DE69428072T2 - Verfahren zur Extraktion von Polyhydroxy-Alkanoaten aus diese enthaltenden halophilen Bakterien - Google Patents
Verfahren zur Extraktion von Polyhydroxy-Alkanoaten aus diese enthaltenden halophilen BakterienInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Polyhydroxyalkanoaten, im folgenden als "PHA" bezeichnet, erzeugt von halophilen Bakterienzellen.
- PHAs werden intrazellulär von vielen Bakterien in Form von Körnchen ("Granula") akkumuliert. Die Verwendung dieser Polymere als Thermoplaste erfordert ihre Trennung vom Rest des zellulären Materials mit einem ausreichenden Reinheitsgrad. Dafür sind zahlreiche Verfahren, basierend auf der Verwendung von Lösungsmitteln und selektiven Fällungsmitteln, beschrieben worden, wobei die Verfahren das Polymer PHA aus der komplexen Mischung, welche die zelluläre Biomasse ausmacht, mit Hilfe eines Verfahrens aus Lösen und Fällen extrahieren.
- US-Patent Nr. 3,107,172 schlägt Sprühtrocknung der Zellen und Verwendung des daraus resultierenden Materials direkt zum Gießen vor. Andere Patente führen die Extraktion und Reinigung eines Polymers unter Verwendung von Lösungsmitteln, in welchen PHA löslich ist und so das PHA vom übrigen zellulären Material herauslösen können, aus. Beispielsweise schlägt EP-A-0015 123 das Trocknen der wäßrigen Suspension von Bakterien in einem Gasstrom bei hoher Temperatur unter Verwendung von Mischungen von Lösungsmitteln (Dichlorethan, Chloroform, usw.) und Nicht-Lösungsmitteln (Aceton und Methanol) vor, um das gereinigte Polymer zu gewinnen. Andere Verfahren bestehen in der Konzentrierung der Suspension durch Zentrifugation und Behandlung dieser mit Aceton zur Trocknung und zur Zerstörung der Zellen. Danach wird das Polymer mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels extrahiert (Pyridin - US-Patent Nr. 3,036,959 oder mit einer Dichlormethan-ethan- Mischung- US-Patent Nr. 3,044,942). Danach ist es notwendig, das Polymer und schließlich das Lösungsmittel gewöhnlicherweise durch Rektifikation wiederzugewinnen (beispielsweise die Europäische Patentanmeldung EP-A-0 124 309). US-Patent Nr. 3,275,610 beschreibt eine Methode, wodurch die Zellen, welche in Wasser suspendiert werden, der Wirkung eines Vibrationsfeldes unterzogen werden, um die PHAs herauszulösen. Sobald die Zellen aufgebrochen sind, wird die resultierende Masse zentrifugiert und getrocknet. Anschließend wird diese mit einem Lösungsmittel (Chloroform) behandelt, um die PHAs zu reinigen. Dieses Verfahren benötigt normalerweise einen hohen Energieverbrauch. US-Patent Nr. 4,101,533 schlägt die Verwendung von heißen zyklischen Carbonsäureestern vor, aus denen das Polymer durch Abkühlung ausfällt, unter Vermeidung der Schritte der Lösungsmittelwiedergewinnung. Es ist auch möglich, die PHAs direkt aus der wäßrigen Suspension der Zellen, ohne die Notwendigkeit das Wasser daraus durch Zentrifugation oder Trocknung mit Gas zu entfernen, durch die direkte Verwendung von bestimmten Lösungsmitteln (Chloroform, Dichlormethan, Dichlorethan) zu extrahieren, wenn auch bisweilen in Zellen mit harten Wänden ein vorheriger Zerkleinerungsprozeß benötigt wird, um die Zellen aufzubrechen. Dieses Verfahren benötigt die Kontrolle der Extraktionsbedingungen, um die Bildung von relativ stabilen Emulsionen aufgrund der Wirkung des Lösungsmittels auf die Lipide und Pigmente zu verhindern, welche eine Reinigung schwierig macht, wobei die PHA kontaminiert zurückgelassen werden.
