ES2317517T5 - Purificación de virus usando ultrafiltración - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Purificacion de virus usando ultrafiltracion Campo de la invencion

La invencion pertenece al campo de la produccion de virus, mas en particular a la purificacion de virus con el fin de hacer vacunas o productos de terapia genica, y las vacunas y productos de terapia genica asf obtenidos.

Antecedentes de la invencion

Los virus, bien los que se dan en la naturaleza, o las versiones recombinantes de los mismos, se usan para la vacunacion en el campo de la terapia genica. Es posible para muchos virus o partfculas similares a virus propagar estas de forma segura y eficaz en celulas (vease por ejemplo el documento WO 01/38362, que describe la propagacion de varios virus en celulas de retina inmortalizadas con E1). Los adenovirus recombinantes son una clase preferida de vectores virales para su uso en terapia genica y para fines de vacunacion. Tales adenovirus recombinantes son normalmente deficientes en al menos la region E1, y se propagan en celulas de complementacion que proporcionan la region E1, tal como celulas 293, o celulas de retina inmortalizadas con E1 tal como las celulas pEr.C6® (vease por ejemplo la patente de EE UU 5.994.128).

Tras la propagacion de los virus en las celulas, es necesario para practicamente todas las aplicaciones purificar los virus de las celulas, antes de su uso adicional.

La solicitud internacional de patente WO 98/22588 describe metodos para la produccion y purificacion de vectores adenovirales. Los metodos comprenden hacer crecer celulas, infectar las celulas con adenovirus, recoger y lisar las celulas, concentrar el lisado crudo, intercambiar el tampon del lisado crudo, tratar el lisado con nucleasa, y purificar adicionalmente el virus usando cromatograffa.

Algunas otras publicaciones describen la purificacion de virus a partir de celulas, la mayor parte discutiendo el uso de matrices cromatograficas espedficas para la purificacion del virus a partir de un lisado celular, veanse por ejemplo las patentes de EE UU 6.008.036, 6.586.226, 5.837.520, 6.261.823, 6.537.793, y las solicitudes internacionales de patente WO 00/50573, WO 02/44348 y WO 03/078592.

En varios procesos industriales para la purificacion de virus, particularmente de adenovirus, se usa un paso de ultrafiltracion, principalmente para concentrar el virus y/o para intercambiar el tampon en el que se mantiene el virus.

A pesar de la descripcion de varios procesos principalmente relacionados con diferentes matrices cromatograficas, permanece una necesidad para metodos alternativos y preferiblemente mejorados para la purificacion de adenovirus. La presente invencion proporciona tales metodos.

Descripcion de las figuras

Figura 1. Esquema del metodo conocido de recoger las celulas (T/B) frente al metodo segun la invencion (B/T), vease el ejemplo 1. T: Triton, B: Benzonasa. p.i.: post infeccion.

Figura 2. Eliminacion de protemas de la celula huesped en la clarificacion despues de proceso T/B frente a B/T (vease la figura 1 para el esquema). Se muestra un analisis de SDS-PAGE (4-12% bis-tris NuPAGE, Invitrogen) tenido con plata de muestras en proceso de 5 purificaciones separadas (veanse el ejemplo 1 y la tabla 1 para las muestras). El panel 2 es de un producto T/B, en donde la lisis precedio a la adicion de nucleasa; los paneles 3-7 son de productos B/T, en donde la nucleasa se anadio antes de la lisis. El producto recogido (carriles 1) se clarifico mediante un filtro Clarigard de 0,5 pm (carriles 2), seguido por un filtro Sartapore 2 de 0,8/0,45 pm (carriles 3). M: marcadores, el peso molecular en kD se muestra en el costado.

Figura 3. Esquema de un proceso para la purificacion de un virus (vease el ejemplo 1; vease tambien el documento PCT/EP2005/050739).

Figura 4. Perfiles de RP-HPLC de una muestra del retenido de FFT de baja pureza (A) y una muestra de retenido de FFT de alta pureza (B). Vease el ejemplo 2 para los detalles.

Figura 5. Perfil de elucion de intercambio anionico para una muestra del retenido de FFT de baja pureza (A, sin presion inversa durante la FFT) y muestra del retenido de FFT de alta pureza (B, presion inversa durante la FFT). Vease el ejemplo 2 para los detalles.

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Figura 6. Analisis estadfstico del efecto de la presion transmembrana (PTM, panel A) y la cantidad alimentada por area de filtro (B) sobre la pureza. Vease el ejemplo 2 para los detalles.

Figura 7. Analisis estadfstico de aplicar presion inversa al permeado sobre la recuperacion de adenovirus. Vease el ejemplo 2 para los detalles.

Figura 8. Representacion esquematica del experimento de FFT. A. sin presion inversa en el lado del permeado (FFT para purificacion de virus segun el estado de la tecnica). B: presion inversa en el lado del permeado (FFT para purificacion de virus segun la invencion). Po: Psalida, Pi: Pentrada, Pp: Pperm. Vease el ejemplo 3.

Figura 9. Flujo durante la FFT de la carrera control sin presion inversa (A) y carrera segun la invencion con presion inversa (B). Vease el ejemplo 3 para los detalles.

Figura 10. SDS-PAGE de los retenidos de FFT. 1: marcador, 2: carrera A (sin presion inversa (control)). 3: carrera B (con presion inversa (segun la invencion)), 4: Ad35 purificado con CsCl. Vease el ejemplo 3 para los detalles.

Figura 11. Analisis por RP-HPLC de los retenidos de FFT. A, carrera sin presion inversa (control). B, carrera con presion inversa (segun la invencion). Vease el ejemplo 3 para los detalles.

Figura 12. Analisis por SDS-PAGE de muestras de un proceso de 20 litros con presion inversa en el retenido durante la FFT. Todos los carriles excepto el carril 2 contienen 5E9 partfculas virales. 1: virus clarificado. 2: permeado tras concentracion 5x. 3: virus diafiltrado. 4: virus capturado (despues de filtracion anionica en Mustang Q). 5: producto preformulado (despues de la separacion de grupo y esterilizacion por filtracion). 6: marcador. Vease el ejemplo 4 para los detalles.

Figura 13. Analisis por RP-HPLC de muestras de un proceso de 20 litros con presion inversa en el retenido durante la FFT (las muestras como en la figura 12). 3: virus diafiltrado. 4: virus capturado (despues de filtracion anionica en Mustang Q). 5: producto preformulado (despues de la separacion de grupo y esterilizacion por filtracion). Vease el ejemplo 4 para los detalles.

Figura 14. Esquema de un proceso para la purificacion de adenovirus segun la invencion.

Figura 15. Analisis por RP-HPLC de Ad5 purificado mediante un gradiente de CsCl (A), o del retenido diafiltrado de la carrera B1 (B, vease el ejemplo 5 para los detalles).

Figura 16. Analisis por SDS-PAGE de Ad5 purificado mediante FFT. 1: marcador. 2: virus B1 diafiltrado (vease el ejemplo 5 para los detalles). 3: virus Ad5 purificado por CsCl.

Figura. 17. Analisis por SDS-PAGE de Ad35 purificado mediante FFT. Cada carril contiene 5 x 108 partfculas virales Ad35-TB-S. 1: producto clarificado. 2: retenido tras concentracion 5x. 3: retenido tras FFT (16 VDF). 4: virus purificado solo por filtracion. 5: virus purificado por gradiente de CsCl.

Figura 18. Analisis por RP-HPLC de Ad35 purificado mediante FFT (vease ejemplo 7 para los detalles). A: Retenido tras 6 VDF. B: retenido tras 10 VDF. C: retenido tras 14 VDF. D: retenido tras 16 VDF. pVI: protema precursora VI.

Descripcion de la invencion

Se divulga un metodo para la purificacion de un adenovirus recombinante (“virus”) que comprende un paso de ultrafiltracion en donde el retenido contiene el virus, caracterizado en que se aplica presion inversa en el lado del permeado. La invencion se define en las reivindicaciones. En una forma de realizacion preferida, dicho metodo comprende antes de dicho paso de filtracion los pasos de: a) cultivar celulas que estan infectadas con dicho virus, b) anadir nucleasa al medio de cultivo. En una forma de realizacion preferida adicional, tras el paso b) dichas celulas se lisan para proporcionar un lisado que comprende el virus. En una forma de realizacion preferida adicional, dicho metodo comprende ademas tras el paso de lisar c) un paso de: d) clarificacion del lisado, preferiblemente mediante filtracion en profundidad seguido por una filtracion en membrana, en donde dicho paso d) es anterior al paso de ultrafiltracion. En formas de realizacion preferidas, el paso de ultrafiltracion se realiza mediante filtracion de flujo tangencial, preferiblemente usando un modulo de fibra hueca. En ciertas formas de realizacion, la presion inversa se aplica mediante una bomba que proporciona presion inversa al permeado. En ciertas formas de realizacion, la presion inversa sobre el lado del permeado esta entre 3-80 kPa (6,89 kPa = 1 psi). En formas de realizacion preferidas, la presion transmembrana es menor de 4 psi, preferiblemente menor de 3 psi, menos de 2 psi, o menos de 1 psi. En ciertas formas de realizacion, dicha ultrafiltracion comprende intercambio de tampon del retenido con un tampon que comprende entre 0,8 M y 2 M de cloruro de sodio u otra sal que de igual fuerza ionica, y preferiblemente

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posterior intercambio de tampon con un tampon que tiene una fuerza ionica de un tampon que comprende al menos 0,5 M de NaCl.

En ciertas formas de realizacion, dicho metodo no comprende un paso de cromatograffa de exclusion molecular y/o de cromatograffa de intercambio anionico o filtracion de intercambio anionico, y en ciertas formas de realizacion dicho metodo no comprende un paso de cromatograffa. En otras formas de realizacion, el metodo comprende ademas un paso de purificar adicionalmente el adenovirus recombinante con al menos un paso de cromatograffa, tal como un paso de cromatograffa de intercambio anionico o filtracion de intercambio anionico y/o cromatograffa de exclusion molecular.

La invencion tambien proporciona un metodo para la purificacion de un adenovirus recombinante, dicho metodo consiste esencialmente en: a) cultivar celulas que estan infectadas con dicho adenovirus recombinante, b) lisar dichas celulas y eliminar y/o fragmentar el acido nucleico libre, para proporcionar un lisado que comprende el adenovirus recombinante, c) clarificar el lisado para obtener una preparacion de adenovirus, d) someter la preparacion de adenovirus a ultrafiltracion, en donde la preparacion de adenovirus esta en el retenido, para concentrar la preparacion de adenovirus, e) someter la preparacion de adenovirus del paso d) a ultrafiltracion, en donde la preparacion de adenovirus esta en el retenido, e intercambiar con ella al menos 5 volumenes de diafiltracion (VDF) de tampon, en donde un VDF es el volumen del retenido tras la concentracion en el paso d), f) preferiblemente esterilizacion por filtracion de la preparacion de adenovirus, estando caracterizado el metodo en que en los pasos d) y e) se aplica presion inversa en el lado permeado. En una forma de realizacion alternativa, la invencion proporciona un metodo para la purificacion de un adenovirus recombinante, dicho metodo consiste esencialmente en: a) cultivar celulas que estan infectadas con dicho adenovirus recombinante, b) lisar dichas celulas y eliminar y/o fragmentar el acido nucleico libre, para proporcionar un lisado que comprende el adenovirus recombinante, c) clarificar el lisado para obtener una preparacion de adenovirus, d) someter la preparacion de adenovirus del paso c) a ultrafiltracion, en donde la preparacion de adenovirus esta en el retenido, e intercambiar con ella al menos 5 volumenes de diafiltracion (VDF) de tampon, en donde un VDF es el volumen de la preparacion de adenovirus tras c), e) preferiblemente esterilizacion por filtracion de la preparacion de adenovirus, estando caracterizado el metodo en que en el paso d) se aplica presion inversa en el lado permeado.

La invencion tambien proporciona un metodo para aumentar la recuperacion y/o el rendimiento de adenovirus recombinante durante un paso de ultrafiltracion en donde el retenido contiene el adenovirus recombinante, caracterizado dicho metodo en que se aplica presion inversa en el lado permeado.

