JPS62501471A - 連鎖球菌の発酵による高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 週４１罠玖九１に、Ｌ多ｊ叛３ゴＬｉよ一ダン３ｏンＪ［九上ツ、−汐Ｊ−ρ− 乳しユ自り 本願は、１９８５年１月１８日付で出願された米国特許出願第６９２６９２号の 一部継続出願であり、この出願の内容を本願の参考資料とするものである。

１１へ１１ 本発明は、連鎖球菌（８工」」且り匹μ鋒−）属の微生物の大規模発酵による高 分子Ｉヒアルロン酸のナトリウム塩の製造方法に係る。

ヒアルロン酸は、５００００〜１３００００００ドルトンの分子量の線状高分子 から構成される天然に存在するグリコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、 交互に１−３及び１−４の結合により結合されたグルクロン酸及びＮ−アセチル グルコサミンの繰り遅し単位から形成される多糖である。

ヒアルロン酸は、皮膚や軟骨のような動物の種々の結合組織中に存在している。

原器、滑液、硝子体液及びニワトリのトサカのような特定の器官は、ヒアルロン 酸を特に多量に含有している。更に、ヒアルロン酸は＾型及びＣ型連鎖球菌のよ うな種々の微生物により産生される。

皮膚及び軟骨中におけるヒアルロン酸の役割は、水分を結合させ、組六の張度及 び弾性を保持ζ〜ることにある。関節液中において粘性のヒアルロン酸溶液は、 細胞に保ｄ環境を与える潤滑剤としてＲ６−Ｂｑする８ニワｌ＝りのトサカから 抽出した超純粋ヒアルロン酸溶液は、例えばＥ４＾　Ｂａｌａｚｑ名義の米国特 許第４１４１９７３号（１９７９年）に開示されているように、数年来眼科手術 用の支持媒体として使用され“Ｃいる。

同様の製剤が競争馬の膝関節炎症の治療に有効であるとして報告されている。ヒ アルロン酸の別の用途はその親水性の高さを利用するものであり、例えばＥ、　 Ｂａｌａｚｓ名義の米国特許第４３０３６７６号（１９８１年）に開示されてい るように、化粧品用としてモイスチャー１コ・−ジョンの理想的な成分を構成す る。

ヒアルロン酸は、上述のように微生物培養液を含む各種の生物ソースから単芯゛ されている。ヒアルロン酸の車前及び特徴付けについては、Ｍｅｙｅｒ他、　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌｌ、　１０又、６２９ている。ヒアルロン酸の構造は 、Ｗｅｉｓｓｎａｎ他、Ｊ、＾―、　Ｃｈｅａ＋。

Ｓｏｃ、　７６、１７５３（１９５４）及びＭ’ｅｙｅｒ、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏ ｃ、　１７．１０７５（１９５８）により解明されている。

連鎖球菌によるヒアルロン酸の製造は、Ｆｏｒｒｅｓｔ他、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　１１８．６１（１９３７）により最初に示され、その 後、多くの研究者によってはさらに研究されており、例えばＲｏｓｅｍａｎ他、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２０３，２１３（１９５３）、Ｐｉｅｒｃｅ 　ａｎｄＷｈｉｔｅ、　Ｐｒｏｅ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ 、　８７．５０（１９５４）、Ｇ、Ｈ。

Ｗａｒｒｅｎの米国特許第２９７５１０４号（１９６１）及びＳ　ｕ　ｎ　Ｂ　 ｈ　ａ　ｒ　ａ他、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４．６２５２（１９７９）が、動物及び微生物ソ ースに由来するヒアルロン酸を示している。＾型連鎖球菌のバッチ式発酵及びヒ アルロン酸の単芯に関する小月模から中想模の方法については、Ｔｈｏｎａｒｄ 他、　Ｊ、　Ｂ’ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、ηリー。

７２６（１９６４）、Ｈｏ１ａ＋ｓｔｒｏｍ　ａｒｉｄ　Ｒｉｃｉｅａ、Δｐｐ １．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　１５゜１４０９（１９６７）、　Ｋｊｅｍｓ　ａｎ ｄ　Ｌｅｂｅｃｈ、八ｅｔａ　Ｐａｔｈ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ。

５ｅａｎｃ１．８４．１６２（１９７６）中に発表されている。これらの方法に は病原性細苗の嫌気的発酵が含まれており、７０００００以下の分子量のヒアル ロン酸が０．４−１！？／ｊ）の収率で製造されている。

別の方法としては、１９８３年４月４日付で公開された発明者＾ｋａｓａｋａ　 Ｈ他による日本特許公開第５８−０５６６９２号に開示されているように、しア ルロン酸を製造するために連鎖球角の好気的発酵を使用する方法がある。その他 の刊行物として、Ｅ、＾、　Ｂａ！ａｚｓ名義の１９７９年２月２７日付米田特 許第４１４１９７３号は、動物結合組繊のようなソ・−スからヒアルロン酸分製 造及び精製する方法について記載している。しかしながら、従来技術中に開示さ れているヒアルロン酸の製造及び精製方法では、　２．０Ｘ１０’ドルトンを越 える平均分子量のヒアルロン酸を製造することができない。これは］、に５ヒア ルｌコン酸が剪断により分解し易いことあるいはヒアルロン酸組成中に存在して いる不純物又は金属・イオンによる触媒反応で酸化し、易いという事実に起因し ている。

本明細書中に記載する新規方法は、嫌気的発酵の場合的２ｓ／ｆ！、好気的発酵 の場合的４〜・６ｇ＃ｔの収率で約１ｘｌＯ’−約４、ＯＸ　１０’ドルトンの 分子量のヒアルロン酸を製造することができる。これは、ヒアルロン酸の高度な 産生者であり且つ溶血素マ・イナス即ち病原性の殆どないＣ型行υ１ρ−ｊ−Ｏ 要Ａ９湛−ジ妨ｙ■鯉叩ｊｓ、Ｉｕ５−１ＨΔ−１１６，訂ＣＣ３９９２０の突 然変革株をＦ　３．ｅすることにより可能になった１兆６７」刃、６−Ｐ節現へ Ｒ１馬す貼−１１６゜ＡＴＣＣ３９９２０の好気的発酵及びそｉｌに続・〈シア ルロン酸塩の精製の結果、３．５ｘ　１０’ドルトンを越える平４９ノ分子量を 有するヒアル「７〉′酸すＩ−リウムのバッチが得ろｉ？六二。本発明は、この ような高分子量のヒアル１７ン＾（すトす１′７ムを相菌発酵により製造及び精 製した最初の方法である。

本発明の方法を使用することにより、非発熱性及び非刺激性のヒアルロン酸が得 られる。本発明の範囲内の別の方法を使用すると、臨床用に好適な超純粋非炎症 性ヒアルロン酸を製造することができる。

元画！す１釘 本発明は、鈷ヱ坦μ空１賢砂μｉｄｅｍ豆す一種、　ＩＩＡ−１１６゜ΔＴＣＣ ３９９２０の微生↑ヶ、及び該微生物に由来し１、発酵によりヒアルロン酸ナト リウムを産生して周囲培地中にこれを分泌することの可能な突然変異体に係る。

