。
實例 7 ： 在收穫期間作為替代添加劑之 MgCl 2 的測試
圖8
除先前測試之賦形劑以外，在收穫時添加氯化鎂以供從感染細胞釋放VSV-GP(-貨物)。研究氯化鎂作為二價陽離子之效果，因為其高度可溶於水且在較低濃度下與氯化鈉相比展示類似的離子強度。此外，鎂陽離子(Mg 2+)在核酸之酶消化期間作為輔因子起重要作用，以移除游離DNA/RNA。在收穫時，將病毒懸浮液分成5 mL或40 mL等分試樣，與不同量之氯化鎂(添加劑0.04 M至0.07 M)一起培育(在34℃下10 min)，如圖8中所展示，且以1000 g離心5 min。使用TCID 50及GC qPCR分析上清液。攜載經NaCl處理之樣品(添加劑0.2 M)作為對照樣品(與0.07 M MgCl 2相比，離子強度類似)。
經NaCl處理之粗製收穫物(對照物，添加劑0.2 M)展示與經MgCl 2處理之粗製收穫物(添加劑0.07 M)相比類似的病毒效價(TCID 50及GC qPCR)。較低濃度之MgCl 2引起VSV-GP(-貨物)之較低釋放。氯化鎂表示收穫期間從HEK293細胞釋放病毒之可能的替代方案。此外，經鹽處理之病毒懸浮液中之較低導電性減少了調節後續陽離子交換層析步驟(捕獲)之導電性所需的稀釋緩衝液之量。
實例 8 ： 在深度過濾之後針對釋放病毒使用 NaCl 進行 過濾器沖洗
圖9
除添加氯化鈉用於在收穫時釋放VSV-GP(-貨物)之外，還測試了深度過濾之後使用過濾器沖洗之病毒溶離。該研究檢查了VSV-GP(-貨物)是否在保留於過濾材料中之後從HEK293細胞中釋放。
在收穫時，將VSV-GP(-貨物)與苯甲酶一起在37℃下在震盪保溫箱中培育30 min。用經限定之體積過濾器負荷(200 L/m²)、恆定體積通量(200 LMH)及1.5巴壓力最大值(預過濾器)執行用於澄清塊狀收穫物之深度過濾(3M™ Zeta Plus™)。在深度過濾之後，使用含有氯化鈉(0.25 M及0.5 M NaCl)之tris緩衝液，實行用經過濾體積之五分之一(20%)進行之過濾器沖洗。圖9為在收穫時未添加添加劑時VSV-GP(-貨物)與HEK293細胞之相互作用的極佳實例，因為經澄清收穫物中之感染性病毒效價非常低。使用利用0.25 M NaCl之第一次過濾器沖洗進行病毒釋放已足夠用於總感染性病毒回收。利用0.5 M NaCl之第二次過濾器沖洗確實釋放了一些其他病毒，但第一次過濾器沖洗已幾乎「溶離了」大部分病毒。使用過濾器沖洗進行病毒釋放的NaCl之所需量與收穫時添加之NaCl之量相當(添加劑0.2 M)。儘管深度過濾之後使用過濾器沖洗可很好地回收VSV-GP(-貨物)，但在程序中在收穫時添加NaCl非常簡單。
實例 9 ： 測定 TCID 50 之例示性方法
細胞及病毒：
在5% CO 2及37℃下培養BHK-21細胞(#603126 (C13), CLS)。培養基(GMEM #21710082, Thermo)補充有8.7 % FCS及4.3 %胰蛋白磷酸鹽培養液。將BHK-21細胞用PBS洗滌且藉由在37℃下與TrypLETM選擇酶一起培育6至8 min而從細胞培養燒瓶中分離。在培養基中獲取細胞，使用Flex2 (nova biomedical)計數且將其接種於96孔盤上。
TCID 50分析： 在96孔盤中，在100 μl補充GMEM中每孔接種10 4個BHK-21細胞。24 h後，在37℃、5 % CO 2下培育三天之前，用病毒或單獨稀釋劑(陰性對照)之11種0.5log 10連續稀釋液感染黏附細胞。用Cytation5多模成像讀取器(BioTek)使用4×物鏡獲得細胞培養物之亮場影像。藉由眼睛(亦即視覺上)評定所成像孔是否為CPE陽性或陰性。藉由史丕曼及卡伯之公式來計算最終效價[TCID 50/mL]。對於各病毒樣品，在同一天在總共在八個盤中執行用連續稀釋液感染。基於彼等八個複本，如上文所描述計算TCID 50/mL (單一量測)。
圖 1 ：描繪針對經LCMV之GP假模式化的水皰性口炎病毒(VSV-GP)之純化/製備執行的上游及下游方法步驟之例示性流程圖。
圖 2 ：按時間順序排序的大規模製備的每劑量1×10 11TCID 50VSV-GP(-貨物)之製程中間物的宿主細胞DNA純度之條形圖。上游澄清樣品(upstream clarified sample；USP)藉由以下方式獲得：獲取細胞培養物之粗製收穫物之樣品，向此粗製收穫物樣品中添加NaCl，且接著藉由離心澄清粗製收穫物樣品，從而得到USP。隨後在USP中量測宿主細胞DNA純度，且接著計算全細胞培養收穫物之宿主細胞DNA純度。在製程結束時獲得的無菌過濾材料展示了原料藥水準上之宿主細胞DNA純度。
圖 3按時間順序排序的大規模製備的每劑量1×10 11TCID 50VSV-GP(-貨物)之製程中間物的宿主細胞蛋白質純度之條形圖。上游澄清樣品(USP)藉由以下方式獲得：獲取細胞培養物之粗製收穫物之樣品，向此粗製收穫物樣品中添加NaCl，且接著藉由離心澄清粗製收穫物樣品，從而得到USP。隨後在USP中量測宿主細胞蛋白質純度，且接著計算全細胞培養收穫物之宿主細胞蛋白質純度。在製程結束時獲得的無菌過濾材料展示了原料藥水準上之宿主細胞蛋白質純度。
圖 4 ：展示指定時間點處HEK293F細胞之VSV-GP感染後(p.i.)之TCID 50/mL水準的條形圖。在未經處理之粗製收穫物(黑色條)中或在經處理之粗製收穫物之離心樣品之上清液(灰色條)中測定TCID 50/mL水準。出於此目的，用不同範圍之添加劑處理粗製收穫物之樣品，且接著藉由離心澄清。隨後在離心之後在經處理之粗製收穫物樣品之上清液中測定TCID 50/mL水準。僅針對對照30h及48h p.i.及硫酸葡聚糖處理來量測粗製收穫物之TCID 50水準。
圖 5 ：展示HEK293F細胞之VSV-GP感染後之基因體效價/毫升水準(黑色條)及TCID 50/mL (灰色條)的條形圖。在未經處理之粗製收穫物(無添加劑，未離心)中及在經處理之粗製收穫物樣品之離心樣品之上清液中測定基因體效價/毫升水準及TCID 50/mL水準。出於此目的，用不同範圍之添加劑處理粗製收穫物之樣品，且接著藉由離心澄清。隨後在離心之後在經處理之粗製收穫物樣品之上清液中測定基因體效價/毫升或TCID 50/mL水準。
圖 6 ：展示如藉由HEK293F細胞之VSV-GP感染後之基因體效價/毫升水準(黑色條)及TCID 50/mL (灰色條)所量測的VSV-GP之回收率的條形圖。在未經處理之粗製收穫物(無添加劑)中測定基因體效價/毫升水準或TCID 50/mL水準且設定為100%。在經處理之粗製收穫物樣品之離心樣品之上清液中量測在用不同濃度之鹽處理之後的VSV-GP之回收百分比。出於此目的，用不同範圍之鹽處理粗製收穫物之樣品，且接著藉由離心澄清。隨後在離心之後在經處理之粗製收穫物樣品之上清液中測定基因體效價/毫升或TCID 50/mL水準。
圖 7A 至圖 7B ： (A)可在50 L標度之製程控制資料中擴展之VSV-GP及 (B)可在4 L之製程控制資料中擴展之VSV-GP的代表性性能資料。在以經鹽處理之收穫物開始且以原料藥(DS)結束的不同單元操作步驟處量測TCID 50/mL及基因體效價/毫升水準。
圖 8 ：展示HEK293F細胞之VSV-GP感染後之基因體效價/毫升水準(黑色條)及TCID 50/mL (灰色條)的條形圖。在經處理之粗製收穫物樣品之離心樣品之上清液中測定基因體效價/毫升水準或TCID 50/mL水準。出於此目的，用不同範圍之MgCl 2或NaCl 2處理粗製收穫物之樣品，且接著藉由離心澄清。隨後在離心之後在經處理之粗製收穫物樣品之上清液中測定基因體效價/毫升或TCID 50/mL水準。
圖 9 ：展示HEK293F感染細胞之收穫物中VSV-GP之總TCID 50的條形圖。在相同運行中測定以下之總TCID 50水準：(i)粗製收穫物，(ii)經核酸酶處理之粗製收穫物，(iii)在深度過濾之後經核酸酶處理之粗製收穫物(澄清的收穫物)，(iv)在第一次過濾器沖洗(溶離液)中使用含有0.25 M氯化鈉之tris緩衝液，及(v)在第二次過濾器沖洗(溶離液)中使用含有0.5 M氯化鈉之tris緩衝液。 

          <![CDATA[<110> 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司(Boehringer Ingelheim International GmbH)]]>
          <![CDATA[<120> 從細胞培養物中製備純化之桿狀病毒之方法]]>
          <![CDATA[<130> 01-3429]]>
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          <![CDATA[<141> 2021-07-09]]>
          <![CDATA[<150> EP 20185118.5]]>
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          Met Gly Gln Ile Val Thr Met Phe Glu Ala Leu Pro His Ile Ile Asp 
          1               5                   10                  15      
          Glu Val Ile Asn Ile Val Ile Ile Val Leu Ile Ile Ile Thr Ser Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile Leu Ala Leu Val Ser 
                  35                  40                  45              
          Phe Leu Phe Leu Ala Gly Arg Ser Cys Gly Met Tyr Gly Leu Asn Gly 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Ile Tyr Lys Gly Val Tyr Gln Phe Lys Ser Val Glu Phe Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Met Ser His Leu Asn Leu Thr Met Pro Asn Ala Cys Ser Ala Asn Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser His His Tyr Ile Ser Met Gly Ser Ser Gly Leu Glu Leu Thr Phe 
                      100                 105                 110         
          Thr Asn Asp Ser Ile Leu Asn His Asn Phe Cys Asn Leu Thr Ser Ala 
                  115                 120                 125             
          Phe Asn Lys Lys Thr Phe Asp His Thr Leu Met Ser Ile Val Ser Ser 
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          Leu His Leu Ser Ile Arg Gly Asn Ser Asn His Lys Ala Val Ser Cys 
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          Asp Phe Asn Asn Gly Ile Thr Ile Gln Tyr Asn Leu Ser Phe Ser Asp 
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          Pro Gln Ser Ala Ile Ser Gln Cys Arg Thr Phe Arg Gly Arg Val Leu 
                      180                 185                 190         
          Asp Met Phe Arg Thr Ala Phe Gly Gly Lys Tyr Met Arg Ser Gly Trp 
                  195                 200                 205             
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          Tyr Ala Gly Pro Phe Gly Met Ser Arg Ile Leu Phe Ala Gln Glu Lys 
                          245                 250                 255     
          Thr Lys Phe Leu Thr Arg Arg Leu Ala Gly Thr Phe Thr Trp Thr Leu 
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          Ser Asp Ser Ser Gly Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr Lys 
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          Leu Ile Asp Tyr Asn Lys Ala Ala Leu Ser Lys Phe Lys Gln Asp Val 
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          Tyr Cys Asn Tyr Ser Lys Phe Trp Tyr Leu Glu His Ala Lys Thr Gly 
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          Glu Thr Ser Val Pro Lys Cys Trp Leu Val Thr Asn Gly Ser Tyr Leu 
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          Lys Gly Gly Ser Cys Pro Lys Pro His Arg Leu Thr Asn Lys Gly Ile 
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          Met Ser Val Thr Val Lys Arg Ile Ile Asp Asn Thr Val Val Val Pro 
          1               5                   10                  15      
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          Arg Lys Ser Lys Glu Ile Pro Leu Tyr Ile Asn Thr Thr Lys Ser Leu 
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          Ser Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Asn Val 
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          Ser Ile Ile His Val Asn Ser Tyr Leu Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile 
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          Arg Gly Lys Leu Asp Lys Asp Trp Ser Ser Phe Gly Ile Asn Ile Gly 
                          85                  90                  95      
          Lys Ala Gly Asp Thr Ile Gly Ile Phe Asp Leu Val Ser Leu Lys Ala 
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          Leu Asp Gly Val Leu Pro Asp Gly Val Ser Asp Ala Ser Arg Thr Ser 
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          Glu Gly Arg Asp Ile Phe Asp Val Trp Gly Asn Asp Ser Asn Tyr Thr 
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          Lys Ile Val Ala Ala Val Asp Met Phe Phe His Met Phe Lys Lys His 
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          Glu Cys Ala Ser Phe Arg Tyr Gly Thr Ile Val Ser Arg Phe Lys Asp 
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          Cys Ala Ala Leu Ala Thr Phe Gly His Leu Cys Lys Ile Thr Gly Met 
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          Ser Thr Glu Asp Val Thr Thr Trp Ile Leu Asn Arg Glu Val Ala Asp 
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          Ser Tyr Met Pro Tyr Leu Ile Asp Phe Gly Leu Ser Ser Lys Ser Pro 
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          Tyr Ser Ser Val Lys Asn Pro Ala Phe His Phe Trp Gly Gln Leu Thr 
