FI85385C - Foerfarande foer producering av ribonukleinsyra. - Google Patents

Description

1 85385

Menetelmä ribonukleiinihapon tuottamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää ribonukleiinihapon tuottamiseksi (jäljempänä käytetään nimitystä RNA). Erityisemmin se koskee menetelmää eristää RNA hiivasta, jota on kasvatettu kasvualustassa kuten esimerkiksi melassis-sa.

RNA:n tuottamiseksi tunnetaan menetelmä, jossa RNA uutetaan hiivasta kuumalla suolaliuoksella, käsitellään uutettua RNA:ta sisältävä liuos hapolla, ja sitten eristetään RNA liuoksesta sedimentoimalla. Sellaisessa uutettua RNA:ta sisältävässä liuoksessa on kolloidisia tai suspendoituneita liukenemattomia aineita, jotka ovat peräisin hiivan epäpuhtauksista. Kun RNA sedimentoidaan lisäämällä happoa, sedimentoituvat liukenemattomat aineet yhdessä RNA:n kanssa. Näin ollen, saatua RNA:ta konta-minoivat liukenemattomat aineet alentavat sen puhtautta. Liukenemattomien aineiden poistamiseksi valmistetusta liuoksesta, jotta saataisiin RNA:ta, jonka puhtaus on suuri, on ehdotettu JP-patenttijulkaisussa 56-46837 RNA:n tuottamiseksi polyakrylaatin tai vastaavien proteiineja koaguloivien aineiden lisäämistä RNA:ta sisältävään liuokseen, liukenemattomien aineiden poistamista liuoksesta koaguloimalla ja sedimentoimalla, hapon lisäämistä sen jälkeen näin saatuun kirkkaaseen liuokseen sen saattamiseksi happameksi, ja sitten RNA:n eristämistä liuoksesta sedimentoimalla.

Toisaalta, mikrobiaalisten tuotteiden puhdistamiseksi liuoksesta on yleisesti käytetty menetelmää, jolla liukenematon aines, jota myös on mukana liuoksessa, hajotetaan lisäämällä liuokseen proteaasla, minkä seurauksena 2 85385 liukenematon aines poistuu siitä. Tätä menetelmää voidaan myös soveltaa liuokseen, jossa on hiivasta uutettua RNA:ta. Tällainen menetelmä tunnetaan esimerkiksi FI-patenttijulkaisusta 53590, jossa kuvataan menetelmä, jossa biomassaa käsitellään alkalilla, liukenematon aines erotetaan neutraloinnin jälkeen, liuoksessa olevat proteiinit hydrolysoidaan proteaasivalmisteella liukoisiksi hydrolyysituotteiksi, minkä jälkeen RNA seostetaan hapolla ja lopuksi saostunut RNA-pitoinen tuote erotetaan esimerkiksi sentrifugoimalla.

Kun RNA uutetaan kuumalla suolaliuoksella hiivasta, jota on kasvatettu sokeria assimiloimalla lignosulfonaattia sisältävässä sulfiittijäteliemessä, voidaan uutettua RNA:ta sisältävän liuoksen liukenemattomat aineet poistaa siitä suhteellisen tehokkaasti lisäämällä liuokseen 5-100 ppm koaguloivaa ainetta, kuten esim. natriumpolyakry-laattia, ja sedimentoimalla liukenemattomat aineet koagu-loinnin kautta, tai lisäämällä liuokseen proteaasia liukenemattomien aineiden hajottamiseksi.

Kuitenkin, mitä tulee liuokseen, joka sisältää RNA:ta, joka on uutettu kuumentamalla suolaliuoksella hiivasta, jota on kasvatettu kasvuliemessä, joka ei sisällä lignosulfonaattia, kuten esim. melassissa, siinä olevia liukenemattomia aineita ei voi riittävästi poistaa proteaasia tai koaguloivaa ainetta, kuten esim. natriumpoly-akrylaattia, lisäämällä. Näin ollen on olemassa ongelma, että RNA-saanto huomattavasti laskee, verrattuna tapaukseen, jossa RNA eristetään liuoksesta, jossa on sulfiit-tijäteliemestä erotetusta hiivasta uutettua RNA:ta.

3 85385 Tämän keksinnön pääkohtana on näin ollen luoda parannettu menetelmä RNA:n tuottamiseksi korkealla saannolla.