- EP-A-0 145 233 offenbart ein Verfahren zur Entfernung von PHA aus diese enthaltenden Mikroorganismen, welches einen proteolytischen Enzymverdau und/oder Abbau mit einem grenzflächenaktiven Mittel der wäßrigen Mikroorganismen-Suspension umfaßt, um das Zellmaterial außer PHA zu lösen, wobei die Suspension auf mindestens 80ºC vor dem Verdau bzw. Abbau erwärmt wird.
- Scawen et al. (1988), in "Molecular biology and biotechnology" (J.M. Walker et al.), Kap. 14, Seiten 295-299, offenbaren verschiedene Methoden zum Zerstören bzw. Aufbrechen von Bakterien, um intrazelluläre Proteine zu isolieren und zu reinigen, einschließlich der Zelllyse durch osmotischen Schock wie auch der Verwendung der Methode zur Isolierung von Enzymen und Proteinen, insbesondere aus dem periplasmatischen Raum Gram-negativer Bakterien.
- Wyss & Eklund (1971) "Microorganism and man", Seiten 105-106, offenbaren die Plasmoptyse der Zellen eines halophilen Mikroorganismus in einem hypertonischen Medium als ein Verfahren zur Zerstörung von Zellwänden von Mikroorganismen.
- Auf jeden Fall ist das Verfahren zur Gewinnung von PHA teuer und bringt die Verwendung von großen Mengen von organischen Lösungsmitteln mit sich. Diese Lösungsmittel müssen wiedergewonnen und im Verfahren wiederverwendet werden, um es kosteneffizient zu machen.
- Das vorliegende Verfahren ist anwendbar für die Extraktion von PHA-Körnchen, welche von Halobakterien und anderen halophilen Bakterien erzeugt werden. Es basiert auf der Schwäche der Zellhülle dieser Mikroorganismen, wenn diese niedrigen Salzkonzentrationen, z. B. in frischem Wasser, ausgesetzt werden; unter diesen Bedingungen lysieren (zerplatzen bzw. brechen auf) die Zellen halophiler Bakterien unter Freisetzung aller Zellbestandteile in das Medium. Da die PHA- Körnchen in Größe und Dichte beträchtlich sind, können diese aus der Suspension der einmal lysierten Zellen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, Sedimentation, Filtration etc. gewonnen werden. Es ist diese Eigenschaft von halophilen Bakterien, wie Haloferax Mediterranei (Spanische Patentanmeldung ES- A-2 019 169), welche die vorliegende Erfindung ermöglicht, worin Wasser und niedrige Konzentrationen von Detergentien verwendet werden, um das Polymer mit hohen Ausbeuten und Reinheitsgraden sowohl in kontinuierlichen als in diskontinuierlichen Verfahren zu erhalten.
- Somit ist es möglich, einen Niederschlag bzw. ein Präzipitat aus PHA-Körnchen mit einem Minimum an Lipid und Proteinverunreinigungen zu erhalten. Um die Reste dieser Verunreinigungen zu entfernen, kann der Niederschlag ein- oder mehrmals mit Detergentien gewaschen werden, welche Proteine abbauen, beispielsweise Natriumdodecylsulfat (SDS) (die Detergentien können anionisch, kationisch, nicht- ionisch oder amphoter sein). Nach einer variablen Zahl von Waschschritten mit dem Detergens und anschließend mit Wasser wird das Material gesammelt, und ein feines Pulver, das aus PHA mit ausreichender Reinheit zur direkten Verwendung in Polymer-verarbeitenden Maschinen besteht, wird erhalten.
