JPH03180182A - ファージｄｎａの精製方法 - Google Patents
ファージｄｎａの精製方法Info
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- JPH03180182A JPH03180182A JP1317114A JP31711489A JPH03180182A JP H03180182 A JPH03180182 A JP H03180182A JP 1317114 A JP1317114 A JP 1317114A JP 31711489 A JP31711489 A JP 31711489A JP H03180182 A JPH03180182 A JP H03180182A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野］
本発明は、ファージＤＮＡの精製方法に関する６本発明
の方法は、遺伝子工学分野において用いることができる
。
の方法は、遺伝子工学分野において用いることができる
。
［従来の技術］
近年、遺伝子工学技術の進歩と共に、種々の細胞、ウィ
ルス、ファージから核酸を精製することが盛んに行なわ
れている。特に遺伝情報を担っているＤＮＡの塩基配列
を決定する方法として、Ｍ１３ファージを大腸菌と共に
培養することにより単鎖ＤＮＡを増幅させる技術は重要
であり、この中でファージＤＮＡの精製が一般的に行な
われている。従来、上記培養液からファージＤＮＡを精
製する方法としては、先ず遠心分離により大腸菌を除去
した後、ポリエチレングリコールでファージを沈殿させ
、フェノール抽出で脱タンパクし、さらにエタノール沈
殿によりＤＮＡを濃縮する方法が広く一般的に行なわれ
ている。
ルス、ファージから核酸を精製することが盛んに行なわ
れている。特に遺伝情報を担っているＤＮＡの塩基配列
を決定する方法として、Ｍ１３ファージを大腸菌と共に
培養することにより単鎖ＤＮＡを増幅させる技術は重要
であり、この中でファージＤＮＡの精製が一般的に行な
われている。従来、上記培養液からファージＤＮＡを精
製する方法としては、先ず遠心分離により大腸菌を除去
した後、ポリエチレングリコールでファージを沈殿させ
、フェノール抽出で脱タンパクし、さらにエタノール沈
殿によりＤＮＡを濃縮する方法が広く一般的に行なわれ
ている。
しかし、上述の方法では、フェノール、クロロホルム等
人体に有害な試薬を使用しなければならない、また、各
段階で遠心分離を必要とするため、機械で自動化を行な
うことが困難であり、今後、自動化をはかるためには遠
心分離を行なわない方法が必要となる。
人体に有害な試薬を使用しなければならない、また、各
段階で遠心分離を必要とするため、機械で自動化を行な
うことが困難であり、今後、自動化をはかるためには遠
心分離を行なわない方法が必要となる。
［発明が解決しようとする問題点］
従って、本発明の目的は、遠心分離操作及び人体に有害
な試薬を必要とせずにファージＤＮＡを高純度に精製す
ることができる、ファージＤＮＡの精製方法を提供する
ことである。
な試薬を必要とせずにファージＤＮＡを高純度に精製す
ることができる、ファージＤＮＡの精製方法を提供する
ことである。
［問題点を解決するための手段］
本願発明者らは鋭意研究の結果、メンブレンフィルター
で大腸菌をろ過除去し、ファージタンパク質を分解、変
性した後に、限外ろ過により除タンパク質及び濃縮する
ことによりファージＤＮＡを高純度に精製することがで
きることを見出し本発明を完成した。
で大腸菌をろ過除去し、ファージタンパク質を分解、変
性した後に、限外ろ過により除タンパク質及び濃縮する
ことによりファージＤＮＡを高純度に精製することがで
きることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、微生物菌体とファージとを含有す
る混合液をメンブレンフィルターによりろ過し、微生物
菌体を除去する工程と１次いでファージタンパク質を分
解、変性させる工程と、次いで限外ろ過により不純物を
除去する工程を含むファージＤＮＡの精製方法を提供す
る。
る混合液をメンブレンフィルターによりろ過し、微生物
菌体を除去する工程と１次いでファージタンパク質を分
解、変性させる工程と、次いで限外ろ過により不純物を
除去する工程を含むファージＤＮＡの精製方法を提供す
る。
［発明の効果］
本発明の方法によれば、培養液から遠心分離操作を必要
とすることなくファージＤＮＡを高純度、高収率に精製
することができる０本発明の方法によると、遠心分離操
作が不要なので機械による自動化が可能である。また、
本発明の方法では人体に有害な試薬を用いる必要がなく