Tämän keksinnön mukaisesti on aikaansaatu menetelmä ribonukleiinihapon tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa a) lisätään 50-1000 ppm proteaasia liuokseen, jossa on hiivasta kuumennetulla suolaliuoksella uutettua ribonukleiinihappoa, ja pidetään syntyneen liuoksen lämpötila välillä 30-80°C 1-8 tunnin ajan, b) säädetään hiivasta uutettua ribonukleiinihappoa sisältävän liuoksen lämpötila välille 50-90eC, lisätään siihen koagulointiainetta, joka käsittää 5-100 ppm natriumpoly-akrylaattia ja 40-500 ppm vesiliukoista metallisuolaa valikoituna ryhmästä, jossa on ferrisuoloja ja alumiini-suoloja, mainitun liuoksen liukenemattoman aineen poistamiseksi koaguloimalla ja sedimentoimalla, ja lisätään sen jälkeen happoa mainittuun liuokseen, joka oli kirkastettu poistamalla liukenematon aine, liuoksen saattamiseksi happamaksi, ja eristetään sitten saadusta liuoksesta ribonukleiinihappo sedimentoimalla. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että ensin suoritetaan edellä olevassa kohdassa a) esitetyt vaiheet ja tämän jälkeen kohdasta a) saadulle, ribonukleiinihappoa sisältävälle liuokselle suoritetaan edellä olevassa kohdassa b) esitetyt vaiheet, jolloin saadaan hyvin puhdasta ribonukleiinihappoa hyvällä saannolla.

Esillä olevassa keksinnössä käytetään edullisesti hiivaa, jota on viljelty kasvuliemessä, jossa ei ole lignosul-faattia. Hiivan sukua ja lajia ei ole rajattu, joskin on edullisempaa käyttää hiivaa, jolla on suuri RNA:n tuottokyky.

4 85385 RNA uutetaan hiivasta kuumennetulla suolaliuoksella. Tarkemmin kuvailtuna, suolaa lisätään kasvuliuokseen hiivan kasvatuksen päätyttyä, tai suolaliuosta lisätään kasvualustasta separoidun hiivan joukkoon. Liuos on edullista valmistaa niin, että hiivan kuiva-aine on välillä 7-14 paino-%, suolapitoisuus on välillä 4-7 paino-%, ja pH on välillä 7-8. Tämän jälkeen liuosta kuumennetaan lämpötilassa 90-99°C, edullisemmin välillä 95-99°C kolmesta kuuteen tunnin ajan. Tästä seuraa RNA:n ekstrahoituminen hiivasta liuosfaasiin. Jäähdyttämisen jälkeen käsitellään muodostunutta RNA-liuosta proteaasilla.

Tämän keksinnön mukaisesti käytetään proteaasia, joka on aktiivista alle neutraaleissa tai lievästi emäksisissä olosuhteissa. Tämän keksinnön mukaista on käyttää proteaaseja, joista esimerkkeinä voi mainita trypsiinin, papaiinin tai Bacillus-suvun, Streptomyces-suvun, Aspergillus-suvun ja Streptococcus-suvun tuottamat proteaasit. Liuokseen lisättävän proteaasin määrä on edullisemmin välillä 50-1000 ppm:ää.

Liuosta käsitellään proteaasilla lähtö-pH:n ollessa välillä 4-8, lämpötilassa 30-80°C, edullisemmin 40-75°C yhdestä kahdeksaan tunnin ajan. Kun proteaasikäsittely on päättynyt, säädetään liuoksen lämpötila välille 50-90°C. Sen jälkeen liuokseen lisätään natriumpolyakrylaattia ja vesiliukoista metallisuolaa, joka on valittu ryhmästä, jossa on ferrisuolaa, kuten esim. ferrikloridi ja ferrisulfaatti, ja alumiinisuolaa, kuten esim. alumiinisulfaatti. Liuoksessa olevat liukenemattomat aineet koaguloituvat ja sen myötä sedimentoituvat.

Tämän keksinnön mukaisesti on natriumpolyakrylaatin molekyyli-paino vähintään 5 000 000, edullisemmin vähintään 10 000 000. Polyakrylaatin vaikutusteho koaguloivana aineena on huonompi, jos sen molekyylipaino on alle 3 000 000. On edullista lisätä liuokseen polyakrylaatti ja yllä mainittu metallisuola määrinä, jotka vaihtelevat välillä 5-100 ppm ja 40-500 ppm vastaavasti. Lisättäessä vesiliukoinen metallisuola yhdessä natriumpoly-•V; akrylaatin kanssa, koaguloituvat liuoksessa olevat liukene- mattomat ainekset tehokkaammin. Jos kuitenkin vesiliukoista

II

5 85385 metallisuolaa lisätään ylenmäärin, osa RNAssta menetetään, koska se sedimentoituu yhdessä liukenemattomien aineiden kanssa. Vaikkakin koaguloitumista tapahtuu merkittävästi huoneenlämmössä, edistää liuoksen lämpötilan pitäminen välillä 50-90°C suotuisasti aggregaattien kasvamista.