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          Ala Leu Leu Leu Arg Ser Thr Arg Ala Arg Asn Ala Arg Gln Pro Asp 
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          Asp Ile Glu Tyr Thr Ser Leu Thr Thr Ala Gly Leu Leu Tyr Ala Tyr 
                          325                 330                 335     
          Ala Val Gly Ser Ser Ala Asp Leu Ala Gln Gln Phe Cys Val Gly Asp 
                      340                 345                 350         
          Asn Lys Tyr Thr Pro Asp Asp Ser Thr Gly Gly Leu Thr Thr Asn Ala 
                  355                 360                 365             
          Pro Pro Gln Gly Arg Asp Val Val Glu Trp Leu Gly Trp Phe Glu Asp 
              370                 375                 380                 
          Gln Asn Arg Lys Pro Thr Pro Asp Met Met Gln Tyr Ala Lys Arg Ala 
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          Val Met Ser Leu Gln Gly Leu Arg Glu Lys Thr Ile Gly Lys Tyr Ala 
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          Lys Ser Glu Phe Asp Lys 
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          Met Asp Asn Leu Thr Lys Val Arg Glu Tyr Leu Lys Ser Tyr Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Leu Asp Gln Ala Val Gly Glu Ile Asp Glu Ile Glu Ala Gln Arg Ala 
                      20                  25                  30          
          Glu Lys Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Gln Glu Asp Gly Val Glu Glu His 
                  35                  40                  45              
          Thr Lys Pro Ser Tyr Phe Gln Ala Ala Asp Asp Ser Asp Thr Glu Ser 
              50                  55                  60                  
          Glu Pro Glu Ile Glu Asp Asn Gln Gly Leu Tyr Ala Pro Asp Pro Glu 
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          Ala Glu Gln Val Glu Gly Phe Ile Gln Gly Pro Leu Asp Asp Tyr Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Glu Glu Val Asp Val Val Phe Thr Ser Asp Trp Lys Gln Pro Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Ser Asp Glu His Gly Lys Thr Leu Arg Leu Thr Ser Pro Glu 
                  115                 120                 125             
          Gly Leu Ser Gly Glu Gln Lys Ser Gln Trp Leu Ser Thr Ile Lys Ala 
              130                 135                 140                 
          Val Val Gln Ser Ala Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Glu Cys Thr Phe Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Gly Glu Gly Val Ile Met Lys Glu Arg Gln Ile Thr Pro Asp 
                          165                 170                 175     
          Val Tyr Lys Val Thr Pro Val Met Asn Thr His Pro Ser Gln Ser Glu 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Ser Asp Val Trp Ser Leu Ser Lys Thr Ser Met Thr Phe Gln 
                  195                 200                 205             
          Pro Lys Lys Ala Ser Leu Gln Pro Leu Thr Ile Ser Leu Asp Glu Leu 
              210                 215                 220                 
          Phe Ser Ser Arg Gly Glu Phe Ile Ser Val Gly Gly Asp Gly Arg Met 
          225                 230                 235                 240 
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          Asn Gln Ala Arg Val Lys Tyr Ser Leu 
                      260                 265 
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 1955]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 水皰性口炎病毒]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Met Glu Val His Asp Phe Glu Thr Asp Glu Phe Asn Asp Phe Asn Glu 
          1               5                   10                  15      
          Asp Asp Tyr Ala Thr Arg Glu Phe Leu Asn Pro Asp Glu Arg Met Thr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Asn His Ala Asp Tyr Asn Leu Asn Ser Pro Leu Ile Ser Asp 
                  35                  40                  45              
          Asp Ile Asp Asn Leu Ile Arg Lys Phe Asn Ser Leu Pro Ile Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Met Trp Asp Ser Lys Asn Trp Asp Gly Val Leu Glu Met Leu Thr Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Gln Ala Asn Pro Ile Pro Thr Ser Gln Met His Lys Trp Met Gly 
                          85                  90                  95      
          Ser Trp Leu Met Ser Asp Asn His Asp Ala Ser Gln Gly Tyr Ser Phe 
                      100                 105                 110         
          Leu His Glu Val Asp Lys Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asp Val Val Glu 
                  115                 120                 125             
          Thr Phe Ile Arg Gly Trp Gly Asn Lys Pro Ile Glu Tyr Ile Lys Lys 
              130                 135                 140                 
          Glu Arg Trp Thr Asp Ser Phe Lys Ile Leu Ala Tyr Leu Cys Gln Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Leu Asp Leu His Lys Leu Thr Leu Ile Leu Asn Ala Val Ser Glu 
                          165                 170                 175     
          Val Glu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Thr Phe Lys Gly Lys Val Arg Arg 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser His Gly Thr Asn Ile Cys Arg Ile Arg Val Pro Ser Leu Gly 
                  195                 200                 205             
          Pro Thr Phe Ile Ser Glu Gly Trp Ala Tyr Phe Lys Lys Leu Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Leu Met Asp Arg Asn Phe Leu Leu Met Val Lys Asp Val Ile Ile Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Met Gln Thr Val Leu Ser Met Val Cys Arg Ile Asp Asn Leu Phe 
                          245                 250                 255     
          Ser Glu Gln Asp Ile Phe Ser Leu Leu Asn Ile Tyr Arg Ile Gly Asp 
                      260                 265                 270         
          Lys Ile Val Glu Arg Gln Gly Asn Phe Ser Tyr Asp Leu Ile Lys Met 
                  275                 280                 285             
          Val Glu Pro Ile Cys Asn Leu Lys Leu Met Lys Leu Ala Arg Glu Ser 
              290                 295                 300                 
          Arg Pro Leu Val Pro Gln Phe Pro His Phe Glu Asn His Ile Lys Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Val Asp Glu Gly Ala Lys Ile Asp Arg Gly Ile Arg Phe Leu His 
                          325                 330                 335     
          Asp Gln Ile Met Ser Val Lys Thr Val Asp Leu Thr Leu Val Ile Tyr 
                      340                 345                 350         
          Gly Ser Phe Arg His Trp Gly His Pro Phe Ile Asp Tyr Tyr Thr Gly 
                  355                 360                 365             
          Leu Glu Lys Leu His Ser Gln Val Thr Met Lys Lys Asp Ile Asp Val 
              370                 375                 380                 
          Ser Tyr Ala Lys Ala Leu Ala Ser Asp Leu Ala Arg Ile Val Leu Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Gln Phe Asn Asp His Lys Lys Trp Phe Val Asn Gly Asp Leu Leu 
                          405                 410                 415     
          Pro His Asp His Pro Phe Lys Ser His Val Lys Glu Asn Thr Trp Pro 
                      420                 425                 430         
          Thr Ala Ala Gln Val Gln Asp Phe Gly Asp Lys Trp His Glu Leu Pro 
                  435                 440                 445             
          Leu Ile Lys Cys Phe Glu Ile Pro Asp Leu Leu Asp Pro Ser Ile Ile 
              450                 455                 460                 
          Tyr Ser Asp Lys Ser His Ser Met Asn Arg Ser Glu Val Leu Lys His 
          465                 470                 475                 480 
          Val Arg Met Asn Pro Asn Thr Pro Ile Pro Ser Lys Lys Val Leu Gln 
                          485                 490                 495     
          Thr Met Leu Asp Thr Lys Ala Thr Asn Trp Lys Glu Phe Leu Lys Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Asp Glu Lys Gly Leu Asp Asp Asp Asp Leu Ile Ile Gly Leu Lys 
                  515                 520                 525             
          Gly Lys Glu Arg Glu Leu Lys Leu Ala Gly Arg Phe Phe Ser Leu Met 
              530                 535                 540                 
