DE69008825T2

DE69008825T2 - Verfahren zur Reinigung von Phagen-DNA.

Info

Publication number: DE69008825T2
Application number: DE1990608825
Authority: DE
Inventors: Kenji Koyama; Takanori Matsuno; Akihiro Nishi; Kazuo Ogawa
Original assignee: Tosoh Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Tosoh Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1989-12-06
Filing date: 1990-12-05
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2010-12-06
Also published as: EP0431905A1; JPH03180182A; JP2978518B2; EP0431905B1; DE69008825D1

Description

I. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Phagen-DNA. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Gentechnik verwendet werden.

II. Stand der Technik

Durch den Fortschritt der Gentechnik ist die Reinigung von Nucleinsäuren von verschiedenen Zellen, Viren und Phagen inzwischen ein häufig verwendetes Verfahren. Die Basensequenzen von DNAs, die eine genetische Information tragen, werden ermittelt, indem üblicherweise einzelsträngige DNAs durch Züchtung des M13-Phagen in E. coli repliziert werden. Bei diesem Verfahren wird meistens die Reinigung von Phagen-DNAs durchgeführt. Es wird üblicherweise ein aus mehreren Schritten bestehendes Verfahren zur Reinigung von Phagen-DNAs aus dem Kulturmedium verwendet, in dem E. coli-Zellen durch Zentrifugation aus dem Kulturmedium entfernt werden, der Phage durch Behandlung mit Polyethylenglycol ausgefällt wird, die Proteine durch Phenolextraktion entfernt werden und die DNA durch Ausfällen mit Ethanol konzentriert wird.
In diesen üblichen Verfahren müssen jedoch für Menschen toxische Reagenzien, wie Phenol und Chloroform, verwendet werden. Da ferner bei jedem Schritt zentrifugiert werden muß, ist eine Automatisierung des Verfahrens schwierig. Zur Automatisierung der Reinigung ist ein Verfahren wünschenswert, das keine Zentrifugation erfordert.

Zusammenfassung der Erfindung

Somit ist das erfindungsgemäpe Ziel die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von Phagen-DNAS, durch das die Phagen-DNAs ohne Zentrifugationsschritte und ohne Verwendung von für Menschen toxischen Reagenzien mit hoher Reinheit erhalten werden können.
Die Erfinder stellten durch intensive Untersuchungen fest, daß Phagen-DNAs mit hoher Reinheit erfindungsgemäß erhalten werden können, wenn die E. coli-Zellen durch Filtration über ein Membranfilter entfernt, die Phagenproteine zersetzt und denaturiert und die Proteine danach durch Ultrafiltration entfernt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt demnach ein Verfahren zur schrittweisen Reinigung von Phagen-DNAs bereit, umfassend in der nachstehenden Reihenfolge die Filtration eines Gemisches, das die Mikroorganismuszellen und den Phagen enthält, durch einen Membranfilter zur Entfernung dieser Mikroorganismuszellen, wobei ein Filtrat erhalten wird, die Zersetzung und Denaturierung der Phagenproteine in diesem Filtrat und die Ultrafiltration des erhaltenen Gemischs zur Entfernung von Verunreinigungen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die Phagen- DNAs aus einem Kulturmedium in hoher Ausbeute mit hoher Reinheit erhalten werden, wobei kein Zentrifugationsschritt durchgeführt werden muß. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren automatisiert werden, da der Zentrifugationsschritt nicht erforderlich ist. Ferner sind im erfindungsgemäßen Verfahren keine toxischen Reagenzien erforderlich, und die zur Reinigung erforderliche Zeit ist kürzer.

Kurze Beschreibung der Figur

Die Figur zeigt das Muster einer Agarose-Gelelektrophorese einer Phagen-DNA, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gereinigt wurde, zusammen mit dem Muster einer Elektrophorese der Phagen-DNA, die durch das übliche Verfahren gereinigt wurde, und dem Muster einer Elektrophorese einer im Handel erhältlichen Phagen-DNA.

Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Gemisch behandelt, das Mikroorganismuszellen und Phagen enthält. Ein übliches Beispiel eines solchen Gemisches ist ein Kulturmedium eines Virus-infizierten Mikroorganismus. Das Kulturmedium kann durch das erfindungsgemäße Verfahren direkt behandelt werden. Beispielsweise kann ein Kulturmedium, das den M13-Phagen und E. coli in 2 x TY-Medium oder ähnlichem enthält, durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelt werden.
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das vorstehend beschriebene Gemisch zur Entfernung der Mikroorganismuszellen durch ein Membranfilter filtriert. Die Porengröße des hier verwendeten Membranfilters ist vorzugsweise 0,45 bis 0,22 µm. Das Membranfilter kann aus jedem beliebigen Material bestehen.
Im zweiten Schritt werden die Phagenproteine im Filtrat zersetzt und denaturiert. Die Zersetzung und Denaturierung der Proteine kann durch Behandlung des Filtrats mit einem proteolytischen Enzym, beispielsweise der Proteinase K, durchgeführt werden. Das proteolytische Enzym sollte dann in einer geeigneten Konzentration gewählt werden. Wenn ein Kulturmedium behandelt wird, das den M13-Phagen und E. coli enthält, kann das proteolytische Enzym üblicherweise in einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 mg/ml verwendet werden. Wie nachstehend beschrieben, wird es vorgezogen, mit dem Filtrat vor der Behandlung mit einem proteolytischen Enzym eine Ultrafiltration durchzuführen und das proteolytische Enzym dem auf der Ultrafiltrationsmembran verbliebenen Phagen zuzusetzen, wobei allerdings dieser Ultrafiltrationsschritt nicht erforderlich ist.
Alternativ zur Behandlung mit einem proteolytischen Enzym können die Phagenproteine durch Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel, einem grenzflächenaktiven Mittel, einem Alkalisalz, durch Hitzebehandlung oder ähnlichem zersetzt und denaturiert werden. Der Zersetzungs- und Denaturierungsschritt der Proteine kann insbesondere durch Behandlung des Proteins mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise mit 30 bis 100 % Methanol oder Ethanol, durchgeführt werden. Die DNA und die Proteine können durch ein Reagens getrennt werden, das im Vergleich zu proteolytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln nicht so stark zersetzend wirkt, sofern ein vergleichsweise einfacher Phage behandelt werden soll. Beispielsweise können die Proteine durch Behandlung mit einem grenzflächenaktiven Mittel zersetzt und denaturiert werden. Bevorzugte Beispiele für ein grenzflächenaktives Mittel sind anionische grenzflächenaktive Mittel, beispielsweise Natriumlaurylsulfat (SDS). Bei einer Verwendung von SDS ist dessen Konzentration vorzugsweise 0,01 bis 1 Gew.-%. Da Proteine hitzeempfindlich und Nucleinsäuren, wie DNAs, relativ hitzeunempfindlich sind, können Proteine und Nucleinsäuren durch Wärme getrennt werden. Dabei sollte die Hitzebehandlung vorzugsweise 5 bis 20 Minuten bei einer Temperatur von 80 bis 100ºC durchgeführt werden. Die Proteine können auch durch eine Alkalibehandlung zersetzt und denaturiert werden. Zu den bevorzugten Beispielen für Alkalisalze gehört eine wäßrige Lösung von Alkalimetallhydroxiden mit einer Konzentration von 0,1 bis 1 N.
Die vorstehend beschriebenen Behandlungen können einzeln oder kombiniert durchgeführt werden. Durch diesen Schritt können Proteine von der Phagen-DNA getrennt werden.
Die erhaltene Lösung wird anschließend ultrafiltriert. Die hier verwendete Ultrafiltrationsmembran fraktioniert vorzugsweise ein Molekulargewicht im Bereich von 20 000 bis 1 000 000. Wenn das zu fraktionierende Molekulargewicht unterhalb dieses Bereichs liegt, werden die Proteine weniger effizient entfernt. Wenn andererseits das Molekulargewicht oberhalb dieses Bereichs liegt, kann die DNA das Ultrafilter passieren. Das Ultrafilter kann aus jedem Material bestehen. Beispielsweise können im Handel erhältliche Ultrafilter aus Polysulfon verwendet werden. Nach der Ultrafiltration kann die Phagen-DNA durch Waschen des Ultrafilters mit einer geeigneten Lösung, beispielsweise einer Pufferlösung, in Lösung erhalten werden. Zur Erhöhung der Ausbeute an Phagen-DNA wird es vorgezogen, das Ultrafilter zu waschen, indem die Lösung durch das Ultrafilter geleitet wird. Es kann jede beliebige Lösung zum Waschen des Ultrafilters verwendet werden. Übliche Pufferlösungen, beispielsweise TE-Puffer (Tris-HCl-Puffer, der EDTA enthält), können als Lösung zum Waschen des Ultrafilters verwendet werden. Durch diesen Ultrafiltrationsschritt werden die Proteine und andere Verunreinigungen aus der im zweiten Schritt erhaltenen Lösung entfernt, so daß die Phagen-DNA gereinigt wird.
Der zweite Schritt kann unmittelbar nach dem ersten Schritt, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt werden. Das erhaltene Filtrat kann jedoch nach dem ersten Schritt zur Entfernung von Bestandteilen mit niedrigem Molekulargewicht ultrafiltriert werden, wobei der Phage gereinigt wird. Unter diesen Umständen kann die Ultrafiltration in der gleichen Weise wie im unmittelbar vorstehend beschriebenen dritten Schritt durchgeführt werden. Wenn dieser Ultrafiltrationsschritt durchgeführt wird, kann ferner die Behandlung zur Zersetzung und Denaturierung der Proteine im zweiten Schritt auf dem Ultrafilter und die Ultrafiltration im dritten Schritt auf dem gleichen Ultrafilter durchgeführt werden.