- Mit diesem Verfahren wird das Erfordernis, die wäßrige Bakteriensuspension zu trocknen und organische Lösungsmittel zu verwenden, beseitigt, wobei die Handhabung deutlich vereinfacht wird, und die Erfordernis, Lösungsmittel zu verwenden und diese zu recyclen, eliminiert wird. Daher wird der Produktextraktionsschritt bedeutend weniger teuer, wodurch sich die Möglichkeit einer viel kosteneffizienteren und attraktiveren Herstellung im großindustriellen Maßstab ergibt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von PHA aus halophilen Bakterien, welche diese enthalten, gekennzeichnet durch
- - Lysis oder Zerstörung bzw. Aufbrechen halophiler Bakterien, welche in Hochsalzmedien wachsen, durch Konzentrierung und Verdünnungsresuspendierung in einem Niedrigsalzmedium, welches weniger als 0,5 Gew.-% NaCl und weniger als 0,1 Gew.-% Magnesiumsalze enthält,
- - Isolierung eines Niederschlages bzw. Sediments, welches PHA-Körnchen enthält, durch Zentrifugation, Fällung bzw. Sedimenation oder Filtration der im vorherigen Schritt erhaltenen Suspension, und
- - Waschen des Niederschlages, welcher PHA-Körnchen enthält.
- Der erste Schritt dieses Verfahrens ist die Entfernung des salzhaltigen Mediums, in welchem die Bakterien wachsen. Dafür ist es notwendig, die Suspension der Bakterien so weit wie möglich zu konzentrieren. Beispielsweise werden für Halobakterien NaCl von 20 bis 25 Gew.-% und verschiedene Magnesiumsalze verwendet. Um die Lysis der Zellen zu bewirken, ist es notwendig, die Konzentration dieser Salze im Medium, welches die Zellen umgibt, auf weniger als 0,5 Gew.-% für NaCl und weniger als 0,1 Gew.-% für Magnesium zu verringern; anderenfalls wäre die Lysis nicht effektiv. Nach dem Entfernen des Mediums ist es hier erforderlich, die Zellen in einer Menge Wasser zu resuspendieren, die groß genug ist, daß die Konzentration der Salze ein angegebenes Niveau erreicht. Um die Lysis in allen Zellen in der kürzest möglichen Zeit sicherzustellen, ist es möglich, bereits in diesem Schritt ein Detergens, welches befähigt ist Bakterienhüllen aufzulösen, Gallensalze, wie Taurocholat oder Desoxycholat, welche sehr effektiv Lysis erzeugen, und ein Kation-komplexierendes Mittel, hinzuzufügen. Andererseits erhöht die übermäßige Verwendung von Wasser die Kosten der Extraktion durch Erhöhung des Wasserverbrauchs und/oder der Detergentien und erhöht die Zeit und den Energieverbrauch für Zentrifugation und/oder Filtration des Niederschlages.
- Um die Lysis der Zellen zu aktivieren, ist es auch möglich, die Suspension zu erhitzen, zum Beispiel von 50 auf 60ºC für 20 bis 30 Minuten. Es ist ebenso möglich, die Zellen anderen Systemen der mechanischen Zerstörung zu unterwerfen, um die Lysis zu beschleunigen, einschließlich intensiven Rührens bzw. Schütteins, plötzlichem Druckabfall, Einfrieren und Auftauen, etc..
- Nach Erhalt der Körnchen-Suspension, frei von ganzen Zellen und Zellbestandteilen signifikanter Größe, wird mit der Fällung oder Zentrifugation bei niedrigen Geschwindigkeiten begonnen, wobei die PHA-Körnchen mit einem hohen Reinheitsgrad erhalten werden. Für diesen Schritt ist es wichtig, daß das Ausgangskulturmedium so weit wie möglich frei von teilchenförmigen Material ist, weil, falls dieses vorliegt, dieses zusammen mit den Körnchen gesammelt würde, was das Endprodukt verunreinigen würde.
- Der Niederschlag, der die Körnchen enthält, weist gewöhnlicherweise Lipid- und Proteinverunreinigungen auf. Diese Verunreinigungen können mit einem oder mehreren Waschschritten bis auf Spuren reduziert werden, unter Verwendung von Wasser und einem Detergens, das Proteine löst, wie SDS. Die Reinheit einer Aufarbeitung kann durch den Verlust der rosa Farbe visuell überwacht bzw. beobachtet werden, welche den Niederschlag in den anfänglichen Schritten charakterisiert und welche vom Vorhandensein von Verunreinigungen aus der Zellmembran der Mikroorganismen und der ganzen Zellen, welche noch nicht lysiert sind, herrührt.