La diferencia mas importante con los metodos para la purificacion de un virus que comprende un paso de ultrafiltracion en donde el retenido contiene el virus, divulgados hasta ahora, es que en esos metodos no se aplica presion inversa en el lado permeado, y el permeado se deja fluir fuera libremente, normalmente en un recipiente de basura. Segun la presente invencion, la presion inversa (tambien llamada contrapresion) se aplica en el lado del permeado, algunas veces denominada aqrn como presion de permeado. Como se divulga en el presente documento, se ha encontrado de forma inesperada que esto produce una mejora sobre los procesos en los que no se aplica presion inversa sobre el lado del permeado. En el metodo segun la presente invencion, se alcanzan mayor recuperacion del virus y/o purificacion aumentada, comparado con el metodo en donde no se aplica presion inversa en el lado del permeado.

Descripcion detallada de la invencion

Celulas

Los virus se pueden propagar de forma adecuada en celulas (a las que algunas veces se denomina 'celulas huesped'). Una celula segun la presente invencion puede ser cualquier celula en donde se puede propagar un adenovirus deseado. Por ejemplo, la propagacion de vectores de adenovirus recombinantes se hace en celulas que complementan deficiencias en el adenovirus. Tales celulas preferiblemente tienen en sus genomas al menos una secuencia de adenovirus E1, y por lo tanto son capaces de complementar adenovirus recombinantes con una delecion en la region E1. Ademas el adenovirus puede tener una delecion en la region E3, que es dispensable del genoma Ad, y por lo tanto tal delecion no se tiene que complementar. Se puede usar cualquier celula que complemente a El, tal como celulas de retina humanas inmortalizadas por E1, por ejemplo 911 (vease la patente de EE Uu 5.994.128), amniocitos transformados con E1 (vease la patente EP 1230354), celulas A549 transformadas con E1 (vease, por ejemplo, el documento WO 98/39411, patente de EE UU 5.891.690), GH329:HeLa (Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293, y similares. Preferiblemente como celulas se usan celulas PER.C6™ (patente de EE UU 5.994.128), o celulas derivadas de las mismas, ya que son adecuadas para la propagacion de adenovirus recombinantes.

Lmeas celulares y metodos adicionales para la propagacion de vectores adenovirales recombinantes se han divulgado por ejemplo en la patente de EE UU 6.492.169 y en el documento WO 03/104467.

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Los ejemplos de otras lmeas celulares de mairnfero utiles que se pueden usar directamente como celulas para propagar virus o convertidas en celulas de complementacion para la replicacion de virus deficientes son celulas Vero y HeLa y lmeas celulares de ovario de hamster chino, celulas W138, BHK, COS-7, HepG2, 3T3, RIN y MDCK, conocidas para el experto en la materia.

Las celulas se cultivan para aumentar los numeros de celulas y virus y/o tftulos de virus. El cultivo una celula se hace para permitir que metabolice, y/o crezca y/o se divida y/o produzca virus de interes segun la invencion. Esto se puede realizar por metodos como tales bien conocidos para los expertos en la materia, e incluye pero no esta limitado a suministrar nutrientes para la celula, por ejemplo en el medio de cultivo apropiado. Los metodos pueden comprender el crecimiento adherido a superficies, crecimiento en suspension, o combinaciones de los mismos. El cultivo se puede hacer por ejemplo en placas, botellas rodantes o en biorreactores, usando sistemas por lotes, semicontinuos o continuos, fibra hueca, y similares. Para alcanzar produccion a gran escala (continua) de virus por medio de cultivo celular se prefiere en la tecnica tener celulas capaces de crecer en suspension, y se prefiere tener celulas capaces de ser cultivadas en ausencia de suero de procedencia animal o humana o componentes de suero de origen animal o humano. Las condiciones adecuadas para cultivar celulas son conocidas (vease por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson, editores (1973), y R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, cuarta edicion (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

En ciertas formas de realizacion, la invencion comprende someter las celulas cultivadas que estan infectadas con los virus a lisis. El cultivo de celulas y su infeccion con un virus es bien conocido para el experto en la materia. La infeccion de celulas se puede realizar por ejemplo simplemente exponiendo el virus a la celula apropiada en condiciones fisiologicas, permitiendo la absorcion del virus. Para ciertos virus no es ni siquiera necesario empezar con virus por si, ya que se pueden usar secuencias de acido nucleico para reconstituir el virus en las celulas cultivadas.

Tambien se pueden encontrar varios aspectos de y sistemas adecuados para el cultivo de celulas para la produccion de adenovirus en el documento WO 98/22588, p. 11-28. Los metodos para el cultivo de celulas y la propagacion de virus en celulas tambien se han divulgado en, por ejemplo, las patentes de EE UU 6.168.944, 5.994.134, 6.342.384, 6.168.941, 5.948.410, 5.840.565, 5.789.390, 6.309.650, 6.146.873 y las solicitudes internacionales de patente WO 01/38362, WO 01/77304 y WO 03/084479.

Virus

En ciertas formas de realizacion, la presente invencion se usa para purificar adenovirus recombinantes, que llevan un transgen heterologo para su uso en terapia genica o para fines de vacunacion.

Adenovirus

Preferiblemente, el vector adenoviral es deficiente en al menos una funcion genica esencial de la region E1, por ejemplo, la region E1a y/o la region E1b, del genoma adenoviral que se requiere para la replicacion del virus. En ciertas formas de realizacion, el vector es deficiente en al menos una funcion genica esencial de la region E1 y al menos parte de la region no esencial E3 (por ejemplo, una delecion Xba I de la region E3). El vector adenoviral puede ser “multiplemente deficiente”, lo que significa que el vector adenoviral es deficiente en una o mas funciones genicas esenciales en cada una de dos o mas regiones del genoma del adenovirus. Por ejemplo los anteriormente mencionados vectores adenovirales deficientes en E1 o en E1 y E3 pueden ser ademas deficientes en al menos un gen esencial de la region E4 y/o al menos un gen esencial de la region E2 (por ejemplo, la region E2A y/o la region E2B). Los vectores adenovirales con la region E4 entera delecionada pueden producir respuestas inmunitarias menores en el huesped. Los ejemplos de vectores adenovirales adecuados incluyen vectores adenovirales que carecen de (a) toda o parte de la region E1 y toda o parte de la region E2, (b) toda o parte de la region E1, toda o parte de la region E2, y toda o parte de la region E3, (c) toda o parte de la region E1, toda o parte de la region E2, toda o parte de la region E3, y toda o parte de la region E4, (d) al menos parte de la region E1a, al menos parte de la region E1b, al menos parte de la region E2a, y al menos parte de la region E3, (e) al menos parte de la region E1, al menos parte de la region E3, y al menos parte de la region E4, y (f) todos los productos genicos esenciales del adenovirus (por ejemplo amplicones adenovirales que comprenden solo las ITR y la serial de empaquetamiento). En caso de deleciones de regiones esenciales del genoma del adenovirus, las funciones codificadas por estas regiones se tienen que suministrar en trans, preferiblemente por la celula, es decir, cuando se delecionan del adenovirus partes o las regiones E1, E2 y/o E4 completas, estas tienen que estar presentes en la celula, por ejemplo integradas en el genoma, o en forma de los denominados adenovirus auxiliares o plasmidos auxiliares.

El vector adenoviral deficiente para replicacion se puede generar usando cualquier especie, cepa, subtipo o mezcla de especies, cepas, o subtipos, de un adenovirus o un adenovirus quimerico como fuente de ADN del vector (vease por ejemplo los documentos WO 96/26281, WO 00/03029), que por ejemplo puede proporcionar al vector adenoviral

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con la capacidad de infectar ciertos tipos de celulas deseadas. El vector adenoviral puede ser cualquier vector adenoviral capaz de crecer en una celula, que en parte significativa (aunque no necesariamente sustancialmente) deriva de o se basa en el genoma de un adenovirus. El vector adenoviral puede comprender un genoma adenoviral de un adenovirus salvaje de tipo C, especialmente de un serotipo 5 (es decir, Ad5) o Ad2. El vector adenoviral tambien puede comprender un genoma adenoviral o al menos una protema de fibra derivada de un adenovirus del grupo B, por ejemplo Ad11, Ad35, Ad51, etc. (vease por ejemplo, el documento WO 00/70071), cuyas formas de realizacion tienen la ventaja de que se encuentran menos anticuerpos neutralizantes contra estos serotipos en la poblacion, y confieren la posibilidad de tener como diana otros tipos celulares, ya que el tropismo de estos vectores adenovirales es diferente de los derivados de Ad5. Por supuesto, el experto en la materia sabra que tambien se puede aplicar cualquier otro serotipo. El experto en la materia sera consciente de las posibilidades de propagar vectores adenovirales de diferentes serotipos en celulas espedficas, usando metodos tales como por ejemplo los divulgados en la patente de EE UU 6.492.169 o en el documento WO 03/104467, y las referencias en las mismas. Los vectores adenovirales, metodos para la construccion de los mismos y metodos para la propagacion de los mismos, son bien conocidos en la tecnica y se describen en, por ejemplo, las patentes de EE UU No. 5.559.099, 5.837.511, 5.846.782, 5.851.806, 5.994.106, 5.994.128, 5.965.541, 5.981.225, 6.040.174, 6.020.191, y 6.113.913, y Thomas Shenk, “Adenoviridae and their Replication”, M. S. Horwitz, “Adenoviruses”, Capftulos 67 y 68, respectivamente, en Virology, B. N. Fields et al., eds., 3a ed., Raven Press, Ltd., Nueva York (1996), y otras referencias mencionadas aqrn.

La construccion de vectores adenovirales esta bien comprendida en la tecnica e implica el uso de tecnicas estandar de biologfa molecular, tal como aquellas descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2a ed., Scientific American Books (1992), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), y otras referencias mencionadas aqrn.

Transgenes

En una forma de realizacion preferida, el virus es un adenovirus recombinante que comprende informacion heterologa, que se puede usar en un marco terapeutico para fines de terapia genica, o como un antfgeno para fines de vacunacion. A la informacion heterologa se hace referencia como “transgen”. Los metodos segun la presente invencion son aplicables con un adenovirus, que comprende cualquier transgen, y por lo tanto la naturaleza del transgen no es en sf misma material de la presente invencion.

Se han descrito varios posibles transgenes por ejemplo en el documento WO 98/22588, p.42-49. Los transgenes que pueden estar presentes en un virus segun la invencion pueden ser por ejemplo genes terapeuticos, tal como genes supresores de tumores, incluyendo pero no limitados a p53, p16, APC, DCC, NF-1, WT-1, p21, BRCA1, BRCA2, y similares; enzimas, tal como citosina desaminasa, HGPRT, glucocerobrosidasa, timidina quinasa de HSV o timidina quinasa humana, etc.; hormonas, tal como hormona del crecimiento, prolactina, eritropoyetina, gonadotropina corionica, hormona estimulante del tiroides, leptina, ACTH, angiotensina, insulina, glucagon, somatostatina, calcitonina, vasopresina, y similares; interleuquinas y citoquinas, tal como IL-1, IL-3, IL-12, G-CSF, GM-CSF, TNF, y similares; genes de recambio que faltan o estan mutados en trastornos espedficos, tal como ADA, factor IX, CFTR, etc.; otros genes terapeuticos tal como inhibidores de angiogenesis, inhibidores del ciclo celular y similares; construcciones antisentido para inhibir la expresion de por ejemplo oncogenes, tal como ras, myc, jun, bcl, abl, y similares; asf como antfgenos para vacunas tal como antfgenos vmcos, por ejemplo derivados de un picornavirus, coronavirus, togavirus, flavivirus, rhabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, poxvirus, hepadnavirus, reovirus, retrovirus, herpesvirus, y similares, por ejemplo mas espedficamente antfgenos del virus de la gripe (con como antfgenos potenciales por ejemplo hA y/o NA), hepatitis B (con como antfgeno potencial el antfgeno de superficie de la hepatitis B), virus del Nilo Occidental, rabia, SARS-CoV, virus del herpes simple 1 y 2, sarampion, viruela, polio, VIH (con antfgenos por ejemplo gag, env, nef, derivadas de VIH-1 o modificaciones de las mismas que incluyen versiones con codones optimizados, vease, por ejemplo, el documento WO 02/22080), Ebola, Marburgo, virus de Lassa; o antfgenos bacterianos, antfgenos fungicos, antfgenos parasfticos (incluyendo tripanosomas, tenias, nematodos, helmintos, malaria, etc.), y similares. Claramente, el experto en la materia elegira el gen de interes que sea util en el marco terapeutico previsto, sea en terapia genica y/o en vacunacion, y no esta limitado a la lista anterior. Tambien esta claro que las regiones de control para los transgenes estan preferiblemente presentes en los vectores virales recombinante cuyo fin es la expresion del transgen, por ejemplo incluyendo un promotor y una senal de poliadenilacion. Todos estos son aspectos bien conocidos para el experto en la materia. Se discuten varias regiones de control en el documento WO 98/22588, p.49-55.