          Ser Trp Lys Leu Arg Glu Tyr Phe Val Ile Thr Glu Tyr Leu Ile Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Thr His Phe Val Pro Met Phe Lys Gly Leu Thr Met Ala Asp Asp Leu 
                          565                 570                 575     
          Thr Ala Val Ile Lys Lys Met Leu Asp Ser Ser Ser Gly Gln Gly Leu 
                      580                 585                 590         
          Lys Ser Tyr Glu Ala Ile Cys Ile Ala Asn His Ile Asp Tyr Glu Lys 
                  595                 600                 605             
          Trp Asn Asn His Gln Arg Lys Leu Ser Asn Gly Pro Val Phe Arg Val 
              610                 615                 620                 
          Met Gly Gln Phe Leu Gly Tyr Pro Ser Leu Ile Glu Arg Thr His Glu 
          625                 630                 635                 640 
          Phe Phe Glu Lys Ser Leu Ile Tyr Tyr Asn Gly Arg Pro Asp Leu Met 
                          645                 650                 655     
          Arg Val His Asn Asn Thr Leu Ile Asn Ser Thr Ser Gln Arg Val Cys 
                      660                 665                 670         
          Trp Gln Gly Gln Glu Gly Gly Leu Glu Gly Leu Arg Gln Lys Gly Trp 
                  675                 680                 685             
          Ser Ile Leu Asn Leu Leu Val Ile Gln Arg Glu Ala Lys Ile Arg Asn 
              690                 695                 700                 
          Thr Ala Val Lys Val Leu Ala Gln Gly Asp Asn Gln Val Ile Cys Thr 
          705                 710                 715                 720 
          Gln Tyr Lys Thr Lys Lys Ser Arg Asn Val Val Glu Leu Gln Gly Ala 
                          725                 730                 735     
          Leu Asn Gln Met Val Ser Asn Asn Glu Lys Ile Met Thr Ala Ile Lys 
                      740                 745                 750         
          Ile Gly Thr Gly Lys Leu Gly Leu Leu Ile Asn Asp Asp Glu Thr Met 
                  755                 760                 765             
          Gln Ser Ala Asp Tyr Leu Asn Tyr Gly Lys Ile Pro Ile Phe Arg Gly 
              770                 775                 780                 
          Val Ile Arg Gly Leu Glu Thr Lys Arg Trp Ser Arg Val Thr Cys Val 
          785                 790                 795                 800 
          Thr Asn Asp Gln Ile Pro Thr Cys Ala Asn Ile Met Ser Ser Val Ser 
                          805                 810                 815     
          Thr Asn Ala Leu Thr Val Ala His Phe Ala Glu Asn Pro Ile Asn Ala 
                      820                 825                 830         
          Met Ile Gln Tyr Asn Tyr Phe Gly Thr Phe Ala Arg Leu Leu Leu Met 
                  835                 840                 845             
          Met His Asp Pro Ala Leu Arg Gln Ser Leu Tyr Glu Val Gln Asp Lys 
              850                 855                 860                 
          Ile Pro Gly Leu His Ser Ser Thr Phe Lys Tyr Ala Met Leu Tyr Leu 
          865                 870                 875                 880 
          Asp Pro Ser Ile Gly Gly Val Ser Gly Met Ser Leu Ser Arg Phe Leu 
                          885                 890                 895     
          Ile Arg Ala Phe Pro Asp Pro Val Thr Glu Ser Leu Ser Phe Trp Arg 
                      900                 905                 910         
          Phe Ile His Val His Ala Arg Ser Glu His Leu Lys Glu Met Ser Ala 
                  915                 920                 925             
          Val Phe Gly Asn Pro Glu Ile Ala Lys Phe Arg Ile Thr His Ile Asp 
              930                 935                 940                 
          Lys Leu Val Glu Asp Pro Thr Ser Leu Asn Ile Ala Met Gly Met Ser 
          945                 950                 955                 960 
          Pro Ala Asn Leu Leu Lys Thr Glu Val Lys Lys Cys Leu Ile Glu Ser 
                          965                 970                 975     
          Arg Gln Thr Ile Arg Asn Gln Val Ile Lys Asp Ala Thr Ile Tyr Leu 
                      980                 985                 990         
          Tyr His Glu Glu Asp Arg Leu Arg Ser Phe Leu Trp Ser Ile Asn Pro 
                  995                 1000                1005            
          Leu Phe Pro Arg Phe Leu Ser Glu Phe Lys Ser Gly Thr Phe Leu Gly 
              1010                1015                1020                
          Val Ala Asp Gly Leu Ile Ser Leu Phe Gln Asn Ser Arg Thr Ile Arg 
          1025                1030                1035                1040
          Asn Ser Phe Lys Lys Lys Tyr His Arg Glu Leu Asp Asp Leu Ile Val 
                          1045                1050                1055    
          Arg Ser Glu Val Ser Ser Leu Thr His Leu Gly Lys Leu His Leu Arg 
                      1060                1065                1070        
          Arg Gly Ser Cys Lys Met Trp Thr Cys Ser Ala Thr His Ala Asp Thr 
                  1075                1080                1085            
          Leu Arg Tyr Lys Ser Trp Gly Arg Thr Val Ile Gly Thr Thr Val Pro 
              1090                1095                1100                
          His Pro Leu Glu Met Leu Gly Pro Gln His Arg Lys Glu Thr Pro Cys 
          1105                1110                1115                1120
          Ala Pro Cys Asn Thr Ser Gly Phe Asn Tyr Val Ser Val His Cys Pro 
                          1125                1130                1135    
          Asp Gly Ile His Asp Val Phe Ser Ser Arg Gly Pro Leu Pro Ala Tyr 
                      1140                1145                1150        
          Leu Gly Ser Lys Thr Ser Glu Ser Thr Ser Ile Leu Gln Pro Trp Glu 
                  1155                1160                1165            
          Arg Glu Ser Lys Val Pro Leu Ile Lys Arg Ala Thr Arg Leu Arg Asp 
              1170                1175                1180                
          Ala Ile Ser Trp Phe Val Glu Pro Asp Ser Lys Leu Ala Met Thr Ile 
          1185                1190                1195                1200
          Leu Ser Asn Ile His Ser Leu Thr Gly Glu Glu Trp Thr Lys Arg Gln 
                          1205                1210                1215    
          His Gly Phe Lys Arg Thr Gly Ser Ala Leu His Arg Phe Ser Thr Ser 
                      1220                1225                1230        
          Arg Met Ser His Gly Gly Phe Ala Ser Gln Ser Thr Ala Ala Leu Thr 
                  1235                1240                1245            
          Arg Leu Met Ala Thr Thr Asp Thr Met Arg Asp Leu Gly Asp Gln Asn 
              1250                1255                1260                
          Phe Asp Phe Leu Phe Gln Ala Thr Leu Leu Tyr Ala Gln Ile Thr Thr 
          1265                1270                1275                1280
          Thr Val Ala Arg Asp Gly Trp Ile Thr Ser Cys Thr Asp His Tyr His 
                          1285                1290                1295    
          Ile Ala Cys Lys Ser Cys Leu Arg Pro Ile Glu Glu Ile Thr Leu Asp 
                      1300                1305                1310        
          Ser Ser Met Asp Tyr Thr Pro Pro Asp Val Ser His Val Leu Lys Thr 
                  1315                1320                1325            
          Trp Arg Asn Gly Glu Gly Ser Trp Gly Gln Glu Ile Lys Gln Ile Tyr 
              1330                1335                1340                
          Pro Leu Glu Gly Asn Trp Lys Asn Leu Ala Pro Ala Glu Gln Ser Tyr 
          1345                1350                1355                1360
          Gln Val Gly Arg Cys Ile Gly Phe Leu Tyr Gly Asp Leu Ala Tyr Arg 
                          1365                1370                1375    
          Lys Ser Thr His Ala Glu Asp Ser Ser Leu Phe Pro Leu Ser Ile Gln 
                      1380                1385                1390        
          Gly Arg Ile Arg Gly Arg Gly Phe Leu Lys Gly Leu Leu Asp Gly Leu 
                  1395                1400                1405            
          Met Arg Ala Ser Cys Cys Gln Val Ile His Arg Arg Ser Leu Ala His 
              1410                1415                1420                
          Leu Lys Arg Pro Ala Asn Ala Val Tyr Gly Gly Leu Ile Tyr Leu Ile 
          1425                1430                1435                1440
          Asp Lys Leu Ser Val Ser Pro Pro Phe Leu Ser Leu Thr Arg Ser Gly 
