CN112899242A - 慢病毒纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种慢病毒纯化工艺，其包括以下步骤：S1对含有慢病毒的细胞培养物进行澄清过滤，获得含有慢病毒的细胞培养上清液；S2采用中空纤维超滤系统将步骤S1中得到的上清液浓缩8～15倍；S3使用第一缓冲液对步骤S2获得的浓缩液洗滤至少10个体积；S4对步骤S3洗滤后的浓缩液进行核酸酶Benzonase酶切处理，处理温度控制在25～37℃，处理时间30～60 min；S5采用中空纤维超滤系统对步骤S4的浓缩液洗滤至少10个体积以去除核酸酶Benzonase及核酸片段，然后向其中加入第二缓冲液，第二缓冲液包含有维持慢病毒颗粒稳定性的Buffer；S6将步骤S5的慢病毒载体浓缩液浓缩至5×107 TU/mL以上，获得纯化的慢病毒。本发明的慢病毒纯化工艺能显著提高慢病毒的回收率，且适合规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及慢病毒纯化工艺。
背景技术
慢病毒常用于嵌合抗原受体-T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)，其具有转导效率高、可整合T细胞基因组并持续表达目标蛋白等优势。现如今，CAR-T生产大多基于慢病毒载体介导的CAR基因转移。当前，用于生产慢病毒的工艺大多为贴壁细胞工艺（如HEK293T），少数为悬浮细胞工艺。使用贴壁工艺通常使用0.45μm滤膜（上清收获时细胞状态较好）或澄清过滤膜包（上清收获时细胞状态较差时）对收获的上清进行澄清过滤处理以去除漂浮的细胞、细胞碎片和其它杂质。而对于悬浮细胞工艺，通常需使用深层过滤膜包截留细胞，并去除细胞碎片和其它杂质。无论是贴壁细胞或悬浮细胞，收获的澄清液通常需要加入核酸酶（如Benzonase）进行处理以去除残留的质粒或未包装成熟的慢病毒基因组，同时还需采用一步或多步层析法，如离子交换法（如Pall公司的Mustang Q，BIA 公司CIM DEAE等）、分子排阻法（SEC，如Capto Core 700）、亲和层析法(AFC)、疏水层析法（HIC）等以去除上清中的杂质，如培养基、胎牛血清（FBS）、细胞培养过程中释放的宿主细胞蛋白质和基因组DNA、转染试剂（如PEIpro）等。此外，下游纯化过程中，通常还需采用超滤浓缩和洗滤法(UF/DF)对慢病毒颗粒进行浓缩以达到预期的感染滴度（TU/mL），并将慢病毒纯化过程中使用的缓冲液（buffer）置换成慢病毒颗粒能长期稳定储存的缓冲液（formulation）。然而，慢病毒颗粒大小通常为80～130 nm，其极其脆弱，不耐机械压力和剪切力，也较为容易降解，不宜长时间进行下游纯化操作。因此，采用较多的纯化步骤将大大降低其回收率（如柱层析），长时间的操作处理也将增加慢病毒颗粒降解的风险，目前基于以上方法纯化的慢病毒颗粒回收率通常只有10～20%。此外，层析法通常需要配备较昂贵的纯化系统，如AKTA，所使用的纯化介质通常也较为昂贵。
发明内容
本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有的慢病毒纯化工艺，回收率低，且所实用的设备昂贵，成本高等问题，提供一种能够解决前述问题的慢病毒纯化工艺。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：慢病毒纯化工艺，其特点是：其包括以下步骤：
S1对含有慢病毒的细胞培养物进行澄清过滤，去除其中的细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质，获得含有慢病毒的细胞培养上清液；
S2采用中空纤维超滤系统将步骤S1中得到的上清液浓缩8～15倍；
S3使用第一缓冲液对步骤S2获得的浓缩液洗滤至少10个体积，以最大程度去除杂质，第一缓冲液包含有核酸酶Benzonase的最适离子种类和维持慢病毒颗粒稳定性的Buffer；
S4对步骤S3洗滤后的浓缩液进行核酸酶Benzonase酶切处理，处理温度控制在25～37 ℃，处理时间30～60 min；
S5采用中空纤维超滤系统对步骤S4的浓缩液洗滤至少10个体积以去除核酸酶Benzonase及核酸片段，然后向其中加入第二缓冲液，第二缓冲液包含有维持慢病毒颗粒稳定性的Buffer；
S6将步骤S5的慢病毒载体浓缩液浓缩至5×107 TU/mL以上，获得纯化的慢病毒。
上述步骤S3和S5中，洗滤至少10个体积中的10个体积是指相对于要洗滤的浓缩液，洗滤10个体积。
进一步的方案是，所述的步骤S1中，采用澄清过滤膜包对贴壁培养工艺的细胞培养物进行澄清过滤处理，采用深层过滤膜包对悬浮细胞培养工艺的细胞培养物进行澄清过滤处理，收获含有慢病毒的细胞培养上清液，并去除细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质。
进一步的方案是，所述的步骤S1中，得到的上清液的浊度降低至5 NTU以下。
进一步的方案是，步骤S3中，所述的第一缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、MgCl2和蔗糖，其浓度分别为10-50 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）， 1-5mM的MgCl2 和4-10%质量百分比的蔗糖。