Lisado de las celulas

Despues de la infeccion de un adenovirus, el virus se replica dentro de la celula y de esta manera se amplifica. La infeccion de adenovirus produce finalmente la lisis de las celulas que se infectan. Las caractensticas ltticas del adenovirus permiten por lo tanto dos modos diferentes de produccion del virus. El primer modo es recoger el virus

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antes de la lisis de las celulas, empleando factores externos para lisar las celulas. El segundo modo es recoger el sobrenadante del virus despues de la lisis celular (casi) completa por el virus producido (vease, por ejemplo, la patente de EE UU 6.485.958, que describe la recogida de adenovirus sin lisis de las celulas mediante un factor externo). Para el ultimo modo, se requieren tiempos de incubacion mas largos para alcanzar lisis celular completa, y por lo tanto mayores rendimientos de virus. Ademas, el vertido gradual del contenido de la celula en el medio puede ser perjudicial para la integridad y rendimiento de los virus obtenidos. Por lo tanto, se prefiere emplear factores externos para lisar las celulas de forma activa.

Los metodos que se pueden usar para la lisis activa de las celulas son conocidos para el experto en la materia, y se han discutido por ejemplo en el documento WO 98/22588, p. 28-35. Los metodos utiles a este respecto son por ejemplo, congelacion-descongelacion, cizallamiento solido, lisis hipertonica y/o hipotonica, cizallamiento lfquido, sonicacion, extrusion a alta presion, lisis con detergente, combinaciones de los anteriores, y similares. En una forma de realizacion de la invencion, las celulas se lisan usando al menos un detergente. El uso de un detergente para la lisis tiene la ventaja de que es un metodo facil, y es facilmente escalable.

Detergentes

Los detergentes que se pueden usar y la manera en que se emplean son en general conocidos para el experto en la materia. Se discuten varios ejemplo por ejemplo en el documento WO 98/22588, p. 29-33. Detergentes, como se usa aqrn, pueden incluir detergentes, anionicos, cationicos, dipolares y no ionicos. Los detergentes de ejemplo incluyen, pero no estan limitados a taurocolato, desoxicolato, taurodesoxicolato, cetilpiridio, cloruro de benzalconio, ZWITTERGENT-3-14®, CHAPS (3-[3-colamidopropil) dimetilamoniol]-1-propanosulfonato hidrato, Aldrich), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, Triton X-100®, Triton X-114®, C12E8, Octil-B-D-Glucopiranosido, PLURONIC-F68®, TWEEN-20®, TWEEN-80® (CALBIOCHEM® Biochemicals), Thesit®, NP-40®, Brij-58®, glucosido de octilo, y similares. Esta claro para el experto en la materia que la concentracion del detergente puede variar, por ejemplo dentro del intervalo de aproximadamente el 0,1%-5% (peso/peso). En ciertas formas de realizacion el detergente esta presente en la solucion de lisis a una concentracion de aproximadamente el 1% (peso/peso). En algunos experimentos piloto de los inventores, el uso de Triton produjo soluciones menos viscosas que algunos de los otros detergentes probados (Tween 20, Tween 80, desoxicolato). En una forma de realizacion de la presente invencion, el detergente usado es Triton X-100.

Nucleasa

La presente invencion en formas de realizacion preferidas emplea nucleasa para eliminar o fragmentar acidos nucleicos contaminantes, libres, es decir, mayoritariamente de celulas. Nucleasas de ejemplo adecuadas para su uso en la presente invencion incluyen Benzonase®, Pulmozyme®, o cualquier otra DNasa y/o RNasa normalmente usada en la tecnica. En formas de realizacion preferidas, la nucleasa es Benzonase®, que hidroliza los acidos nucleicos rapidamente hidrolizando los enlaces fosfodiester internos entre nucleotidos espedficos, reduciendo de esta manera la viscosidad del lisado celular. Benzonase® se puede obtener comercialmente de Merck KGaA (codigo W214950).

La concentracion a la que la nucleasa se emplea esta preferiblemente dentro del intervalo de 1-100 unidades/ml.

Segun ciertas formas de realizacion preferidas de la invencion, la nucleasa se emplea antes de que las celulas se lisen (vease tambien el documento WO 2005/0805565). Se puede anadir tan solo segundos antes de (o virtualmente concomitante a) el paso de lisis, pero preferiblemente la nucleasa se anade al cultivo al menos un minuto antes del paso de lisis. El cultivo celular con la nucleasa anadida se puede entonces incubar por encima de la temperatura del proceso, por ejemplo alrededor de 40°C, o la temperatura de cultivo (por ejemplo entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 37°C), o a temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) o menor (por ejemplo aproximadamente 0°C), en donde en general se requieren tiempos de incubacion mas largos a temperatura mas baja para alcanzar el mismo resultado (vease el folleto de Benzonase® de Merck KGaA codigo W 214950). Como ejemplo no limitante, la incubacion se puede por ejemplo realizar a aproximadamente 37°C, durante aproximadamente 10 minutos, despues de lo cual las celulas se lisan. Obviamente la nucleasa puede y preferiblemente aun degradara acidos nucleicos de forma activa despues del paso de lisis, y en ciertas formas de realizacion segun la presente invencion la incubacion de las celulas con endonucleasa despues de la lisis se prolonga durante aproximadamente 50 minutos (produciendo un tiempo total de tratamiento con nucleasa de aproximadamente 1 hora, aunque este tiempo puede ser efectivamente mas largo, puesto que se anticipa que la nucleasa todavfa sera funcional hasta que se elimine en pasos de purificacion posteriores). Esto es considerablemente mas corto que la incubacion de toda la noche divulgada en el documento WO 98/22588. Por supuesto, la incubacion mas larga, tal como por ejemplo incubacion de 2 horas o de toda la noche o mas larga (en el folleto de Benzonase® de Merck KGaA codigo W 214950, se proporcionan datos de hasta 30 horas de incubacion) tambien es posible segun metodos de la presente invencion, pero no se requiere para obtener resultados aceptables.

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El 'paso de lisis' (es decir, someter las celulas que contienen el virus producido en ellas a lisis) como se usa en estas formas de realizacion, significa que es un paso lisis empleando factores externos (vease en 'lisado de las celulas' anteriormente), tal como un detergente. Obviamente, durante el cultivo de las celulas en donde se propaga el adenovirus, algunas celulas se pueden haber lisado ya debido al virus en ausencia de factores externos. Por lo tanto, en formas de realizacion preferidas, tal lisis en ausencia de factores externos se ha producido en menos del 50%, preferiblemente menos del 40%, mas preferiblemente menos del 30%, aun mas preferido menos del 20% de las celulas, cuando se inicia el tratamiento con nucleasa, es decir preferiblemente la nucleasa se anade cuando las celulas tienen una viabilidad de al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, respectivamente.

Aunque no preferidos (vease anteriormente), tambien se podnan usar metodos que son dependientes de la lisis de las celulas en ausencia de factores externos. Se han descrito procesos que implican lisis 'espontanea', en donde se desaprueba el uso de benzonasa (vease la patente de EE UU 6.485.958). Sin embargo, segun los inventores presentes sera beneficioso tambien en tales sistemas anadir nucleasa durante las fases tardfas del cultivo, es decir, preferiblemente cuando las celulas en donde se propaga el virus aun tienen una viabilidad del al menos el 5%, mas preferiblemente de al menos el 10%, aun mas preferiblemente de al menos el 20% (es decir, cuando menos del 95%, el 90%, el 80% de las celulas se han lisado, respectivamente). Se anticipa que esto mejorana el proceso en la calidad de los virus obtenidos cuando se empleara este paso. El descubrimiento del momento optimo (es decir, correspondiente al porcentaje optimo de celulas que se han lisado) para anadir la nucleasa en estos aspectos de la invencion dependera de la cantidad de nucleasa anadida y el descenso de la actividad espedfica de la nucleasa durante la incubacion, y se puede determinar de forma empmca por el experto en la materia, ahora que la ventaja de la adicion de nucleasa al cultivo por sf se ha divulgado aqu (vease tambien el documento WO 2005/080556). El lisado obtenido segun estas formas de realizacion se puede purificar adicionalmente empleando metodos y pasos como se discute en el presente documento, tal como ultrafiltracion y opcionalmente cromatograffa.

La solicitud internacional de patente WO 03/097797 describe metodos alternativos para purificar partfculas de adenovirus a partir de lisados celulares, que comprenden la adicion de un agente de precipitacion selectivo para precipitar impurezas de ADN. Tal metodo tambien se puede combinar con metodos de purificacion segun la presente invencion, incluyendo el paso de ultrafiltracion en el que se aplica presion inversa en el lado del permeado. Este es un metodo alternativo para eliminar acido nucleico libre, en lugar de fragmentarlo mediante tratamiento con nucleasa. Aunque se especifica en el documento WO 03/097797 que no se requiere un paso de nucleasa cuando se usa ese metodo, se usa tal paso en una fase posterior del procedimiento por eficacia. La forma de realizacion descrita antes, incluyendo el paso de anadir un nucleasa antes de la lisis celular, se podna combinar de forma adecuada con la adicion de un agente de precipitacion selectivo tras la lisis, haciendo de esta manera un paso de adicion de nucleasa mas adelante en el proceso (como se prefiere en el documento WO 03/097797) potencialmente superfluo.

Clarificacion

En formas de realizacion preferidas de la invencion, el lisado celular que comprende el virus se clarifica. La clarificacion se puede hacer mediante un paso de filtracion, eliminando los restos celulares y otras impurezas. Los filtros adecuados pueden utilizar filtros de celulosa, fibras de celulosa regenerada, fibras de celulosa combinadas con auxiliares de filtrado inorganicos (por ejemplo, tierra de diatomeas, perlita, sflice ahumada), filtros de celulosa combinados con auxiliares de filtrado inorganicos y resinas organicas, o cualquier combinacion de los mismos, y filtros polimericos (los ejemplos incluyen pero no estan limitados a nailon, polipropileno, polietersulfona) para alcanzar la eliminacion eficaz y recuperaciones aceptables. En general, un proceso con multiples fases es preferible pero no requerido. Un proceso de dos o tres fases de ejemplo consistina en filtro(s) grueso(s) para eliminar precipitados grandes y restos celulares seguido por filtro(s) de segunda fase de limpieza con tamanos de poros nominales mayores de 0,2 micrometros pero menores de 1 micrometro. La combinacion optima puede ser una funcion de la distribucion del tamano del precipitado asf como otras variables. Ademas, tambien se pueden usar operaciones de fase unica que emplean un filtro relativamente impermeable o centrifugacion para la clarificacion. Mas generalmente, cualquier aproximacion de clarificacion incluyendo pero no limitado a filtracion convencional, micofiltracion, centrifugacion, o alimentacion de auxiliares de filtrado (por ejemplo, tierra de diatomeas) en combinacion con filtracion convencional o de profundidad, que proporciona un filtrado de claridad adecuada para no ensuciar la membrana y/o resinas en los pasos posteriores, sera aceptable para usar en el paso de clarificacion de la presente invencion.

En una forma de realizacion, se usa la filtracion en profundidad y filtracion en membrana. Los productos comercialmente disponibles utiles en este respecto se mencionan por ejemplo en el documento WO 03/097797, p.20-21. Las membranas que se pueden usar pueden estar compuestas de diferentes materiales, se pueden diferenciar el tamano de poro, y se pueden usar en combinaciones. Se pueden obtener comercialmente de varios vendedores.