、また、精製に費やされる時間も短縮される。
とすることなくファージＤＮＡを高純度、高収率に精製
することができる０本発明の方法によると、遠心分離操
作が不要なので機械による自動化が可能である。また、
本発明の方法では人体に有害な試薬を用いる必要がなく
、また、精製に費やされる時間も短縮される。
［発明の詳細な説明］
本発明の方法では、微生物菌体とファージとを含有する
混合液が処理される。このような混合液の代表例として
は、ファージが感染した微生物の培養液を挙げることが
できる。培養液としては、通常の方法で培養された培養
液をそのまま使用することができ１例えばＭ１３ファー
ジを大腸菌と共に２ｘＴＹ培地で培養した培養液等を用
いることができる。
混合液が処理される。このような混合液の代表例として
は、ファージが感染した微生物の培養液を挙げることが
できる。培養液としては、通常の方法で培養された培養
液をそのまま使用することができ１例えばＭ１３ファー
ジを大腸菌と共に２ｘＴＹ培地で培養した培養液等を用
いることができる。
本発明の方法の第１工程では、上記混合液をメンブレン
フィルターによりろ過し、微生物菌体を除去する。ここ
で、使用されるメンブレンフィルターの孔径は、菌体の
透過阻止率とろ過速度の関係より０．４５μｍないし０
．２２μ■程度が好ましい、また、メンブレンフィルタ
ーの材質は何ら限定されるものではない。
フィルターによりろ過し、微生物菌体を除去する。ここ
で、使用されるメンブレンフィルターの孔径は、菌体の
透過阻止率とろ過速度の関係より０．４５μｍないし０
．２２μ■程度が好ましい、また、メンブレンフィルタ
ーの材質は何ら限定されるものではない。
続く第２工程では、第１工程で得られたろ液について、
クンバク質の分解、変性を行なう、タンパク質の分解、
変性の方法として、例えばブロテイナーゼにのようなタ
ンパク質分解酵素を作用させる方法を挙げることができ
る。この場合、タンパク質分解酵素の濃度は適宜選択す
ることができるが、Ｍ１３ファージと大腸菌とを含む培
養液を処理する場合には通常０．００１ ｍｇ／ｓｌな
いし０．５ｍｇ／ｍｌ程度である。タンパク質分解酵素
を用いる方法以外にも、常法に基づき、有機溶媒処理、
界面活性剤処理、アルカリ処理又は加熱処理等によりフ
ァージタンパク質の分解、変性工程を行なうことができ
る。これらの処理をよ、り詳細に説明すると、まず、最
初に限外ろ過膜上にＭ１３ファージと大腸菌培養液が存
在しているわけであるが、培養液をろ過し、Ｍ１３ファ
ージのみを残す、ただし条件によっては培養液が存在し
たままでも構わない１次に上記タンパク質分解酵素を加
える。
クンバク質の分解、変性を行なう、タンパク質の分解、
変性の方法として、例えばブロテイナーゼにのようなタ
ンパク質分解酵素を作用させる方法を挙げることができ
る。この場合、タンパク質分解酵素の濃度は適宜選択す
ることができるが、Ｍ１３ファージと大腸菌とを含む培
養液を処理する場合には通常０．００１ ｍｇ／ｓｌな
いし０．５ｍｇ／ｍｌ程度である。タンパク質分解酵素
を用いる方法以外にも、常法に基づき、有機溶媒処理、
界面活性剤処理、アルカリ処理又は加熱処理等によりフ
ァージタンパク質の分解、変性工程を行なうことができ
る。これらの処理をよ、り詳細に説明すると、まず、最
初に限外ろ過膜上にＭ１３ファージと大腸菌培養液が存
在しているわけであるが、培養液をろ過し、Ｍ１３ファ
ージのみを残す、ただし条件によっては培養液が存在し
たままでも構わない１次に上記タンパク質分解酵素を加
える。
タンパク質分解酵素のうち好ましい６のの例としてプロ
テイナーゼＫが挙げられる。また、タンパク質を分解、
変性させる工程は、３０〜１００％メタノールやエタノ
ールのような有機溶媒で処理することによっても行なう
ことができる。さらに１Ｍ１３フアージのような、比較
的単純なファージの分解においては、酵素や有機溶媒等
強い分解力を持つものでなくとも、ＤＮＡとタンパク質
は分離できる。すなわち、例えば、界面活性剤処理によ
ってもタンパク質の分解、変性を行なうことができ、好
ましい界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＯ３
）のような陰イン系界面活性剤であり、その濃度はＳＤ
Ｓの場合０，０１〜１重量％である。また、タンパク質
は熱に弱＜、ＤＮＡ等の核酸は比較的強いことから、熱
変性を利用することらでき、この場合、加熱条件は８０
℃ないし１００℃で５分ないし２０分が好ましい、また
、アルカリ処理によって６タンパク質の分解、変性を行
なうことができ、好ましいアルカリとしては０．ＩＮな
いし１Ｎの濃度のアルカリ金属水酸化物水溶液を挙げる