本発明はまた、好適な栄養培地中で好適な条件下で連須球菌属微生物を強い撹拌 下に増殖させることから成るヒアルロン酸ナトリウムの獲得方法に係る。培地は 、炭素源として約０．２〜１０ｇ／ρの実質的に一定濃度の糖成分を含んでおり 、約６．５〜７．５の範囲の実質的に一定のｐｉｔを有しており、更に０．０５ ｓ／１を越える実質的に一定のマグネシウムイオン濃度を有している。微生物は ヒアルロン酸すトリウムを産生し、培地中にこれを分泌する。しアルロン酸ナト リウムはその後、培地から回収される。

ヒアルロン酸ナトリウムは、微生物及び培地中の不溶性の他の物質を除去するべ く微生物を含んでいる培地を処理する段階と、例えば有機溶媒により培地からヒ アルロン酸ナトリウムを沈降させる段階と、沈降物を回収する段階とから成る方 法により培地から回収される。次に沈降物は粉砕及び乾燥され得る６以上の方法 により、発熱性及び炎症性のないことを特徴とするヒアルロン酸ナトリウム組成 物を製造することができる。

本発明はまた、大量のヒアル口〉・酸を産生し、且つ溶崩活性をもたない微生物 を選択するための方法に係る。話方法は、突然変異体を形成するべくヒアルロン 酸産生微生物を好適な突然変異誘発物質で処理する段階と、好適な固形培地上で 突然変異体を増殖させる段階と３含んでいる。ムコイドコロニーを同定し、回収 する６回収したコロニーを血液寒天培地上で増殖させ、ヘモグロビンを溶解させ ないコロニーを選択する。

光５トγ謹３シｄ朋一 本発明は、連鎖法菌属の微生物、例えば亀、ト副」０１シ住幻リー又はＳ、　ｅ ｘ■ｉＬｉユＩｉｓ、から高分子量のヒアルロン酸ナトリウムを獲得する方法に 係る。該方法は、好適な条件下で好適な栄養培地中で連鎖法菌属の微生物を強い 撹拌下に増殖させる段階を含んでいる。培地は、炭素源として約０．２〜１０９ ７ｐの実質的に一定濃度の糖成分で含んでおり、約０．０５ｙ＃を越える実質的 に一定のマグネシウムイオン濃度を有しており、約６．５〜７．５の実質的に一 定のｐｉｔを有している。微生物は、ヒアルロン酸ナトリウムを産生じこれを培 地中に分泌する。ヒアルロン酸ナトリウムはその後、培地から回収される。

本発明の実施にあたっては、ヒアルロン酸を産生ずる任意の連鎖法菌種を使用す ることができ、例えば辷り一幻口這−７，３，７−又はＳ−Ｚを使用することが できる。好適な種はＳＬ涙狂泥且込←１道り」−であり、その菌株としては、大 量のヒアルロン酸を産生する微生物を獲得するために本発明の方法に従って製造 される突然変異株であるＳ、り且むｊ±」１犯」ユ　＋ｉΔ・１１６＾ＴＣＣ３ ９９２０が挙げられる。

ヒアルロン酸ナトリウムは、好気性又は嫌気性条件下で連鎖球菌を増殖させるこ とにより得られる０本発明の一好適具体例において好適な増殖条件は、毎分培地 容量当たり空気的０．５容ｉ　（ｖｖｍ）を越える速度で培地を曝気することを 含む、一般には１〜２ｖｖｍの曝気速度が使用されるが、曝気速度は高いほうが 望ましい、この好適具体例において・好適な栄養培地は１１当たり約１０〜３０ ｇのカゼイン加水分解物と、約５〜１５ｇの酵母エキスと、約２ｇのＮａＣｌと 、約０．５９を越えるＭｇＳＯ４・７Ｈ２０と、約２．５９のに２ＨＰＯ，と、 約２〜１５３のグルコースとを含んでいる。

ヒアルロン酸ナトリウムは、例えば−過又は遠心分離により微生物及び培地中の 不溶性の他の物質を除去するべく微生物を含んでいる培地を処理することにより 回収され得る。次にヒアルロン酸ナトリウムは培地から沈降及び回収される。沈 降物はその後均等な寸法の粒子に粉砕及び乾燥され得る。

本発明の一具体例においてヒアル１コン酸ナトリウムは。

微生物を含んでいる培地のｐｎを約５．０のｐＨに調整し、次に好適な時間約８ ０℃〜９５℃の温度に培地を加熱し、例えば２０分間約９０℃の温度に加熱する か又は好ましくは４０分間８０℃に加熱することにより回収される。加熱後、微 生物及び他の不溶性物質を除去する。好適な除去方法は、ケイソウ土のような濾 過助剤を使用した一過により行なうものである。

イソプロパツールのような第１の有機溶媒を培地に加えることにより、培地又は Ｐ液からヒアルロン酸ナトリウムを沈降させることができる。沈降物を３％水性 酢酸ナトリラムに再溶解させ、次いでエタノールのような第２の有機溶媒で沈降 させる。第２の沈降物を３％水性酢酸ナトリウムに再溶解させ、活性炭を加えて 懸濁液を形成する。懸濁液をＦ遇し、例えばアセトンのような第３の有機溶媒を 加えてヒアルロン酸ナトリウムの沈降物を形成する。第１、第２及び第３の有機 溶媒は１、夫々イソプロパツール、エタノール又はアセトンであり得る。あるい は各段階で同一の有機溶媒を使用することによりヒアルロン酸塩を沈降させても よく、例えば３つの沈降段階のいずれにおいてもイソプロパツールを使用するこ とにより培地からヒアルロン酸ナトリウムを沈降させてもよい。

本発明の別の具体例では、微生物を除去するために培地を処理する段階に先立ち 、微生物を含んでいる培地のｐＨを約７．０に調整し、培地を約４℃〜１５℃、 好ましくは約４℃〜２０℃の温度に冷却する０次に、３％水性酢酸ナトリウムを 使用して、その後の処理を可能とするのに必要な程度、例えば３倍〜４倍に培地 を希釈する。

本発明の一具体例では、ヒアルロン酸ナトリウム沈降物を０．１５Ｍ水性ＮａＣ ｌに再溶解させ、塩化セチルピリジニウムを添加してヒアルロン酸のセチル−ピ リジニウム塩を形成する。セチルピリジニウム塩を水性ＮａｃＩ及び１５％エタ ノール、例えば少なくともＩＭのＮａＣ１に溶解させ、例えばヒアル口〉・酸ナ トリウムを沈降させる〕エタノールのような有機溶媒を添加することによりヒア ルロン酸すｌ−リウムを回収する。

このヒアルロン酸ナトリウム沈降物を０．１５Ｍ水性ＮａＣ１中に再溶解させれ ばよい、塩化セチルピリジニウムを添加し２て再びヒアルロン酸のセチルピリジ ニウム塩を形成する。

