JP2677553B2 - 連鎖球菌の発酵による高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの製造方法 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本願は、1985年１月18日付で出願された米国特許出願
第692692号の一部継続出願であり、この出願の内容を本
願の参考資料とするものである。 発明の背景 本発明は、連鎖球菌（Streptococcus）属の微生物の
大規模発酵による高分子量ヒアルロン酸のナトリウム塩
の製造方法に係る。 ヒアルロン酸は、50000〜13000000ドルトンの分子量
の線状高分子から構成される天然に存在するグリコサミ
ノグリカンである。ヒアルロン酸は、交互に１−３及び
１−４の結合により結合されたグルクロン酸及びＮ−ア
セチルグルコサミンの繰り返し単位から形成される多糖
である。 ヒアルロン酸は、皮膚や軟骨のような動物の種々の結
合組織中に存在している。臍帯、滑液、硝子体液及びニ
ワトリのトサカのような特定の器官は、ヒアルロン酸を
特に多量に含有している。更に、ヒアルロン酸はＡ型及
びＣ型連鎖球菌のような種々の微生物により産生され
る。 皮膚及び軟骨中におけるヒアルロン酸の役割は、水分
を結合させ、組織の張度及び弾性を保持することにあ
る。関節液中において粘性のヒアルロン酸溶液は、細胞
に保護環境を与える潤滑剤として機能する。ニワトリの
トサカから抽出した超純粋ヒアルロン酸溶液は、例えば
E.A.Balazs名義の米国特許第4141973号（1979年）に開
示されているように、数年来眼科手術用の支持媒体とし
て使用されている。同様の製剤が競争馬の膝関節炎症の
治療に有効であるとして報告されている。ヒアルロン酸
の別の用途はその親水性の高さを利用するものであり、
例えばE.Balazs名義の米国特許第4303676号（1981年）
に開示されているように、化粧品用としてモイスチャー
ローションの理想的な成分を構成する。 ヒアルロン酸は、上述のように微生物培養液を含む各
種の生物ソースから単離されている。ヒアルロン酸の単
離及び特徴付けについては、Meyer他,J.Biol.Chem.107,
629（1934）、J.Biol.Chem.114,689（1936）に記載され
ており、最近ではMethods in Enzymol.28,73（1972）中
で考察されている。ヒアルロン酸の構造は、Weissman
他,J.Am.Chem.Soc.76,1753（1954）及びMeyer,Fed.Pro
c.17,1075（1958）により解明されている。 連鎖球菌によるヒアルロン酸の製造は、Forrest他,J.
Biol.Chem.118,61（1937）により最初に示され、その
後、多くの研究者によってはさらに研究されており、例
えばRoseman他,J.Biol.Chem.203,213（1953）、Pierce
and White,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.87,50（1954）、G.
H.Warrenの米国特許第2975104号（1961）及びSunghara
他,J.Biol.Chem.254,6252（1979）が、動物及び微生物
ソースに由来するヒアルロン酸を示している。Ａ型連鎖
球菌のバッチ式発酵及びヒアルロン酸の単離に関する小
規模から中規模の方法については、Thonard他,J.Biol.C
hem.239,726（1964）、Holmstrom and Ricica,Appl.Mic
robio.15,1409（1967）、Kjems and Lebech,Acta Path.
Microbiol.Scand.84,162（1976）中に発表されている。
これらの方法には病原性細菌の嫌気的発酵が含まれてお
り、700000以下の分子量のヒアルロン酸が0.4〜1g/の
収率で製造されている。 別の方法としては、1983年４月４日付で公開された発
明者Akasaka H他による日本特許公開第58−056692号に
開示されているように、ヒアルロン酸を製造するために
連鎖球菌の好気的発酵を使用する方法がある。その他の
刊行物として、E.A.Balazs名義の1979年２月27日付米国
特許第4141973号は、動物結合組織のようなソースから
ヒアルロン酸を製造及び精製する方法について記載して
いる。しかしながら、従来技術中に開示されているヒア
ルロン酸の製造及び精製方法では、2.0×10⁶ドルトンを
越える平均分子量のヒアルロン酸を製造することができ
ない。これは主に、ヒアルロン酸が剪断により分解し易
いことあるいはヒアルロン酸組成中に存在している不純
物又は金属イオンによる触媒反応で酸化し易いという事
実に起因している。 本明細書中に記載する新規方法は、嫌気的発酵の場合
約2g/、好気的発酵の場合約４〜6g/の収率で約１×
10⁶〜約4.0×10⁶ドルトンの分子量のヒアルロン酸を製
造することができる。これは、ヒアルロン酸の高度な産
生者であり且つ溶血素マイナス即ち病原性の殆どないＣ
型Streptococcus zooepidemicus,HA−116,ATCC39920の
突然変異株を製造することにより可能になった。S. zooe
pidemicus,HA−116,ATCC39920の好気的発酵及びそれに
続くヒアルロン酸塩の精製の結果、3.5×10⁶ドルトンを
