JPS6279790A - 改質されたヒアルロン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、改質されたヒアルロン酸又はそノ塩つまり分
子量分布が狭く、任意の平均分子量に調整された均質な
ヒアルロン酸又はその塩の製造法ｔこ関する。

従来の技術 ヒアルロン酸は、生物由来のムコ多糖である。

ヒアルロン酸の一般構造式は、メルク、インデックス７
０版（Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ、　／　Ｏｔｈ）編、乙
ざざ頁ｔこ例示されている。ヒアルロン酸は、また保湿
性作用にすぐれ、皮膚化粧料や外用塗布剤の処方中に応
用されるに至り、注目されている。ヒアルロン酸の応用
は、この他やこ、医薬治療分野ｔこおいて点眼薬剤をは
じめ、動脈硬化などの血液又は血清疾患、関節炎、腎炎
などに対する応用が考えられているものである。

また、ヒアルロン酸又はその塩は、少なくとも３つの起
源から得られる。それは、人間の腰の緒、鶏冠等の動物
組織及び群Ａ及びＣのストレプトコッカス細菌等の微生
物を挙げることが出来、従来のヒアルロン酸の製造法と
して（１）動物組織を細断し、アセトン等の有機溶媒を
用いて脱脂後、プロテアーゼ処理を行ったのち、溶出、
分離、精製する方法〔ジャーナルオプパイオロジカル　
ケミヌ　ト　リ　−　（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　
　）　　　／　　ｇ　　乙　、ｌＩ　　タ　Ｓ〜３／／
、（／り！；　Ｏ）　）　（２）動物組織を細断し、ア
セトン等の有機溶媒を用いて脱脂後、大量の水又は塩溶
液を用いて溶出、分離する方法〔バイオケミカエトバイ
オフイジカアクタ（Ｂ　ｉ　ｏ　ｃ　ｈ　ｅｍ、Ｂ　１
ｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ）　　７３ｇ　　７７〜３０．　（／り６乙）
〕（３）動物組織からヒアルロン酸を分離の工程におい
て、共存しているコンドロイチン硫酸が抽出されないた
めに、温度を３Ｓ〜乙Ｓ℃で、３０〜３００分の条件下
で解凍し、プロテアーゼの反応温度については、３５〜
乙Ｏ℃に限定した方法（特開昭！；２−７１Ｉ３；！；
９’１号公報）（４）鶏冠を、第ｑ級アンモニウム塩０
．０２〜／、０％溶液で加熱処理したのち、プロテアー
ゼを用いて、５０℃でＳ時間の反応後、分取する方法（
特開昭！；！；−７≠７７乙号公報）（５）群人のヒア
ルロン酸産生ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｕｓ）細菌を培養し、ヒフ　７ｔｚ　ａン酸を分離採
取する方法〔アククパソロジカエミクロピオロジカ　ス
カンジナビ力、セクションＢ　（ＡｃＬａ、Ｐａもり、
ｍ１ｃｒｏｂｉｏ１．５ｃａｎｄ、、５ｅｃｔｉｏｎ　
Ｂ）ｇｌｌ、、／６２〜／乙≠、（／り７乙））（６１
３％以上の糖成分を主炭素源とする栄養培地にヒアルロ
ン酸産生ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐむｏｃｏｃｕ
ｓ）細菌を培養し、ヒアルロン酸を分離採取する方法（
特開昭５ｇ−５乙乙デ２号公報）＋７１ＣＯ２増強嫌気
条件下、生育培地でヒアルロン酸産生ストレプトコッカ
ス細菌の液体培養発酵を行い、発酵プロスから細菌細胞
を分離し、プロス残存成分から平均分子量友Ｓ　ＯＯの
ヒアルロン酸を採取する方法（特表昭乙０−３；００３
９７　）等を挙げることが出来る。

