JPH04158796A - ヒアルロン酸ナトリウム水溶液の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒアルロン酸ナトリウムの発酵培養液から、
高純度のヒアルロン酸ナトリウムの水溶液を直接製造す
る方法に関するものである。

（従来の技術） ヒアルロン酸は、関節、硝子体、側帯、軟骨、皮膚、鳥
類のとさか等の結合組織中にその構成成分として存在し
、Ｍｌ織の柔軟性、構造維持、細胞の代謝調節等に重要
な機能を果たしている。またヒアルロン酸ナトリウムは
、高分子物質であり、その溶液は強い粘弾性を持ち、保
水作用を有するところから、化粧品原料として広く使用
されるはか、眼科治療薬、目薬、関節症治療薬としての
用途がある。

かかる用途に用いられるヒアルロン酸ナトリウムは高分
子量でかつ高純度のものであることが要求される。

ヒアルロン酸ナトリウムは工業的にはにわとりのとさか
からの抽出法か、或いはヒアルロン酸を生産する能力を
持つ微生物を培地に培養して製造する方法（発酵法）が
行われている。

従来、高純度のヒアルロン酸ナトリウムの水溶液は、抽
出法又は発酵法により得られたヒアルロン酸ナトリウム
含有液を４級アンモニウム塩による沈澱形成、再溶解、
プロテアーゼ処理、−活性炭処理、アルコール添加によ
るヒアルロン酸ナトリウム析出（晶析）、分離、乾燥等
の工程を経て、−旦ヒアルロン酸ナトリウム粉末を作り
、それを再溶解する方法により製造されていた。

（発明が解決しようとする課Ｂ） これらの方法では、培養液を精製した後に、エタノール
等の沈澱側を添加してヒアルロン酸ナトリウムを一旦沈
澱させて粉末状ヒアルロン酸ナトリウムを製造し、これ
を再溶解して高純度のヒアルロン酸ナトリウムの水溶液
とする面倒な工程が必要であった。

今まではヒアルロン酸の発酵培養液から純度の高いヒア
ルロン酸ナトリウム水溶液を直接製造することは行われ
ていなかった。

本発明は、高純度のヒアルロン酸ナトリウム水溶液を得
るために、前記のような面倒な方法を採ることなく、直
接、発酵培養液から純度の高いヒアルロン酸ナトリウム
の水溶液を製造する方法を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） すなわち、ヒアルロン酸ナトリウムの発酵培養液を活性
炭処理し、処理液を濾過後、限外濾過を行うことにより
、化粧品原料として使用できる高純度のヒアルロン酸ナ
トリウム水溶液を製造することを特徴とする。

本発明にいう「純度が高い」とは、次のことを意味して
いる。ヒアルロン酸ナトリウム水溶液を凍結乾燥した時
の凍結乾燥物に対し、ヒアルロン酸ナトリウムを８５重
蓋％以上含有し、蒸発残留物はヒアルロン酸ナトリウム
量に対し、１００重量％以上１３０重量％以内、かつ蛋
白質はヒアルロン酸ナトリウム量に対し０．１重量％以
下の純度である。

本発明に用いるヒアルロン酸ナトリウムは、ヒアルロン
酸産生能を有する微生物を栄養培地に培養した培養液か
ら得ることが出来る。ヒアルロン酸を得る′為に本発明
に使用する微生物はヒアルロン酸を菌体外に分泌する菌
株であればいずれも使用可能であるが、ストレプトコツ
カス属の菌種が良い０例えばストレプトコッカス・ピオ
ゲネス、ストレプトコンカス・エクイ、ストレプトコア
カス・エクイシミリス、ストレプトコアカス・ディスガ
ラクチイエ、ストレプトコアカス・ズーエビデミクス等
があげられる。

本発明に用いる培地としては、ヒアルロン酸生産菌を培
養するのに通常用いられる培地を用いればよく、例えば
ブドウ糖２．０〜３．０％、酵母エキス０．５％、リン
酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チ
オ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩
０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバ
ルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％、消泡剤
０．５％を含む成分でｐＨ６，０〜８，５の培養液を用
いる事が出来る（但し％はいずれも重量をｇ、容量を〃
とした重量／容量％をあられす）。

培養は振盪培養、通気培養等の好気的条件下で行う。培
養温度は２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３５℃の
温度で、ｐＨは６．５〜８．０好ましくは７．０に調整
して行う。培養は通常１〜３日間行い、ヒアルロン酸を
培地に生成蓄積させる。培養終了液は培地残存成分と発
酵過程で生成した高分子成分、低分子成分、色素類と菌
体及びヒアルロン酸の混合物である。