进一步的方案是，步骤S5中，所述的第二缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸和蔗糖，其浓度分别为10-50 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和4-10%质量百分比的蔗糖。
进一步的方案是，所述的步骤S2中，采用300-750KD的中空纤维超滤系统对上清液进行浓缩。
进一步的方案是，所述的步骤S5中，采用100-300KD的中空纤维超滤系统对浓缩液进行洗滤。
本发明的慢病毒纯化工艺具有以下优点：1）本发明的慢病毒纯化工艺，不依赖于柱层析和离心法，采用了中空纤维超滤系统对上清液进行了洗滤，并在洗滤的过程中加入了缓冲液，替代了现有技术中采用层析法处理的方案，能够解决层析法处理时慢病毒颗粒容易降解的问题，提高慢病毒颗粒的回收率，回收率能提高至30%以上；2）本发明的慢病毒纯化工艺，仅需采用中空纤维超滤系统，避免了采用昂贵的纯化系统和纯化介质，降低了成本；3）本发明的慢病毒纯化工艺，节省了工艺操作时间、降低了劳动强度，提高了工作效率；4）本发明的慢病毒纯化工艺，步骤S3中使用的第一缓冲液包含有核酸酶Benzonase的最适离子种类和维持慢病毒颗粒稳定性的Buffer，增强核酸酶Benzonase的处理效果，并对慢病毒颗粒进行保护，防止慢病毒颗粒的降解；5）本发明的慢病毒纯化工艺，步骤S5中，用中空纤维切向流的原理进行洗滤，最大程度的去除核酸酶Benzonase和核酸片段，在洗滤过程中使用了维持慢病毒颗粒稳定性的第二缓冲液，对慢病毒颗粒进行保护，防止慢病毒颗粒的降解，提高慢病毒颗粒的回收率；6）本发明的慢病毒纯化工艺，能采用密闭工艺的手段确保纯化的整个流程为密闭环境，可免去终端除菌过滤导致的回收率损失，因此也较为适合规模化GMP生产。
附图说明
图1为步骤S2中采用不同孔径的中空纤维，对应的回收率的示意图表。
图2为步骤S5中采用不同孔径的中空纤维，对应的核酸酶残留量的示意图表。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种慢病毒纯化工艺，其包括以下步骤：
S1采用澄清过滤膜包对贴壁培养工艺的细胞培养物进行澄清过滤处理，采用深层过滤膜包对悬浮细胞培养工艺的细胞培养物进行澄清过滤处理，收获含有慢病毒的细胞培养上清液，并去除细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质，上清液的浊度降低至5 NTU以下；
S2采用300KD的中空纤维超滤系统将步骤S1中得到的上清液浓缩8倍；
S3使用第一缓冲液对步骤S2获得的浓缩液洗滤至少10个体积，以最大程度去除杂质，第一缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、蔗糖和MgCl2，其浓度分别为，10 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）， 2mM MgCl2 和4%质量百分比的蔗糖，第一缓冲液的pH 值为8.0。其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸和蔗糖为维持慢病毒颗粒稳定性的Buffer，能对慢病毒颗粒进行保护，MgCl2为核酸酶Benzonase的最适离子种类；
S4对步骤S3洗滤后的浓缩液进行核酸酶Benzonase酶切处理，处理温度控制在25℃，处理时间60 min；
S5采用100KD的中空纤维超滤系统对步骤S4的浓缩液洗滤至少10个体积以去除核酸酶Benzonase及核酸片段，然后向其中加入第二缓冲液，第二缓冲液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和蔗糖，其浓度分别为，50 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和30%质量百分比的蔗糖，第二缓冲液的pH 值为7.5，能维持慢病毒颗粒稳定性，对慢病毒颗粒进行保护；
S6将步骤S5的慢病毒载体浓缩液浓缩至5×107 TU/mL以上，获得纯化的慢病毒。
实施例2
一种慢病毒纯化工艺，其包括以下步骤：
S1采用澄清过滤膜包对贴壁培养工艺的细胞培养物进行澄清过滤处理，采用深层过滤膜包对悬浮细胞培养工艺的细胞培养物进行澄清过滤处理，收获含有慢病毒的细胞培养上清液，并去除细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质，上清液的浊度降低至5 NTU以下；
S2采用750KD的中空纤维超滤系统将步骤S1中得到的上清液浓缩15倍；
S3使用第一缓冲液对步骤S2获得的浓缩液洗滤至少10个体积，以最大程度去除杂质，第一缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、蔗糖和MgCl2，其浓度分别为，50 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）， 5mM MgCl2 和10%质量百分比的蔗糖，第一缓冲液的pH 值为8.0。其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸和蔗糖为维持慢病毒颗粒稳定性的Buffer，能对慢病毒颗粒进行保护，MgCl2为核酸酶Benzonase的最适离子种类；
S4对步骤S3洗滤后的浓缩液进行核酸酶Benzonase酶切处理，处理温度控制在37℃，处理时间30 min；