発明が解決しようとする問題点 また特開昭Ｓター２／り２０ｑ号公報において、分子量
が７万〜１０万、平均分子量が２万〜ｇ万のヒアルロン
酸および／またはその塩類を水性皮膚化粧料の基剤の中
に配合した化粧料は明らか１こ感触官能効果、４航改善
効果、角質改善効果が認められ分子量および平均分子量
が前記下限値よりも小さいと感触官能効果、荒れ肌改善
効果、角質改善効果がわるくなり、また前記上限値より
も大、官能効果、荒れ肌９＃ｉ果効果、角質改善効果が
低下するので好ましくないと記載されており、またサイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　　２２ｇ、　’Ａ７０３　
１３２４〜７３２ｇ＜／ｑｇ！；）においてヒアルロン
酸の分解物のうち、二糖類がｔないし７５個連結したヒ
アルロン酸塩フラグメントである分画において脈管形成
反応の誘発が認められるが、元のヒアルロン酸塩の高分
子のままや徹底的に分解したものには脈管形成能は認め
られないことが記載されており、ある特定の分子量範囲
を有するヒアルロン酸が、特定の用途及び効果を有する
ことが示唆されている。

しかしながら、従来法により得られるヒアルロン酸から
、任意の平均分子量のヒアルロン酸を得るｔこは、高分
子量（平均分子量７００万〜２００万）のヒアルロン酸
を、化学処理又は分解酵素による加水分解によって得ら
れた分子量分布の広いヒアルロン酸又は市販の広い分子
量分布を有するヒアルロン酸を分画すればよいのである
が、一般的分画法として知られているイオン交換樹脂を
用いたカラムクロマトグラフィーによる方法及びゲルろ
過による方法では、ヒアルロン酸が高粘度性であること
から、収率よく分画することは極めて難しく煩雑であり
、工業的に大量生産を行う方法としては不適当であり、
現在までｔこ任意の平均分子量を工業的に大量生産を行
う方法はなかった。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、上述した従来法の難点を排し、分子量分
布の狭い任意の平均分子量を有する改質されたヒアルロ
ン酸を容易に工業的に大量生産を行う方法について鋭意
検討の結果、通常多糖ｔこエンド型分解酵素を作用させ
ると分子量分布の広がった部分分解された多糖が得られ
ることが知られているが〔バイオテクノロジー　アンド
　バイオエンジニアリング（ＢＩＯＴＥＣＩ（ＮＯＬＯ
ＧＹ　ＡＮＤ　ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＷＧ）　　Ｘ
ＶＩ　Ｉ　　１１３３〜１１３？　Ｃ／り７５）ジョン
　ウィリー　アンド　ソン出版；同　ＸＩＸ　　２／９
〜２３３＜／り７７）〕、まったく意外にも、原料ヒア
ルロン酸又はその塩にエンド型ヒアルロニダーゼを作用
させることやこより、任意の平均分子量を有するヒアル
ロン酸又はその塩を容易ｅこ工業的に大量生産を行うこ
とが出来、エンド型ヒアルロニダーゼを作用させるに従
って分子量分布の範囲が狭くなり、改質されたヒアルロ
ン酸又はその塩が得られることを見出し、本発明を完成
するに至った。

即ち、本発明は、水性媒体中、原料ヒアルロン酸又はそ
の塩にエンド型ヒアルロニダーゼを作用せしめ、改質さ
れたヒアルロン酸又はその塩を採取することを特徴とす
る改質されたヒアルロン酸又はその塩の製造法である。

本発明に用いられる原料ヒアルロン酸は、高分子量ある
いは比較的高分子量のヒアルロン酸例えば、分子量約３
０万以上であれば、市販の鶏冠由来の分子量３０万〜５
０万のヒアルロン酸や、微生物由来の分子量約７００万
以上のヒアルロン酸でもよく、好ましくは、分子量分布
の多極性が見られないものがよく、特に好ましくはヒア
ルロン酸生産微生物を厳密に管理された条件下培養し、
採取することによって得られた比較的均質で高分子量の
ヒアルロン酸を用いればよい。