                          1445                1450                1455    
          Pro Ile Arg Asp Glu Leu Glu Thr Ile Pro His Lys Ile Pro Thr Ser 
                      1460                1465                1470        
          Tyr Pro Thr Ser Asn Arg Asp Met Gly Val Ile Val Arg Asn Tyr Phe 
                  1475                1480                1485            
          Lys Tyr Gln Cys Arg Leu Ile Glu Lys Gly Lys Tyr Arg Ser His Tyr 
              1490                1495                1500                
          Ser Gln Leu Trp Leu Phe Ser Asp Val Leu Ser Ile Asp Phe Ile Gly 
          1505                1510                1515                1520
          Pro Phe Ser Ile Ser Thr Thr Leu Leu Gln Ile Leu Tyr Lys Pro Phe 
                          1525                1530                1535    
          Leu Ser Gly Lys Asp Lys Asn Glu Leu Arg Glu Leu Ala Asn Leu Ser 
                      1540                1545                1550        
          Ser Leu Leu Arg Ser Gly Glu Gly Trp Glu Asp Ile His Val Lys Phe 
                  1555                1560                1565            
          Phe Thr Lys Asp Ile Leu Leu Cys Pro Glu Glu Ile Arg His Ala Cys 
              1570                1575                1580                
          Lys Phe Gly Ile Ala Lys Asp Asn Asn Lys Asp Met Ser Tyr Pro Pro 
          1585                1590                1595                1600
          Trp Gly Arg Glu Ser Arg Gly Thr Ile Thr Thr Ile Pro Val Tyr Tyr 
                          1605                1610                1615    
          Thr Thr Thr Pro Tyr Pro Lys Met Leu Glu Met Pro Pro Arg Ile Gln 
                      1620                1625                1630        
          Asn Pro Leu Leu Ser Gly Ile Arg Leu Gly Gln Leu Pro Thr Gly Ala 
                  1635                1640                1645            
          His Tyr Lys Ile Arg Ser Ile Leu His Gly Met Gly Ile His Tyr Arg 
              1650                1655                1660                
          Asp Phe Leu Ser Cys Gly Asp Gly Ser Gly Gly Met Thr Ala Ala Leu 
          1665                1670                1675                1680
          Leu Arg Glu Asn Val His Ser Arg Gly Ile Phe Asn Ser Leu Leu Glu 
                          1685                1690                1695    
          Leu Ser Gly Ser Val Met Arg Gly Ala Ser Pro Glu Pro Pro Ser Ala 
                      1700                1705                1710        
          Leu Glu Thr Leu Gly Gly Asp Lys Ser Arg Cys Val Asn Gly Glu Thr 
                  1715                1720                1725            
          Cys Trp Glu Tyr Pro Ser Asp Leu Cys Asp Pro Arg Thr Trp Asp Tyr 
              1730                1735                1740                
          Phe Leu Arg Leu Lys Ala Gly Leu Gly Leu Gln Ile Asp Leu Ile Val 
          1745                1750                1755                1760
          Met Asp Met Glu Val Arg Asp Ser Ser Thr Ser Leu Lys Ile Glu Thr 
                          1765                1770                1775    
          Asn Val Arg Asn Tyr Val His Arg Ile Leu Asp Glu Gln Gly Val Leu 
                      1780                1785                1790        
          Ile Tyr Lys Thr Tyr Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ser Glu Lys Asn Ala 
                  1795                1800                1805            
          Val Thr Ile Leu Gly Pro Met Phe Lys Thr Val Asp Leu Val Gln Thr 
              1810                1815                1820                
          Glu Phe Ser Ser Ser Gln Thr Ser Glu Val Tyr Met Val Cys Lys Gly 
          1825                1830                1835                1840
          Leu Lys Lys Leu Ile Asp Glu Pro Asn Pro Asp Trp Ser Ser Ile Asn 
                          1845                1850                1855    
          Glu Ser Trp Lys Asn Leu Tyr Ala Phe Gln Ser Ser Glu Gln Glu Phe 
                      1860                1865                1870        
          Ala Arg Ala Lys Lys Val Ser Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Gly Ile Pro 
                  1875                1880                1885            
          Ser Gln Phe Ile Pro Asp Pro Phe Val Asn Ile Glu Thr Met Leu Gln 
              1890                1895                1900                
          Ile Phe Gly Val Pro Thr Gly Val Ser His Ala Ala Ala Leu Lys Ser 
          1905                1910                1915                1920
          Ser Asp Arg Pro Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Met Ala 
                          1925                1930                1935    
          Ile Ile Ser Tyr Tyr Asn Ile Asn His Ile Arg Val Gly Pro Ile Pro 
                      1940                1945                1950        
          Pro Asn Pro 
                  1955
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 229]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 水皰性口炎病毒]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val 
                  35                  40                  45              
          Asp Glu Met Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Leu Gly 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln 
                  115                 120                 125             
          Pro Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg 
              130                 135                 140                 
          Met Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr 
                          165                 170                 175     
          Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His 
                      180                 185                 190         
          Phe Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe 
                  195                 200                 205             
          Gly Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser 
              210                 215                 220                 
          Ile Gly His Phe Lys 
          225                 
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 498]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 丹德農病毒]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Met Gly Gln Leu Ile Thr Met Phe Glu Ala Leu Pro His Ile Ile Asp 
          1               5                   10                  15      
          Glu Val Ile Asn Ile Val Ile Ile Val Leu Val Ile Ile Thr Ser Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile Ile Ala Leu Ile Ser 
                  35                  40                  45              
          Phe Cys Leu Leu Ala Gly Arg Ser Cys Gly Leu Tyr Gly Val Thr Gly 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Ile Tyr Lys Gly Leu Tyr Gln Phe Lys Ser Val Glu Phe Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Met Ser Gln Leu Asn Leu Thr Met Pro Asn Ala Cys Ser Ala Asn Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser His His Tyr Ile Ser Met Gly Lys Ser Gly Leu Glu Leu Thr Phe 
                      100                 105                 110         
          Thr Asn Asp Ser Ile Ile Ser His Asn Phe Cys Asn Leu Thr Asp Gly 
                  115                 120                 125             
          Phe Lys Lys Lys Thr Phe Asp His Thr Leu Met Ser Ile Val Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu His Leu Ser Ile Arg Gly Asn Thr Asn Tyr Lys Ala Val Ser Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Asn Asn Gly Ile Thr Ile Gln Tyr Asn Leu Ser Phe Ser Asp 
                          165                 170                 175     
          Ala Gln Ser Ala Ile Asn Gln Cys Arg Thr Phe Arg Gly Arg Val Leu 
                      180                 185                 190         
          Asp Met Phe Arg Thr Ala Phe Gly Gly Lys Tyr Met Arg Ser Gly Tyr 
                  195                 200                 205             
          Gly Trp Lys Gly Ser Asp Gly Lys Thr Thr Trp Cys Ser Gln Thr Ser 
              210                 215                 220                 
          Tyr Gln Tyr Leu Ile Ile Gln Asn Arg Thr Trp Glu Asn His Cys Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Ala Gly Pro Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Phe Ala Gln Glu Lys 
                          245                 250                 255     
          Thr Lys Phe Leu Thr Arg Arg Leu Ala Gly Thr Phe Thr Trp Thr Leu 