- Die Detergentien, welche verwendet werden, können anionisch sein (Natrium- oder Kaliumsalze linearer Fettsäuren, lineare Alkylbenzolsulfonate (LAS), Paraffinsulfonate, α-ofefinische Sulfonate, Dialkylsulfosuccinate, Alkylsulfate, Alkylpolyestersulfate, Alkylphosphate, kationische (Fettamine und ihre Salze, quartäre Ammoniumsalze, polyethoxylierte Fettamine), nicht-ionische (polyethoxylierte Alkylphenole, polyethoxylierte Fettalkohole, polyethoxylierte Fettsäuren, Alkanoamine bzw. Alkanolamine oder Alkanoaminkondensate, wie Alphol, Nonylphenol, etc.) und amphotere (N-Alkylbetaine, N-Alkylsulfobetaine, Alkylimidazoline, N-Alkyl-β-Aminopropionsäuren, etc.).
- Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:
- Beginn mit einer Kultur der Haloferax Mediterranei ATCC 33500 (die ATCC-Nummer bezieht sich auf die Kultur-Nummer, eingereicht bei American Type Culture Collection, Bethesda, Maryland, United States). Die Eigenschaften dieser Mikroorganismen als Erzeuger von PHA werden beschrieben in (Spanische Patentanmeldung Nr. Es-A-2 019 169). Eine Kultur mit 500 ml Volumen, welche 10 g/l, Biomasse enthält, von denen 6 g/l PHA sind, wird bei 600 Upm für 15 Minuten zentrifugiert, liefert einen konzentrierten Niederschlag, von dem der Überstand durch Dekantieren entfernt wird.
- Anschließend wird der Niederschlag in 500 ml destilliertem Wasser, welches 0,1% SDS enthält, resuspendiert. Der Niederschlag wird durch intensives Schütteln im Suspensionsmedium resuspendiert; nach dem Erhalt einer homogenen Suspension, wartet man, bis die Trübung verschwindet - was zwischen 1 und 20 Minuten eintritt.
- Die Suspension wird bei 2.000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert, was einen weißlichen, kompakten Niederschlag liefert. Der Überstand wird dekantiert und in 500 ml Wasser mit SDS (0,1%) resuspendiert, zentrifugiert wie im vorherigen Schritt und in destilliertem Wasser (500 ml) resuspendiert und wieder zentrifugiert.
- Das Wasser wird durch Dekantieren entfernt, und der resultierende Brei wird durch Sprühen in ein Flüssigkeitsbett bzw. fluidisiertes Bett in einem Luftstrom bei 70ºC für ungefähr 2 Stunden in einem Ofen getrocknet, was ungefähr 3 g PHA mit einem Reinheitsgrad von 98, 99% liefert.
- Die Zellen werden durch Zentrifugation analog zum vorherigen Fall abgetrennt und in destilliertem Wasser durch intensives Zerreiben in einem Labormörser resuspendiert. Die Suspension wird auf 65ºC für 20 min erwärmt. Nach diesem Schritt wird die Suspension bei 200 Upm für 5 min zentrifugiert, gefolgt durch die Wiederholung aller Schritte des vorherigen Beispiels ebenso wie der Behandlung mit Wasser, Detergentien und darauffolgenden Zentrifugationen. Ein Produkt wird mit einer Ausbeute von 97 bis 99% und einer Reinheit von 98, 99% erhalten.
