JP2726802B2 - ポリヒドロキシアルカノエートの抽出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は好塩菌(bacterias halof
ilas; halophile bacterium)の細胞から産生されるポリ
ヒドロキシアルカノエート（以下ＰＨＡと称する）の抽
出法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＰＨＡは多くの細菌により顆粒の形で細
胞内に蓄積される。これらのポリマーを熱可塑性物質と
して用いるためには、残余の細胞物質を分離して、十分
な純度とする必要がある。そのため、細胞バイオマスを
代表とする複雑な混合物から溶解・沈澱法によりＰＨＡ
ポリマーを抽出するための選択的な溶媒及び沈澱剤の使
用に基く多数の方法が文献に記載されている。

【０００３】米国特許第３，１０７，１７２号明細書に
おいては撒布により細胞を乾燥させ、生じた材料を直
接、注型に用いることが提案されている。他の幾つかの
特許に記載の方法においては、ＰＨＡを溶解する、従っ
て残余の細胞物質からＰＨＡを浸出し得る溶媒を利用す
ることによりポリマーの抽出及び精製を実施している。
例えば英国特許第７，９０６，０７６号明細書において
は細菌の水性懸濁液を高温ガス流中において乾燥させ、
溶媒（ジクロロエタン、クロロホルムなど）と非溶媒
（アセトン及びメタノール）との混合物を精製されたポ
リマーの回収のために用いることが提案されている。別
の方法は懸濁液を遠心分離して濃縮し、アセトンで処理
して乾燥させ、細胞を破砕することからなる。次に適当
な溶媒（米国特許第３，０３６，９５９号明細書ではピ
リジン、米国特許第３，０４４，９４２号明細書ではジ
クロロメタン−エタン混合物）を用いてポリマーを抽出
する。次にポリマーを、また最後に溶媒を、通常は精溜
により（例えば欧州特許第８４３０２５０８．１号明細
書）回収することが必要である。米国特許第３，２７
５，６１０号明細書には水中に細胞を懸濁させ、振動場
の作用を受けさせてＰＨＡを浸出させる方法が記載され
ている。一旦、細胞が破砕されると、生成したものを遠
心分離にかけかつ乾燥させる。続いて溶媒（クロロホル
ム）を用いて処理してＰＨＡを精製する。この操作は通
常エネルギー消費が大きい。米国特許第４，１０１，５
３３号明細書には熱間でカルボン酸環式エステルを用
い、冷却させてそれからポリマーを沈澱させることによ
り溶媒回収段階を回避することが提案されている。同様
に、遠心分離又はガスを用いる乾燥により、水を除去す
る必要なしに、若干の溶媒（クロロホルム、ジクロロメ
タン、ジクロロエタン）を直接使用して水性細胞懸濁液
から直接にＰＨＡを抽出することもできるが、時には細
胞膜が堅い場合、細胞を破砕するために先行の磨砕過程
が必要である。この方法では、溶媒が脂質及び顔料に作
用して比較的安定な乳濁液を作り、このことがＰＨＡの
精製を困難にし、不純なままとすることを回避するため
に抽出条件を制御することを必要とする。

【０００４】何れの場合にも、ＰＨＡの製造法は費用が
かかり、大量の有機溶媒の使用を伴なう。これらの溶媒
はＰＨＡの製造が経済的に引き合うものとなるように回
収、再使用されなくてはならない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は上記し
たごとき従来の製造法の欠点のない方法を提供すること
である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の方法はハロバク
テリア(halobacteria)及びその他の好塩菌により産生さ
れるＰＨＡ顆粒の抽出に適用し得る。本発明は低濃度の
塩、例えば軟水に暴露されたとき、これらの条件下にお
いて好塩菌の細胞が溶解（破壊）して細胞成分のすべて
が媒体中へ放出されるという、これらの微生物の細胞膜
の脆弱さに基いている。ＰＨＡ顆粒の粒度及び密度がか
なり大きいので一旦損傷した細胞の懸濁液から低速遠心
分離、沈降、濾別などにより回収できる。ハロフェラッ
クス・メディテラネイ(Haloferax Mediterranei)（特許
第８９０３４７号）のごとき好塩菌の上記の特質が、連
続法においても不連続法においても高い収率及び純度で
ポリマーを得るために、水及び低濃度の洗浄剤を用いる
本発明の方法の実施を可能にしている。