                      260                 265                 270         
          Ser Asp Ser Ser Gly Thr Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr Lys 
                  275                 280                 285             
          Trp Met Leu Ile Ala Ala Glu Leu Lys Cys Phe Gly Asn Thr Ala Val 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Cys Asn Ile Asn His Asp Glu Glu Phe Cys Asp Met Leu Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ile Asp Tyr Asn Lys Ala Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Asp Val 
                          325                 330                 335     
          Glu Ser Ala Leu His Leu Phe Lys Thr Thr Val Asn Ser Leu Ile Ser 
                      340                 345                 350         
          Asp Gln Leu Leu Met Arg Asn His Leu Arg Asp Leu Met Gly Val Pro 
                  355                 360                 365             
          Tyr Cys Asn Tyr Ser Lys Phe Trp Tyr Leu Glu His Val Lys Thr Gly 
              370                 375                 380                 
          Asp Thr Ser Val Pro Lys Cys Trp Leu Val Ser Asn Gly Ser Tyr Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Glu Thr His Phe Ser Asp Gln Ile Glu Gln Glu Ala Asp Asn Met 
                          405                 410                 415     
          Ile Thr Glu Met Leu Arg Lys Asp Tyr Ile Lys Arg Gln Gly Ser Thr 
                      420                 425                 430         
          Pro Leu Ala Leu Met Asp Leu Leu Met Phe Ser Thr Ser Ala Tyr Leu 
                  435                 440                 445             
          Ile Ser Val Phe Leu His Leu Met Lys Ile Pro Thr His Arg His Ile 
              450                 455                 460                 
          Lys Gly Gly Thr Cys Pro Lys Pro His Arg Leu Thr Ser Lys Gly Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Cys Ser Cys Gly Ala Phe Lys Val Pro Gly Val Lys Thr Val Trp Lys 
                          485                 490                 495     
          Arg Arg 
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 489]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 丹德農病毒]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          Met Gly Gln Ile Val Thr Phe Phe Gln Glu Val Pro His Ile Leu Glu 
          1               5                   10                  15      
          Glu Val Met Asn Ile Val Leu Met Thr Leu Ser Ile Leu Ala Ile Leu 
                      20                  25                  30          
          Lys Gly Ile Tyr Asn Val Met Thr Cys Gly Ile Ile Gly Leu Ile Thr 
                  35                  40                  45              
          Phe Leu Phe Leu Cys Gly Arg Ser Cys Ser Ser Ile Tyr Lys Asp Asn 
              50                  55                  60                  
          Tyr Glu Phe Phe Ser Leu Asp Leu Asp Met Ser Ser Leu Asn Ala Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Pro Leu Ser Cys Ser Lys Asn Asn Ser His His Tyr Ile Gln Val 
                          85                  90                  95      
          Gly Asn Glu Thr Gly Leu Glu Leu Thr Leu Thr Asn Thr Ser Ile Ile 
                      100                 105                 110         
          Asp His Lys Phe Cys Asn Leu Ser Asp Ala His Arg Arg Asn Leu Tyr 
                  115                 120                 125             
          Asp Lys Ala Leu Met Ser Ile Leu Thr Thr Phe His Leu Ser Ile Pro 
              130                 135                 140                 
          Asp Phe Asn Gln Tyr Glu Ala Met Ser Cys Asp Phe Asn Gly Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Ser Ile Gln Tyr Asn Leu Ser His Ser Asn Tyr Val Asp Ala Gly 
                          165                 170                 175     
          Asn His Cys Gly Thr Ile Ala Asn Gly Ile Met Asp Val Phe Arg Arg 
                      180                 185                 190         
          Met Tyr Trp Ser Thr Ser Leu Ser Val Ala Ser Asp Ile Ser Gly Thr 
                  195                 200                 205             
          Gln Cys Ile Gln Thr Asp Tyr Lys Tyr Leu Ile Ile Gln Asn Thr Ser 
              210                 215                 220                 
          Trp Glu Asp His Cys Met Phe Ser Arg Pro Ser Pro Met Gly Phe Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Leu Leu Ser Gln Arg Thr Arg Asn Phe Tyr Ile Ser Arg Arg Leu 
                          245                 250                 255     
          Leu Gly Leu Phe Thr Trp Thr Leu Ser Asp Ser Glu Gly Asn Asp Met 
                      260                 265                 270         
          Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr Arg Ser Met Leu Ile Gly Leu Asp Leu 
                  275                 280                 285             
          Lys Cys Phe Gly Asn Thr Ala Ile Ala Lys Cys Asn Gln Ala His Asp 
              290                 295                 300                 
          Glu Glu Phe Cys Asp Met Leu Arg Leu Phe Asp Phe Asn Lys Gln Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Ser Lys Leu Arg Ser Glu Val Gln Gln Ser Ile Asn Leu Ile Asn 
                          325                 330                 335     
          Lys Ala Val Asn Ala Leu Ile Asn Asp Gln Leu Val Met Arg Asn His 
                      340                 345                 350         
          Leu Arg Asp Leu Met Gly Ile Pro Tyr Cys Asn Tyr Ser Lys Phe Trp 
                  355                 360                 365             
          Tyr Leu Asn Asp Thr Arg Thr Gly Arg Thr Ser Leu Pro Lys Cys Trp 
              370                 375                 380                 
          Leu Val Thr Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Glu Thr Gln Phe Ser Thr Glu 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Glu Gln Glu Ala Asn Asn Met Phe Thr Asp Met Leu Arg Lys Glu 
                          405                 410                 415     
          Tyr Glu Lys Arg Gln Ser Thr Thr Pro Leu Gly Leu Val Asp Leu Phe 
                      420                 425                 430         
          Val Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Leu Ile Ser Val Phe Leu His Leu Ile 
                  435                 440                 445             
          Lys Ile Pro Thr His Arg His Ile Lys Gly Lys Pro Cys Pro Lys Pro 
              450                 455                 460                 
          His Arg Leu Asn His Met Ala Ile Cys Ser Cys Gly Phe Tyr Lys Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Gly Leu Pro Thr Gln Trp Lys Arg 
                          485                 
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 467]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys 
                      20                  25                  30          
          Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu 
                  35                  40                  45              
          Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile 
              50                  55                  60                  
          Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg 
                  115                 120                 125             
          Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr 
              130                 135                 140                 
          Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp 
                      180                 185                 190         
          Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met 
                  195                 200                 205             
          Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg 
              210                 215                 220                 
          Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                      260                 265                 270         
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                  275                 280                 285             
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
              290                 295                 300                 
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
                      340                 345                 350         