Kuten edellä on kuvattu, poistetaan koaguloituneet ja sitten sedimentoituneet liukenemattomat aineet liuoksesta sentrifu-goimalla, suodattamalla tai luonnollisella sedimentaatiolla, jossa liuoksen annetaan seistä lämpötilassa 50-90°C yhdestä neljään tunnin ajan. Näin menetellen kirkastuu uutettua RNA:ta sisältävä liuos.

Tämän jälkeen jäähdytetään muodostunut kirkas liuos lämpötilaan 3-15°C, minkä jälkeen sen pH säädetään noin l,5:ksi suolahappoa lisäämällä, mikä aiheuttaa RNA:n saostumisen.

Tämä saostuma otetaan talteen ja liuotetaan natriumhydroksi-dilla neutraloimalla. Näin saatu liuos kuivataan spray-kuivu-rilla tai vastaavilla kuivureilla, jolloin saadaan RNA:ta, jonka puhtaus on suuri ja saanto korkea.

Voidaan katsoa, että RNA:ta, jolla on suuri puhtaus, voidaan jatkuvasti saada korkealla saannolla tämän keksinnön mukaan seuraavalla perusteella.

Osa RNA:s ta, joka on uutettu kuumennetulla suolaliuoksella hiivasta, jota on kasvatettu kasvualustassa, jossa ei ole lignosulfonaattia, muodostaa kompleksin proteiinin kanssa. Tälle kompleksille on ominaista, ettei se saostu happoa lisäämällä. Kun suolahappoa lisätään RNA:ta sisältävään liuokseen, ei proteiinin kanssa kompleksin muodostanut RNA saostu. Tämä voi olla syy RNA:n saannon putoamiseen tavanomaisten menetel-: : : mien mukaan toimittaessa.

Tämän keksinnön mukaisesti, päinvastaisesta, suurin osa RNA-proteiini-kompleksista, jota yllä kuvailtiin, erotetaan ensin - RNA:ksi ja hajonneeksi proteiiniksi käsittelemällä liuosta proteaasilla. Niin ollen, kun koaguloivaa ainetta, muodostuen 6 85385 natriumpolyakrylaaLista ja vesiliukoisesta metallisuolasta, lisätään liuokseen seuraavassa vaiheessa, liukenemattomat aineet, kuten liuoksen proteiini, poistetaan tehokkaasti liuoksesta koagulaation ja sedimentaation kautta, ilman RNA:n tappioita. Sen tähden, lisättäessä suolahappoa näin saatuun kirkkaaseen liuokseen sen saattamiseksi happamaksi, sekä RNA, joka alunperin oli vapaana, että kompleksista vapautettu RNA, voidaan ottaa talteen ilman tappiota. Tästä syystä, tämän keksinnön mukaisesti, voidaan jatkuvasti saada korkealla saannolla RNA:ta, jolla on suuri puhtaus.

Myöskin liuoksista, jotka sisältävät RNA:ta, joka on eristetty hiivasta, jota kasvatetaan sokerin assimilaatioon perustuen sulfiittijäteliemessä, jossa on lignosulfonaatLia, voidaan joissakin tapauksissa saada RNA:ta puhtaampana ja paremmalla saannolla käyttämällä proteaasia yhdessä koaguloivan aineen kanssa. Vaikutus ei kuitenkaan tässä tapauksessa ole niin huomattava kuin liuoksessa, jossa on RNA:ta, joka on uutettu hiivasta, jota on kasvatettu liemessä, jossa ei ole lignosul-fonaattia.

Seuraavat esimerkit kuvaavat tämän keksinnön mukaisia yksityiskohtia.