越える平均分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムのバ
ッチが得られた。本発明は、このような高分子量のヒア
ルロン酸ナトリウムを細菌発酵により製造及び精製した
最初の方法である。 本発明の方法を使用することにより、非発熱性及び非
刺激性のヒアルロン酸が得られる。本発明の範囲内の別
の方法を使用すると、臨床用に好適な超純粋非炎症性ヒ
アルロン酸を製造することができる。 発明の要約 本発明は、Streptococcus zooepidemicus種,HA−11
6,ATCC39920の微生物、及び該微生物に由来し、発酵に
よりヒアルロン酸ナトリウムを産生して周囲培地中にこ
れを分泌することの可能な突然変異体に係る。 本発明はまた、好適な栄養培地中で好適な条件下で連
鎖球菌属微生物を強い攪拌下に増殖させることから成る
ヒアルロン酸ナトリウムの獲得方法に係る。培地は、炭
素源として約0.2〜10g/の実質的に一定濃度の糖成分
を含んでおり、約6.5〜7.5の範囲の実質的に一定のpHを
有しており、更に0.05g/を越える実質的に一定のマグ
ネシウムイオン濃度を有している。微生物はヒアルロン
酸ナトリウムを産生し、培地中にこれを分泌する。ヒア
ルロン酸ナトリウムはその後、培地から回収される。 ヒアルロン酸ナトリウムは、微生物及び培地中の不溶
性の他の物質を除去するべく微生物を含んでいる培地を
処理する段階と、例えば有機溶媒により培地からヒアル
ロン酸ナトリウムを沈降させる段階と、沈降物を回収す
る段階とから成る方法により培地から回収される。次に
沈降物は粉砕及び乾燥され得る。以上の方法により、発
熱性及び炎症性のないことを特徴とするヒアルロン酸ナ
トリウム組成物を製造することができる。 本発明はまた、大量のヒアルロン酸を産生し且つ溶血
活性をもたない微生物を選択するための方法に係る。該
方法は、突然変異体を形成するべくヒアルロン酸産生微
生物を好適な突然変異誘発物質で処理する段階と、好適
な固形培地上で突然変異体を増殖させる段階とを含んで
いる。ムコイドコロニーを同定し、回収する。回収した
コロニーを血液寒天培地上で増殖させ、ヘモグロビンを
溶解させないコロニーを選択する。 発明の詳細な説明 本発明は、連鎖球菌属の微生物、例えば、S. zooepide
micus又はS. equisimilisから高分子量のヒアルロン酸ナ
トリウムを獲得する方法に係る。該方法は、好適な条件
下で好適な栄養培地中で連鎖球菌属の微生物を強い攪拌
下に増殖させる段階を含んでいる。培地は、炭素源とし
て約0.2〜10g/の実質的に一定濃度の糖成分で含んで
おり、約0.05g/を越える実質的に一定のマグネシウム
イオン濃度を有しており、約6.5〜7.5の実質的に一定の
pHを有している。微生物は、ヒアルロン酸ナトリウムを
産生しこれを培地中に分泌する。ヒアルロン酸ナトリウ
ムはその後、培地から回収される。 本発明の実施にあたっては、ヒアルロン酸を産生する
任意の連鎖球菌種を使用することができ、例えばS. zooe
pidemicus、S. equisimilis又はS. pyogenesを使用するこ
とができる。好適な種はS. zooepidemicusであり、その
菌株としては、大量のヒアルロン酸を産生する微生物を
獲得するために本発明の方法に従って製造される突然変
異株であるS. zooepidemicus HA−116 ATCC39920が挙げ
られる。 ヒアルロン酸ナトリウムは、好気性又は嫌気性条件下
で連鎖球菌を増殖させることにより得られる。本発明の
一好適具体例において好適な増殖条件は、毎分培地容量
当たり空気約0.5容量（vvm）を越える速度で培地を曝気
することを含む。一般には１〜2vvmの曝気速度が使用さ
れるが、曝気速度は高いほうが望ましい。この好適具体
例において、好適な栄養培地は１当たり約10〜30gの
カゼイン加水分解物と、約５〜15gの酵母エキスと、約2
gのNaClと、約0.5gを越えるMgSO₄・7H₂Oと、約2.5gのK₂
HPO₄と、約２〜15gのグルコースとを含んでいる。 ヒアルロン酸ナトリウムは、例えば過又は遠心分離
により微生物及び培地中の不溶性の他の物質を除去する
べく微生物を含んでいる培地を処理することにより回収
され得る。次にヒアルロン酸ナトリウムは培地から沈降
及び回収される。沈降物はその後均等な寸法の粒子に粉
砕及び乾燥され得る。 本発明の一具体例においてヒアルロン酸ナトリウム
は、微生物を含んでいる培地のpHを約5.0のpHに調整
し、次に好適な時間約80℃〜95℃の温度に培地を加熱
し、例えば20分間約90℃の温度に加熱するか又は好まし
くは40分間80℃に加熱することにより回収される。加熱
後、微生物及び他の不溶性物質を除去する。好適な除去
方法は、ケイソウ土のような過助剤を使用した過に
より行なうものである。 イソプロパノールのような第１の有機溶媒を培地に加
えることにより、培地又は液からヒアルロン酸ナトリ
ウムを沈降させることができる。沈降物を３％水性酢酸
ナトリウムに再溶解させ、次いでエタノールのような第
２の有機溶媒で沈降させる。第２の沈降物を３％水性酢
酸ナトリウムに再溶解させ、活性炭を加えて懸濁液を形
成する。懸濁液を過し、例えばアセトンのような第３
の有機溶媒を加えてヒアルロン酸ナトリウムの沈降物を
形成する。第１、第２及び第３の有機溶媒は、夫々イソ