- Verschiedene Verhältnisse von Wasser und Detergentien wurden in bezug auf PHA in mehrfachen Kontakten mit in jedem Schritt neuen Mischungen aus Wasser und Detergentien überprüft (Waschen in einzelnen Schritten würde etliche sehr große Mengen an Wasser und Detergentien benötigen). Beispielsweise wird ein Liter Kulturmedium, welches in der Regel 10 g/l Biomasse enthält, von denen 5 bis 6 g/l PHA sind, einem Verfahren mit einem Zellzerstörungsschritt, ähnlich dem aus Beispiel 1, unterworfen, welcher das Konzentrat mit Verdünnung durch Wasser ohne Salze oder Detergentien behandelt (diese Behandlung ist optional, falls sie nicht durchgeführt wird, werden schlechtere Ergebnisse erhalten). Nach Zentrifugation bei 8.000 Upm für 20 Minuten wird die resultierende Suspension in drei Teile geteilt. Einer von diesen wird mit 3 · 250 ml SDS in Wasser bei 0,2% aufbereitet, ein anderer mit 3 · 125 ml derselben Lösung und der letzte mit 3 · 75 ml der Lösung. Das Aufbereiten endet durch Waschen mit Wasser, um das Detergens zu entfernen; danach wird die Trocknung in einem Ofen oder in einem Flüssigkeitsbett in einem Luftstrom bei 70ºC für 2 Stunden durchgeführt. Die Ausbeute ist in allen Fällen größer als 95% und die Reinheit, bestimmt durch Auflösen der PHA-Probe und das Wiegen des unlöslichen Rückstandes, betrug von 98 bis 99% im ersten Fall, von 90 bis 91% im zweiten Fall bzw. von 87 bis 90% im dritten Fall.
- Der Lysisschritt wird vor dem Waschen im Gegenstrom durchgeführt, weil diese Methode die Ausbeute verbessert. Im Lysisschritt ist es möglich, ein Detergenz und ebenso ein Kation-maskierendes oder -komplexierendes Mittel (z. B. Ethylendiamintetraessigsäure, EDTA) zu verwenden, um die Reinheit zu verbessern. Beispielsweise die Reinheit, die im Fall der Aufbereitung des Konzentrats erhalten wird, welches wie in Beispiel 1 mit 3 · 500 ml Wasser mit SDS bei 2% oder mit 3 · 500 ml Wasser mit SDS und 0,6 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) erhalten wird, war 78,8%, verglichen mit 92% im zweiten Fall.
- Ein weiteres Beispiel für die Wirkung von Mitteln, welche die Lysis von Bakterien vor dem Beginn des Waschens im Gegenstrom begünstigen, ist die Verwendung von Gallensalzen, so wie Taurocholsäure, welche eine Verringerung des Wasserverbrauchs und ebenso des Detergens ohne eine nachweisbare Reduzierung der Reinheit ermöglicht. Beispielsweise ergibt sich ein Endprodukt mit einer Reinheit von 96 bis 97%, erhalten durch die Aufarbeitung eines Liters Medium, welcher bei 8.000 Upm für 20 Minuten zentrifugiert wird, wobei das erhaltene Sediment mit 125 ml SDS 0,2%, 6 mM Taurocholsäure gewaschen wird, und anschließend mit 125 ml SDS 0,2% gewaschen wird.
- 3 l Medium, welches 3 g/l PHA enthält, wurden aufgearbeitet. Ein Liter wurde mit 3 · 500 ml SDS bei 0,2%, der zweite mit 500 ml SDS bei 0,2% und 2 · 500 ml SDS bei 0,1% und der dritte mit 3 · 500 ml SDS bei 0,1% behandelt. In allen Fällen wurden die vorherigen Waschschritte (Lysisschritt) mit SDS und 0,6 mM EDTA ausgeführt. Die Endreinheit war 91,9%, 76,9% bzw. 59,3%.
- Waschen im Gegenstrom. Ein Test wurde mit dem Sediment bzw. Niederschlag durchgeführt, welcher aus der Behandlung ähnlich der in Beispiel 1 beschriebenen, aber unter Verwendung von EDTA wie in Beispiel 4 oder 6, resultiert. Die Behandlung wurde in drei Schritten mit 150 ml Wasser mit SDS bei 0,2% in einem kontinuierlichen Gegenstromelement ausgeführt. Die erhaltene Reinheit betrug 97%.