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                  355                 360                 365             
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
              370                 375                 380                 
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
                          405                 410                 415     
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                      420                 425                 430         
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                  435                 440                 445             
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
              450                 455                 460                 
          Ser Pro Gly 
          465         
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 433]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 
          1               5                   10                  15      
          Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp 
                      20                  25                  30          
          Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn 
                  35                  40                  45              
          Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His 
                          85                  90                  95      
          Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys 
                  115                 120                 125             
          Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn 
              130                 135                 140                 
          Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn 
                      180                 185                 190         
          Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asp 
                  195                 200                 205             
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                          245                 250                 255     
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                      260                 265                 270         
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
                  275                 280                 285             
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
              290                 295                 300                 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                          325                 330                 335     
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                      340                 345                 350         
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
                  355                 360                 365             
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
              370                 375                 380                 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                          405                 410                 415     
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                      420                 425                 430         
          Gly 
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 98]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser 
                      20                  25                  30          
          Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu 
                  35                  40                  45              
          Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys 
              50                  55                  60                  
          Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala 
                          85                  90                  95      
          Gln Gly 
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 79]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln 
                  35                  40                  45              
          Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met 
              50                  55                  60                  
          Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala Gln Gly 
          65                  70                  75                  
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 11169]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 水皰性口炎病毒]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          ugcuucuguu uguuugguaa uaauaguaau uuuccgaguc cucuuugaaa uugucauuag       60
          uuuuacagac aaugucaguu cucuuaguaa cuguuguguc agcaucaagg uuuugaagga      120
          cguuuacucc uaggucaccu uaugggccgu cuaaugaagu cuuuuaguuu ccucuaagga      180
          gaaauguagu uaugauguuu uucaaacagu cuagauucuc cuauacagau gguuccggag      240
          uuuaggccuu uacauaguua guauguacag uugucgauga acauaccucg uaauuuccug      300
          uaggccccau ucaaccuauu ucuaaccagu ucaaagccuu auuuguagcc cuuucguccc      360
          cuauguuagc cuuauaaacu ggaacauagg aacuuucggg accugccgca ugaaggucua      420
          ccucauagcc uacgaagguc uuggucgcgu cuacuguuua ccaacggaaa cauagaugaa      480
          ccgaauaugu cucacccguc uuguguuuac ggacuuaugu cuuuuuucga guaccuaccc      540
          gacuguuuag uuacguuuua cuaguuacuu gucaaacuug gagaacacgg ucuuccagca      600
          cuguaaaaac uacacacccc uuuacuguca uuaauguguu uuuaacagcg acgucaccug      660
          uacaagaagg uguacaaguu uuuuguacuu acacggagca agucuaugcc uugauaacaa      720
          aggucuaagu uucuaacacg acguaaccgu uguaaaccug uggagacguu uuauuggccu      780
          uacagauguc uucuacauug cuggaccuag aacuuggcuc uucaacgucu acuuuaccag      840
          guuuacuacg aagguccggu ucuuuaacug uuccggcuaa guauguacgg aauaaacuag      900
          cugaaaccua acagaagauu cagagguaua agaaggcagu uuuugggacg gaaggugaag      960
          acccccguua acugucgaga agacgagucu agguggucuc guuccuuacg ggcugucgga     1020
          cuacuguaac ucauauguag agaaugaugu cguccaaaca acaugcgaau acgucauccu     1080
          aggagacggc ugaaccgugu ugucaaaaca caaccucuau uguuuaugug aggucuacua     1140
          ucauggccuc cuaacugcug auuacguggc gguguuccgu cucuacacca gcuuaccgag     1200
          ccuaccaaac uucuaguuuu gucuuuuggc ugaggacuau acuacgucau acgcuuuucu     1260
          cgucaguaca gugacguucc ggauucucuc uucuguuaac cguucauacg auucagucuu     1320
          aaacuguuua cugggauauu aagagucuag uggauaauau auaauacgau guauacuuuu     1380
          uuugauuguc uauaguaccu auuagagugu uuucaagcac ucauagaguu caggauaaga     1440
          gcagaccuag uccgccaucc ucucuaucua cucuagcuuc guguugcucg acuuuucagg     1500
          uuaauacuca acaagguucu ccuaccucac cuucucguau gauucgggag aauaaaaguc     1560
          cgucgucuac uaagacugug ucuuagacuu ggucuuuaac uucuguuagu uccgaacaua     1620
          cguggucuag gucuucgacu cguucaacuu ccgaaauaug uccccggaaa ucuacugaua     1680
          cgucuacucc uucaccuaca acauaaauga agccugaccu uugucggacu cgaacuuaga     1740
          cugcucguac cuuucuggaa ugccaacugu agcggucucc caaauucacc ucucgucuuu     1800
          agggucaccg aaagcugcua auuucgucag cacguuucac gguuuaugac cuuagaccgu     1860
          cucacgugua aacuucguag cccucuuccc caguaauacu uccucgcggu cuauugaggc     1920
          cuacauauau uccagugagg ucacuacuug uguguaggca ggguuagucu ucgucauagu     1980
          cuacaaacca gagagaguuu cuguagguac ugaaagguug gguucuuucg uucagaaguc     2040
          ggagaguggu auaggaaccu acuuaacaag aguagaucuc cucucaagua gagacagccu     2100
          ccacugccug cuuacagagu auuucuccgg uaggacgagc cggacucuau guuuuucaac     2160
          auguuagucc gcucucaguu uauaagagac aucugauacu uuuuuucauu gucuauagug     2220
          cuagauucac aauaggguua gguaaguagu acucaaggaa uuucuucuaa gagccagacu     2280
          uccccuuucc auucuuuaga uucuuuaauc ccuagcgugg ugggggaaua cuucuccugu     2340
          gaucguaccu cauacgaggc ucgcgagguu aacuguuuag gauaaaaccu caacugcucu     2400
          accuguggau acuaggcuua guuaauucua uacucuuuaa gaagaaaugu cacuuuuacu     2460
          gccaaucuag auuagcaggc aagucuugua ugagucuaca ccgucggcga cauaggguaa     2520
          cccuagugua cauguagccu uaccgucccu uugcagggaa gauguuuuag aaccgaaaaa     2580
          acccaagaag auuagauuuc cggugagguc gccauaaccg ucuaguucca guuggucuca     2640