ヒアルロン酸塩’３８ａＣＩ（少なくとも約１８）及びエタノールに溶解させ、 有機溶媒を添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを回収する。その後沈降 物を無菌水性１．８　ＮａＣ１に溶解させ、得られた溶液をケイ酸マグネシウ１ １吸着剤、例えばフロリジルと接触させ、不純物及び残留セチルピリジニウムイ オンを除去する０次に溶液を滅菌し、無菌有機溶媒例えば無菌インプロパツール を添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを沈降させる。こうし、て製造さ れたヒアルロン酸ナトリウムを、無菌条件下で空気乾燥すればよい。

本発明の別の具体例て゛は、発酵及び加熱段階以後で且つ微生物除去段落以前の 培地を第１の有機溶媒で処理する。

こうして沈降したヒアルロン酸すトリウムを回収し、３％水性酢酸すトリウムに 再溶解させ、次に活性炭を加えて懸濁液を形成する。懸濁液をケイソウ土のよう な濾過助剤を使用して濾過し、有機溶媒を加えてヒアルロン酸ナトリウムの沈降 物を形成する。この沈降物をその後粉砕及び乾燥する。

本発明の別の具体例では、培地の処理に先立ち、微生物を含んでいる培地のｐＨ を約７．０に調整し、培地を約４℃〜２０℃の温度に冷却する。

本発明の一好適具体例では、微生物を含んでいる培地にエタノールのような有機 溶媒を加え、更に有機溶媒を使用して沈降物を収集し完全に洗浄する。ヒアルロ ン酸ナトリウム沈降物を０．１５Ｍ水性ＮａＣ１に再溶解させ、活性炭を加える 。得られた懸濁液をケイソウ土濾過助剤を使用してｐ遇し、活性炭、微生物及び 他の不溶性物質を除去する０次に清澄なＦ液を塩化セチルピリジニウムで処理し 、不溶性のヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩を形成する。セチルピリジニウ ム塩を収集し、１０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを含有する水性ＮａＣｌ、例えば少 なくともＩＮのＮａＣｌに溶解させ、例えばエタノールのような有機溶媒を添加 することによりヒアルロン酸ナトリウムを回収する。

このヒアルロン酸ナトリウムを０．１５Ｍ水性ＮａＣ１に再溶解させればよい、 塩化セチルピリジニウムを添加して再びヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩を 形成する。１０％エタノールを含むＮａＣＩ（少なくとも約ＩＭ）にヒアルロン 酸塩を溶解させ、有機溶媒を添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを回収 する。その後、無菌水性１ＭＮａＣ１中に沈降物を溶解させ、得られた溶液を例 えばフロリジルのようなケイ酸マグネシウム吸着剤と接触させて不純物及び残留 セチルピリジニウムイオンを除去する。次に溶液を譚過滅苗し、無菌エタノール のような無菌有機溶媒を添加することによりヒアルロン酸ナトリウムを沈降させ る。こうして製造されたヒアルロン酸ナトリウムを無菌条件下で空気乾燥すれば よい。

このヒアルロン酸ナトリウムは、化粧品グレード及び臨床用グレードのヒアルロ ン酸すｌ−リウム組成物中で、あるいは他の好適なキャリヤー、例えばグリセロ ール、ポリプロピレングリコール、ソルビトール、コラーゲン、ポリエチレング リコールと共に使用するのに適している。

本発明の方法により製造される化粧品グレードのヒアルロン酸す１−リウム組成 物は、皮膚に刺激を与えないことを特徴とする。該組成物は、分子量が約７００ ０００〜１５０００００ドルトンの範囲であり且つグルクロン酸とＮ−アセチル グルコサミンとの比が１＝１であるようなヒアルロン酸ナトリウムを約８７％〜 ９１％含有し７ており、更に約８〜、約１２重量％の水と、約４〜約５重量％の ナトリウムイオンと、約０．１重量％未満のタンパク質と、約０．０５重１％未 満の硫酸塩と、約０．５重量％未満の核酸とを含有している。

本発明の臨床用グレードの、ヒアルロン酸すトリウム組成物は、発熱性及び炎症 性をもたないことを特徴とする。該組成物は、平均分子量が約２〜３．５ｘ　１ ０′′ドル■・ンであり且つグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの比が １＝１であるようなヒアルロン酸ナトリウムを約８８〜約９２重量％含有してお り、更に約８〜約１２重呈％の水と、約４〜約６重量％のすｌ・リウムイオンと 、約０．０１重量％未満のタンパク質と、約０．００１重量％未満の硫酸塩と、 約０．０２重量％未満の核酸と、約０．２重量％未満の中性糖とを含有している 。

本発明の方法により製造される好適な超純粋ヒアルロン酸ナトリウム組成物は、 最小限界粘度的３．５ｍ３７ｋｇ、　Ｒ小平均分子量約３．５Ｘ　１０’ドルト ンであり、２５℃及び波長４３６ｎｎで測定した比旋光度が約１５５°〜１６５ ゛であり、タンパク質含有量が約１■／ｇであり、波長２５７肘の吸光度がｉｉ 、！Ｊ０、５未満であり、内毒素含有量が約Ｑ、０５ｎｇ／ｒｊ！未満９．鉄含 有量約０．２■／ｇ、飼含有１約０．０２■／ｇ未満であり、生理的耘衝液中に 溶解した１％組成物溶液１ｒｄをツクロウザルの硝子体液の約２分の１と置換す るように注入した場合、このツクロウザルの眼の水性体液１３当たり約２００個 未満の白血球が浸透することを特徴とする。

３．５Ｘ　１０’ドルＩ・ンを越える平均分子量と各種の純度グレードとを有す る高分子量ヒアルロン酸ナトリウム組成物もまた、本発明の方法により製造され た。

ツクロウザルの眼の硝子体試験は、本貫的に［、＾、Ｂａ１ａｚｓの米国特許第 ４１４１９７３号（１９７９年）の記載に従って実施した。

本発明は更に、微生物法−Ｕ」ｙ９ｃ　ｏ　ｃへ１Ｌ色７ｖ翌囮見竺セ倶Σ１１ ＾−１１６ＡＴＣＣＮｏ、　３９９２０又はこれに由来する突然変異体に係る。

該微生物は、大量のヒアルロン酸ナトリウムを産生じ且つ溶血活性をもたない微 生物を選択する方法により得られた。該方法は、連鎖法菌属の微生物のようなし アルロン酸産生微生物を、例えばニトロソグアニジンのような生物の突然変異体 を産生ずることの可能な好適な突然変異誘発物質と接触させることから成る８例 えばＴｏｄｄ−１１ｅｗｉｔ寒天培地のような好適な固形培地上で突然変異体を 増殖させ、ムコイドコロニーを同定する８これらのコロニーを固形培地から回収 し、血液寒天培地上で増殖させる。次にヘモグロビンを溶解させないコロニーを 選択し、本発明の方法に従ってヒアルロン酸を製造するために使用する。

