ES2769643T3

ES2769643T3 - Procedimiento para purificar partículas similares a virus (VLP)

Info

Publication number: ES2769643T3
Application number: ES12753905T
Authority: ES
Inventors: Victoria Demina; Heiko Manninga
Original assignee: Life Science Inkubator Betriebs GmbH and Co KG
Current assignee: Life Science Inkubator Betriebs GmbH and Co KG
Priority date: 2011-08-02
Filing date: 2012-08-01
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2032-08-01
Also published as: EP2739725A1; EP2739725B1; US20140309408A1; WO2013017272A1; SI2739725T1; US9868762B2; DK2739725T3; EP2554664A1

Abstract

Procedimiento para la purificación de partículas similares a virus (VLP), caracterizado porque se filtra una composición que contiene VLP por un medio filtrante con un límite de exclusión de más de 30 kDa a 1500 kDa, en cuyo caso como composición que contiene VLP se usa el sobrenadante del cultivo de las células que expresan VLP (sobrenadante de cultivo celular), en donde las VLP se componen de la proteína estructural VP1 del virus JC humano y con la filtración se efectúa al mismo tiempo una reamortiguación de pH) de la composición que contiene VLP.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para purificar partículas similares a virus (VLP)

La presente invención se refiere a un procedimiento para purificar composiciones que contienen VLP y composiciones que contienen VLP de alta pureza y a su uso en procedimientos de diagnóstico o terapéuticos.

En el desarrollo de procedimientos de diagnóstico o terapéuticos específicos, el uso de sistemas de transferencia (delivery systems) que permiten una transferencia, específica para células tanto como es posible, de sustancias tales como ácidos nucleicos, marcadores o sustancias activas es de gran importancia. para esta transferencia específica para células se ha desarrollado, entre otros, un sistema a base de “partículas similares” a virus (VLP por virus like particles) (publicaciones WO 97/19174; EP 1270586 B1). La base de este sistema es la propiedad de las VLPs, por ejemplo, de poder empacar sustancias activas o ácidos nucleicos y luego insertarlos específicamente en determinadas células.

Las VLPs se pueden preparar, por ejemplo, mediante la expresión recombinante de la proteína estructural principal VP1 del poliomavirus humano JCV (VP1-VLP). A diferencia de la expresión de VP1 de otros virus de polioma, Las VP1-VLP se secretan en el sobrenadante de los cultivos de células anfitrionas. Ya se han desarrollado varios procedimientos para purificar el VP1-VLP del sobrenadante del cultivo celular. Sin embargo, todos estos no son adecuados para preparar VLP a escala comercial (gran escala). Esto es válido principalmente si el procedimiento de preparación debe ser certificable por GMP, ya que la pureza dla VLP está sujeta a requisitos particularmente altos. Por ejemplo, Goldmann et al. (J. Virol., 1999, 73: 4465-4469) describen la purificación de VP1-VLP expresada en células de insecto mediante centrifugación por densidad con una solución de sacarosa al 40% seguida de una centrifugación por densidad con sacarosa al 40% y metrizamida (2-({3-(acetilamino)-5-[acetil(metil)amino]-2,4,6-triyodobenzoilo}amino)-2-desoxi-D-glucopiranosa al 50% . Este procedimiento no solo es inadecuado para la producción a gran escala. Las proteínas VP1 así proporcionadas también están contaminadas con fragmentos de VP1 de 38 y 40 kDa.

Para la purificación de VLP recombinante a partir de células de E. coli lisadas, Pushko et al. (Protein Engineering, 1993, 6(8): 883-891) usan una precipitación con sulfato de amonio seguida de cromatografía de permeación en gel usando una columna Sephadex G25 y una columna G100.

Por la publicación WO 92/13081 A1 se conoce un procedimiento de purificación para el aislamiento de VLP derivada de MS-2 por precipitación fraccionada con sulfato de amonio y posterior precipitación por puntos isoeléctricos, centrifugación por densidad de sacarosa y cromatografía de permeación en gel.

En la publicación WO 2006/136566 A9 se describe la purificación de VLP recombinante expresada de modo bacteriano mediante cromatografía de intercambio aniónico seguida de una columna de hidroxilapatita y una cromatografía de permeación en gel opcional.

Citkowicz et al. (Anal. Biochem., 2008, 376(2): 163-172) describen un procedimiento de purificación de VLP en el que las VLP se separan primero de los residuos celulares mediante centrifugación y luego se precipita el sobrenadante que contiene VP1-VLP usando PEG. Luego se filtra por medio de un filtro de acetato de celulosa de 0,22 |jm. Las VLP se recogen en el filtrado y se purifican adicionalmente.

Los procedimientos conocidos del estado de la técnica no son lo suficientemente adecuados para preparar la VLP fuera de la escala del laboratorio, ya que son muy complejos, no permiten la ampliación a un procedimiento industrial y/o no cumplen con los altos requisitos de un procedimiento conforme con GMP. Esto último es válio sobre todo debido a las impurezas que se pueden incluir en las VLP.

Por lo tanto, la invención se basa en el objetivo de proporcionar un procedimiento de preparación de VLP que al menos reduzca o incluso evite en gran medida una desventaja de los procedimientos de preparación conocidos. Este objetivo se consigue según la invención mediante el procedimiento según la reivindicación principal. Las formas de realización ventajosas son objeto de las reivindicaciones dependientes correspondientes. También se reivindican composiciones de VLP de determinada pureza; así como proteínas ventajosas de VP1.

La presente invención proporciona un procedimiento para purificar eficazmente VLP. El procedimiento tiene la ventaja particular de que se permite la preparación a gran escala, que también cumple con los altos requisitos para un procedimiento de GMP (“buenas prácticas de fabricación”).

El procedimiento de acuerdo con la invención para la purificación de VLP se caracteriza porque una composición que contiene VLP se filtra a través de un medio filtrante, en particular una membrana; el medio filtrante tiene un límite de exclusión (corte de peso molecular (MWCO) de más de 30 kDa hasta 1500 kDa y como composición que contiene VLP se usa el sobrenadante de cultivo celular de células que expresan VLP. Los inventores han descubierto que, con una etapa así al comienzo de un procedimiento posterior que se lleva a cabo en todo caso después de al menos una etapa de cromatografía del estado de la técnica, es posible una purificación simple y eficiente de las VLP.

Cuando la VLP se filtra a través del medio filtrante utilizado según la invención, los posibles contaminantes pasan a través del medio filtrante y se acumulan en el filtrado, mientras que las VLP de alto peso molecular permanecen en el retenido en forma purificada. Este procedimiento de una sola etapa permite, por lo tanto, una separación sencilla de las VLP de las impurezas presentes en la composición.

Dependiendo del procedimiento, se puede lograr una concentración de la composición que contiene VLP en esta etapa de purificación, ya que el volumen líquido del retenido disminuye naturalmente durante la filtración y aumenta la fracción relativa de VLP en el retenido. La concentración es una ventaja en muchos procedimientos de purificación, porque las etapas posteriores como, por ejemplo, una purificación por cromatografía en columna, se pueden llevar a cabo de manera más eficiente y rentable.

Además, esta etapa de purificación se usa para cambiar las condiciones de solución de la composición que contiene VLP, por ejemplo, intercambiando el regulador de pH (denominado, re-amortiguación). Este procedimiento también se conoce como diafiltración.

El procedimiento de purificación de acuerdo con la invención también tiene al menos una de las siguientes ventajas:

• es un procedimiento de purificación suave que deja las VLP en su forma nativa, tanto como es posible, lo cual es esencial para su actividad. Por lo contrario, en procedimientos del estado de la técnica se dan parcialmente cambios en la superficie de VLP (por ejemplo, con respecto a los cambios en la carga), que pueden afectar negativamente el uso posterior o el tratamiento de las VLP.

• Se puede evitar el uso de disolventes orgánicos, que de lo contrario pueden traer consigo el riesgo de desnaturalización de proteínas.

• El medio iónico y el pH de la composición que contiene VLP se pueden mantener si es necesario.

• La etapa de filtración de acuerdo con la invención es rápida y económica. También es eficiente y puede usarse para purificación, concentración y/o amortiguación del pH al mismo tiempo.

• Se puede llevar a cabo a bajas temperaturas como, por ejemplo, en una habitación fría.

Sin embargo, la ventaja particular del procedimiento de acuerdo con la invención es que se puede lograr una mejora significativa en la pureza de las VLP en una composición altamente compleja y altamente contaminada en una sola etapa. Esto también se aplica a composiciones tan complejas como un sobrenadante de cultivo celular. Por lo tanto, la pureza de la composición que contiene VLP después de la filtración de acuerdo con la invención puede ser de al menos 70 %, ventajosamente de al menos 75% o de al menos 80%. La pureza se puede aumentar mediante procedimientos de purificación adicionales.