          uagugcgagu gacgcuuccg ucccgaauaa acgguguauc cuaccccuuc uggggagggu     2700
          acgaguuaca uggucucgug aagucuucug guaaguuaua uccagaaaug uucccuugcu     2760
          aacucgagug uuacugguag augcuacuac ucagugaccu ucgucgagga uacuagaccc     2820
          uaguaaaguu aagaagguuu aaaagacuaa agucucucuu ccggaauuac aaaccggacu     2880
          aacagcucuu uuuccguaga ccucgcaccc aggaccugag auagccggug aaguuuacuc     2940
          gaucagauug aagaucgaag acuuguuagg ggccaaauga gucagagggg auuaaggucg     3000
          gagagcuugu ugauuauagg acagaaaaga uagggauacu uuuuuugauu gucucuagcu     3060
          agacaaaugc gcagugccua gggggcccga cguccuuaag cggugguacc cggucuagca     3120
          cugguacaag cuccgggacg ggguguagua gcugcuccac uaguuguagc acuaguagca     3180
          cgaguaguag uaguggucgu aguuccggca cauguugaag cgguggacgc cguaggaccg     3240
          ggaccacucg aaggacaagg accggccguc uucgacgccg uacaugccgg acuuaccggg     3300
          gcuauagaug uucccgcaca uggucaaguu cucgcaccuc aagcuguacu cgguggacuu     3360
          ggagugguac ggguugcgga cgucgcgguu guuaucggug gugauguagu cguacccguc     3420
          gucgccggac cucaacugga agugguugcu gucguaggac uugguguuga agacguugga     3480
          guggucgcgg aaguuguucu uuuggaagcu ggugugggag uacucguagc acucgucgga     3540
          cguggacucg uagucuccgu ugucguuggu guuccggcac ucgacgcuga aguuguugcc     3600
          guagugguag gucauguugg acucgaaguc gcuaggaguc ucgcgguagu cggucacguc     3660
          uuggaagucu ccgucucacg accuguacaa gucuuggcgg aagccgccgu ucauguacuc     3720
          uucgccgacc ccgacccggc cgucgcugcc guucuggugg accacgucgg ucuggucgau     3780
          ggucauggag uaguaggucu ugucuuggac ccucuuggug acgucuaugc ggccuggaaa     3840
          gccguacucg ucuuaggaca agcggguccu cuuuugguuc aaggaguggu ccucugaccg     3900
          gccguggaag uggaccuggg acucgcuguc gucgccgcac cucuugggac cgccgaugac     3960
          ggagugguuc accuacuagg accggcggcu cgacuucacg aagccguugu ggcggcaccg     4020
          guucacguug cacuuggugc ugcuccucaa gacgcuguac gacucugagu agcugauguu     4080
          guuccggcgg gacucguuca aguucguccu gcaccucucg cgggacgugc acaaguucug     4140
          guggcacuug ucggaguagu cgcuggucga cgaguacucu uugguggacu cucuggagua     4200
          cccgcacggg augacguuga ugucguucaa gaccauagac cucgugcggu ucuggccgcu     4260
          cuggucgcac ggguucacga ccgaccacug guuaccgucg auggacuugc ucugggugaa     4320
          gucgcugguc uagcucgucc uucggcuguu guacuagugg cucuacgacu ccuuccugau     4380
          guaguucucu gucccgucgu ggggggaccg ggaguaccua gacgaguaca agucgugguc     4440
          gcggauggag uagucguaga aggacgugga ccacuucuag gggugggugu cuguguaguu     4500
          cccgccgucg acgggguucg gggugucuga gugguuguuc ccguagacgu cgacgccgcg     4560
          gaaguuccac gggccgcacu uuugguagac cuucuccucu auucgccggc gaugcuggag     4620
          cucuuaauua acgaucgguc uaagaaguac aaaccugguu uaguugaaca cuaugguacg     4680
          aguuucuccg gaguuaauau aaacucaaaa auuaaaaaua cuuuuuuuga uugucguuag     4740
          uaccuucagg ugcuaaaacu cuggcugcuc aaguuacuaa aguuacuucu acugauacgg     4800
          uguucucuua aggacuuagg gcuacucgcg uacugcauga acuuaguacg acuaauguug     4860
          gacuuaagag gagauuaauc acuacuauaa cuguuaaauu aguccuuuaa guuaagagaa     4920
          gguuaaggga gcuacacccu aucauucuug acccuaccuc aagaacucua caauugcagu     4980
          acaguucggu uaggguaggg uuguagaguc uacguauuua ccuacccuuc aaccaauuac     5040
          agacuauuag uacuacgguc aguucccaua ucaaaaaaug uacuucaccu guuucuccgu     5100
          cuuuauugua aacugcacca ccucuggaag uaggcgccga ccccguuguu ugguuaacuu     5160
          auguaguuuu uccuuucuac cugacugagu aaguuuuaag agcgaauaaa cacaguuuuc     5220
          aaaaaccuga auguguucaa cuguaauuag aauuuacgac agagacucca ccuuaacgag     5280
          uugaaccgcu ccugaaaguu uccguuucag ucuucuucaa gaguaccuug cuuguauacg     5340
          uccuaauccc aagggucgaa cccaggauga aaauaaaguc uuccuacccg aaugaaguuc     5400
          uuugaacuau aagauuaccu ggcuuugaaa gacaauuacc aguuucuaca cuaauauccc     5460
          uccuacguuu gccacgauag guaccauaca ucuuaucugu uggacaagag ucucguucug     5520
          uagaagaggg aagauuuaua gaugucuuaa ccucuauuuu aacaccucuc cgucccuuua     5580
          aaaagaauac ugaacuaauu uuaccaccuu ggcuauacgu ugaacuucga cuacuuuaau     5640
          cguucucuua guuccggaaa ucaggguguu aagggaguaa aacuuuuagu auaguucuga     5700
          agacaacuac uuccccguuu uuaacuggcu ccauauucua aggagguacu agucuauuac     5760
          ucacacuuuu gucaccuaga gugugaccac uaaauaccua gcaagucugu aaccccagua     5820
          ggaaaauauc uaauaaugug accugaucuu uuuaauguaa ggguucauug guacuucuuu     5880
          cuauaacuac acaguauacg uuuucgugaa cguucacuaa aucgagccua acaagauaaa     5940
          guugucaagu uacuaguauu uuucaccaag cacuuaccuc ugaacgaggg aguacuagua     6000
          gggaaauuuu caguacaauu ucuuuuaugu accggguguc gacgaguuca aguucuaaaa     6060
          ccucuauuua ccguacuuga aggcgacuaa uuuacaaaac uuuaugggcu gaaugaucug     6120
          gguagcuauu auaugagacu guuuucagua aguuacuuau ccagucucca caacuuugua     6180
          caggcuuacu uaggcuugug aggauaggga ucauuuuucc acaacgucug auacaaccug     6240
          uguuuccgau gguuaaccuu ucuuaaagaa uuucucuaac uacucuuccc gaaucuacua     6300
          cuacuagauu aauaaccaga auuuccuuuc cucucccuug acuucaaccg uccaucuaaa     6360
          aagagggauu acagaaccuu uaacgcucuu augaaacauu aauggcuuau aaacuauuuc     6420
          ugaguaaagc agggauacaa auuuccggac uguuaccgcc ugcuagauug acgucaguaa     6480
          uuuuucuaca aucuaaggag uaggccgguu ccuaacuuca guauacuccg uuaaacguau     6540
          cgguuagugu aacuaaugcu uuuuaccuua uuggugguuu ccuucaauag uuugccgggu     6600
          cacaaggcuc aauacccggu caagaaucca auagguagga auuagcucuc uugaguacuu     6660
          aaaaaacucu uuucagaaua uaugauguua ccuucugguc ugaacuacgc acaaguguug     6720
          uugugugacu aguuaaguug gaggguugcu caaacaaccg uuccuguucu cccaccugac     6780
          cuuccagaug ccguuuuucc uaccucauag gaguuagaug accaauaagu uucucuccga     6840
          uuuuagucuu ugugacgaca guuucagaac cguguuccac uauuaguuca auaaacgugu     6900
          gucauauuuu gcuucuuuag cucuuugcaa caucuuaaug ucccacgaga guuaguuuac     6960
          caaagauuau uacucuuuua auacugacgu uaguuuuauc ccugucccuu caauccugaa     7020
          aacuauuuac ugcuacucug auacguuaga cgucuaauga acuuaauacc uuuuuauggc     7080
          uaaaaggcac cucacuaauc ucccaaucuc ugguucucua ccagugcuca cugaacacag     7140
          ugguuacugg uuuaugggug aacacgauua uauuacucga gucaaaggug uuuacgagag     7200
          uggcaucgag uaaaacgacu cuuggguuag uuacgguacu augucauguu aauaaaaccc     7260
          uguaaacgau cugagaacaa cuacuacgua cuaggacgag aagcaguuag uaacauacuu     7320
          caaguucuau ucuauggccc gaacguguca agaugaaagu uuaugcggua caacauaaac     7380
          cugggaaggu aaccuccuca cagcccguac agaaacaggu ccaaaaacua aucucggaag     7440
          ggucuagggc auugucuuuc agagaguaag accucuaagu agguacaugu acgagcuuca     7500
          cucguagacu uccucuacuc acgucauaaa ccuuuggggc ucuaucgguu caaagcuuau     7560
          ugaguguauc uguucgauca ucuucuaggu uggagagacu uguagcgaua cccuuacuca     7620
          ggucgcuuga acaauuucug acuccaauuu uuuacgaauu agcuuaguuc uguuugguag     7680
          uccuuggucc acuaauuccu acguugguau auaaacauag uacuucuccu agccgagucu     7740
          ucaaagaaua ccaguuauuu aggagacaag ggaucuaaaa auucacuuaa guuuaguccg     7800
          ugaaaaaacc cucagcgucu gcccgaguag ucagauaaag uuuuaagagc augauaagcc     7860
          uugaggaaau ucuuuuucau aguaucccuu aaccuacuaa acuaacacuc cucacuccau     7920
          aggagaaacu guguaaaucc cuuugaagua aacucuuccc cuaguacauu uuacaccugu     7980
          acaagucgau gaguacgacu guguaauucu auguuuagga ccccggcaug ucaauaaccc     8040
          uguugacaug ggguagguaa ucuuuacaac ccagguguug uagcuuuucu cugaggaaca     8100
          cgugguacau uguguagucc caaguuaaua caaagacacg uaacaggucu gcccuaggua     8160
          cugcagaaau caagugcccc ugguaacgga cgaauagauc ccagauuuug uagacuuaga     8220
          uguagauaaa acgucggaac ccuuucccuu ucguuucagg gugacuaauu uucucgaugu     8280
          gcagaaucuc uacgauagag aaccaaacaa cuugggcuga gauuugaucg uuacugauau     8340
          gaaagauugu aggugagaaa uuguccgcuu cuuaccuggu uuuccgucgu acccaaguuu     8400
          ucuuguccca gacgggaagu auccaaaagc uguagagccu acucgguacc acccaagcgu     8460
          agagucucgu gacgucguaa cugguccaac uaccguugau gucuguggua cucccuagac     8520
          ccucuagucu uaaagcugaa aaauaagguu cguugcaacg agauacgagu uuaauggugg     8580