又ｌユｌ乱 社可屋去盈−り笈思交羨 ニトロソグア二ノ）２礼然ＸＪａ友ヌ一連鎖球菌属の細菌をトリス−マレイン酸 緩街液ｐＨ６，０中の１００■／ｄのＮ−メチル−Ｎ゛−ニトロ−Ｎ−ニトロソ グアニジンで４０分間処理し、高度産生体を選択するためのＴｏｄｄｉｌｅｗｉ ｔｔ寒天プレート又は溶血素マイナス選択用の血液寒天プレート上で分落させた 。細菌の生存率は一般に約０．１％であった。病院収蔵試料から得た各種のＣ型 連鎖球菌を前記のように処理した。

ｌ皮１進ＪＢＵ巧町＆ クローンの視覚評価により、大きなムコイドコロニーを選択した。このようなコ ロニーの一例は、Ｃ型鉄■吐竺竺−■１組旦ｊ刃±垣の変異体（Ｈ＾−１００と 呼称）としてイスラエル保健省の田立連鎖球苗リファ１．ンスセンターにより分 類されている菌株の単芹体から得パノ１．た５、連鎖法菌株の同定に用いる’Ａ ＰＩ　２０５ｔｒｅｐ’試験（フランスＡＰＩ　ＳＹＳＴＥＭ社）に基づくその ｔ糸の試験の結果、Ｈへ１００は＄−汐±店ｊ旦９♂眞−リー１トｐＩ接に関連 していることがわかった。

ｌ創Ｌ１血土スス撚ヌ１遜−へ耳ヌー 菌株ＨＡ−１００を上記の突然変異誘発手順で処理し、溶血素マイナス［ｈｅｍ 、（ｉ］コロニーについて、溶血素活性及び試験管発酵におけるヒアルロン酸生 成を試験した。ヒアル口つ選択し、大規模ヒアルロン酸製造に使用した。この突 然変異体をＨ＾−１１６と呼称した。”ΔＰＩ　２０５ｔｒｅｐ”試験の結果、 １１Ａ−１１６は辷■〃凪±口左岨の菌株であることがわかった。

汀−シボ己ヱＣ０ＣＣｕ５硯竺江鼓負ｙ王旧Ａ−１１６は、特許手続上の微生物 の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定に従って１２３０１　Ｐａｒｋ ！ａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍｄ　２０８５２に所在の八 ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託され ており、寄託番号＾ＴＣＣ３９９２０を付与されている。

Ｉ娩１ユｊ基 選択された突然変異体Ｈ＾−１１６の使用に加えて、発明者らは細菌発酵により 製造されるヒアルロン酸の収率及び分子量を増加させると共に発酵時間を短縮す るための他の幾つかの独自の方法を発明し、た。この発明は、（ｉ）マグネシウ ムイオン濃度を高レベルに維持すること、及び（ｉｉ）高い曝気速度で強い撹拌 下に好気性発酵を実施することを含んでいる。

本発明の一好適具体例において、発酵培地の組成は以下の通りである。

えた　遭Ｊコ３　ｒ’　Ｄ　） カゼイン加水分解物　２０ 酵母エキス　１Ｏ ＮａＣＩ　２ Ｍｇ５Ｏ，・７１１，０　１．５ に、ＨＰＯ４２，５ グルコース　５ 本発明のより好適な一具体例において、発酵培地中のＭｇ５Ｏ，・７Ｈ２０の濃 度はｘ、ｏｙ／ρであり、グルコースの濃度は１０９７ρであり、他の成分の濃 度は上記の通りである。

続的に添加することにより約７．０に維持する０等量の５０％（ｗ／ν）グルコ ースの同時添加は、コ〉四−ローラに並列に接続されたポンプにより実施する。

細菌の培芥はワ気下に行っても非曝気下に行ってもよい４いずれの場合も強い撹 拌トて培乙することが好まし、い。曝気は毎分培地容量当ノこり空気的１−・− ２容量の速度で実施することが好ましい。非曝気ドの発酵器の収率は、約１．５ ・〜２＼１０″の平均Ｍ、Ｗて′ヒアルロン酸約２〜・・３３／１て′あっ７′ ：：。嘔気上発酵、つ収率は、ｊ！−）　２、２〜３．３Ｘ１吋の平均ＭＪＩで ヒアル１７ン酸約４〜６ｇ／ρであった。平均ＭＪは、当業者に既知の粘度測定 に基づいて決定し／、、：。どちらの場合も、６６０ｎｍＴ測定した０、Ｄ、単 位が２．、Ｏヘ−２，５まて′増殖した５％（ｗ／ｖ）ＱＢｍＧ種材料を使用し た時、インキュベーション時間は約１２時間とした。

発酵の終ｒ時に、生物集団の密度はＯ，Ｄ、　９位８へ−Ｃ３の温度に相当した 。

（乙先ｌ乙肛咬臭４欠囚■− ヒアルロン酸は３種類の異なる手ＲＩ、■及び■により精製され得る。

ｖＬ！Ｌ玉１ヒし 精製１１項Ｉは八及びＢの２段階に分けることができる０段階へでは「化粧品グ レード」のヒアルロン酸ナトリウムを生成し、段階Ｂでは段階へで得られた化粧 品グレードを更に精製し、臨床用に好適な高純度の非炎症性材料を生成する。

改］人 この段階は、細菌及び他の不溶性物質を濾過により除去し、その後、イソプロパ ツールで３回連続的に沈降させ、活性炭で処理することから成る。

化粧品グレードのみの材料が生成されたら、濾過する前に温度約９０℃及びｐＨ 約５，０で発酵培養液を２０分開加熱する。

この時、希釈は不要である。臨床用グレードの高分子量材料を生成するためには 、発酵培養液を約り０℃〜約１５℃の温度に氷冷し、３％酢酸ナトリウムで３倍 〜４倍に希釈し、ｐＨを約７．０に調整し、その後？ｐ遇する。真空式又は圧力 式濾過器と、ケイソウ上型の濾過助剤、例えばオハイオ州、シンシナチー、Ｅａ ｇｌｅ−Ｐｉｃｋｅｒ　ＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓのＣｅｌａｔｏｍ　Ｆｌ＋ｔ−１ ４をＯＭ／Ｉ！使用する。ｌ容量のイソプロパツールを添加することによりＰ液 からヒアルロン酸す■・リウムを沈降させる。

沈降物を等量の３％酢酸ナトリウムに再溶解させ、材料を再び９ツブロバノール で沈降させる。第２の沈降物を３％酢酸ナトリウムに再溶解させ、次にｌｙ、Ｑ ）の活性炭を加え、混合物を約１時間撹拌する。この懸濁液を濾過し、イソプロ パツールを添加するごとによりヒアルｌクン酸ナトリウムを沈降させ、イソプロ パツールで洗い、最後に粉砕及び空気乾燥して「化粧品グｌ／−ド」の製品を得 る。