ヒアルロン酸生産微生物としては、ストレプトコッカヌ
属細菌が挙げられ、ヒアルロン酸の生成について、スト
レプトコッカス・ピオゲネヌ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコツ３１ｍ１　
Ｉｉｓ　）　、ストレプトコッカス・ディヌガラクテイ
ｘ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃ
ｔｉａｅ）　　およびストレプトコッカス・ズーエピデ
ミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｃｏｃｃｕ）　ｚｏｏｅｐｉ
ｄｅｍｉｃｕｓ）　　等の細菌によりヒアルロン酸を生
産する事がすてｔこ知られており、これらのヒアルロン
酸生産株を変異処理等をおこなうが、スクリーニング等
によりヒアルロニダーゼ非生産株であるヒアルロン酸生
産株を取得するか、あるいはヒアルロン酸の小分子への
分解を排除するために熱又は酵素禁止剤のような禁止剤
を用いてヒアルロニダーゼ生産禁止にして使用すること
が出来る。

また厳密に管理された条件下では、例えばヒアルロン酸
生産のために最適の温度、ｐＨ１栄養培地維持するため
に、ヒアルロン酸の産生にともなうｐＨの低下を調整す
ることが必須であるが、これを攪拌器による物理的攪拌
により行うと、培養中にランダムな低分子化が生ずるた
め、窒素ガスあるいは炭酸ガス等のガスによる吹き込み
をしなからｐＨコントロールをし、また適宜、栄養培地
を培養途中、追加添加する等の操作を行ない、分子量１
００万〜／３０万の高分子量の均質なヒアルロン酸を培
養することを示し、このよう１こして培養した後、例え
ば熱処理あるいはトリクロル酢酸等の添加により培養を
停止、その後遠心分離等により菌体及びその他の夾雑物
を除去し、塩析、エタノール等の有機謬謀等ｔこよる分
画あるいは限外ろ過を用いた濃縮、精製をし、必要に応
じて凍結乾燥等により乾燥固化すればよい。

エンド型ヒアルロニダーゼとしては、エンド型のヒアル
ロニダーゼであれば市販のものでよく、例えばストレプ
トマイセス、・ヒアルロティカス由来のヒアルロニダー
ゼあるいはストレプトマイセス・コガネイエンシス由来
のヒアルロニダーゼを挙げることが出来、またストレプ
トコッカス属等の他の微生物由来のヒアルロニダーゼ、
動物組織よりのヒアルロニダーゼもエンド型ヒアルロニ
ダーゼであれば適宜使用しうる。

反応温度は使用するヒアルロニダーゼによっても異なる
が、２０〜１１０℃が好ましく、反応ｐＨは、使用する
ヒアルロニダーゼ至適ｐＨが好ましく、ヒアルロン酸と
ヒアルロニダーゼの量比、反応時間は目的とするヒアル
ロン酸平均分子量に応じて適宜調整する。

反応は、原料ヒアルロン酸をリン酸バッファ等の緩衝液
に、爵解し、エンド型ヒアルロニダーゼを添加反応終了
時間はたとえば分子量分布等を高速液体クロマトグラフ
ィー（以下ＨＰＬＣと略す）で観測していき、必要な平
均分子量なこ分解された所で、トリクロル酢酸等のタン
パク凝集剤、メタノールフエタノーμ等の有機溶媒によ
るヒアルロニダーゼの析出、あるいは加熱処理等、以上
の操作を単独あるいは適宜組み合わせて、ヒアルロン酸
の分解を停止させ、有機溶媒／分画、塩析、透析、限外
ろ過等の通常知られた操作により単離精製することによ
り改質されたヒアルロン酸を単離することが出来る。