Esimerkki 1

Saccharomyces cerevisiae, viljeltynä melassissa, erotettiin sentrifugoimalla ja pestiin, jolloin saatiin 1 kg:n hiiva-kakku. Tämä kakku suspendoitiin 3 l:aan vettä, ja 150 g nat-riumkloridia lisättiin uuttamista varten. Näin saatua liuosta kuumennettiin lämpötilassa 95°C neljän tunnin ajan, jossa yhteydessä RNA ekstrahoitui. Seuraavaksi poistettiin hiiva liuoksesta sentrifugoimalla. Erotettu hiiva pestiin 800 ml:11a vettä. Lisäämällä hiivan pesuvesi liuokseen, josta hiiva erotettiin, saatiin 3,8 1 liuosta, jossa oli uutettua RNA:ta.

Tämä liuos jaettiin kahteen yhtä suureen osaan.

Toisen osan yllä kuvatuista jaetuista liuoksista, jonka tila-

II

7 85385 vuus oli 1,9 1, pH säädettiin 6:ksi natriumhydroksidilla. Tämän jälkeen liuokseen lisättiin papaiinia (proteaasi) noin 300 ppm, minkä jälkeen liuosta pidettiin sekoitettuna lämpötilassa 40°C kuuden tunnin ajan. Tämän jälkeen 70°C:ksi kuumennettuun liuokseen lisättiin 200 ppm ferrikloridia. Liuosta sekoitettiin ja siihen lisättiin vielä 40 ppm nat-riumpolyakrylaattia, minkä seurauksena liuoksessa olleet liukenemattomat aineet koaguloituivat ja sedimentoituivat. Sen jälkeen kun koaguloitunut liete oli poistettu liuoksesta suodattamalla, ja syntynyt kirkas, RNArta sisältävä liuos oli jäähdytetty 5°C:n lämpötilaan, säädettiin kirkkaan liuoksen pH l,5:ksi suolahapolla. Tästä seurasi RNA:n saostuminen.

Sen jälkeen kun saostunut RNA oli otettu talteen sentrifugoi-malla, suspendoitiin talteen otettu RNA veteen ja liuotettiin säätämällä suspendoidun liuoksen pH arvoon 5,6 natriumhydroksidilla. Tämän jälkeen liuos kuivattiin spraykuivaus-menetelmällä ja näin saatiin 12 g RNA:ta. Liuoksesta saadun RNA:n saanto oli 96 % ja sen puhtaus oli 86,5 %.

Vertailuesimerkki 1 Käyttäen esimerkissä 1 valmistettujen jaettujen liuoserien toista osaa, jonka määrä oli 1,9 1, toistettiin esimerkin 1 mukainen menettely sillä poikkeuksella, ettei papaiinia lisätty liuokseen, jolloin saatiin 10,5 g RNA:ta. Liuoksesta saadun RNA:n saanto oli 84 % ja sen puhtaus oli 76 %.

Esimerkki 2

Candida utilis, viljeltynä glukoosilla, separoitiin sentrifu-goimalla ja pestiin, jolloin saatiin 2 kg:n hiivakakku.

Tämä kakku suspendoitiin 6 l:aan vettä, ja siihen lisättiin 300 g natriumkloridia uuttamista varten. Näin saatua liuosta kuumennettiin lämpötilassa 95°C neljän tunnin ajan, missä yhteydessä RNA ekstrahoitui. Tämän jälkeen hiiva poistettiin ; liuoksesta sentrifugoimalla. Erotettu hiiva pestiin 1,6 1:11a vettä. Lisäämällä hiivan pesuvesi liuokseen, josta hiiva erotettiin, saatiin 7,6 1 liuosta, jossa oli uutettua RNA:ta. Tämä liuos jaettiin kahteen yhtäsuureen osaan.

s 85385

Toisen osan yllä kuvatuista jaetuista liuoksista, jonka tilavuus oli 3,8 1, pH säädettiin arvoon 6 natriumhydroksidilla. Tämän jälkeen liuokseen lisättiin 300 ppm Daiwa Kasei Co.

Ltd.:n toimittamaa PROTIN PC-10 (proteaasi) ja sitten liuosta pidettiin sekoitettuna 75°C:n lämpötilassa kuuden tunnin ajan. Seuraavaksi liuokseen lisättiin 150 ppm ferrikloridia. Liuosta sekoitettiin ja siihen lisättiin vielä 30 ppm nat-riumpolyakrylaattia, minkä seurauksena liuoksessa olleet liukenemattomat aineet koaguloituivat ja sedimentoituivat. Sen jälkeen kun koaguloitunut liete oli poistettu liuoksesta suodattamalla, ja syntynyt kirkas RNA:ta sisältävä liuos oli jäähdytetty 5°C:n lämpötilaan, säädettiin kirkkaan liuoksen pH l,5:ksi suolahapolla. Tästä seurasi RNA:n saostuminen.