Definiciones

A menos que se especifique lo contrario, los términos utilizados en la descripción y las reivindicaciones tienen los significados que se definen a continuación:

el término “partículas similares a virus (VLP)” en el sentido de la invención se refiere a una estructura en forma de partículas en la que varias proteínas están presentes en forma agregada, en cuyo caso preferiblemente encierran un espacio vacío. Al menos una parte de las proteínas formadoras de estructura es idéntica a o derivada de proteínas estructurales virales (proteínas de la cápside), en particular de virus de la familia Papoviridae. Esto incluye la familia Papillomaviridae y la familia Polyomaviridae. Las VLP también pueden provenir de otras familias de virus, como, por ejemplo, la familia de Parvoviridae, Flavoviridae y Retroviridae. Las VLP según la invención se componen a partir de la proteína estructural VP1 del virus JC humano.

Se forma preferiblemente una VLP de 60, 72, 120, 180, 240, 300, 360 y más de 360 proteínas estructurales virales y puede tener una estructura tubular o esférica. Una VLP que consta de 360 proteínas estructurales generalmente está compuesta por 72 pentámeros, cada uno de los cuales está formado por cinco proteínas estructurales monoméricas. Las proteínas estructurales y los pentámeros pueden agregarse por unión no covalente o covalente de las proteínas. En el caso de un enlace covalente, se prefiere la formación de puentes disulfuro.

Una VLP puede construirse a partir de una multiplicidad de una sola proteína estructural, o puede comprender diferentes proteínas estructurales. Se prefiere la presencia de una sola proteína estructural, concretamente VP1. Se divulgan proteínas estructurales de las VLP, en particular la VP1 (pero también la VP2 y/o la VP3) que son idénticas a o derivadas de las proteínas estructurales, por ejemplo, de los siguientes virus de la familia de los Polyomaviridae: poliomavirus de cercopithecus (mono verde) (AGMPyV), poliomavirus de babuino 2 (BPyV-2), poliomavirus Humano 1 (BK Virus, BKV o BKPyV), poliomavirus Humano 2 (JC Virus, JCV o JCPyV), poliomavirus bovino (BPyV), poliomavirus de periquito (poliomavirus de enfermedad de polluelo, BFPyV), poliomavirus de hámster (HaPyV), virus neumotrópico de murino (MPtV), poliomavirus de murino (MPyV), poliomavirus de conejo (virus vacuolado de riñon de conejo Rabbit kidney vacuolating virus, RKV), virus de simio 12 (SV-12), virus de simio 40 (SV-40), poliomavirus de cuervo, poliomavirus hemorrágico de ganso (GHPV), poliomavirus de células de Merkel, poliomavirus de chimpancé, poliomavirus de pinzón y poliomavirus KI (KIV).

Sin embargo, las VLP también pueden corresponder a o derivarse de las proteínas estructurales de los virus, preferiblemente el L1 (pero también el L2) de la familia Papillomaviridae, por ejemplo de los siguientes géneros de virus: alfa-papilomavirus, beta-papilomavirus, gamma-papilomavirus, delta-papilomavirus, épsilon-papilomavirus, zeta-papilomavirus, etapapilomavirus, thetapapilomavirus, iotapapilomavirus, kappapapilomavirus, lambdapapilomavirus, mupapilomavirus, nupapilomavirus, xipapilomavirus, omikronpapilomavirus, pipapilomavirus, papilomavirus de trichosurus vulpécula (zarigüeya australiana) y papilomavirus de didélfido.

La VLP de la invención también puede tener una o más proteínas heterólogas adicionales en la cápside: es decir, proteínas que no son idénticas o similares a una proteína de un virus de la familia Papoviridae. En principio, todas las proteínas que pueden incorporarse a la cápside o que se unen a la cápside y que no perjudican significativamente el ensamblaje de la VLP son adecuadas como proteínas heterólogas.

Una “composición que contiene VLP” es cualquier composición que contiene VLP, preferiblemente un líquido. El término “líquido”, a diferencia de un sólido, incluye todas las composiciones fluidas, incluyendo líquidos altamente viscosos, aceitosos o bituminosos. La composición puede ser monofásica o multifásica. Las VLP pueden estar disuletas, pero opcionalmente también pueden presentarse en forma de partículas dispersas o suspendidas con la formación de agregados.

Según la invención, el término "medio filtrante" se refiere a cualquier medio que permita la separación de sólido/líquido. Preferiblemente tiene la forma de una matriz porosa que separa al menos dos compartimentos y permite la etapa de sustancias individuales de un compartimento a al menos un segundo compartimento. Cualquier procedimiento que se lleve a cabo utilizando un medio filtrante debe entenderse como "filtración" dentro del alcance de la presente invención.

Una "membrana" en el sentido de la invención es una estructura que generalmente es extendida superficialmente y tiene poros. La membrana es preferiblemente flexible y consiste en un polímero o una mezcla de polímeros. Según la invención, el polímero utilizado es, en particular, polietersulfona o celulosa (en particular celulosa regenerada). Según la invención, el "límite de exclusión" (también "límite de separación") indica la tasa de retención de filtración. Por lo general, se relaciona con la masa molar y se indica en daltons (NMWC, inglés: corte de peso molecular nominal, también MWCO, corte de peso molecular). Se define como la masa molecular mínima de una molécula retenida por el medio filtrante.

Un "pentámero" en el contexto de la invención es una estructura que está formada por cinco subunidades de polipéptidos. La unión entre las subunidades de polipéptidos individuales puede tener lugar por unión no covalente o covalente. Las cinco subunidades a menudo forman una estructura anular con simetría pentagonal. Como regla general, cada subunidad interactúa con dos subunidades vecinas.

En el contexto de la invención, "disociación" significa el procedimiento en el cual la integridad de la VLP se ve afectada de tal manera que el espacio preferiblemente encerrado por la VLP entra en contacto con el medio externo que rodea la VLP y/o las proteínas de la cápside se separan de la VLP. Por lo general, esto se logra mediante la escisión de algunos polipéptidos o proteínas que forman la VLP. Aquí, la VLP también puede descomponerse enteramente en sus subunidades como, por ejemplo, los pentámeros VP1 o L1.

Según la invención, una "reasociación" es una restauración parcial o completa de una VLP a partir de una disociación de VLP previa.

La abreviatura "GMP" es el nombre corto de "Reglamento de buenas prácticas de fabricación". Estas reglas básicas de la Organización Mundial de la Salud compilan las reglas y medidas reconocidas para la fabricación de productos medicinales y alimenticios, que garantizan una producción segura para el consumidor (paciente o consumidor) con base en el estado actual de la técnica. Además del equipo adecuado para el personal, las habitaciones y las máquinas, las reglas de GMP requieren un sistema de medidas de seguridad que se extienda desde la inspección entrante hasta la inspección saliente durante todo el procedimiento de fabricación.

Las "impurezas" deben entenderse como aquellos componentes de la composición que contiene VLP que no son deseables en la composición y, por lo tanto, deben agotarse tanto como sea posible. Estas pueden ser, por ejemplo, sales, compuestos de bajo peso molecular o también macromoleculares. La extracción de las impurezas conduce a un aumento en la pureza de la sustancia deseada, es decir a un aumento en el contenido material de la sustancia deseada (aquí VLP) con respecto a toda la mezcla de sustancias. Los términos "intercambiador de aniones" o "matriz de intercambiador de aniones" son sinónimos y ambos se refieren a sustancias naturales o artificiales que pueden unir aniones y pueden intercambiarlos por aniones de un medio circundante. Un intercambiador de aniones transporta iones positivos e intercambia contraiones cargados negativamente.

Los "intercambiadores de aniones fuertes" en el sentido de la invención llevan grupos de amonio cuaternario de tipo I:

© ©

■N(CH3)3 x

o del tipo II:

que se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, cloruro, sulfato, bromuro, yoduro, fluoruro, sulfuro, hidrosulfato, sulfuro de hidrógeno, fosfato, difosfato, monofosfato, carbonato, bicarbonato (hidrocarbonato), citrato, tartrato y ftalato. Una columna disponible comercialmente con una fuerte matriz de intercambio aniónico es, por ejemplo, la columna Mono Q de GE Healthcare (Munich, RFA).

Los "intercambiadores de aniones débiles" en el sentido de la invención portan grupos de amina terciaria o secundaria como grupos funcionales, tales como, por ejemplo, grupos dietilaminoetilo (DEAE). Una matriz de intercambio aniónico DEAE débil disponible comercialmente es, por ejemplo, el "adsorbente de membrana Sartobind Q" de Sartorius (Gottingen, RFA).