          ugacaacguu cucugccuac cuagugguca acaugucuag uaauaguaua acggacauuc     8640
          aggacaaacu cuggguaucu ucucuagugg gaccugaguu cauaccugau gugcgggggu     8700
          cuacauaggg uacacgacuu cuguaccucc uuaccccuuc caagcacccc uguucucuau     8760
          uuugucuaga uaggaaaucu ucccuuaacc uucuuaaauc guggacgacu cguuaggaua     8820
          guucagccgu cuacauaucc aaaagauaua ccucugaacc gcauaucuuu uagaugagua     8880
          cggcuccugu caagagauaa aggagauaga uauguuccag cauaaucucc agcuccaaag     8940
          aauuuuccca acgaucugcc uaauuacucu cguucaacga cgguucauua uguggccucu     9000
          ucagaccgag uaaacuucuc cggccgguug cgucacaugc cuccaaacua aaugaacuaa     9060
          cuauuuaacu cacauagugg agguaaggaa agagaaugau cuaguccugg auaaucucug     9120
          cuuaaucuuu gcuaaggggu guucuagggu uggaggauag gcuguucguu ggcacuauac     9180
          ccccacuaac agucuuuaau gaaguuuaug guuacggcag auuaacuuuu cccuuuuaug     9240
          ucuaguguaa uaaguguuaa uaccaauaag agucuacaga auagguaucu gaaguaaccu     9300
          gguaagagau aaagguggug ggagaacguu uaggauaugu ucgguaaaaa uagacccuuu     9360
          cuauucuuac ucaacucucu cgaccguuua gaaagaagua acgauucuag uccucucccc     9420
          acccuucugu auguacacuu uaagaagugg uuccuguaua auaacacagg ucuccuuuag     9480
          ucuguacgaa cguucaagcc cuaacgauuc cuauuauuau uucuguacuc gauaggggga     9540
          accccuuccc uuaggucucc cuguuaaugu uguuagggac aaauaauaug cuggugggga     9600
          auggguuucu acgaucucua cggagguucu uagguuuuag gggacgacag gccuuagucc     9660
          aacccgguua augguugacc gcgaguaaua uuuuaagccu cauauaaugu accuuacccu     9720
          uagguaaugu cccugaagaa cucaacaccu cugccgaggc cucccuacug acgacguaau     9780
          gaugcucuuu uacacguauc gucuccuuau aaguuaucag acaaucuuaa uagucccagu     9840
          caguacgcuc cgcggagagg acucgggggg ucacgggauc uuugaaaucc uccucuauuu     9900
          agcucuacac auuuaccacu uuguacaacc cuuauaggua gacugaauac acuggguucc     9960
          ugaacccuga uaaaggaggc ugaguuucgu ccgaaccccg aaguuuaacu aaauuaacau    10020
          uaccuauacc uucaagcccu aagaagauga ucggacuuuu aacucugcuu acaaucuuua    10080
          auacacgugg ccuaaaaccu acucguuccu caaaauuaga uguucugaau accuuguaua    10140
          uaaacacucu cgcuuuucuu acgucauugu uaggaaccag gguacaaguu cugccagcug    10200
          aaucaaguuu gucuuaaauc aucaagaguu ugcagacuuc auauauacca uacauuucca    10260
          aacuucuuua auuagcuacu uggguuaggg cuaaccagaa gguaguuacu uaggaccuuu    10320
          uuggacaugc guaaggucag uagucuuguc cuuaaacggu cucguuucuu ccaaucaugu    10380
          augaaaugga acuguccaua agggaggguu aaguaaggac uaggaaaaca uuuguaacuc    10440
          ugauacgaug uuuauaagcc ucaugggugc ccacacagag uacgccgacg gaauuuuagu    10500
          agacuaucug gacgucuaaa uaacugguaa ucggaaaaaa uauaccgcua auauagcaua    10560
          auauuguagu uaguauaguc ucauccuggc uauggaggcu ugggggguag ucuaccuuaa    10620
          cguguuuuac accccuagcg auauugacca uauucgaaaa ccgacucaaa cuaccucuuu    10680
          cuguaaggug auauaguugu cacaaaucgu caauaggucg uuaguaaggg cuaauccacc    10740
          cuccgacaaa gucauuuucc uccuauguuc gucuucaccu caugaucucc acuacccgag    10800
          gguuuucuau gggcuuaaag ucugaggaac cgggguuagc ccuugaccua gucuagagac    10860
          cuuaaccagg cuuugguuca agcagauuua gguaaguuac ucuagaacaa guuagucgau    10920
          acagcauguc accuauuagu aaacuuuacc aguuuaaacg cuucuuugug uccuuacuaa    10980
          cuuaccuagu uaucugcuua aaguuuucuu cuggccagau augacuacaa cuucucacug    11040
          gaugugcucc uuuugagaac cucucuaauu uuuuaguacu ccucugaggu uugaaauuca    11100
          uacuuuuuuu gaaacuagga auucugggag aacaccaaaa auaaaaaaua gaccaaaaca    11160
          ccagaagca                                                            11169
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Claims (35)

  1. 一種在細胞培養物中製備桿狀病毒之方法，其包含以下步驟： (i)    藉由以下從該細胞培養物中獲得桿狀病毒收穫物： a.  向該細胞培養物中直接添加病毒釋放劑，隨後較佳地經由深度過濾、切向流過濾或離心來澄清該細胞培養物，以及回收上清液中之該桿狀病毒收穫物， 或 b.  使該細胞培養物經受過濾步驟，較佳為深度過濾，隨後用病毒釋放劑沖洗過濾器，較佳為深度過濾器，以及回收該上清液中之該桿狀病毒收穫物。
  2. 如請求項1之方法，其中該桿狀病毒為水皰病毒，較佳為水皰性口炎病毒。
  3. 如請求項2之方法，其中該水皰性口炎病毒之醣蛋白G係經淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中步驟(ia)中之該病毒釋放劑為固體鹽或鹽水溶液，且步驟(ib)中之該病毒釋放劑為鹽水溶液。
  5. 如請求項4之方法，其中在步驟(ia)中，該細胞培養物中之鹽濃度增加了至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或0.5 M，且步驟(ib)中之該鹽水溶液之濃度為至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或0.5 M。
  6. 如請求項4之方法，其中在步驟(ia)中，該細胞培養物中之鹽濃度增加，且在步驟(ib)中，該鹽水溶液之濃度為約0.01 M至約5 M、約0.05 M至約5 M、約0.1 M至約5 M、約0.15 M至約5 M、約0.2 M至約5 M、約0.25 M至約5 M、約0.3 M至約5 M、約0.35 M至約5 M、約0.4 M至約5 M、約0.45 M至約5 M、或約0.5 M至約5 M。
  7. 如請求項4之方法，其中該鹽為NaCl、KCl、MgCl 2、CaCl 2、NH 4Cl、硫酸銨、乙酸銨或碳酸氫銨。
  8. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該病毒釋放劑為胺基酸，較佳為極性、酸性或鹼性胺基酸，更佳為精胺酸。
  9. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該病毒釋放劑為硫酸化多醣，較佳為硫酸葡聚糖。
  10. 如請求項1至3中任一項之方法，其中在步驟(ia)中，藉由向該細胞培養物中添加該病毒釋放劑，使該細胞培養物之離子強度較佳地增加了至少大致0.01 M、或至少大致0.05 M、或至少大致0.1 M、或至少大致0.15 M、或至少大致0.2 M、或至少大致0.25 M、或至少大致0.3 M、或至少大致0.35 M、或至少大致0.4 M、或至少大致0.45 M、或至少大致0.5 M、或約0.01 M至約5 M、或約0.05 M至約5 M、或約0.1 M至約5 M、或約0.15 M至約5 M、或約0.2 M至約5 M；且在步驟(ib)中，用含病毒釋放劑之水溶液沖洗該過濾器，該水溶液之離子強度為至少大致0.01 M、至少大致0.05 M、或至少大致0.1 M、或至少大致0.15 M、或至少大致0.2 M、或至少大致0.25 M、或至少大致0.3 M、或至少大致0.35 M、或至少大致0.4 M、或至少大致0.45 M、或至少大致0.5 M、或約0.01 M至約5 M、或約0.05 M至約5 M、或約0.1 M至約5 M、或約0.15 M至約5 M、或約0.2 M至約5 M。
  11. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該桿狀病毒係在哺乳動物宿主細胞、較佳地HEK293細胞中製備。
  12. 如請求項11之方法，其中該哺乳動物宿主細胞係在懸浮液中培養。
  13. 如請求項1至3中任一項之在細胞培養物中製備桿狀病毒之方法，其進一步包含以下步驟： (ii)   (視情況選用)較佳地藉由稀釋、透濾或透析來降低在步驟(ia)或(ib)之後獲得的收穫物之鹽濃度， (iii)  (視情況選用)用DNA降解核酸酶，較佳用苯甲酶或鹽活性核酸酶處理該桿狀病毒收穫物， (iv)   藉由在陽離子交換劑上裝載在步驟(i)至(iii)中之任一者之後獲得的溶液來捕獲該桿狀病毒， (v)    溶離該桿狀病毒且回收該溶離液， (vi)   (視情況選用)較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉步驟(vii)之該桿狀病毒溶離液， (vii)  (視情況選用)較佳地經由超濾及透濾或透析來交換經精煉桿狀病毒溶離液之緩衝液， (viii) (視情況選用)無菌過濾桿狀病毒。
  14. 如請求項13之方法，其中該陽離子交換劑為單石(monolith)、樹脂或膜。
  15. 如請求項14之方法，其中該陽離子交換劑為單石吸附劑。
  16. 如請求項1至3中任一項之方法，其中將該桿狀病毒調配至醫藥組合物中。
  17. 一種從感染有桿狀病毒之細胞培養物中純化該桿狀病毒之方法，其包含以下步驟： (i)    藉由以下從該細胞培養物中獲得桿狀病毒收穫物： a.  向該細胞培養物中直接添加病毒釋放劑，隨後較佳地經由深度過濾、切向流過濾或離心來澄清該細胞培養物，以及回收上清液中之該桿狀病毒收穫物， 或 b.  使該細胞培養物經受過濾步驟，較佳為深度過濾，隨後用病毒釋放劑沖洗過濾器，較佳為深度過濾器，以及回收該上清液中之該桿狀病毒收穫物。
  18. 如請求項17之方法，其中該桿狀病毒為水皰病毒，較佳為水皰性口炎病毒。
  19. 如請求項18之方法，其中該水皰性口炎病毒之醣蛋白G係經淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換。
  20. 如請求項17至19中任一項之方法，其中步驟(ia)中之該病毒釋放劑為固體鹽或鹽水溶液，且步驟(ib)中之該病毒釋放劑為鹽水溶液。
  21. 如請求項20之方法，其中在步驟(ia)中，該細胞培養物中之鹽濃度增加了至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或0.5 M，且步驟(ib)中之該鹽水溶液之濃度為至少大致0.01 M、0.05 M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M或0.5 M。
  22. 如請求項21之方法，其中在步驟(ia)中，該細胞培養物中之鹽濃度增加，且在步驟(ib)中，該鹽水溶液之濃度為約0.01 M至約5 M、0.05 M至約5 M、約0.1 M至約5 M、約0.15 M至約5 M、約0.2 M至約5 M、約0.25 M至約5 M、約0.3 M至約5 M、約0.35 M至約5 M、約0.4 M至約5 M、約0.45 M至約5 M、或約0.5 M至約5 M。
  23. 如請求項20之方法，其中該鹽為NaCl、KCl、MgCl 2、CaCl 2、NH 4Cl、硫酸銨、乙酸銨或碳酸氫銨。
  24. 如請求項17至19中任一項之方法，其中該病毒釋放劑為胺基酸，較佳為極性、酸性或鹼性胺基酸，更佳為精胺酸。
  25. 如請求項17至19中任一項之方法，其中該病毒釋放劑為硫酸化多醣，較佳為硫酸葡聚糖。
  26. 如請求項17至19中任一項之方法，其中在步驟(ia)中，藉由向該細胞培養物中添加該病毒釋放劑，使該細胞培養物之該離子強度較佳地增加了至少大致0.01 M、或至少大致0.05 M、或至少大致0.1 M、或至少大致0.15 M、或至少大致0.2 M、或至少大致0.25 M、或至少大致0.3 M、或至少大致0.35 M、或至少大致0.4 M、或至少大致0.45 M、或至少大致0.5 M、或約0.01 M至約5 M、或約0.05 M至約5 M、或約0.1 M至約5 M、或約0.15 M至約5 M、或約0.2 M至約5 M；且在步驟(ib)中，用含病毒釋放劑之水溶液沖洗該過濾器，該水溶液之離子強度為至少大致0.01 M、或至少大致0.05 M、或至少大致0.1 M、或至少大致0.15 M、或至少大致0.2 M、或至少大致0.25 M、或至少大致0.3 M、或至少大致0.35 M、或至少大致0.4 M、或至少大致0.45 M、或至少大致0.5 M、或約0.01 M至約5 M、或約0.05 M至約5 M、或約0.1 M至約5 M、或約0.15 M至約5 M、或約0.2 M至約5 M。
  27. 如請求項17至19中任一項之方法，其中該桿狀病毒係從哺乳動物宿主細胞、較佳地HEK293細胞中純化。
  28. 如請求項27之方法，其中該哺乳動物宿主細胞係在懸浮液中培養。
  29. 如請求項17至19中任一項之純化桿狀病毒之方法，其進一步包含以下步驟： (ii)   (視情況選用)較佳地藉由稀釋、透濾或透析來降低在步驟(ia)或(ib)之後獲得的收穫物之鹽濃度， (iii)  (視情況選用)用DNA降解核酸酶，較佳用苯甲酶或鹽活性核酸酶處理該桿狀病毒收穫物， (iv)   藉由在陽離子交換劑上裝載在步驟(i)至(iii)中之任一者之後獲得的溶液來捕獲該桿狀病毒， (v)    溶離該桿狀病毒且回收該溶離液， (vi)   (視情況選用)較佳地經由尺寸排阻、多模態尺寸排阻、離子交換及/或切向流過濾來精煉步驟(vii)之該桿狀病毒溶離液， (vii)  (視情況選用)較佳地經由超濾及透濾或透析來交換經精煉桿狀病毒溶離液之緩衝液， (viii) (視情況選用)無菌過濾桿狀病毒。
  30. 如請求項29之方法，其中該陽離子交換劑為單石、樹脂或膜。
  31. 如請求項30之方法，其中該陽離子交換劑為單石吸附劑。
  32. 如請求項17至19中任一項之方法，其中將該桿狀病毒調配至醫藥組合物中。
  33. 一種水皰性口炎病毒，其中該水皰性口炎病毒之醣蛋白G係經淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白GP置換、根據如請求項1至16中任一項之方法製備或根據如請求項17至32中任一項之方法純化。
  34. 如請求項33之經製備或純化之水皰性口炎病毒，其中該水皰性口炎病毒之RNA基因體由與SEQ ID NO: 12至少98%、至少99%或100%一致的編碼序列組成。
  35. 如請求項33或34之經製備或純化之水皰性口炎病毒，其中如藉由TCID 50/mL所量測，感染性粒子之量為至少約1×10 9、2×10 9、3×10 9、4×10 9、5×10 9、6×10 9、7×10 9、8×10 9、9×10 9個或至少約1×10 10個。
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