Sen jälkeen kun saostunut RNA oli otettu talteen sentrifu-goimalla, suspendoitiin talteen otettu RNA veteen ja liuotettiin säätämällä suspendoitun liuoksen pH arvoon 5,6 natriumhydroksidilla. Tämän jälkeen liuos kuivattiin spraykuivausmene-telmällä ja näin saatiin 24,1 g RNA:ta. Liuoksesta saadun RNA:n saanto oli 96,4 %, ja sen puhtaus oli 87 %.

Vertailuesimerkki 2 Käyttäen esimerkissä 2 valmistettujen liuoserien toista osaa, jonka määrä oli 3,8 1, toistettiin esimerkin 2 mukainen menettely sillä poikkeuksella, että liuos jäähdytettiin lämpötilaan 5°C ilman, että lisättiin ferrikloridia ja natriumpolyakrylaat-tia, jolloin saatiin 22,4 g RNA:ta. Liuoksesta saadun RNA:n saanto oli 89,6 % ja sen puhtaus oli 78 %.

Kuten edellä on kuvattu, tämän keksinnön mukaisesti, voidaan liukenemattomat ainekset tehokkaasti poistaa lisäämällä - liuokseen vuorotellen ensin proteaasia ja sitten koaguloivaa ainetta, jossa on natriumpolyakrylaattia jne., näissä erityisolosuhteissa, jolloin RNA:ta, jolla on suuri puhtaus, voidaan jatkuvasti tuottaa korkealla saannolla ilman tappioita.

li

Claims (1)

1. 9 85385 Patenttivaatimus Menetelmä ribonukleiinihapon tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa a) lisätään 50-1000 ppm proteaasia liuokseen, jossa on hiivasta kuumennetulla suolaliuoksella uutettua ribonukleiinihappoa, ja pidetään syntyneen liuoksen lämpötila välillä 30-80°C 1-8 tunnin ajan, b) säädetään hiivasta uutettua ribonukleiinihappoa sisältävän liuoksen lämpötila välille 50-90°C, lisätään siihen koagulointlainetta, joka käsittää 5-100 ppm natriumpolyakry-laattia ja 40-500 ppm vesiliukoista metallisuolaa valikoituna ryhmästä, jossa on ferrisuoloja ja alumiinisuoloja, mainitun liuoksen liukenemattoman aineen poistamiseksi koaguloimalla ja sedimentoimalla, ja lisätään sen jälkeen happoa mainittuun liuokseen, joka oli kirkastettu poistamalla liukenematon aine, liuoksen saattamiseksi happamaksi, ja eristetään sitten saadusta liuoksesta ribonukleiinihappo sedimentoimalla, tunnettu siitä, että ensin suoritetaan edellä olevassa kohdassa a) esitetyt vaiheet ja tämän jälkeen kohdasta a) saadulle, ribonukleiinihappoa sisältävälle liuokselle suoritetaan edellä olevassa kohdassa b) esitetyt vaiheet, jolloin saadaan hyvin puhdasta ribonukleiinihappoa hyvällä saannolla. Förfarande för producering av ribonukleinsyra, vilket förfa-rande innefattar stegen där man a) tillsätter 50-1000 ppm av ett proteas i en lösning inne-hällande ribonukleinsyra som extraherats frän jäst med en upphettad saltlösning och häller den erhälinä lösningen . . vid en temperatur mellan 30 och 80°C under en tid av 1-8 timmar, b) inställer temperaturen hos en lösning innehällande ribonukleinsyra som extraherats frän jäst tili mellan 50 och 90eC, tillsätter däri ett koaguleringsmedel som innefattar 5-100 ppm natriumpolyakrylat och 40-500 ppm av ett vatten-lösligt metallsalt valt ur gruppen som bestär av ferrisalter 10 8 5385 och aluminiumsalter för avlägsnande av i nämnda lösning ingäende olösligt material genom koagulering och sedimente-ring, och tillsätter därefter en syra i nämnda lösning, som gjorts klarare genom avlägsnande av det olösliga mate-rialet, för ansyrning av lösningen, och isolerar sedan ribonukleinsyran ur den erhällna lösningen genom sedimente-ring, kännetecknat av att stegen under punkt a) ovan utföres först och därefter utsättes den under punkt a) erhällna lösningen som innehäller ribonukleinsyra för stegen under punkt b) ovan, varvid man erhäller ribonukleinsyra med hög renhet i högt utbyte. li