活性炭処理でヒアルロン酸以外の高分子成分や色素類及
び低分子成分の一部を吸着・除去する。

特に高分子成分としては、アレルギー反応の原因となる
蛋白質の除去を十分に行う必要がある。菌体は活性炭処
理後の活性炭を濾過除去する際に一緒に除去される。

活性炭を用いて、高分子成分、特に蛋白質を吸着・除去
する条件について本発明者等は鋭意検討を行った結果、
０．２Ｍ以上の食塩の共存下で活性炭処理を行うことに
より、はぼ完全に蛋白質を咬着・除去出来ることを見出
した。活性炭処理時の食塩濃度と、得られたヒアルロン
酸ナトリウム当りの蛋白質含量との関係を次表に示す。

表１ この結果から判るように、活性炭処理を行うときは、０
．２Ｍ以上、好ましくは０．３〜０．４Ｍの食塩の共存
下で活性炭処理を行うことが必要である。

活性炭処理した濾過液は限外濾過することにより、培地
由来もしくは発酵過程で生成し活性炭処理で残存する低
分子成分及び活性炭処理時に添加した食塩を除去するこ
とができる。

発酵培養液中のヒアルロン酸ナトリウムは通常７０〜８
０万以上の分子量を持つ。他方、発酵原料として用いた
ブドウ糖やリン酸塩類等或いは発酵中に生成した有機酸
の塩類の分子量は通常５千以下である。

従って、分画分子量６千〜５万の限外濾過膜を用いて限
外濾過を行うと分子量がこの範囲以下の物質は除去する
ことができる。ただ、１回の限外濾過操作だけでは通常
十分に低分子成分を除去することはできないので、精製
水を間欠的或いは連続的に加えて繰り返し限外濾過操作
を行う必要がある。低分子成分及び食塩の除去とともに
電気伝導度は低下するので、電気伝導度を測定すること
で精製の進み具合を判断することが出来る。例えば、ヒ
アルロン酸ナトリウムの発酵培養液の活性炭処理濾過液
に精製水を加え、ミリボア製ミニタン（分画分子量３万
）にて限外濾過操作を行う時、電気伝導度とヒアルロン
酸ナトリウム純度及び蒸発残留物との関係は次の表２の
様な結果が得られる。該電気伝導度の値はヒアルロン酸
ナトリウム濃度により変わるため、本発明にあっては、
該電気伝導度の値はすべてヒアルロン酸ナトリウム濃度
が０．２重量％（２５℃）のときの値で示した。

表２ ＊１　凍結乾燥物当たりのヒアルロン酸ナトリウム純度 ＊２　ヒアルロン酸ナトリウム１％に換算した値この結
果から、純度が高いヒアルロン酸ナトリウム溶液を製造
するには、限外濾過処理を電気伝導度が０．４ｍＳ／ａ
ｍ以下になるまで行うことが必要である。

また、本発明の製造方法は限外濾過処理を、活性炭処理
し該活性炭を分離除去した後に行うか、もしくは限外濾
過、活性炭処理、活性炭分離除去ついで限外濾過処理を
行うものである。この場合には１回目の限外濾過処理を
行う液としては発酵培養液の除菌濾過液を使用すること
になる。活性炭処理の前にも限外濾過処理を行うことで
、そうしない場合に比べてより少量の活性炭で同様の精
製効果を得ることが出来る。

本発明により、ヒアルロン酸ナトリウムの発酵培養液か
ら純度の高いヒアルロン酸ナトリウム溶液を直接製造す
ることが出来るが、更にこれを使用目的に応じ、最終濾
過や濃縮器による濃縮を常法により行っても良い。

（発明の効果） 本発明により、高純度のヒアルロン酸ナトリウムの水溶
液を、発酵培養液から直接製造することが出来る。従来
の面倒な方法を簡便にすることができ、コストを引き下
げ、しかも化粧原料や薬剤として使用することが出来る
高純度の製品を得ることが可能になった。

（実施例） 以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は
これに限定されるわけではない。

実施例１ ヒアルロン酸ナトリウムの発酵培養液３００ｉを３倍に
希釈し、食塩を添加し溶解して食塩濃度を０．３Ｍに調
整した。これに活性炭（式日薬品工業製、白すギＡ−５
０Ｗ、５０重量％含水晶）６０ｇを添加、１時間撹拌し
て活性炭を濾過除去した。この時の電気伝導度は２２．
Ｏｍｓ／ａｍであった。この濾過液を分画分子量３万の
限外濾過膜（日本ミリポア製、ミニタン）で精製水を加
えながら限外濾過を行い、電気伝導度が０．２４　ｔｍ
ｓ／ｃｍになるまで処理した。この処理液のヒアルロン
酸ナトリウム当たりの蛋白質は０．０６重量％、蒸発残
留物はヒアルロン酸ナトリウムの１１５重量％、純度は
凍結乾燥勘当たり９０．４重量％であり、化粧品用とし
て通した純度の高いヒアルロン酸ナトリウム水溶液が得
られた。