改質されたヒアルロン酸とは、分子量分布が狭く、必要
に応じた平均分子量を有するヒアルロン酸であり、具体
的には、たとえばヒアルロン酸生産株であるストレプト
コッカス°エクイを培地に培養し採取した平均分子量約
１００万、ｇＯ％の信頼限界が約３ＳＯ万〜約／２万で
あるヒアルロン酸を原料ヒアルロン酸（第４図にこのＨ
ＰＬＣデータを示す）として使用し、ストレプトマイセ
ス・ヒアルロリテイカス由来のヒアルロニダーゼをｔｏ
分間作用させたものは平均分子量約７０万ざ０％の信頼
限界が約２５万〜３万であ°〕、また４５時間作用させ
たものは平均分子量約２万コ千、ｇＯ％の信頼限界が約
１０万〜約５千であるヒアルロン酸（第１図１ここのＨ
ＰＬＣデータを示ス）、また２５時間作用させたものは
平均分子量約／万３千、ｇＯ％の信頼限界が約５万〜約
３千であるヒアルロン酸（第２図にこのＨＰＬＣデータ
を示す）が得られ、また７５時間作用させたものは平均
分子量約ｇ千１ｇＯ％の信頼限界が約７万〜乙かるよう
に、きわめて均質な分子量分布の狭い、任意の平均分子
量を有する改質されたヒアルロン酸を得ることが出来る
。

以下に、本発明による製造法ｔこついて実施例を基に説
明するが、何らこれら実施例？こ限ったものではない。

例 参考例／　微生物によるヒアルロン酸の製造３０１ジャ
ーファーメンタ−をこ、グルコース２％、ペプトン７５
％、Ｌ、Ｓ、Ｌ、２％の組成の培地２０１を／２０′Ｃ
２０分間加熱殺菌後、但しｌグルコースはオートクレー
ブにより分別殺菌後、無菌的ｔこ前記培地に合一し、／
□ＮＮａＯＨを用いて培地をｐＨ７２に調整した。

アＩ−、カＬ、メ、グルコーヌ／％、イーストエキスθ
Ｓ％、ペプトン／、５％の組成の培地／ｌを用いて、前
培養したストレプトコッカス・エキ（ＡＴＣＣ９！；２
７）を前記培地に全量移植した。培養は培養中窒素ガス
を吹き込むことにより攪拌しながら／　Ｑ　Ｎ　ＮａＯ
Ｈを用いてｐＨを６ｆ　〜７．５に調整し、３７℃、３
日間実施した。

培養終了後、培養液を７００℃、３０分間加熱処理後、
遠心分離？こより菌体及びその他の夾雑物−を除去し、
上澄液にｔｔｏｔのエタノ−ｐを攪拌しながら加え、繊
維状物質が沈澱した。これを炉別後、エタノールで充分
洗浄後、再び水に溶解し、セチルピリジウムクロライド
を加え、生じた沈澱を枦取し、水および０．　／　Ｍ　
ＮａＣ１水溶液にて充分洗浄後ｓ　ｔの０．５　Ｍ　Ｎ
ａＣ１水溶液にてヒアルロン酸を抽出し、その溶液にエ
タノ−ｔＶｌｏｌを加え、生じた繊維状物質を一取し、
この繊維状沈澱物を７５％エタノール水、ついでエタノ
ールで充分洗浄後、真空乾燥して培養液／ｌあたり３０
２のヒアルロン酸を得た。