プロパノール、エタノール又はアセトンであり得る。あ
るいは各段階で同一の有機溶媒を使用することによりヒ
アルロン酸塩を沈降させてもよく、例えば３つの沈降段
階のいずれにおいてもイソプロパノールを使用すること
により培地からヒアルロン酸ナトリウムを沈降させても
よい。 本発明の別の具体例では、微生物を除去するために培
地を処理する段階に先立ち、微生物を含んでいる培地の
pHを約7.0に調整し、培地を約４℃〜15℃、好ましくは
約４℃〜20℃の温度に冷却する。次に、３％水性酢酸ナ
トリウムを使用して、その後の処理を可能とするのに必
要な程度、例えば３倍〜４倍に培地を希釈する。 本発明の一具体例では、ヒアルロン酸ナトリウム沈降
物を0.15M水性NaClに再溶解させ、塩化セチルピリジニ
ウムを添加してヒアルロン酸のセチル−ピリジニウム塩
を形成する。セチルピリジニウム塩を水性NaCl及び15％
エタノール、例えば少なくとも1MのNaClに溶解させ、例
えばヒアルロン酸ナトリウムを沈降させるエタノールの
ような有機溶媒を添加することによりヒアルロン酸ナト
リウムを回収する。 このヒアルロン酸ナトリウム沈降物を0.15M水性NaCl
中に再溶解させればよい。塩化セチルピリジニウムを添
加して再びヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩を形成
する。ヒアルロン酸塩をNaCl（少なくとも約1M）及びエ
タノールに溶解させ、有機溶媒を添加することによりヒ
アルロン酸ナトリウムを回収する。その後沈降物を無菌
水性1M NaClに溶解させ、得られた溶液をケイ酸マグネ
シウム吸着剤、例えばフロリジルと接触させ、不純物及
び残留セチルピリジニウムイオンを除去する。次に溶液
を滅菌し、無菌有機溶媒例えば無菌イソプロパノールを
添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを沈降させ
る。こうして製造されたヒアルロン酸ナトリウムを、無
菌条件下で空気乾燥すればよい。 本発明の別の具体例では、発酵及び加熱段階以後で且
つ微生物除去段階以前の培地を第１の有機溶媒で処理す
る。こうして沈降したヒアルロン酸ナトリウムを回収
し、３％水性酢酸ナトリウムに再溶解させ、次に活性炭
を加えて懸濁液を形成する。懸濁液をケイソウ土のよう
な過助剤を使用して過し、有機溶媒を加えてヒアル
ロン酸ナトリウムの沈降物を形成する。この沈降物をそ
の後粉砕及び乾燥する。 本発明の別の具体例では、培地の処理に先立ち、微生
物を含んでいる培地のpHを約7.0に調整し、培地を約４
℃〜20℃の温度に冷却する。 本発明の一好適具体例では、微生物を含んでいる培地
にエタノールのような有機溶媒を加え、更に有機溶媒を
使用して沈降物を収集し完全に洗浄する。ヒアルロン酸
ナトリウム沈降物を0.15M水性NaClに再溶解させ、活性
炭を加える。得られた懸濁液をケイソウ土過助剤を使
用して過し、活性炭、微生物及び他の不溶性物質を除
去する。次に清澄な液を塩化セチルピリジニウムで処
理し、不溶性のヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩を
形成する。セチルピリジニウム塩を収集し、10％（v/
v）エタノールを含有する水性NaCl、例えば少なくとも1
MのNaClに溶解させ、例えばエタノールのような有機溶
媒を添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを回収
する。 このヒアルロン酸ナトリウムを0.15M水性NaClに再溶
解させればよい。塩化セチルピリジニウムを添加して再
びヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩を形成する。10
％エタノールを含むNaCl（少なくとも約1M）にヒアルロ
ン酸塩を溶解させ、有機溶媒を添加することによりヒア
ルロン酸ナトリウムを回収する。その後、無菌水性1M N
aCl中に沈降物を溶解させ、得られた溶液を例えばフロ
リジルのようなケイ酸マグネシウム吸着剤と接触させて
不純物及び残留セチルピリジニウムイオンを除去する。
次に溶液を過滅菌し、無菌エタノールのような無菌有
機溶媒を添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを
沈降させる。こうして製造されたヒアルロン酸ナトリウ
ムを無菌条件下で空気乾燥すればよい。 このヒアルロン酸ナトリウムは、化粧品グレード及び
臨床用グレードのヒアルロン酸ナトリウム組成物中で、
あるいは他の好適なキャリヤー、例えばグリセロール、
ポリプロピレングリコール、ソルビトール、コラーゲ
ン、ポリエチレングリコールと共に使用するのに適して
いる。 本発明の方法により製造される化粧品グレードのヒア
ルロン酸ナトリウム組成物は、皮膚に刺激を与えないこ
とを特徴とする。該組成物は、分子量が約700000〜1500
000ドルトンの範囲であり且つグルクロン酸とＮ−アセ
チルグルコサミンとの比が1:1であるようなヒアルロン
酸ナトリウムを約87％〜91％含有しており、更に約８〜
約12重量％の水と、約４〜約５重量％のナトリウムイオ
ンと、約0.1重量％未満のタンパク質と、約0.05重量％
未満の硫酸塩と、約0.5重量％未満の核酸とを含有して
いる。 本発明の臨床用グレードのヒアルロン酸ナトリウム組
成物は、発熱性及び炎症性をもたないことを特徴とす