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En ciertas formas de realizacion de la invencion, se usa una combinacion de filtros de 0,8 pm y 0,45 pm, por ejemplo filtros Sartopore-2, para la clarificacion.

Ultrafiltracidn/diafiltracidn

Segun la presente invencion, la suspension de virus se somete a ultrafiltracion (algunas veces denominada diafiltracion cuando se usa para intercambio de tampon, ver mas adelante) al menos una vez durante el proceso, por ejemplo para concentrar el virus y/o intercambio de tampon, y/o para la concentracion y diafiltracion del producto clarificado, y en particular para la eliminacion de contaminantes, tal como protemas de la celula huesped, ADN (fragmentado) de la celula huesped, componentes del medio de cultivo, detergentes y benzonasa. El proceso usado para concentrar el virus segun el metodo de la presente invencion puede incluir cualquier proceso de filtracion (por ejemplo, ultrafiltracion (UF)) donde la concentracion del virus aumenta forzando a que el diluyente pase a traves de un filtro de tal manera que el diluyente se elimina de la preparacion del virus mientras que el virus es incapaz de pasar a traves del filtro y por lo tanto permanece, en forma concentrada, en la preparacion de virus. La UF se describe en detalle en, por ejemplo Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman y A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, 1996); y en: Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9). Un proceso de filtracion preferido es la filtracion de flujo tangencial (“FFT”) como se describe en, por ejemplo el catalogo de MILLIPORE titulado “Pharmaceutical Process Filtration Catalogue” pp. 177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96). La FFT se usa ampliamente en la industria de bioprocesamiento para la recogida de celulas, clarificacion, purificacion y concentracion de productos incluyendo virus. El sistema se compone de tres corrientes distintas del proceso: la solucion de alimentacion, el permeado y el retenido. Dependiendo de la aplicacion, se pueden usar filtros con diferentes tamanos de poro. En la presente invencion el retenido contiene el producto (virus), y se puede usar para pasos adicionales de purificacion si se desea. Para esto, la membrana de ultrafiltracion particular seleccionada tendra un tamano de poro lo suficientemente pequeno para retener al virus pero lo suficientemente grande para limpiar las impurezas de forma eficaz. Dependiendo del fabricante y del tipo de membrana, para valores de corte de peso molecular nominal de adenovirus (NMWC) entre 100 y 1000 kDa puede ser apropiado, por ejemplo membranas con un NMWC de 300 kDa o 500 kDa. La composicion de la membrana puede ser, pero no esta limitada a, celulosa regenerada, polietersulfona, polisulfona, o derivados de las mismas. Las membranas pueden ser hojas planas (tambien llamadas pantallas planas) o fibras huecas. UF normalmente se refiere a filtracion usando filtros con un tamano de poro menor de 0,1 pm. Los productos (aqrn: adenovirus) generalmente se retienen, mientras que se puede reducir el volumen a traves de permeacion (o mantenerse constante durante la diafiltracion anadiendo tampon a la misma velocidad con la que el permeado, que contiene tampon e impurezas, se elimina en el lado del permeado). Las dos geometffas mas ampliamente utilizadas para FFT en la industria biofarmaceutica son modulos de placa & marco (pantalla plana) y de fibra hueca. Las unidades de fibra hueca para la ultrafiltracion y microfiltracion fueron desarrolladas por Amicon y Ramicon a principios de la decada de 1970 (Cheryan, M. Ultrafiltration Handbook), incluso aunque ahora hay muchos vendedores incluyendo Spectrum y GE Healthcare. Los modulos de fibra hueca consisten en una serie de fibras que se autosoportan con una capa externa densa que da a las membranas su permselectividad. Los diametros de las fibras vaffan desde 0,5 mm - 0,3 mm. Una ventaja de los modulos de fibra hueca es la disponibilidad de filtros de areas de membrana pequenas (ca. 16 cm2) a areas de membrana muy grandes (ca. 20 m2) permitiendo el aumento progresivo lineal y simple. En ciertas formas de realizacion preferidas segun la invencion, se usan las fibras huecas para FFT. Se ha descrito que estas dan menos cizalla y una proporcion parffcula viral/unidad de infeccion (VP/UI) mejor que las membranas de pantalla plana. Ademas, la presion transmembrana es generalmente menor en fibras huecas que con pantallas planas. En ciertas formas de realizacion, se usan fibras huecas de 0,05 pm de tamano de poro segun la invencion.

La ultrafiltracion puede comprender diafiltracion (DF), usando ultrafiltros y es una manera ideal para eliminar e intercambiar sales, azucares, solventes no acuosos, la separacion de especies libres de las unidas, eliminacion de material de bajo peso molecular, o cambio rapido de entornos ionicos y/o de pH. Los microsolutos se eliminan mas eficazmente anadiendo solvente a la solucion que se esta ultrafiltrando a una velocidad igual a la velocidad de UF. Esto lava microespecies de la solucion a un volumen constante, purificando el virus retenido. La presente invencion utiliza un paso de DF para intercambiar el tampon del lisado, opcionalmente antes de cromatograffa adicional u otros pasos de purificacion, pero particularmente para eliminar impurezas de las preparaciones de virus. Segun una forma de realizacion de la invencion se realiza la Df mediante FFT para el intercambio de tampon, en donde la adicion de tampon iguala la eliminacion del permeado.

Se puede usar UF/DF para concentrar y/o intercambiar tampon de las suspensiones de virus segun la presente invencion en diferentes estadios del proceso de purificacion, por ejemplo el lisado y/o las suspensiones de virus adicionalmente purificadas tal como las que se han sometido a cromatograffa. Sin embargo, usando los metodos segun la presente invencion, en donde se aplica una presion inversa en el lado del permeado, se encontro de forma inesperada que es posible purificar adenovirus suficientemente sin uso adicional de columnas de cromatograffa o filtros de intercambio ionico. Esto tiene varias ventajas: a) el proceso se hace mas sencillo, y no requiere material de columna caro, material de columna que a su vez no necesita ser validado, limpiado, etc.; b) el proceso se hace mas

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rapido, porque no se requiere ningun paso de cromatograffa y fraccionamiento que exige mucho tiempo; c) el rendimiento total aumentara porque cada paso extra de purificacion tras la ultrafiltracion producira inevitablemente perdida de producto de virus.

La invencion por lo tanto proporciona un metodo nuevo y conveniente para la purificacion de un adenovirus recombinante, dicho metodo comprende: a) cultivar celulas que estan infectadas con dicho adenovirus recombinante, b) lisar dichas celulas y eliminar y/o fragmentar el acido nucleico libre (es decir impurezas de acido nucleico, tal como ADN de la celula huesped), para proporcionar un lisado que comprende el adenovirus recombinante, c) clarificar el lisado para obtener una preparacion de adenovirus, d) someter la preparacion de adenovirus a ultrafiltracion, en donde la preparacion de adenovirus esta en el retenido, para concentrar la preparacion de adenovirus, e) someter la preparacion de adenovirus del paso d) a ultrafiltracion (diafiltracion), en donde la preparacion de adenovirus esta en el retenido, e intercambiar con ella al menos 5, preferiblemente al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 volumenes de diafiltracion (VDF) de tampon, en donde un VDF es el volumen del retenido tras la concentracion en el paso d), y f) preferiblemente esterilizacion por filtracion de la preparacion de adenovirus, el metodo esta caracterizado en que en los pasos d) y e) se aplica presion inversa en el lado del permeado, y en que el metodo no comprende un paso de intercambio anionico ni un paso de cromatograffa de exclusion molecular. En una forma de realizacion preferida, la invencion por lo tanto proporciona un metodo para la purificacion de un adenovirus recombinante, dicho metodo consiste esencialmente en: a) cultivar celulas que estan infectadas con dicho adenovirus recombinante, b) lisar dichas celulas y eliminar y/o fragmentar el acido nucleico libre, para proporcionar un lisado que comprende el adenovirus recombinante, c) clarificar el lisado para obtener una preparacion de adenovirus, d) someter la preparacion de adenovirus a ultrafiltracion, en donde la preparacion de adenovirus esta en el retenido, para concentrar la preparacion de adenovirus, e) someter la preparacion de adenovirus del paso d) a ultrafiltracion, en donde la preparacion de adenovirus esta en el retenido, e intercambiar con ella al menos 5, preferiblemente al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 volumenes de diafiltracion (VDF) de tampon, en donde un VDF es el volumen del retenido tras la concentracion en el paso d), el metodo esta caracterizado en que en los pasos d) y e) se aplica presion inversa en el lado del permeado. Este proceso por lo tanto no comprende un paso de cromatograffa de exclusion molecular, y ademas esta desprovisto de un paso de cromatograffa de intercambio anionico o filtracion de intercambio anionico. Tales pasos se pueden anadir si se desea, pero una de las ventajas del metodo presente es que el numero de pasos cromatograficos se reduce a cero, produciendo las ventajas descritas anteriormente. Los presentes inventores encontraron inesperadamente que el adenovirus recombinante que se obtiene usando este proceso, probablemente cumple las especificaciones explicadas para que un lote de virus recombinante se use en clmica (cantidad residual de ADNch <10 ng/dosis, asumiendo una dosis de 1E11 pv/ml, proporcion PV/IU<30). El paso d) de este metodo podffa no ser estrictamente requerido, pero es conveniente disminuir el volumen de la suspension de virus antes de la diafiltracion para el intercambio de tampon en el paso e), y por lo tanto la invencion tambien proporciona este metodo sin el paso d), aunque el metodo que incluye el paso d) es preferido. En una forma de realizacion preferida de estos metodos, el paso b) comprende: b, i) anadir nucleasa al cultivo de celulas, y posteriormente b, ii) lisar dichas celulas para proporcionar un lisado que comprende el virus recombinante. Aplicando este orden de primero anadir la nucleasa y posteriormente lisar las celulas, la cantidad de ADN de la celula huesped se puede reducir comparado con el orden en donde las celulas primero se lisan y posteriormente se tratan con nucleasa (vease anteriormente, y el documento WO 2005/080556). Al final del proceso, es decir tras el paso de diafiltracion por FFT, la preparacion de adenovirus preferiblemente se somete a esterilizacion por filtracion, como es normal en procesos para materiales de grado farmaceutico, y como sabe el experto en la materia. Tal esterilizacion por filtracion se puede por ejemplo realizar adecuadamente filtrando la preparacion a traves de un filtro de 0,22 pm. Opcionalmente, antes de este filtro de 0,22 pm, se realiza un paso de filtracion a traves de un filtro de 0,45 pm, y se entendera que tal paso esta dentro del ambito del proceso como esencialmente se divulga en el presente documento (es decir, no concede un paso que desviaffa el proceso del proceso que consiste esencialmente en los pasos a)-e) o a)-f), descrito anteriormente). Despues del paso de esterilizacion por filtracion, la preparacion de adenovirus esta lista para uso clmico.

En lugar de o ademas del tratamiento con una nucleasa tal como benzonasa para fragmentar el acido nucleico libre (principalmente ADN de la celula huesped), se puede aplicar la precipitacion selectiva (eliminacion) de impurezas de ADN en el medio de cultivo celular de despues de la lisis, por ejemplo, mediante precipitacion con una cantidad adecuada de un agente de precipitacion selectivo tal como bromuro de domifeno (DB), CTAB (bromuro de cetil- trimetil-amonio), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de benzetonio (BTC), cloruro de tetradecil-trimetil-amonio (TTA), polietilenimina (PEI), etc., como se divulga en detalle en el documento WO 03/097797.

El metodo preferido de ultrafiltracion/diafiltracion empleado comprende FFT.