S5采用300KD的中空纤维超滤系统对步骤S4的浓缩液洗滤至少10个体积以去除核酸酶Benzonase及核酸片段，然后向其中加入第二缓冲液，第二缓冲液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和蔗糖，其浓度分别为，30 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和20%质量百分比的蔗糖，第二缓冲液的pH 值为7.5，能维持慢病毒颗粒稳定性，对慢病毒颗粒进行保护；
S6将步骤S5的慢病毒载体浓缩液浓缩至5×107 TU/mL以上，获得纯化的慢病毒。
实施例3
一种慢病毒纯化工艺，其包括以下步骤：
S1采用澄清过滤膜包对贴壁培养工艺的细胞培养物进行澄清过滤处理，采用深层过滤膜包对悬浮细胞培养工艺的细胞培养物进行澄清过滤处理，收获含有慢病毒的细胞培养上清液，并去除细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质，上清液的浊度降低至5 NTU以下；
S2采用500KD的中空纤维超滤系统将步骤S1中得到的上清液浓缩15倍；
S3使用第一缓冲液对步骤S2获得的浓缩液洗滤至少10个体积，以最大程度去除杂质，第一缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、蔗糖和MgCl2，其浓度分别为，50 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）， 1mM MgCl2 和10%质量百分比的蔗糖，第一缓冲液的pH 值为8.0。其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸和蔗糖为维持慢病毒颗粒稳定性的Buffer，能对慢病毒颗粒进行保护，MgCl2为核酸酶Benzonase的最适离子种类；
S4对步骤S3洗滤后的浓缩液进行核酸酶Benzonase酶切处理，处理温度控制在30℃，处理时间40 min；
S5采用200KD的中空纤维超滤系统对步骤S4的浓缩液洗滤至少10个体积以去除核酸酶Benzonase及核酸片段，然后向其中加入第二缓冲液，第二缓冲液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和蔗糖，其浓度分别为，10 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和5%质量百分比的蔗糖，第二缓冲液的pH 值为7.5，能维持慢病毒颗粒稳定性，对慢病毒颗粒进行保护；
S6将步骤S5的慢病毒载体浓缩液浓缩至5×107 TU/mL以上，获得纯化的慢病毒。
对上述实施例1中的慢病毒纯化工艺进行反复实验，可以得出本发明的慢病毒纯化工艺的回收率数据列表如下：
通过商标可以看出，采用本发明的慢病毒纯化工艺，能够将慢病毒的回收率上升至30%以上，与现有技术中10-20%的回收率相比，大幅度提升了慢病毒的回收率。
通过图1可以看出，在步骤S2中，采用的中空纤维的孔径在100KD时，慢病毒的回收率最高，通过图2可以看出，在步骤S5中，采用中空纤维的孔径在300KD时，核酸酶的残留量最少，因而，通过调整实施例中的步骤S2和步骤S5中的中空纤维的孔径能进一步提高慢病毒的回收率，并降低核酸酶的残留量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种慢病毒纯化工艺，其特征在于：其包括以下步骤：
S1对含有慢病毒的细胞培养物进行澄清过滤，去除其中的细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质，获得含有慢病毒的细胞培养上清液；
S2采用中空纤维超滤系统将步骤S1中得到的上清液浓缩8～15倍；
S3使用第一缓冲液对步骤S2获得的浓缩液洗滤至少10个体积，以最大程度去除杂质，第一缓冲液包含有核酸酶Benzonase的最适离子种类和维持慢病毒颗粒稳定性的Buffer；
S4对步骤S3洗滤后的浓缩液进行核酸酶Benzonase酶切处理，处理温度控制在25～37℃，处理时间30～60 min；
S5采用中空纤维超滤系统对步骤S4的浓缩液洗滤至少10个体积以去除核酸酶Benzonase及核酸片段，然后向其中加入第二缓冲液，第二缓冲液包含有维持慢病毒颗粒稳定性的Buffer；
S6将步骤S5的慢病毒载体浓缩液浓缩至5×107 TU/mL以上，获得纯化的慢病毒。
2.根据权利要求1所述的慢病毒纯化工艺，其特征在于：所述的步骤S1中，采用澄清过滤膜包对贴壁培养工艺的细胞培养物进行澄清过滤处理，采用深层过滤膜包对悬浮细胞培养工艺的细胞培养物进行澄清过滤处理，收获含有慢病毒的细胞培养上清液，并去除细胞、细胞碎片及其大颗粒杂质。
3.根据权利要求1所述的慢病毒纯化工艺，其特征在于：所述的步骤S1中，得到的上清液的浊度降低至5 NTU以下。
4.根据权利要求1所述的慢病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S3中，所述的第一缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、MgCl2和蔗糖，其浓度分别为10-50 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）， 1-5mM的MgCl2 和4-10%质量百分比的蔗糖。