El término "ultrafiltración" se refiere a un procedimiento en el que un líquido (típicamente bajo presión) se pone en contacto con un medio filtrante, en particular una membrana semipermeable. La presión se puede aplicar ejerciendo una presión sobre el líquido ubicado sobre la membrana del filtro o centrifugando la unidad de filtro. Alternativamente, la etapa de la solución puede acelerarse aplicando una presión negativa debajo de la membrana del filtro. La membrana contiene poros de un tamaño definido para que las moléculas o complejos que son lo suficientemente pequeños como para ser porosos pasen a través de la membrana hacia el lado opuesto, mientras que permanecen las moléculas o complejos que son demasiado grandes para pasar a través de los poros en el lado de carga de la membrana. Las membranas de ultrafiltración generalmente consisten en polímeros o mezclas de polímeros y están diseñadas para un límite de separación de peso molecular específico (límite de exclusión).

El término "diafiltración" se refiere a una forma de ultrafiltración que combina las propiedades de la diálisis con las de la ultrafiltración. La adición de un disolvente al retenido de filtración permite cambiar o diluir el disolvente original (por ejempolo, "re-amortiguación").

Un "sobrenadante de cultivo celular" en el contexto de la invención es esa parte del cultivo celular que proviene de un cultivo celular y que está esencialmente libre de células que secretan VLP. En una forma de realización preferida de la invención, el sobrenadante de cultivo celular contiene menos del 5%, preferiblemente menos del 2%, en particular menos del 1% de células secretoras de VLP. El sobrenadante del cultivo celular generalmente contiene una alta proporción de contaminantes (por, ejemplo, restos celulares, proteínas o fragmentos de los mismos). El sobrenadante del cultivo celular puede tratarse, por ejemplo, química o físicamente. El sobrenadante también se puede centrifugar. Pero también puede dejarse sin tratar, es decir, por ejemplo, puede purificarse según la invención sin centrifugación. Preferentemente se centrifuga, pero no se trata química ni enzimáticamente. Según la invención, el término sobrenadante de cultivo celular presupone que el medio de partida cosechado no se ha cromatografiado. La "cromatografía" es un procedimiento que permite la separación de una mezcla de sustancias mediante una distribución diferente de sus componentes individuales entre una fase estacionaria y una móvil. En este sentido, la centrifugación no es cromatografía.

Una cromatografía de "fase inversa" es un procedimiento en el que la fase estacionaria es una fase no polar y la fase móvil es una fase polar. Cualquier sustancia inerte no polar que pueda empaquetarse como una columna puede usarse para cromatografía de "fase inversa". Ejemplos de fases estacionarias son un residuo octadecilo (C18) unido a sílice, un residuo octilo (C8), un material de sílice que lleva grupos ciano o grupos fenilo o material de sílice puro. Como una fase no polar. La elución en gradiente se usa a menudo en HPLC, por lo que la composición del disolvente se cambia lentamente (por ejemplo, de 80% a 20% de contenido de agua). Esto significa que los componentes no polares abandonan la columna muy tarde y los componentes polares muy temprano y, por lo tanto, es posible separarlos unos de otros.

Una "disrupción celular" en el contexto de la invención es una composición que resulta de la disrupción de las células. La disrupción como destrucción de la integridad celular puede lograrse mediante procedimientos químicos (por ejemplo, detergentes), procedimientos biológicos (por ejemplo, tratamiento enzimático) y/o procedimientos físicos (por ejemplo, tratamiento de ultrasonido, fuerzas de cizalla). En este sentido, la disrupción celular puede representar un sobrenadante de cultivo celular.

El término "mezcla de traducción in vitro sin células" se refiere a un procedimiento experimental en biología molecular con la ayuda de la cual las moléculas de ARNm aisladas de las células o generadas por medio de la transcripción in vitro se usan en el recipiente de reacción para la biosíntesis de proteínas (traducción). Son útiles los llamados sistemas de traducción in vitro que contienen las enzimas necesarias y las moléculas de ARNt, así como los aminoácidos, de modo que la síntesis de proteínas se produce después de la adición del ARNm. La metionina marcada con el isótopo de azufre 35S se agrega frecuentemente a la mezcla de reacción para poder detectar los productos de traducción. Los sistemas libres de células comunes son el extracto de germen de trigo y el lisado de reticulocitos.

La invención en detalle

De acuerdo con la invención, una composición que contiene VLP se filtra a través de un medio filtrante con un límite de exclusión de más de 30 kDa a 1500 kDa. Puede preferirse usar un medio filtrante con un límite de exclusión de al menos 40 kDa. En una forma de realización particular, el límite de exclusión del medio filtrante es de 80 a 1500 kDa; Se prefiere particularmente un límite de exclusión de aproximadamente 100 kDa.

Un medio filtrante que tiene un límite de exclusión en el intervalo mencionado anteriormente permite la separación eficiente de contaminantes de peso molecular más alto de la composición que contiene VLP mientras minimiza la pérdida de rendimiento de VLP.

La composición que contiene VLP es el sobrenadante del cultivo celular de las células secretoras de VLP. Este sobrenadante de cultivo celular puede tomarse directamente del cultivo celular y luego filtrarse de acuerdo con la invención. Sin embargo, en una forma de realización de la invención, también es posible que el sobrenadante de cultivo celular sea tratado de antemano, por ejemplo, química, enzimática o térmicamente. Bajo ciertas circunstancias, este tratamiento puede facilitar la filtración de acuerdo con la invención sin salir de la propia invención.

El medio filtrante que se puede usar según la invención puede consistir en un polímero o una mezcla de polímeros. Un polímero o mezcla de polímeros se selecciona preferiblemente del grupo que comprende celulosa, polietersulfona (PES), triacetato de celulosa (CTA), acetato de celulosa, nitrato de celulosa, poliacrilonitrilo (PAN), poliamida, policarbonato y politetrafluoroetileno (PTFE). Estos polímeros forman membranas de filtro estables que son inertes, no tienden a la agregación de proteínas y pueden propveer de cavidades de diámetro controlado.

En una forma de realización de la invención, al filtrar se crea una diferencia de presión entre 0,5 bares y 10 bares, preferiblemente entre 0,5 y 5 bares y de modo particularmente preferible entre 0,5 bares y 3 bares, entre el lado del filtrado y el compartimento del lado del retenido.

Numerosos procedimientos están disponibles para el experto en la materia para crear y regular una presión correspondiente. Al centrifugar la unidad de filtro, se puede ejercer una presión resultante sobre el retenido de acuerdo con la aceleración centrífuga. Además, aplicando una sobrepresión del lado retenido, por ejemplo, se puede generar una presión por medio de una bomba o un punzón. Alternativamente, la diferencia de presión también se puede generar aplicando una presión negativa en el lado del filtrado, por ejemplo, mediante una bomba de vacío. La diferencia de presión se puede mantener constante durante el tiempo de la purificación, pero también se puede generar una diferencia de presión variable en el tiempo que, por ejemplo, como programa de filtración, incluye diferentes fases con una duración de tiempo respectiva y una presión diferente.

En una forma de realización preferida, la filtración se puede llevar a cabo como la denominada "filtración de flujo transversal" (también llamada "flujo tangencial" o "filtración de flujo cruzado"). Aquí puede generarse un flujo cruzado a una alta velocidad, por ejemplo, de aproximadamente 2,5 a 3 m/s, que fluye a lo largo de una membrana o un medio filtrante. La alta velocidad evita que en la membrana pueda crearse una torta de filtro (capa superior o suciedad) a partir de las partículas sólidas que han de separarse.

En una forma de realización alternativa de la invención, la filtración también se puede llevar a cabo utilizando el procedimiento de dead-end (callejón sin salida). En la filtración dead-end, se bombea una corriente de alimentación contra la membrana con la presión más baja posible para minimizar la compactación de las sustancias retenidas. Debido al flujo de salida permanente del permeado, en la membrana se acumula una torta de filtro (capa superior o suciedad) o un gradiente de concentración (polarización de concentración) de las partículas de proteína a separar. La torta del filtro aumenta la resistencia a la filtración y, por lo tanto, la pérdida de presión a través de la membrana. Dependiendo de la composición de la alimentación, se debe eliminar a intervalos regulares mediante lavado a contracorriente (bombeando de nuevo el medio ya separado) y purificación química y, por lo tanto, el elemento del filtro se debe regenerar.