Segun la invencion, se aplica presion inversa en el lado del permeado. Esto produce la mejora divulgada en el presente documento por primera vez permitiendo un proceso para obtener un adenovirus recombinante lo suficientemente puro que cumple las especificaciones para ensayos clmicos, sin el uso de pasos de cromatograffa en columna, o centrifugacion en densidad en cloruro de cesio molesto y no economico. La presion inversa en el lado

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del permeado distingue la presente invencion de los metodos de ultrafiltracion descritos en la tecnica para la purificacion de adenovirus, en donde no se aplica presion inversa, es decir, donde el lado del permeado esta abierto a la atmosfera (la presion inversa es cero es esos casos [las presiones aqm se dan todas comparadas con la presion atmosferica, que se ajusta a cero]). Los medios para suministrar la presion inversa en el lado del permeado no son cnticos para la presente invencion, en tanto que produzcan una presion inversa (contrapresion) en el lado del permeado, y puede ser cualquier medio adecuado para alcanzar tal presion inversa. Tal presion inversa en el lado del permeado se puede aplicar por ejemplo de forma adecuada mediante una bomba, que proporciona presion inversa al permeado. Un metodo sencillo de aplicar presion inversa es cerrando parcialmente la salida del permeado, por ejemplo sujetando parcialmente con una pinza el tubo en el lado del permeado, o mediante una bomba de permeado tal como una bomba de manguera, bomba centnfuga, bomba rotatoria, bomba redproca, y similares, aplicando cualquier medio que prevenga que el lado permeado este completamente abierto a la atmosfera, y similares, y los medios adecuados seran aparentes para el experto en la materia despues de tener el conocimiento de las ventajas divulgadas en la presente solicitud. El uso de una bomba en el lado del permeado puede producir alguna pulsacion (fluctuacion) de la presion inversa, que no parece que tenga efecto negativo en los metodos divulgados aqm, y puede incluso ser beneficioso. La ventaja de usar una bomba para aplicar la presion inversa es que la presion inversa se puede regular facilmente.

La presion inversa (presion de permeado) que se va a aplicar segun la invencion es al menos de 3 kPa, preferiblemente al menos aproximadamente 5 kPa. En ciertas formas de realizacion, la presion inversa es al menos 10 kPa, o al menos 15 kPa, o al menos 20 kPa, o al menos 25 kPa, o al menos 30 kPa, o al menos 40 kPa, o al menos 50 kPa, o al menos 100 kPa, o al menos 150 kPa, o al menos 200 kPa, o al menos 250 kPa. En ciertas formas de realizacion, la presion inversa esta por ejemplo entre aproximadamente 3-80 kPa. Se puede determinar facilmente una presion inversa adecuada de forma emprnca por el experto en la materia, y dependera por ejemplo de la configuracion de la columna de membrana de diafiltracion (por ejemplo, longitud). En general, se prefiere usar una presion inversa que este cercana a la presion de salida del retenido, porque si la presion inversa es muy alta, el modulo de diafiltracion se usa de forma menos eficaz. Una fibra hueca mas larga por ejemplo producira una presion de salida mayor, de modo que en tales casos la presion inversa tambien se aumenta. Tfpicamente, la presion inversa aplicada segun la invencion no es mayor de 400 kPa. En ciertas formas de realizacion, la presion inversa aplicada segun la invencion no es mayor de 300 kPa, o no es mayor de 200 kPa, o no es mayor de 100 kPa, o no es mayor de 80 kPa.

La presion de entrada minima de una fibra hueca es aproximadamente 10 kPa. La presion de entrada de una fibra hueca es mayor que la presion de salida. La presion maxima que se puede aplicar a una fibra hueca es aproximadamente 500 kPa.

La aplicacion de presion inversa en el lado del permeado reduce la presion transmembrana (PTM) durante el paso de ultrafiltracion, reduccion de la PTM que puede contribuir a los resultados mejorados descritos en el presente documento. La PTM se puede calcular como sigue: PTM = {(Pin + Pout)/2}-Pperm (en donde Pin es la presion de entrada, Pout es la presion de salida, y Pperm es la presion de permeado [siendo la ultima cero en los procesos descritos hasta ahora para purificacion de virus, y siendo de al menos 3 kPa segun la invencion]). En ciertas formas de realizacion, la presion transmembrana se mantiene por debajo de aproximadamente 150 kPa, o por debajo de 100 kPa, o por debajo de 50 kPa, o por debajo de 27 kPa, o por debajo de aproximadamente 20 kPa, o por debajo de aproximadamente 13 kPa, o por debajo de aproximadamente 7 kPa. Estos valores son valores medios a lo largo de la longitud de la fibra hueca. Esto se puede establecer de forma adecuada por el experto en la materia mediante la variacion de la presion de entrada y salida en el lado del retenido y la presion inversa en el lado del permeado. Estos valores son valores medios a lo largo de la duracion del paso de fFt, y en formas de realizacion preferidas estos valores son los valores maximos para al menos el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, preferiblemente al menos el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95% de la duracion del paso de FFT. De nuevo, la configuracion de la columna de membrana, por ejemplo la longitud, puede tener efecto en el valor para la presion PTM: una fibra hueca mas larga por ejemplo producira generalmente una PTM mayor (debido a la mayor presion de salida), a menos que la presion inversa que se aplica segun la invencion aumente correspondientemente segun la formula anterior.

La aplicacion de presion inversa en el lado del permeado (y el descenso resultante en la presion transmembrana) mejora el rendimiento de los adenovirus obtenidos (vease el ejemplo 3), y la pureza de los mismos (de modo que puede que no se requieran ya los pasos posteriores de purificacion).

En formas de realizacion preferidas, la ultrafiltracion se usa primero para reducir el volumen de la suspension de virus, por ejemplo por un factor de 5, simplemente aplicando ultrafiltracion sin alimentar tampon al retenido (que comprende el virus). Ya en este paso se debe aplicar la presion inversa al permeado.

Posteriormente, la suspension de virus se diafiltra (usando la misma membrana de ultrafiltracion, preferiblemente un modulo de fibra hueca de FFT), en donde se pueden usar diferentes tampones para el intercambio de tampon. Se deben usar al menos 5 volumenes de diafiltracion (VDF), preferiblemente al menos 6, 7, 8, 9, o 10 DFV durante el

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paso de diafiltracion, que de nuevo se debe llevar a cabo segun la invencion con la aplicacion de presion inversa al permeado. Para mejorar mas la pureza del virus si se desea, se pueden usar mas VDF adecuadamente, por ejemplo, al menos 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50 o mas VDF. Este paso de diafiltracion normalmente se lleva a cabo como diafiltracion a volumen constante, anadiendo tampon al retenido (suspension de virus) a la misma velocidad a la que se elimina el permeado que contiene tampon e impurezas en el lado del permeado.

Al final del proceso de purificacion, en una forma de realizacion preferida el virus se puede diafiltrar contra un tampon de formulacion de (adeno)virus adecuado, tampones de formulacion que como tales son conocidos para el experto en la materia. De forma alternativa, el virus se podffa diafiltrar contra un tampon adecuado para pasos adicionales de proceso, si se desea, por ejemplo un tampon adecuado para aplicaciones posteriores de intercambio de aniones (por ejemplo NaCl 0,25 para cargar un filtro de intercambio de aniones Mustang Q para la purificacion de Ad35).

La presente invencion tiene como una caracteffstica distintiva que durante un paso de ultrafiltracion en la purificacion de virus en donde el retenido contiene el virus, se aplica una presion inversa (de al menos 3 kPa) en el lado del permeado. No se aplico presion inversa en los procesos de purificacion de virus descritos en el estado de la tecnica, por ejemplo, los documentos US 2002/182723, WO 98/22588 o WO 03/097797. Ademas, la patente de EE UU 5.947.689 describe un sistema de filtracion automatizado en el que la velocidad del flujo del retenido (flujo transversal) se controla basado en las presiones medidas. Cuando la presion aumenta, se baja el flujo transversal, produciendo presiones menores. No se describe allf presion en el filtrado (lado del permeado). Ademas, la patente de EE UU 4.579.662 describe un metodo de filtracion mediante el cual se limpia una membrana manchada forzando un lfquido de limpieza desde el lado del permeado (filtrado) al lado del retenido. Durante la limpieza la filtracion se interrumpe temporalmente y el flujo se invierte (permeado a retenido). Esa divulgacion no describe aplicar una presion en lado del permeado mientras que el filtrado continua fluyendo desde el lado del retenido al del permeado.

Purificacidn adicional

Aunque es deseable proporcionar un proceso para la purificacion de adenovirus que sea tan sencillo y economico como sea posible, como se alcanza mediante el metodo divulgado en el presente documento donde se aplica presion inversa al permeado durante la ultrafiltracion/diafiltracion, y preferiblemente no se requiere purificacion adicional tras el paso de UF/DF, es sin embargo posible aplicar pasos adicionales de purificacion tras el paso de UF/DF, si asf se desea. Por lo tanto, segun ciertas formas de realizacion de la invencion, la suspension de virus que se ha obtenido mediante un metodo segun la invencion se puede opcionalmente purificar mas, por ejemplo, mediante metodos generalmente conocidos para el experto en la materia, tal como centrifugacion en gradiente de densidad (por ejemplo, documento WO 98/22588, p. 59-61), o preferiblemente cromatograffa (por ejemplo discutida en el documento WO 98/22588, p. 61-70). Se han descrito muchos procesos para la purificacion adicional de virus, en donde se incluyen pasos de cromatograffa en el proceso. El experto en la materia sera consciente de estos procesos, y puede variar el modo exacto de emplear los pasos cromatograficos para optimizar el proceso de la invencion.

Es por ejemplo posible purificar ciertos virus mediante una combinacion de pasos cromatograficos de intercambio anionico e intercambio cationico (vease la patente de EE UU 6.008.036). Tambien es posible emplear un medio de hidroxiapatita para purificar adenovirus (vease el documento WO 02/44348). Tambien se podffa usar un paso de adsorcion en fase reversa (vease, por ejemplo, el documento WO 03/097797, p. 26).

Para la purificacion de adenovirus, es normalmente preferido usar al menos un paso de cromatograffa de intercambio anionico. El uso de la cromatograffa de intercambio anionico para la purificacion de adenovirus se ha descrito de forma extensa, y este aspecto esta por lo tanto al alcance del experto en la materia (vease, por ejemplo, patente de EE UU 5.837.520; Huyghe et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 1403-1416); patente de EE UU 6.485.958; documento WO 00/50573; patente de EE UU 6.586.226; patente de EE UU 6.537.793. Ademas de las columnas de intercambio anionico, son adecuados productos cromatograficos de membranas de intercambio anionico ('filtros de intercambio anionico'). Para el uso de estos filtros y sus ventajas en la purificacion de adenovirus vease, por ejemplo, el documento WO 03/078592. Claramente, el empleo de tales filtros tambien esta dentro del ambito del termino ‘cromatograffa de intercambio anionico' como se usa en el presente documento. Los filtros de intercambio anionico adecuados para su uso en estos metodos de la invencion son conocidos en la tecnica y estan comercialmente disponibles (vease, el documento WO 03/078592, parrafos [40]-[41]), por ejemplo de Pall (por ejemplo serie Mustang™) y de Sartorius (por ejemplo serie Sartobind).

Como se ha descrito anteriormente, el proceso puede emplear adecuadamente ademas un paso de cromatograffa de exclusion molecular (vease, por ejemplo, el documento WO 97/08298; patente de EE UU 6.261.823). En el paso de exclusion molecular, se alcanza una separacion de grupo de parffculas virales de impurezas de bajo peso molecular. Es por ejemplo posible cargar aproximadamente el 5-30%, preferiblemente aproximadamente el 10% del

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volumen de columna en la columna de exclusion molecular (modo de separacion de grupo de la cromatograffa de exclusion molecular).

Por lo tanto, en ciertas formas de realizacion de la invencion, una suspension de adenovirus que se ha preparado segun el metodo de la invencion se purifica adicionalmente usando un paso de cromatograffa de intercambio ionico y un paso de cromatograffa de exclusion molecular.

Tampones

Se pueden usar muchos tampones durante la purificacion del virus segun la presente invencion. En varias formas de realizacion de la presente invencion, los tampones usados para UF/DF y cromatograffa de intercambio ionico en general contienen NaCl 0,1-1,0 M y tampon TRIS (por ejemplo 50 mM, pH 7,5). En ciertas formas de realizacion, se usa un tampon que contiene NaCl 0,25 mM/ PS80 al 0,05%, MgCl2 2 mM/ Tris 50 mM pH 8,0 para la purificacion de Ad35.