る。該組成物は、平均分子量が約２〜3.5×10⁶ドルトン
であり且つグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンと
の比が1:1であるようなヒアルロン酸ナトリウムを約88
〜約92重量％含有しており、更に約８〜約12重量％の水
と、約４〜約６重量％のナトリウムイオンと、約0.01重
量％未満のタンパク質と、約0.001重量％未満の硫酸塩
と、約0.02重量％未満の核酸と、約0.2重量％未満の中
性糖とを含有している。 本発明の方法により製造される好適な超純粋ヒアルロ
ン酸ナトリウム組成物は、最小限界粘度約3.5m³/kg、最
小平均分子量約3.5×10⁶ドルトンであり、25℃及び波長
436nmで測定した比旋光度が約155゜〜165゜であり、タ
ンパク質含有量が約1mg/gであり、波長257nmの吸光度が
約0.5未満であり、内毒素含有量が約0.05ng/ml未満、鉄
含有量約0.2mg/g、銅含有量約0.02mg/g未満であり、生
理的緩衝液中に溶解した１％組成物溶液1mlをフクロウ
ザルの硝子体液の約２分の１と置換するように注入した
場合、このフクロウザルの眼の水性体液mm³当たり約200
個未満の白血球が浸透することを特徴とする。 3.5×10⁶ドルトンを越える平均分子量と各種の純度グ
レードとを有する高分子量ヒアルロン酸ナトリウム組成
物もまた、本発明の方法により製造された。 フクロウザルの眼の硝子体試験は、本質的にE.A.Bala
zsの米国特許第4141973号（1979年）の記載に従って実
施した。 本発明は更に、微生物Streptococcus zooepidemicus
HA−116 ATCC No.39920又はこれに由来する突然変異体
に係る。該微生物は、大量のヒアルロン酸ナトリウムを
産生し且つ溶血活性をもたない微生物を選択する方法に
より得られた。該方法は、連鎖球菌属の微生物のような
ヒアルロン酸産生微生物を、例えばニトロソグアニジン
のような生物の突然変異体を産生することの可能な好適
な突然変異誘発物質と接触させることから成る。例えば
Todd−Hewit寒天培地のような好適な固形培地上で突然
変異体を増殖させ、ムコイドコロニーを同定する。これ
らのコロニーを固形培地から回収し、血液寒天培地上で
増殖させる。次にヘモグロビンを溶解させないコロニー
を選択し、本発明の方法に従ってヒアルロン酸を製造す
るために使用する。 実験の詳細 細菌選択及び突然変異 ニトロソグアニジン突然変異誘発 連鎖球菌属の細菌をトリス−マレイン酸緩衝液pH6.0
中の100mg/mlのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンで40分間処理し、高度産生体を選択するた
めのTodd−Hewitt寒天プレート又は溶血素マイナス選択
用の血液寒天プレート上で分離させた。細菌の生存率は
一般に約0.1％であった。病院収蔵試料から得た各種の
Ｃ型連鎖球菌を前記のように処理した。 高度産生物質の選択 クローンの視覚評価により、大きなムコイドコロニー
を選択した。このようなコロニーの一例は、Ｃ型Strept
ococcus equisimilisの変異体（HA−100と呼称）とし
てイスラエル保健省の国立連鎖球菌リファレンスセンタ
ーにより分類されている菌株の単離体から得られた。連
鎖球菌株の同定に用いる“API 20 Strep"試験（フラン
スAPI SYSTEM社）に基づくその後の試験の結果、HA−10
0はS. zooepidemicusと密接に関連していることがわかっ
た。 溶血素マイナス突然変異体の選択 菌株HA−100を上記の突然変異誘発手順で処理し、溶
血素マイナス［hem.（−）］コロニーについて、溶血素
活性及び試験管発酵におけるヒアルロン酸生成を試験し
た。ヒアルロン酸の高度産生者でありhem.（−）である
突然変異体を一つ選択し、大規模ヒアルロン酸製造に使
用した。この突然変異体をHA−116と呼称した。“API 2
0 Strep"試験の結果、HA−116はS. zooepidimicusの菌株
であることがわかった。Streptococcus zooepidemicus
HA−116は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関
するブダペスト条約の規定に従って12301 Parklawn Dri
ve,Rockville,Md 20852に所在のAmerican Type Culture
Collectionに寄託されており、寄託番号ATCC39920を付
与されている。 発酵プロセス 選択された突然変異体HA−116の使用に加えて、発明
者らは細菌発酵により製造されるヒアルロン酸の収率及
び分子量を増加させると共に発酵時間を短縮するための
他の幾つかの独自の方法を発明した。この発明は、
（ｉ）マグネシウムイオン濃度を高レベルに維持するこ
と、及び（ii）高い曝気速度で強い攪拌下に好気性発酵
を実施することを含んでいる。 本発明の一好適具体例において、発酵培地の組成は以
下の通りである。 成分 濃度（g/） カゼイン加水分解物 20 酵母エキス 10 NaCl 2 MgSO₄・7H₂O 1.5 K₂HPO₄ 2.5 グルコース 5 本発明のより好適な一具体例において、発酵培地中の
MgSO₄・7H₂Oの濃度は1.0g/であり、グルコースの濃度