Según la invención, el medio filtrante puede tener diferentes geometrías, tal como puede formarse, por ejemplo, en forma de una membrana enrollada en espiral, membrana tubular o membrana de fibra hueca. La diferente geometría del filtro considera las condiciones del procedimiento con respecto al volumen de la solución, la concentración/cantidad de VLP o contaminantes o diferencia de presión aplicada.

Además del sobrenadante de cultivo celular ya mencionado, en el procedimiento de purificación divulgado también pueden usarse otras composiciones que contienen VLP. Por lo tanto, los posibles medios de acuerdo con la divulgación se seleccionan del grupo de los siguientes medios:

(a) sobrenadante de cultivo celular del cultivo de células que expresan VLP;

(b) sobrenadante de cultivo celular según (a) después de la purificación por centrifugación y/o diálisis;

(c) disrupción celular de (a);

(d) disrupción celular (posterior) después de la purificación por centrifugación y/o diálisis;

(e) mezcla de traducción in vitro sin células; o

(f) mezcla de traducción in vitro sin células después de la purificación por centrifugación y/o diálisis.

En otra forma de realización de la invención, además de la purificación, también se logra que se concentre la composición que contiene VLP. Esto sucede preferiblemente porque el volumen de material retenido que disminuye durante la filtración no se completa o se completa solo parcialmente.

Según la invención, además de la purificación, también se consigue una reamortiguación de pH de la composición que contiene VLP. Este intercambio de amortiguador tiene lugar preferiblemente porque el volumen de material retenido que disminuye durante la filtración se reemplaza por un amortiguador que tiene una composición que difiere con respecto al amortiguador de partida.

En una forma de realización preferida, el pH se reduce, y es ventajoso un pH cercano al valor de pI de las proteínas de la cápside. Para las VLP que consisten en VP1, este es un pH entre 5,0 y 8,0. Este valor de pH reducido da como resultado una estabilidad reducida de las VLP, que se pueden disociar más fácilmente en una etapa de disociación posterior y, por ejemplo, se deben usar cantidades más pequeñas de agente reductor disociador de puente disulfuro y agente complejante que enlaza iones Ca2+.

En una forma de realización de la invención, la composición que contiene VLP purificada usando el procedimiento de la invención se purifica me manera adicional mediante cromatografía, preferiblemente usando una cromatografía de intercambio aniónico.

La purificación adicional se lleva a cabo de modo preferido por separación usando un intercambiador de aniones (en particular débil). Este contiene grupos de amina primaria, secundaria o terciaria como grupos funcionales, en cuyo caso se prefieren los grupos dietilaminoetilo (DEAE). En una forma de realización preferida de la invención, la matriz de este intercambiador aniónico consiste en DEAE-Sepharose.

La elución de las VLP o los pentámeros VP1 de este intercambiador aniónico pueden prepararse según la invención mediante una solución que contiene NaCl que preferiblemente contiene NaCl en una concentración de 150 mM a 750 mM, de modo particularmente preferible NaCl de 300 mM.

En otra forma de realización de la invención, la purificación adicional de la VLP por medio de un intercambiador de aniones comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar la composición que contiene VLP purificada por ultrafiltración;

(b) poner en contacto la composición que contiene VLP con un intercambiador de aniones en condiciones que permitan que la VLP se una al intercambiador de aniones;

(c) lavado opcional del intercambiador de aniones;

(d) elución de la VLP unida;

(e) diálisis opcional de la VLP contra una solución acuosa.

Un intercambiador de aniones débil se utiliza preferiblemente para esto.

En otra forma de realización de la invención, la composición que contiene VLP purificada según la invención se purifica usando un intercambiador de aniones fuerte que contiene grupos de amonio cuaternario de tipo I o tipo II:

(Tipo I)

^{© G} ^N(CH3)2 X

_c 2 _h5_oh

" " (Tipo II)

donde X es un anión seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, cloruro, sulfato, bromuro, yoduro, fluoruro, sulfuro, hidrosulfato, sulfuro de hidrógeno, fosfato, difosfato, monofosfato, carbonato, bicarbonato (hidrocarbonato), citrato, tartrato o ftalato.

En un aspecto preferido de la invención, se usa una matriz Q-Sepharose o una columna MonoQ como el intercambiador de aniones fuerte.

La VLP puede eluirse del intercambiador de aniones fuerte por una o más soluciones acuosas que contienen NaCl. La concentración de NaCl se puede variar mediante un gradiente que aumenta linealmente o un gradiente escalonado.

Se prefiere un gradiente como el gradiente lineal de NaCl en el que la concentración de NaCl del amortiguador de elución aumenta de un NaCl inicial de 100 mM a 1 M. Se prefiere un gradiente de tres o cuatro etapas como el gradiente escalonado de NaCl.

El gradiente escalonado de NaCl de tres etapas puede consistir preferiblemente en las siguientes etapas:

(i) NaCl de 50 mM a 150 mM,

(ii) NaCl de 200 mM a 400 mM,

(iii) NaCl de 1 M a 2 M; o

El gradiente escalonado de NaCl de cuatro etapas puede consistir preferiblemente en las siguientes etapas:

(i) NaCl de 50 mM a 150 mM,

(ii) NaCl de 200 mM a 400 mM,

(iii) NaCl de 500 mM a 800 mM

(iv) NaCl de 1 M a 2 M.

En otra forma de realización de la invención, la composición que contiene VLP purificada usando el procedimiento de la invención se purifica adicionalmente mediante filtración en gel o mediante cromatografía en columna de hidroxiapatita cerámica. Estos procedimientos permiten que la VLP se separe de los monómeros de la cápsida u oligómeros de la cápsida como, por ejemplo, pentámeros.

En una forma de realización de la invención, las VLP purificadas por el procedimiento de acuerdo con la invención se purifican por un procedimiento de acuerdo con las siguientes etapas:

(a) disociación de las VLP;

(b) purificación de las VLP disociadas;

(c) Reasociación de las VLP disociadas.

La VLP se disocia preferiblemente en presencia de un agente reductor que disocia puentes de disulfuro y un agente complejante que une iones Ca2+.

En un aspecto de la invención, los compuestos que contienen azufre se usan como agentes reductores que disocian los puentes de disulfuro, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en 2-mercaptoetanol (2-ME), ditiotreitol (DTT), ditioeritrol (DTE), glutatión, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), monotioglicerina y de modo particularmente preferible DTT.

En los casos en que la toxicidad es particularmente crítica, se prefieren los agentes reductores que disocian puentes de disulfuro: 2-mercaptoetanol (2-ME) y monotioglicerina. 2-ME puede eliminarse fácilmente debido a su volatilidad, pero la monotioglicerina, por otro lado, también es adecuada para su posterior uso en cultivo celular.

Los agentes reductores que contienen azufre son agentes reductores débiles, pero su potencial redox es suficiente para reducir los puentes de disulfuro y formar los residuos de cisteína libres. El uso de tales agentes reductores débiles tiene la ventaja de que no se reducen otros grupos funcionales de la VLP y, de esta manera, se conservan esencialmente la integridad y la naturaleza nativa de las VLP. Según la invención, también es posible usar otros agentes reductores cuyo potencial redox se encuentre dentro del intervalo de los agentes reductores que contienen azufre mencionados anteriormente.

En otro aspecto de la invención, el agente complejante que enlaza el ion Ca2+, utilizado en la disociación, es un agente quelante, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicoltetraacético (EGTA) o las sales correspondientes de estos ácidos y particularmente se prefiere EGTA.

En una forma de realización de la invención, las VLP disociadas, que están presentes preferiblemente como proteínas de la cápside, de modo particularmente preferible como proteínas VP1 o L1, se purifican adicionalmente mediante cromatografía, preferiblemente usando cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de "fase inversa".

En una forma de realización preferida, se usa un intercambiador de aniones fuerte que contiene grupos de amonio cuaternario de tipo I o tipo II:

© ©

— N{CH3)s x

(Tipo I)

^{© G} ^N(CH3)2 X

_c 2 _h5_oh

" " Tipo (II)

donde X es un anión seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, cloruro, sulfato, bromuro, yoduro, fluoruro, sulfuro, hidrosulfato, sulfuro de hidrógeno, fosfato, difosfato, monofosfato, carbonato, bicarbonato, citrato, tartrato o ftalato.

Según la invención, la VLP disociada (o las proteínas estructurales de la misma) se puede eluir del intercambiador aniónico fuerte mediante una o más soluciones acuosas que contienen NaCl. La concentración de NaCl se puede variar mediante un gradiente que aumenta linealmente o un gradiente escalonado. Se prefiere un gradiente como el gradiente lineal de NaCl en el que la concentración de NaCl del amortiguador de elución aumenta de NaCl de 100 mM inicial a 1 M. Se prefiere un gradiente de tres o cuatro etapas como el gradiente escalonado de NaCl.