En algunas formas de realizacion de la invencion, se intercambia el tampon de la preparacion de adenovirus a un tampon que comprende aproximadamente NaCl 1 M durante la diafiltracion, y posteriormente a tampones con menor fuerza ionica. Se ha mostrado en la solicitud internacional de patente WO 2005/080556 que tal paso puede mejorar la eliminacion de protemas y ADN de la preparacion. Sin embargo, tal paso no es estrictamente requerido, y debido al riesgo posiblemente aumentado de agregacion a estas fuerzas ionicas altas, los presentes inventores probaron si un proceso sin tal paso de alta sal produce un virus (Ad35) suficientemente puro. Aunque la diafiltracion contra un tampon que comprende NaCl 1 M parece que mejora ligeramente la eliminacion de ADN y protema, se encontro que no se requiere la diafiltracion frente a un tampon con alta sal (que comprende NaCl 1 M) para un buen proceso de purificacion de adenovirus segun la invencion. Por lo tanto, la fuerza ionica durante la diafiltracion se puede mantener por debajo de la de una solucion que comprende NaCl 1 M. Sin embargo, si esto no proporcionara preparaciones de virus suficientemente puras, se prefiere incluir un paso en donde dicho intercambio de tampon con el retenido comprende un paso de intercambio de tampon con un tampon que comprende cloruro de sodio entre 0,8 My 2 Mu otra sal que de igual fuerza ionica. Preferiblemente, tal proceso comprende el posterior intercambio de tampon con un tampon que tiene una fuerza ionica de un tampon que comprende menos de NaCl 0,5 M. La deseabilidad de tal paso de diafiltracion con alta sal (es decir, contra un tampon que tiene una fuerza ionica de una solucion que contiene NaCl al menos 0,8 M, y preferiblemente menos de 2 M, por ejemplo 1 M) puede depender de la concentracion del virus y/o la concentracion de celulas huesped en el material de partida, y el experto en la materia sera capaz de decidir si incluir o no tal paso, basado en experimentos piloto en los que el material de virus obtenido se analiza para el contenido y pureza de ADN. En una forma de realizacion segun la invencion, se intercambia el tampon del adenovirus durante la separacion de grupo por - y por ultimo se almacena en- el tampon que tambien se usa para el Estandar Mundial de Adenovirus (Hoganson et al, Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing Marzo 2002, p. 43-48): Tris 20 mM pH 8, NaCl 25 mM, glicerol al 2,5%. En una forma de realizacion preferida sin embargo, no se requiere separacion de grupo, pero se intercambia el tampon del adenovirus directamente durante la diafiltracion al tampon de formulacion.

Obviamente, se pueden usar muchos otros tampones, y se pueden encontrar varios ejemplos de formulaciones adecuadas para el almacenamiento y administracion farmaceutica de preparaciones de (adeno)virus purificados, por ejemplo, en la patente europea no. 0853660, y en las solicitudes internacionales de patente WO 99/41416, Wo 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763.

Las referencias citadas en esta especificacion se incorporan junto a esta para la parte espedfica indicada, o en su totalidad si no se indica parte espedfica.

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar adicionalmente la invencion por medio de ciertas formas de realizacion de la invencion, y no se debe considerar que limiten el ambito de la presente invencion en manera alguna.

Ejemplos

Ejemplo 1. La adicion de nucleasa al cultivo de celulas en lugar de al lisado de celulas mejora el proceso para la purificacidn de virus.

En este ejemplo se muestra que la adicion de nucleasa al cultivo de celulas antes de lisar las celulas reduce la cantidad de ADN residual de la celula huesped en el producto purificado final.

En las carreras 1 y 2 se liso un cultivo de 10 litros de celulas PER.C6® con Triton X-100® (Sigma) en el dfa 2,5 tras la infeccion con un vector adenoviral. Treinta minutos despues de la lisis, se anadieron Benzonase® (Merck KgaA, 50

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En las carreras 3-8, se anadieron Benzonase® (50 U/ml) y MgCl2 (2 mM) a un cultivo de 10 litros de celulas PER.C6 (el dfa 2,5 tras la infeccion), y despues de 10 minutos de incubacion las celulas se lisaron con Triton X-100® al 1%. Despues de una incubacion adicional de 50 minutos el producto de Benzonase®/Triton X-100® (B/T) se clarifico mediante filtracion.

La diferencia con el proceso conocido de la tecnica por lo tanto es en el orden en el que se anadieron la nucleasa (Benzonase®) y el detergente (Triton X-100®): clasicamente primero se lisan las celulas, y posteriormente se anade la nucleasa (denominado en el presente documento producto T/B), mientras que en el proceso segun la invencion, primero se anade la nucleasa y posteriormente se lisan las celulas (denominado en el presente documento producto B/T). Esto se muestra de forma esquematica en la figura 1.

Las muestras se purificaron despues adicionalmente. La clarificacion se realizo mediante filtracion de profundidad (filtro Clarigard de 0,5 pm, Millipore) seguida por clarificacion adicional sobre un filtro Sartopore 2 de 0,8/0,45 pm (Sartorius). El material clarificado se concentro 5 veces a traves de una fibra hueca de 0,05 pm (Spectrum), seguido mediante diafiltracion con posteriormente 6 volumenes de NaCl 1,0 M/TRIS 50 mM pH 7,5 y 4 volumenes de NaCl

0. 4.M/Tris 50 mM pH 7,5. El retenido diafiltrado se cargo en una columna de Sepharosa Q-XL (Amersham) y la fraccion de virus se eluyo con NaCl 0,55 M/TRIS 50 mM pH 7,5. Esta fraccion se purifico adicionalmente y el tampon se intercambio con una columna de Sepharosa 4 FF (Amersham). El producto purificado generado se concentro a la concentracion deseada con una fibra hueca (tamano de poro 0,05 pm, Spectrum), se filtro por 0,22 pm y se alicuoteo. Las muestras del producto purificado se analizaron para ADN residual de celulas huesped mediante Q- PCR.

El tratamiento T/B dio como resultado una reduccion de ADN que tras el procesamiento adicional posterior pudo satisfacer justo la especificacion requerida en el material terminado y relleno. Los requerimientos reguladores para ADN residual de celulas huesped para formulaciones de virus vivos son <10 ng por dosis (se asume que una dosis contiene 1E11 partmulas virales).

Como se muestra en la tabla 1, cambiar los pasos de Triton X-100® y Benzonase® redujo la cantidad de ADN residual de celulas huesped en el producto purificado significativamente: mediante la adicion de la nucleasa antes de la lisis activa de las celulas la cantidad de ADN residual de celulas huesped se pudo reducir de 10 a 40 veces, a menos de 0,1 ng/1E11 partmulas virales.

Ademas, esta claro del analisis por SDS-PAGE (Fig. 2) que tras la clarificacion por filtracion de profundidad y de membrana de un producto B/T un numero de protemas de la celula huesped, entre las cuales una cantidad significativa de protemas histona (Mw aproximadamente 10-20 kDa en geles, identidad confirmada mediante espectrometna de masa), se elimino durante la clarificacion mientras que estas protemas estan claramente todavfa presentes en el producto T/B clarificado.

Por lo tanto, la adicion de nucleasa antes de lisar las celulas produce ventajas significativas sobre las conocidas del estado de la tecnica (vease el documento PCT/EP2005/050739). Sin querer estar unido a ninguna teona, las explicaciones posibles para las diferencias entre las carreras 1 y 2 (T/B) por una parte y las carreras 3-8 (B/T) por otra parte pueden incluir:

1. Tras la adicion de Benzonase® el ADN liberado por las celulas lisadas debido a la produccion de virus ya se puede digerir. Tan pronto como el ADN se libera de las celulas lisadas por Triton, la Benzonase® esta presente para digerir inmediatamente el ADN, previniendo de esta manera la formacion de grandes agregados de ADN. La digestion de ADN no agregado es probablemente mas eficaz que la digestion de los agregados principales de ADN.

2. El tiempo total de incubacion con Benzonase® aumenta con 30 minutos, produciendo una digestion mas eficaz (ver el folleto de Benzonase® de Merck KGaA codigo W 214950).

3. Probablemente se forman complejos mayores de histonas cuando el ADN se digiere inmediatamente tras la liberacion y estas partmulas mayores son retenidas por los filtros de clarificacion. La retencion de los complejos histona-ADN durante la clarificacion tambien podna haber contribuido a la reduccion del ADN residual de celulas huesped.

Se han probado varias resinas de intercambio anionico por ejemplo, QAE 550C y Super Q 650M (adquiridas de Tosoh), Q Sepharosa HP, ANX Sepharosa 4FF, DEAE Sepharosa, Q Sepharosa XL, Q Sepharosa Big Bead y Q Sepharosa fF (adquiridas de Amersham). Aunque todas estas resinas fueron adecuadas para la purificacion de adenovirus recombinantes, se determino que Q Sepharosa XL era la mas adecuada para el proposito basado en la separacion de virus de las protemas de las celulas huesped y el ADN de celulas huesped, y las caractensticas de

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flujo. Ademas, se obtuvieron muy buenos resultados usando un filtro Sartobind 75 (filtro cargado que contiene grupos anionicos, Sartorius) en lugar de una columna de intercambio anionico.

Se probaron varias resinas de exclusion molecular, por ejemplo Sephacryl S300, Sephacryl S500, Sepharosa 4FF y Sepharosa 6 FF (todas adquiridas de Amersham). Aunque todas estas resinas fueron adecuadas para la purificacion de adenovirus recombinantes, se encontro la Sepharosa 4FF la mas adecuada para el proposito basado en la capacidad de separar virus de las protemas y ADN de las celulas huesped.

Basados en estos y otros resultados, se muestra de forma esquematica un posible proceso para la purificacion de adenovirus en la figura 3 (vease tambien el documento WO 20005/080556).

Ejemplo 2: La aplicacion de presion inversa en el lado del permeado durante UF/DF aumenta la pureza y recuperacion de adenovirus.

Se hicieron crecer celulas PER.C6 en un tanque en agitacion hasta una densidad celular que variaba de 0,9 a 2,6 millones de celulas/ml. Estas celulas se infectaron con un vector Ad35 que comprendfa un transgen CS (gen circumsporozoite (CS) con codon optimizado de Plasmodium falciparum, clon 02-659, como se describe en el documento WO 2004/055187; adenovirus recombinante llamado Ad35.dE3.Ad5orf6/7.AdApt535, o brevemente Ad35.CS, vease tambien el documento WO 2005/080556) con una MDI de 40 pv/celula. Despues de 3 a 4 dfas de produccion de virus el cultivo de celulas infectadas se trato con Benzonasa y Triton (metodo B/T) como se describe en el ejemplo 1. El producto B/T (tftulo: aproximadamente 2E11 pv/ml) se clarifico mediante filtracion de profundidad seguida por filtracion de membrana. El producto clarificado se uso como alimento para varios experimentos de FFT usando una fibra hueca de 0,05 pm.

Los experimentos de FFT se realizaron para reducir el ensuciamiento durante el paso de FFT. El ensuciamiento reducido mejorara la pureza del retenido final, mejorara la recuperacion de partfculas virales y aumentara el flujo.

Los parametros probados son: la cantidad relativa de alimento (l/m2 de area de filtro), la presion transmembrana (PTM) y la presion en el lado del permeado.

En todos los experimentos el alimento se concentro 5 veces, y posteriormente se diafiltro (usando FFT) contra 10 volumenes de diafiltracion de un tampon basado en TRIS (pH 7,5-8,0) que contema cantidades variables de NaCl (entre 0,1-1,0 M). En algunos experimentos se anadieron PS80 al 0,05% y MgCh 2 mM al tampon de diafiltracion.