は10g/であり、他の成分の濃度は上記の通りである。 培地のpHはpHコントローラの必要に応じて5N NaOHを
連続的に添加することにより約7.0に維持する。等量の5
0％（w/v）グルコースの同時添加は、コントローラに並
列に接続されたポンプにより実施する。 細菌の培養は曝気下に行っても非曝気下に行ってもよ
い。いずれの場合も強い攪拌下で培養することが好まし
い。曝気は毎分培地容量当たり空気約１〜２容量の速度
で実施することが好ましい。非曝気下の発酵器の収率
は、約1.5〜２×10⁶の平均M.Wでヒアルロン酸約２〜3g/
であった。曝気下発酵の収率は、約2.2〜3.3×10⁶の
平均M.Wでヒアルロン酸約４〜6g/であった。平均M.W
は、当業者に既知の粘度測定に基づいて決定した。どち
らの場合も、660nmで測定したO.D.単位が2.0〜2.5まで
増殖した５％（w/v）細菌接種材料を使用した時、イン
キュベーション時間は約12時間とした。発酵の終了時
に、生物集団の密度はO.D.単位８〜13の濁度に相当し
た。 ヒアルロン酸の単離及び精製 ヒアルロン酸は３種類の異なる手順Ｉ、II及びIIIに
より精製され得る。 精製手順Ｉ 精製手順ＩはＡ及びＢの２段階に分けることができ
る。段階Ａでは「化粧品グレード」のヒアルロン酸ナト
リウムを生成し、段階Ｂでは段階Ａで得られた化粧品グ
レードを更に精製し、臨床用に好適な高純度の非炎症性
材料を生成する。 段階Ａ この段階は、細菌及び他の不溶性物質を過により除
去し、その後、イソプロパノールで３回連続的に沈降さ
せ、活性炭で処理することから成る。 化粧品グレードのみの材料が生成されたら、過する
前に温度約90℃及びpH約5.0で発酵培養液を20分間加熱
する。この時、希釈は不要である。臨床用グレードの高
分子量材料を生成するためには、発酵培養液を約10℃〜
約15℃の温度に氷冷し、３％酢酸ナトリウムで３倍〜４
倍に希釈し、pHを約7.0に調整し、その後過する。真
空式又は圧力式過器と、ケイソウ土型の過助剤、例
えばオハイオ州、シンシナチー、Eagle−Picker Indust
riesのCelatom FW−14を0.5g/使用する。１容量のイ
ソプロパノールを添加することにより液からヒアルロ
ン酸ナトリウムを沈降させる。沈降物を等量の３％酢酸
ナトリウムに再溶解させ、材料を再びイソプロパノール
で沈降させる。第２の沈降物を３％酢酸ナトリウムに再
溶解させ、次に1g/の活性炭を加え、混合物を約１時
間攪拌する。この懸濁液を過し、イソプロパノールを
添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを沈降さ
せ、イソプロパノールで洗い、最後に粉砕及び空気乾燥
して「化粧品グレード」の製品を得る。 段階Ｂ 化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウムのセチルピ
リジニウム塩を２回連続的に沈降させた後、例えばフロ
リジルのようなケイ酸マグネシウムのカラムに不純物を
吸着させることにより化粧品グレードのヒアルロン酸ナ
トリウムを精製する。フロリジル（Florisil）は、ウェ
ストバージニア州、バークレー・スプリングス、Florid
in社の登録商標である。 塩化セチルピリジニウム（CPC）沈降：段階Ａで得られ
た化粧品グレードの材料を0.15M NaClに溶解させ、約0.
25％の濃度のヒアルロン酸塩溶液を得る。0.15M NaCl中
の10％CPC1容量を約８容量の0.25％ヒアルロン酸塩溶液
に加える。セチルピリジニウム塩をデカンテーション及
び遠心分離により分離し、0.15M NaClで洗った後、15％
エタノールを含有する2M NaCl中に再溶解させ、約0.2％
のヒアルロン酸塩溶液を得る。１容量のイソプロパノー
ルを添加することにより、ヒアルロン酸をナトリウム塩
として沈降させる。ペレットをイソプロパノールで洗
い、上記のように0.15M NaClに再溶解させ、CPC沈降プ
ロセスを繰り返す。次に、２度目のCPC沈降により得ら
れたイソプロパノール沈降物を、フロリジル処理のため
に1M NaClに再溶解させる。 フロリジル吸着：ピロゲンを含まない1M NaCl中の約0.2
5％ヒアルロン酸ナトリウム溶液を30〜60メッシュの活
性化フロリジル、例えば溶液10当たり200gのフロリジ
ルのカラムに通す。次に0.2mフィルタで過することに
より溶液から細菌を除去する。過滅菌したイソプロパ
ノール（１容量）によりヒアルロン酸ナトリウムを沈降
させた後、無菌分析用グレードエタノールで洗う。最後
に沈降物を無菌空気流により乾燥する。 この手順によるヒアルロン酸の収率は約60〜70％であ
る。 精製手順II及びIII 別の方法として、２つの異なる精製方法を用いて化粧
品グレード及び臨床グレードのヒアルロン酸ナトリウム
を製造することができる。これらの手順はヒアルロン酸
ナトリウムを得るための好ましい手順である。手順IIに
よって低分子量の「化粧品グレード」のヒアルロン酸ナ
トリウムが製造され、手順IIIによって臨床使用に適し
た高純度高分子量の非炎症性ヒアルロン酸ナトリウムが
製造される。 手順II 発酵が終了すると、発酵培養液を約90℃に加熱し、次
にpHを約5.0に調整し、培地を80℃で40分間維持した。p
Hを7.0に調整し約20℃に冷却することによってこのステ
ップを終了する。この加熱プロセスでヒアルロン酸塩の
分子量が約１−1.5×10⁶ドルトンまで減少する。 1.5倍容のエタノールを添加しヒアルロン酸ナトリウ