Claims (14)
1. Verfahren zur Extraktion von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) aus halophilen
Bakterien, die diese enthalten, gekennzeichnet durch
- Lysis oder Aufbrechen halophiler Bakterien, welche in Hochsalzmedien
wachsen, durch Konzentrierung und Verdünnungsresuspendierung in einem
Niedrigsalzmedium, welches weniger als 0,5 Gew.-% NaCl und weniger als
0,1 Gew.-% Magnesiumsalze enthält,
- Isolierung eines Niederschlages, welcher PHA-Körnchen enthält, durch
Zentrifugation, Fällung oder Filtration der im vorherigen Schritt erhaltenen
Suspension, und
- Waschen des Niederschlages, welcher PHA-Körnchen enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lysis oder das
Aufbrechen der halophilen Bakterien in Gegenwart eines Detergens, welches
zum Auflösen der Bakterienhüllen befähigt ist, gegebenenfalls zusammen mit
einem Gallensalz oder Desoxycholat durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens ein
anionisches, kationisches, nicht-ionisches oder amphoteres Detergens,
ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumdodecylsulfat (SDS),
linearem Alkylbenzolsulfonat, Natriumcholat, Alphol und Nonylphenol, ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gallensalz
Taurocholat ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das
Kationenkomplexierende Mittel Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lysis- oder
Aufbrechungsschritt der halophilen Bakterien durch Erwärmen der
Suspension bei einer Temperatur zwischen 50 und 60ºC für einen Zeitraum
zwischen 20 und 30 min durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lysis- oder
Aufbrechungsschritt der halophilen Bakterien zusammen mit der Verwendung
eines anderen Systems zum mechanischen Aufbrechen der Zellen
durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das System zum
mechanischen Aufbrechen der Zellen aus der Gruppe, bestehend aus
Zerreibung, Schüttelung, Vibration, Druckabfall, Erwärmung und Einfrieren
und Auftauen, ausgewählt ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Waschschritt
des Niederschlages, welcher PHA-Körchen enthält, mit Wasser und einem
Detergens durchgeführt wird, welches befähigt ist, das Protein zu lösen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens ein
anionisches, kationisches, nicht-ionisches oder amphoteres Detergens ist,
welches aus der Gruppe, bestehend aus Natrium- oder Kaliumsalzen linearer
Fettsäuren, linearen Alkylbenzolsulfonaten, Paraffinsulfonaten, α-olefinischen
Sulfonaten, Dialkylsulfosuccinaten, Alkylsulfaten, Alkylpolyestersulfaten,
Alkylphosphaten, Fettaminen und deren Salzen, quartären Ammoniumsalzen,
polyethoxylierten Fettaminen, polyethoxylierten Alkylphenolen,
polyethoxylierten Fettalkoholen, polyethoxylierten Fettsäuren, Alkanoaminen
oder Alkanoaminkondensaten, n-Alkylbetainen, n-Alkylsulfobetainen,
Alkylimidazolinen und n-Alkyl-β-aminopropionsäure, ausgewählt ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens
Natriumdodecylsulfat (SDS) ist.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Waschen
kontinuierlich oder diskontinuierlich, in einem oder einer Vielzahl von Schritten
mit frischem Lösungsmittel in jedem Schritt oder in einem
Gegenstromverfahren durchgeführt werden.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der letzte
Waschschritt mit Wasser durchgeführt wird, um das Detergens zu entfernen.
14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Lysisschritt in
Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) und Ethylendiamintetraessigsäure
oder in Gegenwart von SDS und Taurocholsäure oder Natriumdesoxycholat
durchgeführt wird und der Waschschritt mit Wasser und SDS im Gegenstrom
in einem oder einer Vielzahl von Schritten mit einem Verhältnis von
Waschwasser zu Polyhydroxyalkanoat von bis zu 200 : 1 durchgeführt wird.
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