La recuperacion de partfculas virales Ad35 se midio mediante HPLC-AEX, la pureza se determino bien mediante RP- HPLC, o mediante el perfil cromatografico que se genero cuando el retenido final se purifico adicionalmente mediante cromatograffa en columna (intercambio ionico o separacion de grupo). En la figura 4 se muestra un ejemplo de los perfiles de RP-HPLC de retenidos con alta o baja pureza. Se categorizo una muestra como de alta pureza cuando el pico que se daba a aproximadamente 60 minutos en el perfil de RP-HPLC era <0,01 UA, una muestra se categorizo como de baja pureza cuando el 'pico de 60 minutos' era >0,1 UA. Si no habfa datos de RP- HPLC disponibles, la pureza del retenido se evaluo mediante cromatograffa de intercambio anionico. El 'pico de 60 minutos de RP-HPLC' no se une a resinas de intercambio anionico o filtros cargados y aparecera en la fraccion de material no retenido. Cuando el area del pico de material no retenido fue menor que el area del pico de elucion, la muestra se categorizo como de alta pureza, de otra manera la muestra se categorizo como de baja pureza (Fig. 5). Los retenidos resultantes de los experimentos se categorizaron como de alta o baja pureza y se representaron frente a la PTM, cantidad de alimento aplicado por m2 de area de filtro y presion de permeado aplicada. El analisis estadfstico muestra un efecto significativo tanto de la PTM como de la cantidad de alimento/ m2 de area de filtro sobre la pureza (Fig. 6). La figura 7 muestra que aplicar presion de permeado tiene un efecto positivo y significativo sobre la recuperacion: sin aplicar presion inversa de permeado la recuperacion media fue del 46% (n=7), con aplicacion de presion inversa la recuperacion media fue del 81% (n=4). La recuperacion mejorada puede ser un efecto de la presion de permeado por si misma o puede ser debida a la disminucion de la TMP aplicando una presion de permeado: PTM = {(Pin + Pout)/2}-Pperm.

Ejemplo 3: Comparacion entre carreras con y sin aplicacion de presion inversa durante UF/DF.

Se hicieron crecer celulas PER.C6 en un tanque en agitacion hasta una densidad celular de 2,4 millones de celulas/ml. Las celulas se infectaron con el vector Ad35.CS con una MDI de 40 pv/celula. Despues de 3 dfas de produccion de virus el cultivo de celulas infectadas se trato con Benzonase (50 U/ml, 10 minutos 37°C), despues de lo cual las celulas se lisaron mediante adicion de Triton X-100 al 1%. El producto B/T se clarifico mediante filtracion de profundidad seguida por filtracion de membrana. El tftulo del producto de esta carrera fue de 2E11 pv/ml, tanto en producto crudo como en B/T tras la clarificacion. El producto clarificado se uso como alimento para los dos experimentos de FFT. Ambos experimentos se realizaron usando fibra hueca con un tamano de poro de 0,05 pm (longitud de la fibra 20 cm, area 0,105 m2). En ambos experimentos se proceso un alimento de 6,7 L/m2 con una

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tasa de cizalla de 2000 s-1. En el experimento A la salida del permeado estaba completamente abierta (Pin aproximadamente 25-35 kPa, Pout aproximadamente 12-20 kPa, Pperm 0 kPa), produciendo una presion transmembrana de 24 kPa (y ninguna presion inversa en el lado del permeado (Pperm=0)); en el experimento B la salida del permeado estaba parcialmente cerrada mediante una bomba de permeado, generando de esta manera una presion en el lado del permeado (Pin aproximadamente 45-48 kPa, Pout aproximadamente 10 kPa, Pperm aproximadamente 10 kPa), la presion transmembrana fue de aproximadamente 17 kPa.

En ambos experimentos el alimento se concentro 5 veces y posteriormente se diafiltro contra 10 volumenes de un tampon basado en TRIS. Se da una representacion esquematica de la TFF en la figura 8. La figura 9 muestra un flujo inicial alto (28 l/h/m2) en el experimento A flujo que disminuye (15 l/h/m2) durante la concentracion, el flujo en el experimento B es menor (10,5 l/h/m2) pero constante durante la concentracion y diafiltracion.

Se determinaron la pureza y recuperacion de los retenidos A y B. El ADN de celulas huesped en ambos retenidos estaba muy por debajo de la especificacion de 10 ng/dosis, esto es 1,0 ng de ADN ch/1E11 pv (vease la tabla 3). El analisis por SDS-PAGe no mostro diferencias entre los retenidos A y B (Fig. 10), en ambos retenidos las bandas principales se identificaron como protemas del virus Ad35. Sin embargo el HPLC de fase reversa muestra un pico mayoritario a aproximadamente 60 minutos (altura 0,4 UA) en el retenido A, mientras que este pico se reduce al menos 10 veces (altura 0,03 UA) en el retenido B (Fig. 11). Se mostro que este pico contema Triton X-100. La recuperacion aumento desde el 75% hasta el 90% cuando se aplico la presion inversa en el lado del permeado (algunas veces tambien llamada 'presion de permeado' en el presente documento) (vease la tabla 4).

Estos datos indican que usar el proceso aplicando presion inversa en el lado del permeado produce una mayor pureza y recuperacion.

Los datos adicionales creados con el proceso de UF/DF realizado con presion inversa en el lado del permeado se muestran en el tabla 2.

El proceso de la invencion, aplicando presion inversa en el lado del permeado, tambien se ha usado con resultados similares para un vector de adenovirus recombinante del grupo C, verbigracia un vector basado en Ad5 (vease el ejemplo 5). Por lo tanto, el proceso de la invencion es adecuado para vectores de adenovirus recombinantes de diferentes serotipos.

Ejemplo 4: Proceso segun la invencion a escala de 20 litros.

Se hicieron crecer celulas PER.C6 en 2 biorreactores de escala de 10 L hasta una densidad celular de 2,3 millones de celulas /ml. Las celulas se infectaron con vector Ad35.CS con una MDI de 40 pv/celula. Despues de 3 dfas de produccion de virus el cultivo de celulas infectadas se trato con Benzonase (50 U/ml, 10 minutos 37°C), despues de lo cual las celulas se lisaron mediante adicion de Triton X-100 al 1%. El producto B/T se clarifico mediante filtracion de profundidad seguida mediante filtracion de membrana. El producto B/T clarificado (21 L) se aplico como alimentacion a una fibra hueca de 3,3 m2 (longitud de la fibra 40 cm, tamano de poro 0,05 pm). La bomba del retenido se inicio con un permeado cerrado. Despues de 5 minutos de recirculacion la bomba del permeado se inicio lentamente hasta que se alcanzo el ajuste de presion deseado. Durante todo el paso de FFT se midieron los siguientes ajustes de presion: Pin 6 psi, Pout 4-5 psi y Pperm 2-3 psi, dando una PTM media de 2,6 psi. Inicialmente la alimentacion se concentro 5 veces, seguido por diafiltracion con 10 VDF de un tampon que contema NaCl 0,25 M, Tris 50 mM, MgCh 2 mM, Tween 80 al 0,05%, pH 8,0. El virus diafiltrado resultante se filtro por 0,45 pm y se purifico adicionalmente al dfa siguiente con un filtro de intercambio anionico Mustang Q (la muestra resultante se denomina virus capturado) y un paso de separacion de grupo (purificacion en columna de Sepharosa 4FF). Por ultimo se realizo una filtracion por 0,45 pm seguida por una esterilizacion por filtracion produciendo el producto preformulado.

Se realizo el analisis por SD-PAGE y RP-HPLC para seguir la pureza despues de cada paso del proceso. El SDS- PAGE (Fig. 12) claramente muestra la eliminacion de una cantidad mayoritaria de protemas de las celulas huesped en el permeado (carril 2). No se obtuvo pureza adicional mediante purificacion adicional del virus diafiltrado (carril 3) mediante separacion con Mustang Q (carril 4) y de grupo (carril 5). El analisis de RP-HPLC muestra un resultado similar (Fig. 13). El virus diafiltrado (3) esta muy purificado con una pequena impureza residual detectada a un tiempo de retencion de 60 minutos. Esta impureza lo mas probable es que sea Triton X-100 restante. Basado en la altura del pico se estima que la cantidad de Triton X-100 es al menos 100 veces menor que en el producto B/T original produciendo una concentracion restante de menos del 0,01%. Si se desea, se pueden usar rondas de diafiltracion adicionales contra el mismo tampon para disminuir mas la cantidad de Triton X-100 residual.

Aparte de la eliminacion del Triton residual, no se produce purificacion adicional mediante el paso de separacion en Mustang Q (4) o de grupo (5), basado en analisis por RP-HPLC. La cantidad de ADN residual de celulas huesped en el virus diafiltrado fue de 1,4 ng/1E11 pv.

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Este ejemplo muestra que un proceso segun la invencion, aplicando presion inversa en el lado del permeado durante la FFT, basta para obtener preparaciones adenovirales suficientemente puras sin necesidad de pasos de cromatograffa. Tal proceso segun la invencion se muestra esquematicamente en la figura 14.

Ejemplo 5: Ad5 con presion inversa, efecto de diafiltracion con alta sal.

Se hicieron crecer celulas PER.C6 en un biorreactor de 10 L (carrera A) o 2 L (carrera B) hasta una densidad celular de 1 millon de celulas/ml. Las celulas se infectaron con el vector Ad5.EBO.GP(S/G).mt (carrera A) o Ad5.EBO.GP(Z).mt (carrera B) con una MDI de 60 pv/celula. Despues de 4 dfas de produccion de virus los cultivos de celulas infectadas se trataron con Benzonase (50 U/ml, 10 minutos 37°C), despues de lo cual las celulas se lisaron mediante adicion de Triton X-100 al 1%. Los productos B/T se clarificaron mediante filtracion de profundidad seguida mediante filtracion de membrana. Los tftulos de los virus en los productos clarificados (determinados mediante HPLC-AEX) fueron de 3,8E10 pv/ml para la carrera A y de 1,7E10 pv/ml para la carrera B. Los productos clarificados se usaron como alimentacion para experimentos de FFT. Como modulo de fibra hueca se uso un modulo de tamano de poro de 0,05 pm (obtenido de Spectrum). Los experimentos de FFT se realizaron aplicando una presion en el lado del permeado como se describe en los ejemplos 2 y 3. Ambos productos clarificados se dividieron en dos partes. Inicialmente todas las partes se concentraron 5 veces. Una parte (A1 y B1) se diafiltro contra 6 volumenes de un tampon con alta sal que contema NaCl 1 M, seguido por 4 VDF con tampon de baja sal (0,4 M carrera A, 0,3 M carrera B); la segunda parte (A2 y B2) se diafiltro con 10 VDF de un tampon con baja sal (0,4 M carrera A, 0,3 M carrera B). En todos los experimentos la PTM media fue o estuvo por debajo de 1 psi. Las muestras de virus diafiltrados resultantes se analizaron para determinar la cantidad de ADN residual de celulas huesped y la pureza mediante RP-HPLC, los datos se muestran en la tabla 5.

La pureza basada en RP-HPLC es muy alta (Fig. 15), y comparable a los resultados de Ad35 generados con el 'protocolo de presion inversa' como se muestra en la tabla 2. A partir de datos previos se sabe que sin aplicar presion inversa este grado de pureza no se habfa obtenido. La cantidad residual de ADNch obtenido despues de la diafiltracion con un tampon con baja sal es mayor que los datos de Ad35 mostrados en la tabla 2. Esto esta lo mas probablemente relacionado con el menor tttulo de virus en el producto (24E10 pv/ml para Ad5 frente a 2E11 pv/ml para Ad35). Sin embargo, si se usa diafiltracion con alta sal la cantidad de ADNch que queda esta bien por debajo del lfmite de 10 ng/ml, asumiendo una dosis de 1E11 pv/ml. Las recuperaciones obtenidas estan por encima del 80%, que es consistente con los datos de Ad35 mostrados en la tabla 2. Se muestra un analisis por SDS-PAGE de una de las muestras en la Figura 16.

Ejemplo 7: Purificacion de adenovirus mediante un proceso de filtracion solo.

Se hicieron crecer celulas PER.C6 en 2 biorreactores de escala de 10 L hasta una densidad celular de 2-3 millones de celulas/ml. Las celulas se infectaron con el vector Ad35.TB-S (un vector derivado de un adenovirus de serotipo 35 que contiene antfgenos de tuberculosis (fusion directa de Ag85A, Ag85B, y TB10.4; tambien descrito en PCT/EP2005/055984)) con una MDI de 10 pv/celula. Despues de 3 dfas de produccion de virus el cultivo celular infectado se trato con Benzonasa (50 U/ml, 10 minutos 37°C), tras lo cual las celulas se lisaron mediante la adicion de Triton X-100 al 1%. El producto B/T se clarifico mediante filtracion de profundidad seguida por filtracion de membrana.