ことができる。
テイナーゼＫが挙げられる。また、タンパク質を分解、
変性させる工程は、３０〜１００％メタノールやエタノ
ールのような有機溶媒で処理することによっても行なう
ことができる。さらに１Ｍ１３フアージのような、比較
的単純なファージの分解においては、酵素や有機溶媒等
強い分解力を持つものでなくとも、ＤＮＡとタンパク質
は分離できる。すなわち、例えば、界面活性剤処理によ
ってもタンパク質の分解、変性を行なうことができ、好
ましい界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＯ３
）のような陰イン系界面活性剤であり、その濃度はＳＤ
Ｓの場合０，０１〜１重量％である。また、タンパク質
は熱に弱＜、ＤＮＡ等の核酸は比較的強いことから、熱
変性を利用することらでき、この場合、加熱条件は８０
℃ないし１００℃で５分ないし２０分が好ましい、また
、アルカリ処理によって６タンパク質の分解、変性を行
なうことができ、好ましいアルカリとしては０．ＩＮな
いし１Ｎの濃度のアルカリ金属水酸化物水溶液を挙げる
ことができる。
上記処理は単独で、又は組合わせて採用することができ
、この工程によりファージＤＮＡからタンパク質を除去
することができる。
、この工程によりファージＤＮＡからタンパク質を除去
することができる。
次いで、得られた溶液について限外ろ過を行なう、ここ
で用いられる限外ろ過膜の分画分子量としては２方ない
し１００万程度のものが好ましい０分画分子量がこの範
囲よりも小さいとタンパク質除去の効率が低下し、これ
より大きいとＤＮＡが流出するおそれがある。また、限
外ろ過膜の材質としては一般に市販されているもの、例
えばポリスルフォン製のもの等の用いることができる。
で用いられる限外ろ過膜の分画分子量としては２方ない
し１００万程度のものが好ましい０分画分子量がこの範
囲よりも小さいとタンパク質除去の効率が低下し、これ
より大きいとＤＮＡが流出するおそれがある。また、限
外ろ過膜の材質としては一般に市販されているもの、例
えばポリスルフォン製のもの等の用いることができる。
限外ろ過膜、望ましくはファージＤＮＡの収率を上げる
ために適当な溶液等で限外ろ過膜を洗浄ろ過すると、フ
ァージＤＮＡは溶液の形態で回収できる。この時用いら
れる溶液としては特に限定されないが、−船釣に用いら
れている緩衝液、例えばＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
緩衝液ＥＩｌＴＡ１等を用いることができる。この限外
ろ過により、第２工程で得られた溶液からタンパク質、
その他の不純物が除かれ、ファージＤＮＡが精製される
。
ために適当な溶液等で限外ろ過膜を洗浄ろ過すると、フ
ァージＤＮＡは溶液の形態で回収できる。この時用いら
れる溶液としては特に限定されないが、−船釣に用いら
れている緩衝液、例えばＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
緩衝液ＥＩｌＴＡ１等を用いることができる。この限外
ろ過により、第２工程で得られた溶液からタンパク質、
その他の不純物が除かれ、ファージＤＮＡが精製される
。
上記したように、第１工程に続いて第２工程を行なうこ
とができるが、第１工程終了後、ろ液を限外ろ過にかけ
て低分子量成分を除去し。
とができるが、第１工程終了後、ろ液を限外ろ過にかけ
て低分子量成分を除去し。
ファージを精製することもできる。この場合の限外ろ過
は、上記第３工程と同様に行なうことができる。なお、
この場合は、第２工程のタンパク質分解、変性処理を限
外ろ過膜上で行ない、第３工程の限外ろ過を同一の限外
ろ過膜を用いて行なうこともできる。
は、上記第３工程と同様に行なうことができる。なお、
この場合は、第２工程のタンパク質分解、変性処理を限
外ろ過膜上で行ない、第３工程の限外ろ過を同一の限外
ろ過膜を用いて行なうこともできる。
［実施例１
以下１本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。
い。
大腸菌ＪＭ１０９株を２ｘＴＹ培地に植菌し、次いでＭ
１３ファージを接種した後、３７℃で４時間培養した。
１３ファージを接種した後、３７℃で４時間培養した。
この培養液を孔径が０．４５μ醜のメンブレンフィルタ
ーにのせて、窒素ガスで加圧することによりろ過した。
ーにのせて、窒素ガスで加圧することによりろ過した。
ろ液を集め、さらに分画分子量３０万の限外ろ過膜でろ
過して低分子量の培地成分を除去した。残ったファージ
のタンパク質を分解するために、膜上に５μｇ／μｌの
ブロテイナーゼに溶液をのせ、１０分間反応させた。