Beispiel

Die Erfindung wird nachstehend in einem Beispiel beschrieben. Das Beispiel soll diese Erfindung lediglich erläutern und den Schutzbereich der Erfindung nicht einschränken.
E. coli JM109 wurde in ein 2 x TY-Medium inokkuliert und anschließend mit dem M13-Phagen infiziert. Das Medium wurde 4 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Das erhaltene Kulturmedium wurde durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 µm unter Druck mit Stickstoffgas filtriert.
Das erhaltene Filtrat wurde zur Entfernung von Bestandteilen mit niedrigem Molekulargewicht im Kulturmedium durch einen Ultrafilter, der ein Molekulargewicht von 300 000 fraktioniert, ultrafiltriert. Zur Zersetzung der Phagenproteine wurde eine Lösung von 5 µg/µl Proteinase K auf das Ultrafilter gegeben und 10 Minuten umgesetzt.
Die Enzymlösung wurde unter Druck entfernt und das Ultrafilter mit TE-Puffer gewaschen, indem der Puffer unter Druck durch das Ultrafilter geleitet wurde. Zweihundert Microliter TE-Puffer wurden auf das Ultrafilter gegeben und das Ultrafilter geschüttelt. Anschließend wurde der TE-Puffer unter Verwendung einer Pipette entnommen.
Durch dieses Verfahren wurden 2,5 µg Phagen-DNA aus 2 ml Kulturmedium gewonnen.
Mit der so erhaltenen Phagen-DNA wurde eine Agarose-Gelelektrophorese gemäß einem üblichen Verfahren durchgeführt. Zur Kontrolle wurde mit der im Handel erhältlichen M13-Phagen- DNA sowie mit der M13-Phagen-DNA, die durch ein übliches, eine Ausfällung mit Polyethylenglycol und eine Phenolextraktion umfassendes Reinigungsverfahren gereinigt worden war, eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in der Figur dargestellt. Bahn 1 der Figur zeigt ein Elektrophorese-Muster von Molekulargewichtsmarkern, die aus HindIII-Spaltprodukten des λ-Phagen bestehen, Bahn 2 zeigt ein Elektrophorese-Muster von im Handel erhältlicher einzelsträngiger M13-Phagen-DNA, Bahn 3 zeigt ein Elektrophorese-Muster von M13-Phagen-DNA, die durch die übliche Polyethylenglycol-Ausfällung und Phenolextraktion gereinigt worden ist, und Bahn 4 zeigt ein Elektrophorese-Muster von M13- Phagen-DNA, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gereinigt worden ist.
Wie der Figur zu entnehmen ist, bestätigte sich, daß die Phagen-DNA durch das erfindungsgemäße Verfahren mit großer Reinheit erhalten werden kann.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Phagen-DNA, das die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfaßt:

Filtern eines Gemisches, das Mikroorganismuszellen und Phagen enthält, durch ein Membranfilter zur Gewinnung eines Filtrats, wobei die Mikroorganismuszellen entfernt werden;

Zersetzung und Denaturierung der Phagenproteine in dem Filtrat; und

Durchführung einer Ultrafiltration mit dem erhaltenen Produkt, um Verunreinigungen zu entfernen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße des Membranfilters 0,45 µm bis 0,22 µm beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das durch die Ultrafiltration zu fraktionierende Molekulargewicht im Bereich 20 000 bis 1 000 000 liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Zersetzungs- und Denaturierungsschritt der Phagenproteine durch Behandlung der Phagenproteine mit einem proteolytischen Enzym durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als weiteren Schritt die Ultrafiltration des im ersten Schritt vom Membranfilter erhaltenen Filtrats vor dem Zersetzungs- und Denaturierungsschritt der Phagenproteine umfaßt.