El tftulo del producto B/T clarificado de esta carrera fue de 2E11 pv/ml. Parte del producto clarificado se uso como alimentacion para un experimento de FFT. El experimento se realizo usando una fibra hueca con un tamano de poro de 0,05 pm (longitud de la fibra 20 cm, area 0,105 m2). Se proceso una alimentacion de 6,7 L/ m2 con una velocidad de cizalla de 2000 s-1. La salida del permeado se cerro parcialmente mediante una bomba de permeado, generando de esta manera un presion en el lado del permeado (Pin aproximadamente 38 kPa, Pout aproximadamente 31 kPa, Pperm aproximadamente 17 kPa), la presion transmembrana fue aproximadamente 17 kPa. La alimentacion se concentro 5 veces y posteriormente se diafiltro contra 10 volumenes de un tampon basado en TRIS, seguido por 6 volumenes adicionales de tampon de formulacion. Se da una representacion esquematica de la FFT en la figura 8B. El virus diafiltrado se filtro secuencialmente sobre 0,8-0,45 pm y un filtro de membrana de 0,22 pm.

Se determinaron la pureza y la recuperacion del virus purificado. La recuperacion global de virus tras la purificacion fue del 69%. El ADN de celulas huesped estuvo bien por debajo de la especificacion de 10 ng/dosis, esto es 0,8 ng de ADN de ch/1E11 pv. Las bandas principales mostradas en SDS-PAGe se identifican como protemas del virus Ad35 (Fig. 17). Todos los picos principales mostrados en el perfil de fase reversa del retenido tras 16 VDF se identifican como protemas de Ad35 (Fig. 18). El HPLC de fase reversa muestra la reduccion de un pico a aproximadamente 60 minutos durante la diafiltracion. Se mostro que este pico contema Triton X-100. Se hizo una estimacion de la cantidad de Triton X-100 residual tras diferentes volumenes de FFT, basado en el area del pico del pico de 60 minutos, y los datos se muestran en la tabla 6. A partir de estos datos parece que, despues de aproximadamente 10 volumenes de diafiltracion (VDF), los niveles residuales de Triton X-100 (estimado en el 0,0135%) estan probablemente a niveles reguladores aceptables. Por ejemplo, FLUARIX™, una vacuna contra la

gripe derivada de huevo aprobada por la FDA, contiene Triton® X-100 (octoxinol-10) <0,085 mg por dosis de 0,5 ml (informacion en la etiqueta:
www.fda.gov/cber/label/inflgla083105LB.pdf), que corresponde a una concentracion residual de Triton X-100 de < 0,017%.

5 Estos datos indican que los adenovirus se pueden purificar con gran recuperacion a casi homogeneidad mediante tecnicas de filtracion solo.

Tablas

10 Tabla 1: Reduccion de la cantidad de ADN residual de celulas huesped en muestras a granel purificadas cambiando el metodo de recogida T/B a B/T. El producto se purifico en una escala de 2-20 L. Vease el ejemplo 1 para los detalles.

Carrera

Vector Metodo de recogida ADN de celula huesped ng/ml PV/ml HPLC-AEX ng de ADN de CH/1E11 PV

1

Ad5.MV-H T/B 0,41 5,40E+10 0,78

2

Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GP dTM (Z) T/B 4,31 5,25E+11 0,82

3

Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP B/T 0,46 7,80E+11 0,06

4

Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP B/T 0,44 6,80E+11 0,07

5

Ad5dE3x.Adapt.vado B/T 0,40 8,90E+11 0,04

6

Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP B/T 0,25 4,66E+11 0,05

7

Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GP dTM (S) B/T 0,55 6,60E+11 0,08

8

Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GP dTM (Z) B/T 0,15 6,60E+11 0,02

9

Ad353.CS B/T 0,62 5,15E+11 0,12

Tabla 2: Se realizaron seis experimentos con presion inversa aplicada en el lado del permeado.

Exp #

Altura del 'pico de 60 min' de RP-HPLC ADN de ch (ng/1E11 pv) Recuperacion

11D

0,001 0,4 87%

16/17C

0,002 0,7 89%

16/17D

0,002 0,05 88%

18A

0,008 1,1 84%

18B

0,008 1,0 82%

TT carrera#1

0,004 1,4 85%

15

Se muestran los resultados de la cantidad residual de Triton X-100 indicados por la altura del pico a un tiempo de retencion de 60 minutos (analisis por RP-HPLC), la cantidad residual de ADN de celulas huesped (medida por Q- PCR) y la recuperacion del virus (tras clarificacion y UF/DF). Vease el ejemplo 3 para los detalles.

20 Tabla 3: ADN de celulas huesped en las preparaciones A y B. Vease el ejemplo 3 para los detalles.______

pv/ml ADN de celulas huesped (ng/ml) ADN de celulas huesped (ng/1E11 pv)

Experimento A

5,2E11 5,2 1,0

Experimento B

6,45E11 6,4 1,0

Tabla 4: Datos de los experimentos A y B. Vease el ejemplo 3 para los detalles.

Cizalla (s'1) Presion inversa Flujo (LHM) Recuperacion Tftulo (pv/ml)

Exp A

2000 No 19 75% 5,5E11

Exp A

2000 Si 10 90% 6,5E11

Tabla 5: Se realizaron cuatro experimented de FFT con presion inversa aplicada en el lado del permeado. Se usaron dos lotes de producto clarificado (A y B) y se diafiltraron con tampon con alta sal seguido por un tampon con baja sal (A1 y B1) o solo con baja sal (A2 y B2). Se muestran los resultados de la cantidad residual de Triton X-100 indicada por la altura del pico a un tiempo de retencion de 60 minutos (analisis por RP-HPLC), la cantidad residual de ADN de 5 celulas huesped (medida mediante Q-PCR) y la recuperacion del virus (despues de la clarificacion y UF/DF).

Exp#

Conc de sal en el tampon de DF Altura del 'pico de 60 min' de RP- HPLC ADNch ng/1E11 pv recuperacion

A1

6x1 M, 4x0,4 M 0,015 1,8 90%

A2

10x0,4 M 0,009 12 92%

B1

6x1 M, 4x0,3 M 0,002 <1,5 81%

B2

10x0,3 M 0,013 <28,2 86%

Tabla 6: % estimado de Triton X-100 residual. Vease el ejemplo 7 para los detalles.

Retenido despues de 6 VDF

0,0674

Retenido despues de 10 VDF

0,0135

Retenido despues de 14 VDF

0,0043

Retenido despues de 16 VDF

0,0007

10

Claims (20)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para la purificacion de un adenovirus recombinante que comprende un paso de ultrafiltracion en donde el retenido contiene el virus, caracterizado en que se aplica presion inversa de al menos 5 kPa en el lado del permeado.
2. 2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde el metodo comprende antes de dicho paso de ultrafiltracion los pasos de:

   a) cultivar celulas que se infectan con dicho virus,

   b) anadir nucleasa al cultivo celular, y despues de ello

   c) opcionalmente lisar dichas celulas para proporcionar un lisado que comprende el virus, y

   d) opcionalmente clarificacion del lisado, preferiblemente mediante filtracion de profundidad seguida por

   filtracion de membrana.
3. 3. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha ultrafiltracion comprende filtracion de flujo tangencial, preferiblemente usando un modulo de fibra hueca.
4. 4. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la presion inversa de al menos 5 kPa se aplica mediante una bomba que proporciona presion inversa al permeado.
5. 5. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la presion transmembrana se mantiene por debajo de 20 kPa.
6. 6. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha ultrafiltracion comprende el intercambio de tampon del retenido con un tampon que comprende cloruro de sodio entre 0,8 M y 2 M u otra sal que da una fuerza ionica igual, y preferiblemente intercambio posterior de tampon con un tampon que tiene una fuerza ionica de un tampon que comprende NaCl menos de 0,5 M.
7. 7. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, dicho metodo no comprende un paso de cromatograffa de exclusion molecular.
8. 8. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, dicho metodo no comprende un paso de cromatograffa de intercambio anionico o filtracion de intercambio anionico.
9. 9. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, dicho metodo esta caracterizado en que no comprende un paso de cromatograffa o un paso de filtracion de intercambio ionico.
10. 10. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, dicho metodo comprende ademas un paso de purificar adicionalmente el adenovirus recombinante con al menos un paso de cromatograffa.
11. 11. Un metodo segun la reivindicacion 10, en donde el metodo comprende un paso de cromatograffa de intercambio anionico, opcionalmente realizado aplicando la solucion que contiene el virus a un filtro cargado que contiene grupos cargados positivamente.
12. 12. Un metodo segun la reivindicacion 10 u 11, en donde el metodo comprende un paso de cromatograffa de exclusion molecular.
13. 13. Un metodo para la purificacion de un adenovirus recombinante, dicho metodo consiste esencialmente en:

    a) cultivar celulas que se infectan con dicho adenovirus recombinante,

    b) lisar dichas celulas y eliminar y/o fragmentar el acido nucleico libre, para proporcionar un lisado que

    comprende el adenovirus recombinante,

    c) clarificar el lisado para obtener una preparacion de adenovirus,

    d) someter la preparacion de adenovirus a ultrafiltracion, en donde la preparacion de adenovirus esta en el

    retenido, para concentrar la preparacion de adenovirus,

    e) someter la preparacion de adenovirus del paso d) a ultrafiltracion, en donde la preparacion de adenovirus

    esta en el retenido, e intercambiar con ella al menos 5 volumenes de diafiltracion (VDF) de tampon, en donde un VDF es el volumen del retenido tras la concentracion en el paso d),

    f) preferiblemente esterilizar por filtracion la preparacion de adenovirus,

    el metodo esta caracterizado en que en los pasos d) y e) se aplica presion inversa de al menos 5 kPa en el lado del permeado.

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35
14. 14. Un metodo para la purificacion de un adenovirus recombinante, dicho metodo consiste esencialmente en:

    a) cultivar celulas que se infectan con dicho adenovirus recombinante,

    b) lisar dichas celulas y eliminar y/o fragmentar el acido nucleico libre, para proporcionar un lisado que

    comprende el adenovirus recombinante,

    c) clarificar el lisado para obtener una preparacion de adenovirus,

    d) someter la preparacion de adenovirus del paso c) a ultrafiltracion, en donde la preparacion de adenovirus

    esta en el retenido, e intercambiar con ella al menos 5 volumenes de diafiltracion (VDF) de tampon, en donde un VDF es el volumen de la preparacion de virus tras c),

    e) preferiblemente esterilizar por filtracion la preparacion de adenovirus,

    dicho metodo esta caracterizado en que en el paso d) se aplica presion inversa de al menos 5 kPa en el lado del permeado.
15. 15. Un metodo segun la reivindicacion 13 o 14, en donde el paso b) comprende: b, i) anadir nucleasa al cultivo de celulas, y despues de ello

    b, ii) lisar dichas celulas para proporcionar un lisado que comprende el adenovirus recombinante.
16. 16. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicha ultrafiltracion comprende filtracion de flujo tangencial, preferiblemente usando un modulo de fibra hueca.
17. 17. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en donde la presion inversa se aplica mediante una bomba que proporciona presion inversa al permeado.
18. 18. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en donde la presion transmembrana durante al ultrafiltracion se mantiene por debajo de 20 kPa.
19. 19. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 13-18, en donde dicho intercambio de tampon con el retenido comprende intercambio de tampon con tampones de diferente fuerza ionica, incluyendo intercambio de tampon con un tampon que comprende cloruro de sodio entre 0,8 M y 2 M u otra sal que da igual fuerza ionica, y preferiblemente posterior intercambio de tampon con un tampon que tiene una fuerza ionica de un tampon que comprende NaCl menos de 0,5 M.
20. 20. Un metodo para aumentar la recuperacion y/o el rendimiento de adenovirus recombinante durante un paso de ultrafiltracion en donde el retenido contiene el adenovirus recombinante, dicho metodo esta caracterizado en que se aplica presion inversa de al menos 5 kPa en el lado del permeado.