参考例２ 実施例／−と同様に培養を実施し、培養終了後、実施例
／と同様ｔこ培養液を１００℃、３０分間加熱後、遠心
分離により菌体及びその他の夾雑物を除去し、上澄液を
得た。得られた上澄液を限外ろ過（分子量排除限界／　
３．０００旭化成社製）することにより水および分子量
／　０．　ＯＯＯ以下の培養上澄液に含まれる蛋白質等
の高分子を限外に除去、濃縮した。ｉ！Ｉ縮液Ｓｔに１
０ｔのエタノールを攪拌しつつ加えると繊維状物質が沈
澱した。これを炉別後エタノールで充分洗浄後、再び水
に溶解し、セチルピリジウムクロフィトを加え、生じた
沈澱をＦ取し、水およびＯ，／　Ｍ　ＮａＣｌ水溶液に
て充分洗浄後、１０ｔの０．　！；　Ｍ　ＮａＣｌにて
ヒアルロン酸を抽出し、再び限外ろ過（分子量排除限界
乙、０００＞することにより、水およびセチルピリジウ
ムクロライドを除去、濃縮した。ｉ！Ｉｉｍ液３１にエ
タノ−／Ｉ／１０ｔを加え、生じた繊維状物質を？Ｆ取
し、この繊維状物質を７Ｓ％エタノール水、ついでエタ
ノールで充分洗浄後、真空乾燥して培養液／ｌあたり２
５ｔのヒアルロン酸を得た。

参考例／、２で得られたヒアルロン酸をＨＰＬＣ（高速
液体クロマトグラフィー）を用い、カラム（Ｓｈｏｄｅ
ｘ　ＯＨｐａｋ　Ｂ−ｇ０３）　　に溶出液として０、
　／　Ｍ　ＩＪン酸カリウム水溶液を用い、流量０．３
ｍｌ／分テ２０　ｇ　ｎ　ｍで検出し、それぞれのヒア
ルロン酸について分子量分布を示すチャートを得た（第
５図−参考例／、第６図−参考例２）。両チャートとも
保持時間５ｇ分のピークは食塩のピークと一致し、食塩
ピークであることがわかり、両チャートの比較により限
外ろ過することにより分子量がｙ、ｏｏｏ前後の物質が
完全に除去でき、きわめて均質な平均分子量１００万の
ヒアルロン酸であることがわかった。

実施例／ 参考例−により得られたヒアルロン酸／Ｖを、０、　Ｏ
ｊ　Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨＨＯ２／Ｌに溶解し、ヒア
ルロン酸溶液を調整した。またストレプトマイセヌ・ヒ
アルロリティカスから得らレタヒアｐロニダーゼ（生化
学工業製、１００ＴＲＵ／アンプル）／アンプルを、Ｓ
ゴ前記リン酸緩衝液（ｐＨ乙Ｏ）に溶かし、この溶液２
ｄと前記ヒアルロン酸湿液ｒｏｏｍｔを混合し、３０℃
攪拌下／、ｓ時間反応させた。反応後直ちにトリクロル
酢酸を加工、ヒアルロニダーゼを除去し、エタノールを
加え、生じた繊維状物質を炉板後、この繊維状物質を７
Ｓ％エタノール水、ついでエタノールで充分に洗浄後、
真空乾燥することｔこより改質されたヒアルロン酸０１
５２を得、参考例コと同様にＨＰＬＣにより分子量分布
を調べると、第１図に示すようにきわめて分子量分布の
狭い、均質なヒアルロン酸であり、平均分子量約２万２
千　ｇＯ％の信頼限界約１０万〜約５ｏｏｏのものであ
った実施例２ 参考例２により得られたヒアルロン酸／２づつを、実施
例／と同様な量比でヒアルロニダーゼと反応させ、３０
℃攪拌下、それぞれ２５時間、７５時間、／６時間反応
させることによって実施例／と同様な処理によってそれ
ぞれ０．　／　ｌＩＳ’、０／乙？、０．／３りの改質
されたヒアルロン酸を得た。それぞれのＨＰＬＣは第２
図、第３図、第７図のごとくであり、第１表に示す分子
量分布を有していた。

実施例３ 参考例コで得られたヒアルロン酸／Ｖを０．０２Ｍトリ
ス−リン酸緩衝液＜ｐＨ７，０）／ｌ＋こ溶解し、ヒア
ルロン酸溶液を調整し、牛精巣から得られたヒアルロニ
ダーゼ（シグマ社製！；２ＯＮＦＵｎｉｔｓ／ゴ）を２
ゴと前記ヒアルロン酸溶液２００ｍ／を混合し、実施例
／と同様に反応ｌ処理を行い第２表をこ示す平均分子量
（ＨＰＬＣにより算出）を有する改質されたヒアルロン
酸であった。