5.根据权利要求1所述的慢病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S5中，所述的第二缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸和蔗糖，其浓度分别为10-50 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和4-10%质量百分比的蔗糖。
6.根据权利要求1所述的慢病毒纯化工艺，其特征在于：所述的步骤S2中，采用300-750KD的中空纤维超滤系统对上清液进行浓缩。
7.根据权利要求1所述的慢病毒纯化工艺，其特征在于：所述的步骤S5中，采用100-300KD的中空纤维超滤系统对浓缩液进行洗滤。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN113373120A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-10 | 浙江康佰裕生物科技有限公司 | Gmp级逆转录病毒载体的纯化方法与应用 |
| CN113980917A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-01-28 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 一种慢病毒溶解缓冲液及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101155915A (zh) * | 2005-04-11 | 2008-04-02 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 利用超滤进行病毒纯化 |
| CN102124115A (zh) * | 2008-06-18 | 2011-07-13 | 牛津生物医学（英国）有限公司 | 病毒纯化 |
| CN109337875A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-02-15 | 深圳市菲鹏生物制药股份有限公司 | 慢病毒的纯化方法 |
| CN111454914A (zh) * | 2019-01-18 | 2020-07-28 | 嘉兴安宇生物科技有限公司 | 一种腺病毒快速纯化方法 |
| CN111876393A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-11-03 | 恒瑞源正（上海）生物科技有限公司 | 一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法 |
-
2021
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101155915A (zh) * | 2005-04-11 | 2008-04-02 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 利用超滤进行病毒纯化 |
| CN102124115A (zh) * | 2008-06-18 | 2011-07-13 | 牛津生物医学（英国）有限公司 | 病毒纯化 |
| CN109337875A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-02-15 | 深圳市菲鹏生物制药股份有限公司 | 慢病毒的纯化方法 |
| CN111454914A (zh) * | 2019-01-18 | 2020-07-28 | 嘉兴安宇生物科技有限公司 | 一种腺病毒快速纯化方法 |
| CN111876393A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-11-03 | 恒瑞源正（上海）生物科技有限公司 | 一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MARTINE GERAERTS等: "Upscaling of lentiviral vector production by tangential flow filtration", 《THE JOURNAL OF GENE MEDICINE》 * |
| 聂蓓娜等: "科研级嵌合抗原受体慢病毒浓缩方法对比研究", 《集成技术》 * |
| 黄炯等: "浓缩和纯化操作对口蹄疫A型弱毒病毒含量的影响", 《中国兽药杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113373120A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-10 | 浙江康佰裕生物科技有限公司 | Gmp级逆转录病毒载体的纯化方法与应用 |
| CN113980917A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-01-28 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 一种慢病毒溶解缓冲液及其应用 |
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