【０００７】かくして脂質及び蛋白質からなる不純物の
含有量が最低のＰＨＡ顆粒の沈降物を取得し得る。これ
ら残留不純物を除去するために、蛋白質を運び去る洗浄
剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを用
いて沈降物を１回又は数回洗浄することができる（洗浄
剤はアニオン系、カチオン系、非イオン系又は両性のも
のであることができる）。洗浄剤を用いて種々の回数洗
浄し、また最後に水で洗浄した後に、材料を回収するこ
とによりポリマー加工機において直接使用するのに十分
な純度のＰＨＡからなる微粉末が得られる。

【０００８】本発明の方法を用いることにより水性細菌
懸濁液の乾燥及び有機溶媒の使用の必要性がなくなり、
取扱いがかなり単純化され、溶媒の使用及び再循環の必
要性がなくなる、かくして生成物の抽出過程がかなり安
価となり、工業規模の生産の可能性が著しく有利かつ魅
力的なものとなる。

【０００９】本発明の方法の第一段階は細菌を成長させ
る含塩媒体の排除である。そのためには細菌懸濁液を最
大に濃縮する必要がある。例えばハロバクテリアについ
てはＮａＣｌ ２０乃至２５重量％及び各種マグネシア
塩を用いる。細胞溶解を引き起こすためには細胞を破壊
する媒体中のこれらの塩の濃度をＮａＣｌについては
０．５％未満まで、またマグネシウムについては０．１
％未満まで低減させなくてはならない。さもないと溶解
が有効に行われない。そのためには一旦媒体を除去し
て、塩の濃度を上記レベルにとどめるのに十分な量の水
中に細胞を再懸濁させなくてはならない。可能な限り短
かい時間で全ての細胞を溶解させるためには、すでにこ
の段階において細胞膜溶解を容易にする洗浄剤、溶解を
引き起こすのに極めて有効なタウロコール酸塩又はデオ
キシコール酸塩などの胆汁酸塩及びカチオン錯生成体を
添加し得る。他方、過剰の量の水を使用することは、水
及び／又は洗浄剤の消費を増大させることにより抽出を
高価なものとしまた遠心分離及び／又は沈降、濾別にお
けるエネルギーの消費及び時間を増大させる。

【００１０】細胞溶解を活性化するためには懸濁液をた
とえば５０乃至６０℃で２０乃至３０分間加熱すること
もできる。同様に細胞を他の強力攪拌、突発的減圧、凍
結−解凍なども含めた溶解促進のための機械的破砕シス
テムにかけることもできる。

【００１１】一旦完全な細胞及び細胞残部の除去された
有意な粒度の顆粒懸濁液が得られた後、沈降又は低速遠
心分離を行って高純度のＰＨＡ顆粒を捕集する。この段
階においては分離される培地が、顆粒と結合して最終製
品中の不純物となるような特定の物質を含まない、可能
な限り清浄なものであることが重要である。

【００１２】顆粒を含有している沈降物中には、脂質及
び蛋白質からなる不純物が通常、存在している。これら
の不純物は水と、蛋白質を溶解するＳＤＳのごとき洗浄
剤とを用いて１回又は数回洗浄することにより低減でき
る。製品の純度は初期段階における沈降物の特徴であり
かつ微生物細胞膜中の不純物の存在とまだ溶解していな
い完全な細胞とに由来する淡紅色の消失により視覚的に
追随できる。

【００１３】使用すべき洗浄剤としてはアニオン系洗浄
剤（直鎖脂肪酸のナトリウム及びカリウム塩、直鎖アル
キルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、パラフィンスル
ホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、ジアルキルス
ルホコハク酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルポリエステ
ル硫酸塩、アルキル燐酸塩、長鎖アルキルベンゼンスル
ホン酸塩、例えば、ＳＡＳ、ＬＡＳ、コール酸ナトリウ
ム、ラウリル硫酸ナトリウムなど）；カチオン系洗浄剤
（脂肪族アミン及びそれらの塩、第四アンモニウム塩、
ポリエトキシ化脂肪族アミン）、非イオン系洗浄剤（ポ
リエトキシ化アルキルフェノール、ポリエトキシ化脂肪
族アルコール、ポリエトキシ化脂肪酸、アルカノールア
ミド又はアルカノールアミドの縮合物、アルフォール、
ノナフェノールなど）及び両性洗浄剤（Ｎ−アルキルベ
タイン、Ｎ−アルキルスルホベタイン、アルキルイミダ
ゾリン、Ｎ−アルキル−β−アミノプロピオン酸など）
を挙げることができる。