ムを発酵混合物から沈澱させる。更に、沈澱物をエタノ
ールで洗浄して微生物の大部分を除去する。この粗材料
を、0.1％のパラヒドロキシ安息香酸メチルエステル含
有の３％酢酸ナトリウム水溶液に再度溶解する。２〜3g
/のヒアルロン酸塩を含むように容量を調整する。1g/
の活性炭と40g/のけい藻土タイプの過助剤例えば
Celatom FW−１、Eagle−Picker Industries Inc.、Cin
cinnati、Ohio、とを溶液に添加し１時間以上攪拌す
る。次に過助剤ケーキで混合物を過する。1.5倍容
のエタノールを添加してヒアルロン酸ナトリウムを沈澱
させ、沈澱物を等容の３％酢酸ナトリウムに再度溶解す
る。この溶液を微孔コットンカートリッジで過し、次
に1.5倍容のエタノールで処理する。沈澱した精製ヒア
ルロン酸ナトリウムを粉砕し最後に風乾して「化粧品グ
レード」の生成物を得る。 手順III この手順では発酵終了直後に発酵培養液を1.5倍容の
エタノールで処理する。沈澱したヒアルロン酸ナトリウ
ムをエタノールで洗浄して微生物の大部分を除去し、次
に0.1％のパラヒドロキシ安息香酸メチルエステル含有
の0.15MのNaCl水溶液に再度溶解する。１〜2g/のヒア
ルロン酸塩が含まれるように容量を調整する。1g/の
活性炭と40g/のCelatom FW−14とを溶液に添加し、混
合物を１時間攪拌する。懸濁液を過助剤ケーキで過
する。 塩化セチルピリジニウム（CPC）沈澱 0.15MのNaCl中のCPCの10％溶液を透明なヒアルロン酸
塩溶液に添加する。CPC溶液の添加量はヒアルロン酸の
５倍の重量になるように計算する。沈澱したセチルピリ
ジニウム塩を傾瀉及び遠心分離によって分離し、次に10
容量％のエタノール含有の1MのNaClに再度溶解して約１
〜2g/の溶液を調製する。1.5倍容のエタノールを添加
してヒアルロン酸ナトリウムを沈澱させる。 沈澱物を0.15MのNaClに再度溶解し、前の段落に記載
したCPC沈澱プロセスを繰り返す。第２のCPCプロセス後
に得られたエタノール沈澱物を最終精製ステップで処理
する。 フロリジル吸着 発熱物質を含まない無菌の1MのNaCl中の約0.1〜0.15
％のヒアルロン酸ナトリウム溶液を、30〜60メッシュの
活性フロリジルカラムに通す。例えば溶液１当たり20
gのフロリジルを用いる。次に0.2μｍのフィルタで過
して溶液を無菌にする。ヒアルロン酸ナトリウムをエタ
ノール（1.5倍容）沈澱させ、分析グレードのエタノー
ルで洗浄する。最後に沈澱物を無菌窒素流で乾燥する。 この手順によるヒアルロン酸ナトリウムの収率は約70
〜80％である。 産生ヒアルロン酸ナトリウムの特性 グレードＩのヒアルロン酸ナトリウム グレードＩのヒアルロン酸ナトリウムは手順Ｉによる
精製ステップＡまたは手順IIの後に得られる「化粧品グ
レード」とヒアルロン酸ナトリウムである。その特性を
以下に示す。 a.ヒアルロン酸ナトリウムの含量 87〜91％。これは参照標準としてSigmaヒアルロン酸T
ype I、cat.＃H1751を使用し、カルバゾール法、Bitter
及びMuir、Anal.Biochem.４、330（1962）の変法で検
定。 b.平均分子量 約700,000〜約1,500,000ドルトン。これは本質的にLa
urent等、Biochem.Biophys.Acta 42、476（1960）によ
って記載された極限粘度数から計算。固有粘度と分子量
との代表的計算を以下に示す。 固有粘度及び分子量 ヒアルロン酸ナトリウム（NaHA）溶液の粘度を毛管粘
度計によって測定した。サンプルの流動時間（ｔ）を測
定し純溶媒の流動時間（ｔ）と比較した。 粘度計:Cannon−Ubbelohdo希釈粘度計 サイズ100（Cannon Instrument Co.） 溶液:0.2M塩化ナトリウム中の0.1％ヒアルロン酸ナトリ
ウム 温度:25℃±0.01 固有粘度の計算 ηrel.−純溶媒に対する溶液粘度の変化を示す相対粘度ρ−密度 ｔ−流動時間（秒） ηsp−比粘度。単位１に比較した粘度増加の測定値。 ηsp/C−減少粘度 Ｃ−濃度g/ml （η）−固有粘度（極限粘度数） 固有粘度（η）の決定 0.1％ヒアルロン酸ナトリウム溶液とこの溶液の２
倍、３倍及び４倍希釈溶液との粘度を測定した。ヒアル
ロン酸ナトリウムの濃度はカルバゾール法で測定した。
sp/CをＣに対してプロットし、Ｃ＝０まで直線状に外挿
した。この線とＹ軸との交点から（η）を決定した。 分子量の決定 実験的に確定したMark−Houwink関係式 （η）＝0.0403・Ｍ^0.775 （式中のＭは分子量をドルトンで示す）からヒアルロン
酸ナトリウムの分子量を決定した。この関係式を使用し
て産生NaHAの種々のロットを分子量を決定した。関係式
を表Ｉに示す。 c.グルクロン酸/N−アセチルグルコサミン（NAG）の比:
1/1。Morgan and Elson法、Methods in Carbohydrate C
hemistry ８、89（1980）の変法によってNAGを検定し
た。 d.含水量:10％±２％ e.タンパク質:0.1％未満。DradfordのCoomasie blue法
（Anal.Biochem.72、248（1976））で検定。 f.ナトリウムイオン:5％±１％。炎光分析で検定。 g.硫酸塩含量:0.05％未満。塩酸中で加水分解後にRoden