(i) NaCl de 50 mM a 150 mM,

(ii) NaCl de 200 mM a 400 mM,

(iii) NaCl de 1 M a 2 M; o

(i) NaCl de 50 mM a 150 mM,

(ii) NaCl de 200 mM a 400 mM,

(iii) NaCl de 500 mM a 800 mM

(iv) NaCl de 1 M a 2 M.

En otra forma de realización de la invención, la purificación de la VLP disociada por medio de un intercambiador de aniones comprende las siguientes etapas:

(c) poner en contacto la composición que contiene VLP disociada con un intercambiador de aniones en condiciones que permitan que la VLP disociada se una al intercambiador de aniones;

(d) lavado opcional del intercambiador de aniones;

(e) elución de la VLP disociada unida;

(f) diálisis opcional de la VLP disociada contra una solución acuosa.

Para ello se usa preferiblemente un intercambiador de aniones fuerte.

Según la invención, la VLP disociada también puede purificarse mediante un intercambiador aniónico débil. Este contiene grupos de amina primaria, secundaria o terciaria como grupos funcionales, en cuyo caso se prefieren los grupos dietilaminoetilo (DEAE). En una forma de realización preferida de la invención, la matriz del intercambiador aniónico débil consiste en DEAE-Sepharose.

De acuerdo con la invención, la VLP disociada se eluye del intercambiador aniónico débil mediante una solución que contiene NaCl que preferiblemente contiene NaCl en una concentración de 150 mM a 750 mM, de modo particularmente preferible NaCl de 300 mM.

(d) lavado opcional del intercambiador de aniones;

(e) elución de la VLP disociada unida;

(f) diálisis opcional de la VLP disociada contra una solución acuosa.

Un intercambiador de aniones débil se utiliza preferiblemente para esto.

En una forma de realización de la invención, las VLP disociadas se purifican por medio de cromatografía de fase inversa. Aquí se prefiere la purificación por "cromatografía líquida de alto desempeño" (HPLC) usando una columna de fase inversa. Esto permite que incluso grandes cantidades de VLP disociadas se purifiquen en poco tiempo. En otra forma de realización de la invención, las VLP disociadas se purifican usando cromatografía de permeación en gel. Este procedimiento se usa preferiblemente en casos en los que se usan proteínas de cápsida modificadas, a las que se les da un peso molecular diferente por la modificación (en particular inserciones o deleciones) y, por lo tanto, se pueden separar de las proteínas de cápsida no modificadas.

Las VLP disociadas pueden purificarse opcionalmente mediante una diálisis adicional para, por ejemplo, realizar un intercambio de los componentes del amortiguador. Para diálisis se usa preferiblemente un amortiguador de pH que es osmomolar con respecto a la sangre. Se prefiere particularmente el uso de solución salina fisiológica como amortiguador de pH de diálisis.

La diálisis se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura inferior a la temperatura ambiente, en cuyo caso se prefiere una temperatura de 5 ± 3°C. La duración de la diálisis es convenientemente de al menos 12 horas y preferiblemente es mayor de 16 horas. La diálisis puede durar hasta 48 horas.

Para almacenar las VLP disociadas, es ventajoso tomar las VLP disociadas en un amortiguador con un pH bajo (5,0 a 7,5) y con una mayor concentración de NaCl (250 mM a 500 mM). Esto evita la agregación. El almacenamiento se lleva a cabo a una temperatura de -80°C. Alternativamente, las VLP disociadas también pueden convertirse en una forma de almacenamiento estable mediante liofilización.

En una forma de realización particular, la VLP puede contener una o más sustancias en el interior de la estructura de la cápside. Dichas sustancias incluyen, por ejemplo, macromoléculas como, por ejemplo, ácidos nucleicos, es decir, ARN, ADN o ácidos nucleicos artificiales modificados, así como proteínas y otras sustancias fisiológicamente activas, que pueden ser naturales, sintéticas o recombinantes. Ejemplos de tales sustancias fisiológicamente activas son, por ejemplo, lípidos, fosfolípidos, péptidos, fármacos, toxinas, etc.

La VLP purificada y opcionalmente cargada con sustancia activa puede reasociarse mediante diálisis con un amortiguador de reasociación que contiene cationes divalentes o, si no, el catión monovalente Rb+. Este amortiguador contiene preferiblemente un catión seleccionado del grupo que consiste en Mg2+, Rb+ o Zn2+ y de modo particularmente preferido Ca2+. El amortiguador de reasociación contiene 0,1 mM a 10 mM de iones Ca2+, preferiblemente 0,5 mM a 5 mM de iones Ca2+ y en especial 1 mM de CaCl².

En otra forma de realización de la invención, las VLP cargadas con la sustancia activa se purifican por medio de cromatografía de permeación en gel. Esto permite que las moléculas de sustancia activa se separen de las VLP cargadas con moléculas objetivo.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de purificación que, a partir de un sobrenadante de cultivo celular, da como resultado una composición que contiene VLP con una pureza de VLP de al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, en particular al menos 95% o lo más preferiblemente al menos 99% y, por lo tanto, es superior a los procedimientos de purificación VLP anteriores. La pureza de la VLP significa la proporción relativa de la VLP en la mezcla total de sustancias como resultado del procedimiento de purificación. Esta composición de VLP está libre de PEG y/o sales y preferiblemente libre de PEG.

Las VLP consisten esencialmente o exclusivamente en la proteína de la cápside VP1 que se deriva de la proteína de la cápsida VP1 del poliomavirus humano JC (JCV) o es idéntica a ella. La secuencia de la VP1 del poliomavirus humano JC se reproduce en la SEQ. ID. NO. 1.

Para la preparación de VP1 recombinante en células de insecto, de acuerdo con la invención puede usarse un ácido nucleico que se ha optimizado para la expresión en estas células puede usarse. Por ejemplo, se puede usar la secuencia mostrada en SEQ. ID. NO. 2 o una secuencia complementaria a la misma, una secuencia correspondiente a esta secuencia en el contexto de la degeneración del código genético o una secuencia hibridizante con estas en condiciones rigurosas. Para este propósito, la secuencia de ácido nucleico o un vector recombinante que contiene esta secuencia se introduce en una célula anfitriona adecuada, la célula anfitriona se cultiva en condiciones en las que se expresa la secuencia de ácido nucleico y la proteína se aísla de la célula o del sobrenadante celular. Las condiciones de hibridación estrictas se definen preferiblemente de acuerdo con Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e incluyen una etapa de lavado de 30 minutos en 0,1 x SSC, 0,5% SDS a 60°C, y preferiblemente 68°C.

En el contexto de la presente invención, por lo tanto, se usa preferiblemente un polipéptido VP1, que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ. ID. NO. 3, que tiene al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, de manera particularmente preferible al menos 90% y lo más preferiblemente al menos 95% de la secuencia de aminoácidos idéntica, en cuyo caso se determina la identidad en todo el intervalo de SEQ ID No. 3.

En otra forma de realización, se usa una proteína VP1 en la que la secuencia de aminoácidos en la región N-terminal, por ejemplo, fue cambiada en el intervalo de 25 aminoácidos N-terminales. Una señal de localización nuclear heteróloga se introduce preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de la VP1. Las señales de localización nuclear preferidas contienen la secuencia de aminoácidos CPGAAPX1X2P, donde X1 y X2 denotan cualquier aminoácido y de preferencia respectivamente K y, por ejemplo, se basan en las señales de localización del núcleo de SV40 o bKv . Las secuencias de aminoácidos de las señales de localización nuclear particularmente preferidas se describen en el documento EP 2036 980 A1, que con esto se incorpora por completo a la presente solicitud.

La VP1 preparada por expresión recombinante se expresa preferiblemente en células eucariotas y de manera particularmente preferible en células de insecto.

En otra forma de realización, se utiliza una proteína VP2 (SEQ ID N° 6), una proteína VP3 (SEQ ID N° 10), una proteína L1 (SEQ ID N° 13) o una proteína L2 (SEQ ID N° 15).

Las secuencias de ácido nucleico de tipo silvestre se pueden usar para la expresión recombinante, por ejemplo, la SEQ ID No. 4 para VP2, la SEQ ID No. 8 para VP3, la SEQ ID No. 12 para L1 y la SEQ ID No. 14 para L2.

En otra forma de realización, las secuencias de ácido nucleico están optimizadas con codones para el sistema de expresión correspondiente. En una forma de realización particular, las siguientes secuencias de ácido nucleico se usan para la expresión en células de insecto: SEQ ID No. 2 para una proteína VP1, SEQ ID No. 5 para una proteína VP2, SEQ ID No. 7 para una proteína VP2-HA, SEQ ID N° 9 para una proteína VP3-HA.