ａＪＢ−β− 化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウムのセチルピリジニウム塩を２回連続的 に沈降させた後、例えばフロリジルのようなケイ酸マグネシウムのカラｌ、に不 純物を吸着させることにより化粧品クレ・−ドのヒアルロン酸ナトリウムをＭＭ する。フロリジル（Ｆｌｏｒｉｓｉｌ）は、ウェストバージニア州、バークレー ・スゲリンゲス、Ｆｌｏｒｉｄｉｎ社の登録商標である。

昔北−１＝−ｒテ二２リ一、層、■ダーツｙン人（ｃｐ−０）３−降−、：　１ ２階Ａｒ得られた化粧品グレードの材料を０．１５Ｍ　ＮａＣ１に溶解させ、約 ０．２５％の濃度のヒアルロン酸塩溶液を得る。０．１５ＨＮａＣ１中の１０％ ＣＰＣ１容量を約８容量の０，２５％１ニアルロン酸塩溶液に加える。セチルピ リジニウム塩をデカンチーシアン及び遠心分離により分離し１．０．１５Ｍ　Ｎ ａＣ１て・洗−）た後、１５９ａエタノールを含有する２８　ＮａＣ１中に再溶 解させ、約０．２％のしアルロン酸塩溶液を得る。１容量のインプロパツールを 添加することにより、ヒアルロン酸をすｌ・リウム塩として沈降させる。べ１／ ツトをイソプロパツールで洗い、上記のように０．１５Ｍ　ＮａＣ１に再溶解さ せ、ｃｐｃ沈降プロセスを繰り返す。次に、２度目のＣＰＣ沈降により得られｔ ′：インプロパノ−・ル沈降物と、フロリジル処理のために１８　ＮａＣ１に再 溶解させるやｒｏ！、Ｄ；［＠：　ピロゲンを含まないＩＭ　ＮａＣ１中の約０ ．２５％ヒアルロン酸ナトリウム溶液を３０〜６０メツシユの活性化フロリジル 、例えば溶液１０１当たり２００ｇのフロリジルのカラムに通す。次に０．２ｍ フィルタで濾過することにより溶液から細菌を除去する。濾過滅菌したインプロ パツール（１容量）によりヒアルロン酸ナトリウムを沈降させた後、無菌分析用 グレードエタノールで洗う。最後に沈降物を無菌空気流により乾燥する。

この手順によるヒアルロン酸の収率は約６０〜７０％である。

Ｗ股土工ＩＬ■且− 別の方法として、２つの異なる精製方法を用いて化粧品グレード及び臨床グレー ドのヒアルロン酸ナトリウムを製造することができる。これらの手順はしアルロ ン酸ナトリウムを得るための好ましい手順である。手順Ｈによって低分子量の「 化粧品グレード」のしアルロン酸ナトリウムが製造され、手順■によって臨床使 用に適した高純度高分子量の非炎症性しアルロン酸すトリウムが製造されろ。

Ｌ」肛−７ 発酵が終了すると、発酵培養液を約９０℃に加熱し、次にｐＨを約５．０に調整 し、培地を８０℃で４０分開維持した。ｐ、　ＩＩを７、Ｏｌ、：調ｍし約２０ ℃に冷却することによってこのステップを終了する。この加熱プロセスでヒアル ロン酸塩の分子量が約１−Ｌ５ｘｌＯ’ドルトンＪ″′Ｃ減少する。

１．５倍容のエタノールと添加ししアルロン酸ナトリウムを発酵混合物から沈澱 させる。更に、沈澱物をエタノールで洗浄して微生物の大部分を除去する。この 粗材前を、０．１％のバラヒドロキシ安息香酸メチルエステル含有の３％酢酸す Ｉ−リウム水溶液に再度溶解する。２〜３ｙ／ρのヒアルロン酸塩を含むように 容量を調整する。　１９／Ｉ！の活性炭と４０ｇ／ｐのけい藻土タイプの濾過助 剤例えばＣｅ１ａｔｏ蹟１１１−１、Ｅａｇｌｅ−Ｐｉｃｋｅｒ　Ｉｎｄｕｓｔ ｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、Ｃ１ｎｃｉｎｎａｔｉ、０ｈｉｏ、とを溶液に添加し１時 間以上撹拌する。次に濾過助剤ケーキで混合物を濾過する。１．５倍容のエタノ ールを添加してヒアルロン酸ナトリウム登沈澱させ、沈澱物を笠容の３％酢酸ナ トリウムに再度溶解する。この溶液を微孔コツトンカートリッジでＦＡし、次に １．５倍容のエタノールで処理する。沈澱した精製ヒアルロン酸すトリウムを粉 砕し最後に風乾して「化粧品グレード」の生成物を得る。

工」１．ｌ この手順では発酵終了直後に発酵培養液を１．５倍容のエタノールで処理する。

沈澱したヒアルロン酸すｌ−リウムをエタノールで洗浄して微生物の大部分を除 去し２、次に０．１％のバラしドロキシ安、９、香酸メチルエステル含有の０． １５ＭのＮａＣ１！水溶液に再度溶解する。１〜２ｙ＃のヒアルロン酸塩が含ま れるように容量をｇ＝する。１９／ρの活性炭と４０ｇ／ρのＣｅｌａｔｏｍ　 Ｆ１４−１４とを溶液に添加し、混合物を１時間撹拌する。懸濁液を濾過助剤ケ ーキで濾過する。

１仙１乞虹【史２二文込」上Ｃ井Ｊ− ０，１５ＭのＮａＣｌ中のＣＰＣの１０％溶液を透明なヒアルロン酸塩溶液に添 加する。ＣＰＣ溶液の添加量はヒアルロン酸の５倍の重量になるように計算する 。沈澱したセチルピリジニウム塩を傾瀉及び遠心分所によって開削し、次に１０ 容量％のエタノール含有のＩＨのＮａＣｌ２に再度溶解し、て約１＝−２ｇ、Ｑ ｌの溶液を調製する。１．５倍容のエフノー・ルを添加してしアル［７〉・酸す トリウムを沈澱さぜる６ 沈澱物を０．１１汁のＮａＣｌに再度溶解し、前の段落に記載！〜たＣＰＣ沈澱 プロセスを繰り返す。第２のＣＰＣブ０七ス後に得られたエタノール沈澱物を最 終精製ステップで処理する。

入１九老少及萱−４ 発熱物質な含まない無菌のＩＭのＮａＣｌ中のｉ、！、　Ｑ　、　１〜０，１５ ％のヒアルロン酸ナトリウＪ１溶液を−５３０−、、、、６０メツシュの活性フ ロリジルカラムに通す。例えば溶液１２当たり２０！？のフロリジルを用いる。

次に０．２Ｉｓのフィルタで゛泥過して溶液を無菌にする。ヒアルロン酸ナトリ ウムをエタノール（１，５１容）沈澱させ、分析グレードのエタノールで洗浄す る。最後に沈澱物を無菌窒素流で乾燥する。