【００１４】

【実施例】本発明を下記の実施例によって更に説明す
る。

【００１５】実施例１ ハロフェラックス・メディテラネイ菌株ＡＴＣＣ３３５
００を出発原料として使用した〔ＡＴＣＣ番号は米国メ
アリランド州ベテスダ市、アメリカン タイプカルチュ
ア コレクション(American Type Culture Collection)
に保管されている菌株の番号である〕。ＰＨＡ産生体と
してのこの微生物の諸特性は特許第８９０３４７号明細
書に記載されている。バイオマス１０ｇ／ｌ（そのうち
６ｇ／ｌはＰＨＡである）を含んでいる培養液５００ｍ
ｌを６００回／分で１５分間遠心分離にかけて濃縮沈降
物を得、傾瀉により上澄液を除去した。

【００１６】ついでＳＤＳを０．１％含有する蒸溜水５
００ｍｌに沈降物を再懸濁させた。再懸濁させるために
沈降物を懸濁媒体中で強く攪拌し、均質の懸濁液を得た
後、濁りの消えるまで放置した。これには１乃至２０分
間要した。

【００１７】懸濁液を２０００回／分で５分間遠心分離
にかけて緻密な白色を帯びた沈降物を得た。上澄液を傾
瀉し、再びＳＤＳ（０．１％）を含有する水５００ｍｌ
に懸濁させ、前回と同様に遠心分離にかけ、蒸溜水（５
００ｍｌ）中に再懸濁させ、再度、遠心分離にかけた。

【００１８】傾瀉により水を除き、生じたペーストを７
０℃の気流中の流動床において約２時間、撒布により一
段階で乾燥させて純度９８．９９％のＰＨＡ約３ｇを得
た。

【００１９】実施例２ 前記と同様にして遠心分離により細胞を分離し、実験室
用破砕機中で強く攪拌して蒸溜水中に再懸濁させた。懸
濁液を６５℃に２０分間加熱した。この工程の後に、２
００回／分で５分間遠心分離にかけ、ついで水−洗浄剤
を用いる前段の処理及び後続の遠心分離を行なうことか
らなる前記実施例１の全工程を反復した。純度９８．９
９％の製品が９７乃至９９％の収率で得られた。

【００２０】実施例３ 本実施例では、各段階で水と洗浄剤との混合物と反復し
て接触させる新規な方法における、ＰＨＡと水及び洗浄
剤との明確な関係を立証した（単一段階での洗浄は極め
て多量の水及び洗浄剤を必要とすることがある）。バイ
オマスを１０ｇ／ｌ程度（そのうち５−６ｇ／ｌがＰＨ
Ａである）含有する培地例えば１ｌを、無塩水と洗浄剤
とからなる溶液を用いて、濃縮物を処理する細胞破砕段
階（この処理は任意であり、実施しない場合は収率が低
下する）を含む実施例１に類似の処理工程にかけた。一
旦８０００回／分で２０分間遠心分離にかけた後、生じ
た懸濁液を３部分に分けた。それらのうちの一つは０．
２％ＳＤＳ水溶液２５０ｍｌを用いて３回、別の一つは
同じ溶液１２５ｍｌを用いて３回、最後のものは該溶液
７５ｍｌを用いて３回処理した。最後の処理として洗浄
剤を除去するために水で洗浄した後、乾燥器又は７０℃
の気流の流動床で２時間乾燥させた。全ての場合におい
て収率は９５％を超え、そして、ＰＨＡの試料を溶解さ
せ、不溶性の残留物を秤量することにより測定した純度
は第１の場合９８−９９％、第２の場合９０−９１％ま
た第３の場合８７−９０％であった。