En una forma de realización particular, la proteína N-terminal o C-terminal respectiva se cambia para mejorar el uso como vacuna. En una forma de realización particular, este es un péptido localizado en el extremo C que comprende el epítopo de hemagluttinina (abreviado como "HA"). Ejemplos de una proteína modificada de este tipo son la proteína VP2-HA (SEQ ID No. 7) y la proteína VP3- HA (SEQ ID No. 11).

En una forma de realización preferida, para la expresión recombinante de las proteínas de la cápside VP1, VP2, VP2-HA, VP3-HA, L1 o L2 y, por lo tanto, para proporcionar VLP se usan células de Spodoptera frugiperda como, por ejemplo, la línea celular SF9, la línea celular SF21 o la línea celular SF158. También se pueden usar otras líneas celulares de insectos, por ejemplo, Trichoplusia ni TN-368, IAL-TND1, Lymantria dispar IPLB-LdFB, Mamestra brassica IZD-MB0503, L. dispar IPLB-LdElta, Anticarsa gemmatalis UFL Ag286, Plodia interpunctella IAL-PID2, Plutella xylostella BCIRL-PxHNU3, T. ni BTI-TN5B1-4 (HiFive®), Manduca sexta MRRL-CH1, líneas de Heliothis virescens: IPLB-HvT1, IPLB-HvE1A, IPLB-HvE6A y la línea celular Diabrotica undecimpunctata IPLB-DU182A.

Las VLP de acuerdo con la invención pueden usarse para fines de diagnóstico y terapéuticos, por ejemplo, para el diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades y afecciones. Para este propósito, pueden contener sustancias terapéuticamente activas o también pueden usarse sin sustancias incluidas.

En una forma de realización preferida, la enfermedad es una infección causada por el virus JC, como PML.

EJEMPLO 1: Preparación de una "cepa de semilla" de baculovirus

1. Preparación del bácmido recombinante.

La secuencia optimizada con codón según la SEQ. ID. NO. 2 del gen VP1 se clonó en plásmidos pFastBac1 de GENEART. El plásmido pFastBac1 se transformó en células de DH5alfa E. coli, las células bacterianas se incrementaron y las bacterias se almacenaron como reservas de glicerina a -80°C. El plásmido pFasBac-VP1 se transformó en células de E. coli DH10Bac para aumentar el ADN de Baculo.

1.1. Transformación de la bacteria DH10Bac E. coli.

Para revitalizar la bacteria DH10Bac E. coli, las células Max Efficiency DH10Bac E. coli se retiran del congelador ultrabajo (-80°C), se descongelan en hielo y se extraen respectivamente 100 pl de la bacteria y se transfieren a un tubo de ensayo de 10 ml.

1.2. Las células DH10Bac E. coli se mezclan con 1 ng (=1 pL) de plásmido pFasBac-VP1 y se incuban en hielo durante 30±3 min. Las bacterias se transformaron con el plásmido de ADN pFastBac1-VP1.

1.3. El ADN recombinante de baculo VP1 se aísla de acuerdo con procedimientos estándar.

2. Revitalización de las células SF9 criopreservadas

Para revitalizar las células SF9, se retira un criotubo de las células SF9 del tanque de almacenamiento de nitrógeno y se descongela. Después del final del procedimiento de descongelación, las células en el tubo de ensayo de 15 ml se distribuyen uniformemente invirtiendo cuidadosamente tres veces y se toma una alícuota para determinar el número de células y la vitalidad (número de células vivas).

Una vez que se completa el procedimiento de descongelación, las células se transfieren a una botella de cultivo celular de un tamaño adecuado (T75 o T175), de modo que se logra una densidad celular de 3 x 105 células vitales por mililitro. En el caso de un T75, la suspensión celular se ajusta a un volumen de <30 ml, en el caso de una botella de cultivo celular T175, la suspensión celular se ajusta a un volumen de >30 ml y <50 ml de medio completo y se transfiere a la botella de cultivo celular. Para la expansión, las células SF9 se incuban en una incubadora a una temperatura de 26°C y una humedad de >80%.

3. Expansión de las células

Las células se incuban en la incubadora hasta que la capa celular tenga una densidad superior al 70%. Luego, se separan las células del fondo del recipiente de cultivo celular y se distribuyen a una botella más grande de cultivo celular o a varias botellas de cultivo celular. Para este propósito, las células en la botella de cultivo celular se enjuagan con amortiguador PBS y se separan de su superficie de crecimiento con el raspador celular. Para distribuir las células de manera uniforme en el medio completo, el recipiente de cultivo se gira cuidadosamente y luego se toma una alícuota para el recuento de células. Al volver a sembrar, se siembran 1x106 células/pocillo en 3 ml de medio completo.

4. Transfección de las células de insecto con complejos recombinantes VP1-Baculo-ADNCellfectina

De 16 hasta 24 horas después de sembrar las células en placas de 6 pocillos, se retira el recipiente de cultivo celular de la incubadora, se disminuye el medio completo y se agrega 1 ml de medio precalentado, sin suero por pocillo. Ahora se preparan los complejos ADN-Cellfectina. Para este fin, se mezclan 8 pl de reactivo Cellfectina con 100 pl de medio sin suero. Se diluyen 2 pg (=2 pL) de VP1-Baculo-ADN con medio sin suero. El lote de Cellfectina se purifica con el lotge de VP1-Baculo-ADN y se incuba durante 30±2 min a temperatura ambiente (20 ± 4°C). Se pipetean 210 pl de los lotes de transfección Cellfectina-ADN en cada pocillo de la placa de 6 pocillos y las células se incuban en la incubadora durante 5 horas ± 15 minutos a 26 ± 1°C. Luego, el medio se retira de los pocillos individuales de la placa de 6 pocillos utilizando el lote de transfección Cellfectina-ADN y se añaden 2 ml/pocillo de medio completo. Las células transfectadas se incuban adicionalmente durante 72 ± 1 hora a 26 ± 1°C. Los baculovirus recombinantes se liberan en el medio de cultivo celular durante este tiempo. Para recolectar los baculovirus recombinantes, el medio de cultivo celular que contiene el virus de las células transfectadas se retira y se transfiere a un tubo de muestra de 15 ml y se centrifuga durante 10 minutos a 2000 * g a 4°C para separar los restos celulares contenidos en las células lisadas del medio de cultivo celular que contiene el virus. A continuación, el medio de cultivo celular que contiene virus (el sobrenadante) se transfiere a un tubo de muestra de 2 ml y se almacena a 5 ± 3°C hasta su uso posterior. Los baculovirus se llaman P1. 1 ml de estos se almacena a -80 ± 5°C. El volumen restante se almacena para la preparación de la cepa de semillas.

5. Preparación de la cepa de semillas de baculovirus

5.1. Preparación de células de insecto Sf9 para la preparación de baculovirus.

Las células se incuban en la incubadora hasta que la capa de células tenga una densidad superior al 70%. Luego, las células se desprenden del fondo del recipiente de cultivo celular y se distribuyen sobre una superficie de crecimiento más grande o varias botellas de cultivo celular. Para este propósito, las células en la botella de cultivo celular se enjuagan con amortiguador PBS y se desprenden de su superficie de crecimiento con el raspador celular. Para distribuir las células de manera uniforme en el medio completo, el recipiente de cultivo se gira cuidadosamente y luego se toma una muestra para determinar el número de células. Por medio del número determinado de células, se siembran 5 x 106 células por botella de cultivo de células T25 en 5 ml de medio completo.

5.2. Infección de las células SF9 con los baculovirus recombinantes

De 16 hasta 24 horas después de sembrar las células, se retira la botella de cultivo celular de la incubadora y se comprueba el medio completo visualmente y microscópicamente en busca de turbidez y, por lo tanto, de posible contaminación. Luego se retira el medio completo y se agregan 4 ml de nuevo medio completo precalentado. Se agrega 1 ml de baculovirus P1 en medio completo. Durante la siguiente infección, las células SF9 se incuban con los baculovirus recombinantes a 26 ± 2°C durante 3 (± 1) días en la incubadora.

5.3. Cosecha del baculovirus recombinante

Para recolectar los baculovirus producidos, el medio de cultivo celular de las células infectadas se retira y se transfiere a un tubo de ensayo de 15 o 50 ml y se centrifuga durante 10 minutos a 2000 * g a 4°C para separar los restos celulares contenidos de las células lisadas del medio que contiene el virus. El medio de cultivo celular que contiene el virus (sobrenadante) se almacena a 5 (± 3) °C.