第　　２　　表 実施例グ 鶏冠より採取されたヒアルロン酸（東京化成社製）／２
を用い、実施例／と同様におこなったところ、第３表に
示す平均分子量を有する（ＨＰＬＣにより算出）改質さ
れたヒアルロン酸が得ちれた。

第　　３　　表 比較例／ 市販のヒアルロン酸のＨＰＬＣは第７図（トｔンヌブツ
サン社製）第５図（東京化成製）に示すように均質な分
子量分布を示すヒアルロン酸とは冨いがだ（、本発明の
改質されたヒアルロン酸とは分子量分布的に異なったヒ
アルロン酸であった比較例２ 実施例／で用いたヒアルロン酸水溶液１０ｄに１００ｍ
Ｍアスコルビン酸、！；ＯｍＭ硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ，
）　　を各２ゴを加え、３０℃、７２時間反応させ、実
施例／と同様な処理をし、得られたヒアルロン酸をＨＰ
ＬＣにより測定した結果、第り図に示すように明らか１
こ分子量分布の広がったものであり、本発明の改質され
たヒアルロン酸とは分子量分布的１こ異なったヒアルロ
ン酸であった。

発明の効果 本発明は、任意の分子量を有し、なおその分子量分布は
狭く、従来のように必要な分子量のヒアルロン酸又はそ
の塩を極めて煩雑な操作をすることなく、工業的に大量
生産出来る方法を見い出したもので、特定の分子量範囲
を有するヒアルロン酸又はその塩を提供出来るものであ
り、化粧品又は医療用において特定の用途を有する分子
量のヒアルロン酸の製造がきわめてｌ効率よく生産出来
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第１１図は、本発明ｅこよつ製造されたヒ
アルロン酸のＨＰ　ＬＣチャートであり、第５図および
第４図は、微生物により製造された原料ヒアルロン酸の
ＨＰＬＣチャートであり、第７図および第５図は、従来
市販されているヒアルロン酸のＨＰＬＣチャートであり
、第り図は原料ヒアルロン酸を化学的ｔこ分解した時の
ＨＰＬＣチャートである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）水性媒体中、原料ヒアルロン酸又はその塩にエン
   ド型ヒアルロニダーゼを作用せしめ、改質されたヒアル
   ロン酸又はその塩を採取することを特徴とする改質され
   たヒアルロン酸又はその塩の製造法。
2. （２）原料ヒアルロン酸又はその塩が、ヒアルロニダー
   ゼ非生産株あるいはヒアルロニダーゼ生産禁止状態であ
   るヒアルロン酸生産微生物を、窒素ガス及び／又は炭酸
   ガスを吹き込み下均質にｐＨ調整をしながら培養し、得
   られたヒアルロン酸を採取し、必要に応じて限外ろ過を
   する工程を含んでなる製造法により製造されたヒアルロ
   ン酸又はその塩である特許請求の範囲第１項記載の製造
   法。
3. （３）ヒアルロン酸生産微生物がストレプトコッカス属
   に属するヒアルロン酸生産株である特許請求の範囲第２
   項記載の製造法。
4. （４）原料ヒアルロン酸又はその塩が鶏冠より採取され
   たものである特許請求の範囲第１項記載の製造法。
5. （５）エンド型ヒアルロニダーゼがストレプトマイセス
   属に属するヒアルロニダーゼ生産株より生産された酵素
   またはその含有物である特許請求の範囲第１項記載の製
   造法。
6. （６）ストレプトマイセス属に属するヒアルロニダーゼ
   生産株が、ストレプトマイセス・ヒアルロリテイカスで
   ある特許請求の範囲第５項記載の改質されたヒアルロン
   酸又はその塩の製造法。