【００２１】実施例４ 収率を向上させるために、向流洗浄を行う前に細胞溶解
工程を実施した。溶解工程においては純度をあげるため
に、洗浄剤の他に、更にカチオン封鎖剤、すなわち、錯
形成体（例えばエチレンジアミン四酢酸、ＥＤＴＡ）を
使用できる。例えば実施例１において得られた濃縮物を
ＳＤＳを０．２％含有する水５００ｍｌで３回又はＳＤ
Ｓ及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）０．６ｍＭ
を含有する水５００ｍｌで３回処理して得られた純度は
７８．８％であり、これに対して第２の場合の９２％で
あった。

【００２２】実施例５ 向流洗浄開始前の細菌溶解に有利に作用する薬剤の別の
例はタウロコール酸などの胆汁酸塩であり、これが明ら
かな純度の低下を生ずることなしに、水及び後の洗浄剤
の消費を低減できる。例えば媒体１ｌを処理し、８００
０回／分で２０分間遠心分離にかけ、生じた沈降物をＳ
ＤＳ０．２％、タウロコール６ｍＭを含有する溶液１２
５ｍｌで、次にＳＤＳ０．２％を含有する溶液１２５ｍ
ｌで洗浄することにより純度９６−９７％の最終製品が
得られた。

【００２３】実施例６ ＰＨＡ３ｇ／ｌを含有する媒体３ｌを処理した。その内
の１ｌは０．２％ＳＤＳ ５００ｍｌで３回、第２のも
のは０．２％ＳＤＳ ５００ｍｌで１回、０．１％ＳＤ
Ｓ ５００ｍｌで２回、また第３のものは０．１％ＳＤ
Ｓ ５００ｍｌで３回処理した。全ての場合、予備洗浄
（溶解工程）はＳＤＳ及び０．６ｍＭ ＥＤＴＡを用い
て実施した。最終純度はそれぞれ９１．９％、７６．９
％及び５９．３％であった。

【００２４】実施例７ 向流で洗浄を行った。実施例１記載のものと同様の、た
だし実施例５のＥＤＴＡを用いる処理から生じた沈降物
について試験を実施した。連続・向流式三段階洗浄装置
において０．２％ＳＤＳ水溶液１５０ｍｌで処理した。
得られた純度は９７％であった。

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 好塩菌に含まれているポリヒドロキシア
   ルカノエートを抽出するにあたり、高濃度塩媒体中にお
   いて成育する好塩性細胞（例えばハロバクテリア型のも
   の）の溶解又は破壊、濃縮、遠心分離を行い、ついで低
   濃度塩媒体、例えば軟水又は蒸溜水による希釈−再懸濁
   及びかくして生じた懸濁液の遠心分離、沈降又は濾過を
   行うことを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート
   の抽出方法。
2. 【請求項２】 ドデシル硫酸ナトリウム、直鎖アルキル
   ベンゼンスルホン酸塩、コール酸ナトリウム、アルフォ
   ール、ノナフェノールのごときアニオン系、カチオン
   系、非イオン系又は両性洗浄剤及び０乃至１．５％の低
   濃度のエチレンジアミン四酢酸型のいずれかのカチオン
   錯生成体を、細菌の溶解の促進及び得られるポリヒドロ
   キシアルカノエートの収率及び純度向上のために使用す
   る、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 細胞の溶解を促進するために、粉砕、攪
   拌、振盪、減圧又は加熱を行う、請求項１に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 得られたポリヒドロキシアルカノエート
   の洗浄及び脂質及び蛋白質の除去のために、上記の型の
   洗浄剤を使用する請求項１又は２に記載の方法。
5. 【請求項５】 洗浄は連続的に又は不連続的に、一段階
   において又は毎回新しい溶媒を用いて数段階において、
   又は向流において行なう、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 洗浄剤を除去するために、最終洗浄段階
   は水を用いて行なう、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 溶解促進のために、ドデシルスルホン酸
   ナトリウム０乃至２％及びエチレンジアミン四酢酸０乃
   至６ｍＭ又はタウロコール酸０乃至６ｍＭ又はデオキシ
   コール酸ナトリウム０乃至６ｍＭを使用し、一段階又は
   数段階の向流法洗浄のために、洗浄水対ポリヒドロキシ
   アルカノエートの比率２００：１を用い、かつ、ドデシ
   ルスルホン酸ナトリウム０乃至３％を用いて、９８％を
   超える純度と９８％を超える収率を得る請求項１に記載
   の方法。