Para cuantificar el título de los virus, el ADN del baculovirus se aísla de 150 pl de medio que contiene virus y se amplifica y cuantifica por medio de PCR cuantitativa. Los baculovirus se denominan P2 y se almacenan a -80 ± 5°C.

6. Almacenamiento de baculovirus recombinantes.

Cada ml de P1 y P2 se toman dos veces y se transfieren a criotubos de 2 ml etiquetados y se almacenan como muestras de reserva a - 80 (± 5) °C.

EJEMPLO 2: Preparación de VP1-VLP por expresión mediada por baculovirus en células SF9

1. Revitalización de las células SF9 criopreservadas.

Para revitalizar las células SF9, se retira un criotubo de las células SF9 del tanque de almacenamiento de nitrógeno en la habitación B.OG 2.4.06 y se descongela. Después del final del procedimiento de descongelación, las células se distribuyen uniformemente en el tubo de ensayo de 15 ml mediante una cuidadosa inversión y se toma una muestra para determinar el número de células y la vitalidad (número de células vivas).

Una vez que se completa el procedimiento de descongelación, las células se transfieren a una botella de cultivo celular de un tamaño adecuado (T75 o T175, botellas de suspensión de 500 ml), de modo que se logra una densidad celular de 3 * 105 células por mililitro. El tamaño de la botella de cultivo celular depende del número de células congeladas y su vitalidad después de la descongelación. En el caso de un T75, la suspensión celular se ajusta a un volumen >10 y <30 ml, en el caso de una botella de cultivo celular T175, la suspensión celular se ajusta a un volumen de >30 ml y <50 ml de medio completo y se transfiere a la botella de cultivo celular. Para la expansión, las células SF9 se incuban en una incubadora a una temperatura de 26°C y una humedad de >80%.

2. Expansión de las células.

Las células se incuban en la incubadora hasta que la capa de células tenga una densidad superior al 70%. Luego, las células se enjuagan con amortiguador PBS, se desprenden del fondo del recipiente de cultivo celular con un raspador celular estéril y se distribuyen en una botella de cultivo celular más grande o en varias. Para distribuir las células de manera uniforme en el medio completo, el recipiente de cultivo se gira cuidadosamente y luego se extrae una para determinar la cantidad de células. El número de células determinado determina el volumen del medio completo en el que las células se resuspenden posteriormente y el tamaño o número de botellas de cultivo celular en las que se transfieren las células SF9. Se aplica lo siguiente: se siembran 3x105 células/ml de medio completo. La suspensión celular se transfiere a una botella T75 de 12 a 30 mililitros y a una botella T175 de 30 a 50 mililitros, y de 300 a 500 ml en la botella de suspensión. Un día después de transferir las células SF9 a nuevas botellas de cultivo celular, se inicia la preparación de las células SF9 para la infección con baculovirus.

3. Infección de las células SF9 con baculovirus

3.1. Preparación de las células SF9 para la infección con baculovirus.

Antes del propio procedimiento de infección, las células SF9 se desprenden de su superficie de crecimiento, se determina el número de células vitales y las células se transfieren a una o más botellas de cultivo celular T175 o a una botella de suspensión de 500 ml. Para este propósito, se siembran 3 x 107 células en 50 ml de medio completo por botella de cultivo celular T175 y 30 a 50 x 108 por botella de suspensión de 500 ml en medio sin suero.

3.2. Infección de las células SF9 con baculovirus

De 16 hasta 24 horas después de sembrar las células, se retira la botella de cultivo celular de la incubadora, se retira el medio completo y se añaden 10 ml de medio precalentado, sin suero. Ahora la botella de cultivo celular se gira cuidadosamente y el medio sin suero se retira nuevamente. Para que la capa de células no se seque, se añaden inmediatamente 10 ml de medio sin suero y la cantidad de baculovirus recombinantes se pipetea en medio completo, de modo que se logra una multiplicidad de la infección (MOI) de 1. Las células en suspensión SF9 se infectan con MOI 5 directamente en volumen completo. Durante la siguiente infección, las células SF9 se incuban con los baculovirus durante 20 ± 5 min a temperatura ambiente (20 ± 4°C). Luego se añaden 30 ml de medio de cultivo celular sin suero a cada botella de cultivo celular T175 y las células adherentes o en suspensión se incuban en la incubadora durante otros 5 (± 1) días.

4. Cosecha de VP1 -VLP.

Para cosechar la VP1-VLP, se extrae el medio de cultivo celular de las células infectadas y se transfiere a un tubo de muestra de 50 ml y se centrifuga durante 60 minutos a 5000xg y 5°C para separar los restos celulares contenidos de las células lisadas del medio que contiene proteínas. El medio de cultivo celular que contiene proteínas (sobrenadante) se transfiere a un vaso de precipitados adecuado y se almacena a 5 (± 3)°C.

EJEMPLO 3: Purificación del VP1-VLP utilizando un intercambiador de aniones débil

1. Purificación de VP1-VLP utilizando DEAE-FPLC

Las VP1-VLP en el medio de cultivo celular se purifican mediante filtración de flujo cruzado (sistema Vivoflow Easy Load de Sartorius) y también se concentran en la misma etapa del procedimiento. El sistema de flujo cruzado está preparado para su uso. Se colocan 500 ml de ddH20 en un depósito adecuado y se lava el sistema con este. El intervalo de presión es de 1,5 a 2,5 bares. Se colocan 500 ml de Tris-HCl 10 ml en el depósito, se lava el sistema con este. El intervalo de presión es de 1,5 a 2,5 bares.

El sobrenadante del cultivo celular se libera de posibles restos celulares en una etapa de centrifugación. El sobrenadante de cultivo celular clarificado se transfiere al depósito y se bombea a través del sistema. El volumen original se reduce a la mitad y luego se conecta un depósito más grande (generalmente con un volumen de 1 a 2 l) con el sistema amortiguador estándar (Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 100 mM). El medio se intercambia luego con un sistema amortiguador Tris-HCl (Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 100 mM). El volumen se reduce a 150 ml. Esta filtración de flujo cruzado elimina todas las impurezas de bajo peso molecular, incluidas las proteínas y los fragmentos de proteínas con un tamaño de 100 kDa.

Las VLP están inicialmente presentes en la muestra como partículas intactas. La siguiente cromatografía de intercambio aniónico separa las contaminaciones de proteínas y los ácidos nucleicos libres contenidos en la muestra. Se utiliza una columna DEAE-Sepharose como un intercambiador de iones débil. Las VLP se miden en el amortiguador estándar usando un gradiente lineal de NaCl (NaCl de 100 mM a 1 M) o se eluyen por gradientes escalonados (3 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM y 3. NaCl de 1M a 2M; 4 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM, 3. NaCl de 500 mM a 800 mM y 4. 1 M a NaCl 2 M).

2. Post-purificación opcional por diálisis

Opcionalmente, la muestra que contiene VLP se dializa contra Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 50 a 150 mM, pH 7,5 durante 24 ± 2 horas para establecer la concentración de sal correctamente.

3. Almacenamiento del VP1-VLP,

Las VP1-VLP se diluyen con Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 150 mM, pH 7,5 a la concentración de 0,5 mg/ml, se distribuyen en alícuotas en tubos de ensayo de 1,5 ml y se almacenan a -80 ± 5°C.

EJEMPLO 4: Purificación del VP1-VLP utilizando un intercambiador de aniones fuerte

1. Purificación de VP1-VLP usando Q-Sepharose FPLC

Las VP1-VLP en el medio de cultivo celular se purifican mediante filtración de flujo cruzado (sistema Vivoflow Easy Load de Sartorius) y también se concentran en la misma etapa del procedimiento. El sistema de flujo cruzado está preparado para su uso. Se colocan 500 ml de ddH20 en un depósito adecuado y se lava el sistema con el mismo. El intervalo de presión es de 1,5 a 2,5 bares. Se colocan 500 ml de Tris-HCl de 10 mM en el depósito, se lava el sistema con el mismo. El intervalo de presión es de 1,5 a 2,5 bares.

Las VLP están inicialmente presentes en la muestra como partículas intactas. La siguiente cromatografía de intercambio aniónico separa las contaminaciones de proteínas y los ácidos nucleicos libres contenidos en la muestra. Aquí se usa una columna Q-Sepharose como un intercambiador iónico fuerte. Las VLP se miden en el amortiguador estándar usando un gradiente lineal de NaCl (NaCl de 100 mM a 1 M) o se eluyen por gradientes escalonados (3 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM y 3. NaCl de 1M a 2M; 4 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM, 3. NaCl de 500 mM a 800 mM y 4. NaCl de 1 M a 2 M).