等の濁り測定法、Mothods Enzymol.28、73（1972）で測
定。 h.核酸:0.5％未満。波長260mで１％溶液の吸光度の測定
により検定。 i.皮膚刺激の有無：この測定には１％溶液に対して以下
の方法を用いる。（ｉ）ウサギのDraize皮膚刺激テス
ト、J.H.Draize、「食品、薬物及び化粧品中の化学物質
の安全性の査定Appraisal of the Safety of Chemicals
in Foods、Drugs and Cosmetics」、Association of F
ood and Drug Officials of the United States、Austi
n、Texas、pp.46−49（1959）；（ii）モルモットの遅
延接触過敏性テスト、Magnusson及びKligman、J.Inves
t.Dermatol.52、268（1969）。 グレードIIのヒアルロン酸ナトリウム グレードIIのヒアルロン酸ナトリウムは手順Ｉの段階
Ｂによる精製又は手順IIIの精製後に得られる「臨床用
グレード」のヒアルロン酸ナトリウムである。その特性
を以下に示す。 a.ヒアルロン酸ナトリウム含量:88〜92％。 b.平均分子量:7×10⁵ドルトンより大きい。通常は手順
Ｉの段階Ｂで精製されたNaHAの分子量は約２〜約3.5×1
0⁶ドルトンの範囲であり手順IIIで精製されたNaHAの分
子量は約２〜約4.4×10⁶ドルトンの範囲である。これら
の分子量範囲は前記のごとく極限粘度数から計算した。 c.グルクロン酸/N−アセチルグルコサミンの比:1/1。 d.含水量:10％±２％。 e.タンパク質：検出不能（0.01％未満）。 f.ナトリウムイオン:5％±１％。 g.硫酸塩含量：検出不能（0.001％未満）。 h.核酸：検出不能（0.02％未満）。 i.中性糖：検出不能（0.2％未満）。 中性糖は加水分解後のサンプルで測定する。2Nトリフ
ルオロ酢酸中で120℃で１時間加水分解し次に減圧乾燥
する。0.02M酢酸ナトリウムで予処理したシリカゲル薄
層プレート（0.2mm）を用いて薄層クロマトグラフィー
を行う。加水分解したサンプルと参照標準とをスポット
し90:10のアセトン：水で展開する。硫酸で炭化して糖
スポットを検出する。 j.発熱性：無。１％溶液をウサギに注射し当業者に公知
の標準方法で発熱性を測定する。 k.炎症活性の非存在：この特性はマウスを用いた感受性
アッセイ法で測定する。この方法は炎症性物質の導入後
の腹膜内への白血球特に多形核白血球及びマクロファー
ジの遊走に基づく。これら細胞は超酸化物ラジカルを生
じるように炎症プロセスで感作される。遊走と感作とを
以下の手順で検定する。マウス２〜３びきずつのグルー
プに1mlのサンプルを腹膜内注射する。24時間後に各動
物の腹膜をを5mlのEarle培地で３回洗浄する。同グルー
プのマウスの洗浄物を合わせる。細胞を1,500RPMで10分
間沈降させ1mlに再度懸濁させて計数する。次にサンプ
ルの容量を４×10⁶細胞/mlになるように調整し0.25mlず
つのサンプルを0.5mlの2mg/mlのシトクロムＣと勾配量
の（０、２、10及び最終20mg）酢酸ミリスチン酸ホルボ
ール（PMA）とによって90分間インキュベートする。PMA
は酸化性「放出」系の活性化因子である。培地を1.500R
PMで15分間遠心し、上清の吸光度を550nmで測定する。 腹膜細胞数の増加とPMAに反応しシトクロムＣを減少
させる最大能の増加との双方によって炎症が示される。
従って、炎症指数は１ぴきのマウスから得られた白血球
全部の活性（形成された超酸化物ラジカルのナノモル）
として定義される。炎症指数が生理食塩水だけを注射し
たマウスに比較して有意に増加していないときはサンプ
ルが非炎症性であると判定する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/725 ＡＢＬ Ａ６１Ｋ 31/725 ＡＢＬ (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:46） 審判番号 平7−17517 (72)発明者 グリーンマン，ベンジヤミン イスラエル国、レホヴオツト、ハーダ ー・ストリート・６ (72)発明者 カンナー，ドヴ イスラエル国、レホヴオツト、ゴード ン・ストリート・21 (72)発明者 ランズバーグ，モシユ イスラエル国、ペタ・テイクヴア、ザー ル・ストリート・２ (56)参考文献 特開 昭58−56692（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−37001（ＪＰ，Ａ) 米国特許4141973（ＵＳ，Ａ) 醗酵工学会誌 53，［９］ Ｐ．648 〜658 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ 83，［６］ Ｐ．1452〜 1456 （1964)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．分子量１×10⁶〜４×10⁶ドルトンの高度に精製され
   たヒアルロン酸ナトリウムを得る方法であって、適当な
   栄養培地中で適当な条件下で微生物Streptococcus zooe
   pidemicusを激しい攪拌を伴って増殖させ次にヒアルロ
   ン酸ナトリウムを培地から回収するステップを含み、前
   記培地が、炭素源として約0.2〜10g/の範囲の実質的