この手順によるヒアル口〉・酸ナトリウムの収率は約７０〜Ｌｂ−−−どＪ−− αζ−Ｔフ１ど−す、−ン酸−す一トル七−ウ！しグレード■のヒアルロン酸す ｌ−リウムは手１１１による精製ステ・ツブΔまたは手順■の後（、：得られる 「化粧品グレード」のヒアルロン酸ナトリウムである、その特性を以下ζ７示す 。

ａ、　見ア〜２１４ｐ−ン」ダナー上−シグζム−のゾ象−Ｌ８７−９１２．＜ 、これは参照標準としてＳｉＨｍａ）ニアフレロン酸Ｔ２．。

１　、　ｅａｔ、＄　Ｈ１７５１を使用！２、カルバゾール法、Ｂｉｔｔｅｒ及 びＭｕｉｒ、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、４．３３０（１９６２）の変法で検定 。

ｂ、工」Ｌ分１−’＃ 約７００，０００〜約１．５００，０００ドルトン。これは本貫的にＬａｕ−ｒ ｅｎｔ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　４２．４７６（１９６ ０）によって記載された極限粘度数から計算。固有粘度と分子量との代表的計算 を以下に示す。

［糊ユ盈ｙ全１ＪＬ ヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）溶液の粘度を毛管粘度計によって測定した 。サンプルの流動時間（１）を測定し純溶媒の流動時間（１）と比較した。

粘度計：Ｃａｎｎｏｎ−Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅ希釈粘度計サイズ１００（Ｃａｎｎ ｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、）溶液　：０．２Ｍ塩化ナトリウム中の０ ．１％ヒアルロン酸ナトリウム 温度　＝２５℃±０．０１ 匣１」Ｌ１９１じＬ ηｒｅ１．−純溶媒に対する溶液粘度の変化な示す相対粘度対照η　対照ρ×対 照ｔ ρ−密度 ｔ−流動時間（秒） ηｓｐ　−比粘度。羊位１に比較し７た粘度増加の潤定値。

試料を一対照ｔ ηｓｐ／Ｃ−減少粘度 Ｃ一温度ｇ／ｒｄ （η）　−伺有粘度（極限粘度数） 匿宜呈且七ｎ−Ｑ汲廻 Ｏｏ１％ヒアルＩコン酸ナトリウム；８液と、二のン容液の２倍、３倍及び４ｆ ＆希釈溶液とｃ’）粘度を測定１．５た、しアルｒ７ン酸すｌ〜ツリウム濃度は カルバゾール法で測定した。ｓｐ／ＣとＣに対してブロワ）Ｌ、Ｃ＝Ｏまで直線 状に外挿し、た。この線とＹ軸との交点から（η）を決定した。

Ｌｉｉ省状−を− 実駅的に確定したＭａｒｋ−１１ｏｕｗｉｉｋ７係式％式％ （式中のＭｌ、１分子量をドルトンで示す）からヒアルロン酸ナトリウムの分子 量を決定した。この関係式を使用して産生ＮａＨ＾の種々のロットを分子量を決 定した。関係式を表■に示す。

８００　３５０．０００ １．２００　５９０．０００ １．６００　８６０．０００ ２．０００　１Ｊ４５，０００ ２、Ｂｏｏ　１，６００，０００ ３．２００　２，１０免没東−一− Ｃ，グルクロン　Ｎ−アセエクグ」≦Ｌ丈ユニ」旦那ｙΩ上工：１／１゜Ｍｏｒ ｇａｎ　ａｎｄ　Ｅｌｓｏｎ法、Ｍｅｔｂｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ ｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、８９（１９８０）の変法によってＮＡＧを検定し た。

ｄ、１丞！：：１０％±２％ ｅ、夕」仁パ３賢質−：’−１％未満、　ＢｒａｄｆｏｒｄのＣｏｏｍａｓｉｅ 　ｂｌｕｅ法（＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２．２４８（１９７６））で検定 。

ｆ、九上曳−ワ１（イジＬンｓ５％±１％、炎光分析で検定。

ｇ、匪１１倉、ｉｌ−：０．０５％未満。塩酸中で加水分解後にＲｏｄｅｎ等の 濁り測定法、Ｍｏｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　２８．７３（１９７２）で測 定。

ｈ、　ｆＬＬＬ：０．５％未満。波長２６０ｎ＋で１％溶液の吸光度の測定によ り検定。

ｉ、　ｍのｊ［無−；この測定には１％溶液に対して以下の方法を用いる。（ｉ ＞ウサギのＤｒａｉｚｅ皮膚刺激テスト、　Ｊ、）［、Ｄｒａｉｚｅ、「食品、 薬物及び化粧品中の化学物質の安全性の査定＾ｐｐｒａｉｓａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ 　５ａｆｅｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ｉｎ　Ｆｏｏｄｓ。

Ｄｒｕｇｓ　ａｎｃｌ　Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓｊ、　Ａｓ５ｏＣｉａｔｉｏｎ　ｎ ｆ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　ＤｒｕｇＯｆＩｉｅｉａ！ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔ ｅｄ　５ｔａｔｅｓ、＾ｕｓｔｉｎ＋Ｔｅｘａｓ−ｐｐ、４６−４９（１９５９ ）　：（ｉｉ　）モルモッ１への遅延接触過敏性テスト、Ｍａｇ−ｎＩＪｓｓ　 ｏ　ｎ及びＫｌｉｇｍａｎ、　Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、５２．２ ６８　（１９６９）。

グレード　■〜！とよ一７！ハ立−ワ〜ン二醇ｆｉ、−、！、：−リー、ウーノ さ一グレ・−ド■のヒアル１フン酸ナトリウムは手順■の段階Ｂによる精製又は 手順■の精製後に得られる「臨床用グレード」のヒアルロン酸すトリウムである 。その特性を以下に示ず。

ａ、ｈ７−ノヒ’、、１ＬＬ１２トー刀−、□’ｙ−−み一含−Ｊｉ、、、−： 　８８〜９２％　。

ｂ、ｌ立１光ｆｉ　ニアＸ　ｉｏ’ドルＩ・ンより大きい。通常は手［Ｉの段階 Ｂ″′Ｃ′Ｃ′Ｃ′Ｃ精製そ菫は約２〜約３．５ｘ　１０”ドルトンの範囲であ り手順■で精製されたＮａＨＡの分子量は約２〜約４．４Ｘ　１０’ドルトンの 範囲である。これらの分子量範囲は前記のごとく極限粘度数から計算した。

Ｃ５□−２−ユＪＢＥ−乙（チールーグ、Ｑｚニー丈ミー乙＠此−：１／１゜ｄ 、　ｊｔ□−：１０％±２％。

ｅ、ム乙仕ｌ−ヌび検出不能（０，０１％未満）。

ｆ、史上」−リ１と歪！し乙＝５％上１％。

［！、　１１【含ｌ；検出不能（０，００１％未満）。

ｈ−ｔｌＪＬ：検出不能（０，０２％未満）。

ｉ、剌艷１：検出不能（０，２％未満）。

中性糖は加水分解後のサンプルで測定する。２Ｎ）リフルオロ酢酸中で１２０℃ で１時間加水分解し１次に減圧乾燥する。

０．０２Ｍ酢酸ナトリウムで子処理したシリカゲル薄層プレー１□　（０，２ｍ ｍ）を用いて薄層クロマトグラフィーな行う。加水分解したサンプルと参照標準 とをスポットし９０：１０のアセトン：水で展開する。硫酸で炭化して糖スポッ トを検出する。