2. Post-purificación opcional por diálisis.

Opcionalmente, la muestra que contiene VLP se dializa luego contra Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 50 a 150 mM, pH 7,5 durante 24 ± 2 horas para establecer la concentración de sal correctamente.

3. Almacenamiento del VP1-VLP.

EJEMPLO 5: Purificación de los pentámeros VP1 usando un intercambiador aniónico débil

1. Disociación de las VLP en pentámeros VP1

En la primera etapa, las VLP en la muestra se disocian agregando DTT de 5 a 20 mM y EGTA de 10-30 mM (concentración final) a temperatura ambiente durante 1 hora y se aplican a una columna con una matriz DEAE como un intercambiador aniónico débil con matriz DEAE. Esta etapa es esencial para obtener una pureza de casi el 100% de los pentámeros VP1, ya que en esta etapa se eliminan los ácidos nucleicos empaquetados y otros contaminantes. Los pentámeros se tratan con un gradiente lineal de NaCl (NaCl de 100 mM a 1 M), o se eluyen por gradientes escalonados (3 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM y 3. NaCl de 1M a 2M; 4 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM, 3. NaCl de 500 mM a 800 mM y 4. NaCl de 1 M a 2 M).

2. Post-purificación opcional por diálisis

En el caso de que se requiera una reducción en la concentración de sal, la solución que contiene pentámeros VP1 se puede dializar opcionalmente contra solución salina fisiológica durante la noche a 5 ± 3°C. Al envasar ingredientes activos, los pentámeros VP1 se mezclan con el ingrediente activo sin esta etapa opcional de purificación posterior (véase la siguiente etapa 3).

3. Mezcla de los pentámeros VP1 con los ingredientes activos.

Se mezclan 1 |jg a 100 |jg de pentámeros VP1 purificados con 1 a 10 |jg de ADN plasmídico. La mezcla se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se coloca en una cámara de diálisis (por ejemplo, de Pierce) con tamaños de poro entre 5kDa y 20kDa. Las cámaras de diálisis se colocan en un amortiguador de reasociación.

4. Reasociación de los pentámeros VP1 en las VLP

Los pentámeros VP1 se reasocian en las VLP por diálisis contra un denominado amortiguador de reasociación que contiene CaCl²de 1 a 5 mM, Tris-HCl de 10 mM y NaCl de 150 mM, pH 7,5) a 5 ± 3°C durante 24-48 h.

5. Almacenamiento de las VLP que contienen ingrediente activo

Luego, las VLP se almacenan a 5 ± 3°C hasta su posterior tratamiento o se congelan a -80°C para su almacenamiento permanente.

EJEMPLO 6: Purificación de los pentámeros VP1 usando un intercambiador de aniones fuerte

El sobrenadante del cultivo celular se libera de los restos celulares en una etapa de centrifugación. El sobrenadante de cultivo celular clarificado se transfiere al depósito y se bombea a través del sistema. El volumen original se reduce a la mitad y luego se conecta un depósito más grande (generalmente con un volumen de 1 a 2 litros) con el sistema de amortiguador estándar (generalmente se usa Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 100 mM como el amortiguador estándar). El medio se intercambia luego con un sistema de amortiguador Tris-HCl (generalmente se usa Tris-HCl de 10 mM, NaCl de 100 mM como el amortiguador estándar). El volumen se reduce a 150 ml. Esta filtración de flujo cruzado elimina todas las impurezas de bajo peso molecular, incluidas las proteínas y los fragmentos de proteínas con un tamaño de 100 kDa.

2. Disociación de las VLP en pentámeros VP1

En la primera etapa, las VLP en la muestra se disocian agregando DTT de 5 a 20 mM y EGTA de 10-30 mM (concentración final) a temperatura ambiente durante 1 hora y se aplican a una columna Mono Q o columna Q Sepharose. Esta etapa es esencial para obtener una pureza de casi el 100% de los pentámeros VP1, porque en esta etapa se eliminan los ácidos nucleicos empaquetados y otros contaminantes. Los pentámeros se tratan con un gradiente lineal de NaCl (NaCl de 100 mM a 1 M), o se eluyen por gradientes escalonados (3 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM y 3. NaCl de 1M a 2M; 4 etapas: 1. NaCl de 50 a 150 mM, 2. NaCl de 200 a 400 mM, 3. NaCl de 500 mM a 800 mM y 4. NaCl de 1M a 2 M).

3. Post-purificación opcional por diálisis

En el caso de que se requiera una reducción en la concentración de sal, la solución que contiene pentámeros VP1 se puede dializar opcionalmente durante la noche contra solución salina fisiológica a 5 ± 3°C. Al envasar ingredientes activos, los pentámeros VP1 se mezclan con el ingrediente activo sin esta etapa opcional de purificación posterior (véase la siguiente etapa 3).

4. Mezcla de los pentámeros VP1 con los ingredientes activos.

1|jg a 100 |jg de los pentámeros VP1 purificados se mezclan con 1 a 10 |jg de ADN plasmídico. La mezcla se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se coloca en una cámara de diálisis (por ejemplo, de Pierce) con tamaños de poro entre 5kDa y 20kDa. La diálisis se lleva a cabo contra un amortiguador de reasociación.

5. Reasociación de los pentámeros VP1 en las VLP

Los pentámeros VP1 se reasocian en las VLP por diálisis contra un denominado amortiguador de reasociación que contiene CaC^de 1 a 5 mM, Tris-HCl de 10 mM y NaCl de 150 mM, pH 7,5) a 5 ± 3°C durante 24-48 h.

6. Almacenamiento de las VLP que contienen ingrediente activo

Luego, las VLP se almacenan a 5 ± 3°C hasta su posterior tratamiento o se congelan para un almacenamiento permanente a -80°C o se liofilizan alternativamente.

Abreviaturas

Bácmido = vector lanzadera (shuttle), propagable en E. coli y en células de insecto

FCS = suero fetal de ternera

LAF = flujo de aire laminar

min = minutos

rpm = revoluciones por minuto

RT = temperatura ambiente

T25, T75, T175 = botellas de cultivo celular con área de crecimiento 25, 75 o 175 cm2

medio completo = Medio de insecto TC-100 con 10% de suero de ternera fetal

VLP = partícula similar a virus

VP1 = proteína 1 viral del virus JC

Listado de figuras

Fig. 1: Diagrama de flujo para la preparación de baculovirus que codifican VP1 por transfección de células de insecto SF9.

Fig. 2: Diagrama de flujo para la recolección de los baculovirus para crear una "cepa de semillas".

Fig. 3: Diagrama de flujo para el procedimiento de preparación de VLP: Parte 1 infección de las células SF9 Fig. 4: Diagrama de flujo para el procedimiento de preparación de VLP: Parte IIa Purificación de las VLP por FPLC con un intercambiador de aniones fuerte

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la purificación de partículas similares a virus (VLP), caracterizado porque se filtra una composición que contiene VLP por un medio filtrante con un límite de exclusión de más de 30 kDa a 1500 kDa, en cuyo caso como composición que contiene VLP se usa el sobrenadante del cultivo de las células que expresan VLP (sobrenadante de cultivo celular), en donde las VLP se componen de la proteína estructural VP1 del virus JC humano y con la filtración se efectúa al mismo tiempo una reamortiguación de pH) de la composición que contiene VLP.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el medio filtrante presenta un límite de exclusión de más de 30 kDa a 100 kDa.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en donde al filtrar se desarrolla una diferencia de presión entre 0,5 bares y 10 bares, preferiblemente entre 0,5 y 5 bares y de modo particularmente preferido entre 0,5 bares y 3 bares.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde al reamortiguar el pH desciende a un valor entre 5,0 y 8,0.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde la filtración se realiza como filtración de flujo cruzado (crossflow).

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en donde la filtración de flujo cruzado genera una corriente transversal de 2,5 a 3 m/s que fluye a lo largo del medio de filtro.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde con la filtración al mismo tiempo se efectúa una concentración de la composición que contiene VLP.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde el sobrenadante de cultivo celular se centrifuga antes de la filtración, pero no se trata de modo enzimático o químico, o se somete a cromatografía.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde las VLP se someten adicionalmente a las siguientes etapas:

(a) Disociación de las VLP;

(b) purificación de las VLP disociadas;

(c) Reasociación de las VLP.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, después de la filtración, la composición que contiene VLP se purifica adicionalmente mediante cromatografía, de preferencia mediante cromatografía de intercambio aniónico.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la VLP presenta la proteína estructural VP1 con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos según SEQ. ID. NO:1 o SEQ. ID. NO:2.