過して低分子量の培地成分を除去した。残ったファージ
のタンパク質を分解するために、膜上に５μｇ／μｌの
ブロテイナーゼに溶液をのせ、１０分間反応させた。
これを加圧して酵素溶液を除き、ＴＥ緩衛液をさらにの
せて加圧し、これを除いた。この限外ろ過膜にＴＥｍ衝
液２００μｌをのせて振盪した後に、これをピペットで
回収した。
せて加圧し、これを除いた。この限外ろ過膜にＴＥｍ衝
液２００μｌをのせて振盪した後に、これをピペットで
回収した。
回収量は、培養液２＋ａｌからファージＤＮＡ２．５μ
ｇであった。
ｇであった。
得られたファージＤＮＡについて、常法に基づきアガロ
ースゲル電気泳動を行なった。対照として、市販のＭ１
３ファージ単鎖ＤＮＡ及び従来法であるポリエチレング
リコール沈殿−フェノール抽出法により精製したＭ１３
ファージＤＮＡについても同様にアガロースゲル電気泳
動を行なった。
ースゲル電気泳動を行なった。対照として、市販のＭ１
３ファージ単鎖ＤＮＡ及び従来法であるポリエチレング
リコール沈殿−フェノール抽出法により精製したＭ１３
ファージＤＮＡについても同様にアガロースゲル電気泳
動を行なった。
結果を図に示す１図中、レーンｌはえ）７−ジのＢ ｉ
ｎ ｄ ＩＩ＋消化物から成る分子量マーカー レー
ン２は市販のＭ１３ファージ単鎖ＤＮＡの泳動パターン
、レーン３はポリエチレングリコール沈殿−フェノール
抽出法により精製したＭ１３ファージＤＮＡの泳動パタ
ーン、レーン４は本発明の方法により精製したＭ１３フ
ァージＤＮＡの泳動パターンを示す。
ｎ ｄ ＩＩ＋消化物から成る分子量マーカー レー
ン２は市販のＭ１３ファージ単鎖ＤＮＡの泳動パターン
、レーン３はポリエチレングリコール沈殿−フェノール
抽出法により精製したＭ１３ファージＤＮＡの泳動パタ
ーン、レーン４は本発明の方法により精製したＭ１３フ
ァージＤＮＡの泳動パターンを示す。
図から明らかなように、本発明の方法によりファージＤ
Ｎ’Ａが高純度に精製されることが確認された。
Ｎ’Ａが高純度に精製されることが確認された。
図面は本発明の方法により精製されたファージＤＮＡの
アガロース電気泳動パターンを従来法により精製された
ファージＤＮＡの泳動パターン及び市販のファージＤＮ
Ａの泳動パターンと共に示す図である。 拐 面 牛
アガロース電気泳動パターンを従来法により精製された
ファージＤＮＡの泳動パターン及び市販のファージＤＮ
Ａの泳動パターンと共に示す図である。 拐 面 牛
Claims (4)
- （１）微生物菌体とファージとを含有する混合液をメン
ブレンフィルターによりろ過し、微生物菌体を除去する
工程と、次いでファージタンパク質を分解、変性させる
工程と、次いで限外ろ過により不純物を除去する工程を
含むファージＤＮＡの精製方法。 - （２）メンブレンフィルターの孔径は０．４５μｍない
し０．２２μｍであり、限外ろ過の分画分子量は２万な
いし１００万である請求項１記載の方法。 - （３）ファージタンパク質の変性、分解工程は、タンパ
ク質分解酵素を作用させることにより行なわれる請求項
１又は２記載の方法。 - （４）メンブレンフィルターによるろ過とファージタン
パク質分解、変性工程との間に限外ろ過工程をさらに含
む請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| JP1317114A JP2978518B2 (ja) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | ファージｄｎａの精製方法 |
| DE1990608825 DE69008825T2 (de) | 1989-12-06 | 1990-12-05 | Verfahren zur Reinigung von Phagen-DNA. |
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|---|---|---|---|
| JP1317114A JP2978518B2 (ja) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | ファージｄｎａの精製方法 |
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|---|---|
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| JP2978518B2 JP2978518B2 (ja) | 1999-11-15 |
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