ｊ−ル１先：無。１％溶液をウサギに注射し当業者に公知の標準方法で発熱性を 測定する。

ｋ、炎症活恒０逃潅玄−：この特性はマウスを用いた感受性アッセイ法で測定す る。この方法は炎症性物質の導入後のＩｌ＆膜内への白血球特に多形核白血球及 びマクロファージの遊走に基づく、これら細胞は超酸化物ラジカルを生じるよう に炎症プロセスで１５作される。遊走と感作とを以下の手順で検定する。マウス ２〜３びきずつのグループに１＆！のサンプルを腹膜的注射する。２・１時間段 に各＠物の腹膜をを５２のＥａｒｌｅ培地で３回洗浄する。同グループのマウス の洗浄物な合わせる。細胞を１．５０ＯＲＰＨて′１０分間沈降させ１ｍｌに再 度懸濁させ゛Ｃ計数する０次にサンプルの容量を４Ｘ１０’紺胞／−になるよう に調整し０．２５ｍｊずつのサンプルを０．５ｍ！！の２〃９７ｍｅのシトクロ ムＣと勾配量の（０，２，１０及び最終２０ｒｎｇ）酢酸ミリスチン酸ホルボー ル（ｆ’Ｎ＾）とによって９０分間インキュベートｒる。ＰＨ＾は酸化性「放出 ｊ系の活性化因子である。

培地を１．５００ＲＩ’Ｍで１５分間遠心し、上清の吸光度を５５０ｎｍで測定 する。

腹膜細胞数の増加とＰＨ八に反応しシ１−クロムＣを減少さぜる最大能の増加と の双方によって炎症が示される。従って、炎症指数は１びきのマウスから得られ た白血球全部の活性（形成された超酸化物ラジカルのナノモル）として定義され る。