   に一定の濃度の糖成分を含有し、約6.5〜7.5の範囲の実
   質的に一定のpHをもち、約0.05g/を上回る実質的に一
   定の濃度のマグネシウムイオンを含有しており、微生物
   にヒアルロン酸ナトリウムを産生させ、このように産生
   したヒアルロン酸ナトリウムを培地中に分泌させること
   を特徴とする方法。 ２．微生物がStreptococcus zooepidemicus、HA−116、
   ATCC39920であり、適当な条件が培地の通気を含んでお
   り、この通気が、毎分培地容量当たり空気約0.5容量を
   上回る速度で行なわれ、 適当な栄養培地が以下の成分を以下の濃度：成分 濃度 カゼイン加水分解物 約10〜30g/ 酵母抽出物 約 5〜15g/ NaCl 約2g/ MgSO₄.7H₂O 約0.5g/以上 K₂HPO₄ 約2.5g/ グルコース 約 2〜15g/ で含有することを特徴とする請求の範囲１に記載の方
   法。 ３．ヒアルロン酸ナトリウムの回収が、微生物と培地中
   の不溶なその他の物質とを除去すべく微生物含有培地を
   処理し、培地からヒアルロン酸ナトリウムを沈澱させ、
   次に沈澱物を回収するステップを含むことを特徴とする
   請求の範囲１又は２に記載の方法。 ４．更に、微生物を除去するための培地の処理以前に微
   生物含有培地のpHを約5.0に調整し、次に温度約80℃〜9
   5℃で適当な時間培地を加熱し、 処理がけい藻土を用いる濾過を含み、 沈澱が、沈澱物を生成すべく第１有機溶媒を培地に添加
   し、３％酢酸ナトリウム水溶液に沈澱物を再度溶解し、
   沈澱物を生成すべく第２有機溶媒を添加し、沈澱物を３
   ％酢酸ナトリウム水溶液に再度溶解し、活性炭を添加し
   て懸濁液を形成し、懸濁液を濾過し、濾液に第３有機溶
   媒を添加してヒアルロン酸ナトリウムの沈澱物を生成す
   るステップを含み、 第１、第２及び第３の有機溶媒の各々がイソプロパノー
   ル、エタノール又はアセトンであることを特徴とする請
   求の範囲３に記載の方法。 ５．更に、沈澱物を0.15M NaCl水溶液に再度溶解し、塩
   化セチル−ピリジニウムを添加してヒアルロン酸のセチ
   ル−ピリジニウム塩を形成し、該セチル−ピリジニウム
   塩を（約1M以上の）NaClとエタノールの水溶液に溶解
   し、有機溶媒を添加し、ヒアルロン酸ナトリウムを回収
   し、 必要に応じて更に、回収したヒアルロン酸ナトリウムを
   0.15M NaCl水溶液に再度溶解し、塩化セチル−ピリジニ
   ウムを添加してヒアルロン酸のセチル−ピリジニウム塩
   を再度形成し、該セチル−ピリジニウム塩を（約1M以上
   の）NaClと10％エタノールの水溶液に溶解し、ヒアルロ
   ン酸ナトリウムを有機溶媒で沈澱させ、該ナトリウム塩
   をNaCl溶液に溶解し、得られた溶液をケイ酸マグネシウ
   ム吸着剤と接触させて不純物と残留セチル−ピリジニウ
   ムイオンとを除去し、溶液を殺菌し、無菌有機溶媒を添
   加して溶液からヒアルロン酸ナトリウムを沈澱させるこ
   とを特徴とする請求の範囲４に記載の方法。 ６．ヒアルロン酸ナトリウムの回収が、培地に第１有機
   溶媒を添加して沈澱物を生成し、より多くの有機溶媒で
   沈澱物を洗浄し、適当な水溶液に沈澱物を再度溶解し、
   活性炭を添加して懸濁液を形成し、懸濁液を濾過して残
   留微生物とその他の不溶物質とを除去するステップを含
   むことを特徴とする請求の範囲１又は２に記載の方法。 ７．更に、第１有機溶媒の添加以前に微生物含有培地の
   pHを約5.0に調整し、培地を温度約80℃〜95℃で適当な
   時間加熱し、 濾過がけい藻土を用いる濾過であり、 適当な水溶液が３％酢酸ナトリウム又は0.15M塩化ナト
   リウムであり、 必要に応じて更に、濾液に第２溶媒を添加して沈澱物を
   形成し、沈澱物を３％酢酸ナトリウム水溶液に再度溶解
   し、溶液を濾過し、濾液に第３有機溶媒を添加してヒア
   ルロン酸ナトリウムの沈澱物を形成し、 第１、第２及び第３の有機溶媒の各々が、イソプロパノ
   ール、エタノール又はアセトンであることを特徴とする
   請求の範囲６に記載の方法。 ８．更に、ヒアルロン酸塩溶液に0.15M NaCl水溶液中の
   塩化セチル−ピリジニウムを添加してヒアルロン酸のセ
   チル−ピリジニウム塩を形成し、10％エタノール含有の
   （約1M以上の）NaCl水溶液に該セチル−ピリジニウム塩
   を再度溶解し有機溶媒を添加してヒアルロン酸ナトリウ
   ムを回収し、 必要に応じて更に、回収したヒアルロン酸ナトリウムを
   0.15M NaCl水溶液に再度溶解し、塩化セチル−ピリジニ
   ウムを添加してヒアルロン酸のセチル−ピリジニウム塩
   を再度形成し、該セチル−ピリジニウム塩を10％エタノ
   ール含有の（約1M以上の）NaCl水溶液に再度溶解し、有
   機溶媒を添加してヒアルロン酸ナトリウムを沈澱させ、
   沈澱物を無菌1M NaCl水溶液に再度溶解し、得られた溶
   液をケイ酸マグネシウム吸着剤と接触させて不純物と残
   留セチル−ピリジニウムイオンとを除去し、溶液を殺菌
   し、無菌有機溶媒を添加して溶液からヒアルロン酸ナト
   リウムを沈澱させ、 有機溶媒がエタノールであることを特徴とする請求の範
   囲６または７に記載の方法。