比較例１ 実施例Ｉと同じ発酵培養液を用い、活性炭を添加しない
以外は実施例１と同様に行い、電気伝導度が０．３０　
ｌｌｓ／ａｍになるまで限外濾過処理を行った。

得られた処理液のヒアルロン酸ナトリウム当たりの蛋白
質は２．７４重量％、蒸発残留物はヒアルロン酸ナトリ
ウムの１２５重量％、純度は凍結乾燥勘当たり８５．５
重量％であり、蛋白質の除去が不十分であった。

比較例２ 実施例１と同じ発酵培養液を用い、食塩を添加しない以
外は実施例１と同様に行い、電気伝導度が０．２０ｍ５
／ａｍになるまで限外濾過処理を行った。

得られた処理液のヒアルロン酸ナトリウム当たりの蛋白
質は１．１２重量％、蒸発残留物はヒアルロン酸ナトリ
ウムの１２０重量％、純度は凍結乾燥勘当たり８６．３
重量％であり、蛋白質の除去が不十分であった。

実施例２ ヒアルロン酸ナトリウムの発酵培養液３ｏｏＭｌを３倍
希釈し、食塩を添加溶解して食塩濃度を０．４Ｍに調整
した。この時の電気伝導度は２８．３　ｍｓ／σであっ
た。これを除菌濾過し、濾過液を分画分子量６０００の
限外濾過膜（脂化成製、限外濾過モジュール、５ＩＰ−
１０１３）で精製水を加えながら限外濾過を行い、電気
伝導度が０．３８１１１３／ＣＪＩになるまで処理した
。この処理液に食塩を０．４Ｍになるように添加溶解し
た後、活性炭（二相化学製、タイコ−８，５０％含水品
）３０ｇを添加、１時間撹拌して活性炭を濾過除去した
。

活性炭濾過液を上記と同じ限外濾過膜で精製水を加えな
がら限外濾過を行い、電気伝導度が０．２０−５／ｃＩ
１１になるまで処理した。

得られた０、２％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液の蛋白
質は、ヒアルロン酸ナトリウム当たり０．０４重量％、
蒸発残留物はヒアルロン酸ナトリウムの１１４重量％、
純度は凍結乾燥勘当たり９２．２重量％であった。この
０．２％水溶液を上記と同じ限外濾過膜で濃縮すること
により１％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液が容易に作製
できた。

比較例３ 実施例２と同じ発酵培養液を用い、２回目の限外濾過処
理を電気伝導度が３．６ｍＳ／ｃａｎで停止する以外は
実施例２と同様に行った。

得られた０、２％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液の蛋白
質は、ヒアルロン酸ナトリウム当たり０．０９重量％、
蒸発残留物はヒアルロン酸ナトリウムの３２０重量％、
純度は凍結乾燥勘当たり３６．７重量％であり、蒸発残
留物が多く純度が低かった。

手続補正書 平成３年１０月１１日

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒアルロン酸ナトリウムの発酵培養液から、純度
   の高いヒアルロン酸ナトリウム水溶液を製造する工程に
   おいて、活性炭処理ついで限外濾過処理、もしくは限外
   濾過、活性炭処理ついで限外濾過処理の工程を実施する
   ことを特徴とする、純度の高いヒアルロン酸ナトリウム
   水溶液の製造法。
2. （２）活性炭処理を塩化ナトリウム濃度０．２Ｍ以上の
   条件で行う請求項１記載の製造法。
3. （３）限外濾過処理を分画分子量１０万以下の限外濾過
   膜を用い、処理液の電気伝導度が０．４ｍＳ／ｃｍ以下
   になるまで透析を行った後に濃縮する請求項１記載の製
   造法。
4. （４）ヒアルロン酸ナトリウムの純度がヒアルロン酸ナ
   トリウム水溶液を凍結乾燥した時の凍結乾燥物に対し、
   ヒアルロン酸ナトリウム８５重量％以上、ヒアルロン酸
   ナトリウム量に対し蒸発残留物が１００重量％以上１３
   ０重量％以内、かつ蛋白質が０．１重量％以下である請
   求項１記載の製造法。
5. （５）ヒアルロン酸ナトリウム水溶液がヒアルロン酸ナ
   トリウムの１重量／容量（ｇ／ｄｌ）％水溶液である請
   求項１記載の製造法。