炎症指数が生理食塩水だけを注射したマウスに比較して有意に増加していないと きはサンプルが非炎症性であると判定する。

国際調査報告 ｌ＋ｌｌｅ＋ｓ＋ｂａ〜ＩＡＤＩｌｋｍｌ研Ｎ６．　ＰＣＴ／ｌＪｓ８６１００ （１６６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ　ＨＡ−１１６　 ＡＴＣＣ　Ｎｏ．３９９２０なる微生物及びこの菌に由来の突然変異体。 ２．適当な栄養培地中で適当な条件下でｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の微生物 を激しい攪拌を伴って増殖させ次にヒアルロン酸ナトリウムを培地から回収する ステップから成り、前記培地が、炭素源として約０．２〜１０ｇ／ｌの範囲の実 質的に一定の濃度の糖成分を含有し、約６．５〜７．５の範囲の実質的に一定の ｐＨをもち、約０．０５ｇ／ｌを上回る実質的に一定の濃度のマグネシウムイオ ンを含有しており、微生物にヒアルロン酸ナトリウムを産生させ、このように産 生したヒアルロン酸ナトリウムを培地中に分泌させることを特徴とする方法。 ３．微生物がＳｔｒｅｐｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ種である ことを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。 ４．微生物がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、ＨＡ −１１６、ＡＴＣＣ３９９２０であることを特徴とする請求の範囲３に記載の方 法。 ５．適当な条件が培地の通気を含んでおり、この通気が、毎分培地容量当たり空 気約０．５容量を上回る速度で行なわれることを特徴とする請求の範囲２に記載 の方法。 ６．適当な栄養培地が以下の成分を以下の濃度：成分　　　　　　　　　濃度 カゼイン加水分解物　　約１０〜３０ｇ／ｌ酵母抽出物　　　　　　約５〜１５ ｇ／ｌＮａＣｌ　　　　　　　約２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０　約０．５ｇ／ｌ以上Ｋ２ＨＰＯ４　　　　　約２．５ｇ ／ｌグルコース　　　　　　約２〜１５ｇ／ｌで含有することを特徴とする請求 の範囲２に記載の方法。 ７．ヒアルロン酸ナトリウムの回収が、微生物と培地中の不溶なその他の物質と を除去すべく微生物含有培地を処理し、培地からヒアルロン酸ナトリウムを沈澱 させ、次に沈澱物を回収するステップを含むことを特徴とする請求の範囲２に記 載の方法。 ８．更に、沈澱物を粉砕し次に乾燥するステップを含むことを特徴とする請求の 範囲７に記載の方法。 ９．更に、微生物を除去するための培地の処理以前に微生物含有培地のｐＨを約 ５．０に調整し、次に温度約８０℃〜９５℃で適当な時間培地を加熱することを 特徴とする請求の範囲７に記載の方法。 １０．培地を約９０℃で約２０分間加熱することを特徴とする請求の範囲９に記 載の方法。 １１．培地を約８０℃で約４０分間加熱することを特徴とする請求の範囲９に記 載の方法。 １２．処理がろ過を含むことを特徴とする請求の範囲７に記載の方法。 １３．ろ過がけい藻土を用いるろ過を含むことを特徴とする請求の範囲１２に記 載の方法。 １４．沈澱が、沈澱物を生成すべく第１有機溶媒を培地に添加し、３％酢酸ナト リウム水溶液に汰澱物を再度溶解し、沈澱物を生成すべく第２有機溶媒を添加し 、沈澱物を３％酢酸ナトリウム水溶液に再度溶解し、活性炭を添加して懸濁液を 形成し、懸濁液をろ過し、ろ液に第３有機溶媒を添加してヒアルロン酸ナトリウ ムの沈澱物を生成するステップを含むことを特徴とする請求の範囲７に記載の方 法。 １５．第１、第２及び第３の有機溶媒の各々がイソプロパノール、エタノール又 はアセトンであることを特徴とする請求の範囲１４に記載の方法。 １６．第１、第２及び第３有機溶媒がイソプロパノールであることを特徴とする 請求の範囲１５に記載の方法。 １７．更に、培地から微生物を除去するための処理以前に微生物含有培地のｐＨ を約７．０に調整し、培地を温度約４℃〜１５℃に冷却し、次に３％酢酸ナトリ ウム水溶液で培地を希釈することを特徴とする請求の範囲７に記載の方法。 １８．更に、培地から微生物を除去するための処理以前に微生物含有培地のｐＨ を約７．０に調整し、培地を温度約４℃〜２０℃に冷却し、次に３％酢酸ナトリ ウム水溶液で培地を希釈することを特徴とする請求の範囲７に記載の方法。 １９．更に、培地から微生物を除去する処理以前に微生物含有培地のｐＨを約７ ．０調整し、培地を温度約４℃〜１５℃に冷却し、次に３％酢酸ナトリウム水溶 液で培地を希釈することを特徴とする請求の範囲１４に記載の方法。 ２０．更に、沈澱物を０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液に再度溶解し、塩化セチルー ピリジニウムを添加してヒアルロン酸のセチル−ピリジニウム塩を形成し、該セ チル−ピリジニウム塩を（約１Ｍ以上の）ＮａＣｌ水溶液とエタノールとに溶解 し、有機溶媒を添加し、ヒアルロン酸ナトリウムを回収することを特徴とする請 求の範囲１９に記載の方法。 ２１．更に、回収したヒアルロン酸ナトリウムを０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液に 再度溶解し、塩化セチル−ピリジニウムを添加してヒアルロン酸のセチル−ピリ ジニウム塩を再度形成し、該セチル−ピリジニウム塩を（約１Ｍ以上の）ＮａＣ ｌ水溶液と１０％エタノールとに溶解し、ヒアルロン酸ナトリウムを有機溶媒で 沈澱きせ、該ナトリウム塩をＮＡＣｌ溶液に溶解し、得られた溶液をケイ酸マグ ネシウム吸着剤と接触させて不純物と残留セチル−ピリジニウムイオンとを除去 し、溶液を殺菌し、無菌有機溶媒を添加して溶液からヒアルロン酸ナトリウムを 沈澱させることを特徴とする請求の範囲２０に記載の方法。 ２２．有機溶媒がイソプロパノールであることを特徴とする請求の範囲２１に記 載の方法。 ２３．更に、ヒアルロン酸ナトリウム沈澱物を無菌条件下で風乾することを特徴 とする請求の範囲２１に記載の方法。 ２４．ケイ酸マグネシウム吸着剤がフロリジルであることを特徴とする請求の範 囲２１に記載の方法。 ２５．ヒァルロン酸ナトリウムの回収が、培地に第１有機溶媒を添加して沈澱物 を生成し、より多くの有機溶媒で沈澱物を洗浄し、適当な水溶液に沈澱物を再度 溶解し、活性炭を添加して懸濁液を形成し、懸濁液をろ過して残留微生物とその 他の不溶物質とを除去するステップを含むことを特徴とする請求の範囲２に記載 の方法。 ２６．更に、第１有機溶媒の添加以前に微生物含有培地のｐＨを約５．０に調整 し、培地を温度約８０℃〜９５℃で適当な時間加熱することを特徴とする請求の 範囲２５に記載の方法。 ２７．適当な時間が４０分間であり温度が８０℃であることを特徴とする請求の 範囲２６に記載の方法。 ２８．ろ過がけい藻土を用いるろ過であることを特徴とする請求の範囲２５に記 載の方法。 ２９．適当な水溶液が３％酢酸ナトリウムであることを特徴とする請求の範囲２ ５に記載に方法。 ３０．更に、ろ液に第２溶媒を添加して沈澱物を形成し、沈澱物を３％酢酸ナト リウム水溶液に再度溶解し、溶液をろ過し、ろ液に第３有機溶媒を添加してヒア ルロン酸ナトリウムの沈澱物を形成することを特徴とする請求の範囲第２５に記 載の方法。 ３１．第１、第２及び第３の有機溶媒の各々が、イソプロパノール、エタノール 又はアセトンであることを特徴とする請求の範囲３０に記載の方法。 ３２．第１、第２及び第３の有機溶媒がエタノールであることを特徴とする請求 の範囲３０に記載の方法。 ３３．更に、第３有機溶媒の沈澱物を粉砕し次に乾燥することを特徴とする請求 の範囲３０に記載の方法。 ３４．第１有機溶媒添加以前に微生物含有培地のｐＨを約７．０に調整し、培地 を温度約４℃〜２０℃に冷却することを特徴とする請求の範囲２５、２６又は３ ０に記載の方法。 ３５．適当な水溶液が、０．１％のパラヒドロキシ安息香酸メチルエステルを含 有する０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液であることを特徴とする請求の範囲２５に記 載に方法。 ３６．更に、ヒアルロン酸塩溶液に０．１５Ｍ　ＮａＣｌ中の塩化セチル−ピリ ジニウムを添加してヒアルロン酸のセチル−ピリジニウム塩を形成し、１０％エ タノール含有の（約１Ｍ以上の）ＮａＣｌ水溶液に該セチル−ピリジニウム塩を 再度溶解し有機溶媒を添加してヒアルロン酸ナトリウムを回収することを特徴と する請求の範囲３５に記載の方法。 ３７．更に、回収したヒアルロン酸ナトリウムを０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液に 毎度溶解し、塩化セチル−ピリジニウムを添加してヒアルロン酸のセチル−ピリ ジニウム塩を再度形成し、該セチル−ピリジニウム塩を１０％エタノール含有の （約１Ｍ以上のＮａＣｌ水溶液に再度溶解し、有機溶媒を添加してヒアルロン酸 ナトリウムを沈澱させ、沈澱物を無菌１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液に再度溶解し、得ら れた溶液をケイ酸マグネシウム吸着剤と接触させて不純物と残留セチル−ピリジ ニウムイオンとを除去し、溶液を殺菌し、無菌有機溶媒を添加して溶液からヒア ルロン酸ナトリウムを沈澱させることを特徴とする請求の範囲３６に記載の方法 。 ３８．有機溶媒がエタノールであることを特徴とする請求の範囲３７に記載の方 法。 ３９．更に、ヒアルロン酸ナトリウムを無菌条件下で窒素によって乾燥すること を特徴とする請求の範囲３７に記載の方法。 ４０．請求の範囲２、７、１３、１７、１９、２５、３０、３４、３６又は３７ のいずれかに記載の方法によって製造されたヒアルロン酸ナトリウム。 ４１．分子量約７００，０００〜１，５００，０００ドルトンでグルクロン酸対 Ｎ−アセチルグルコサミンの比１：１をもつヒアルロン酸ナトリウム約８７％〜 ９１％と、約８〜約１２重量％の水と約４〜約５重量％のナトリウムイオンと約 ０．１重量％未満のタンパク質と約０．０５重量％未満の硫酸塩と約０．５重量 ％未満の核酸とを含むことを特徴とする皮膚刺激性のないヒアルロン酸ナトリウ ム組成物。 ４２．平均分子量約２〜約３．５×１０６ドルトンでグルクロン酸対Ｎ−アセチ ルグルコサミンの比１：１をもつヒアルロン酸ナトリウム約８８〜９２重量％と 、約８〜約１２重量％の水と約４〜約６重量％のナトリウムイオンと０．０１重 量％未満のタンパク質と０．００１％未満の硫酸塩と０．０２重量％未満の核酸 と０．２重量％未満の中性糖とを含むことを特徴とする発熱性及び炎症活性のな いヒアルロン酸ナトリウム組成物。 ４３．平均分子量約２〜約４．４×１０６ドルトンでグルクロン酸対Ｎ−アセチ ルグルコサミンの比１：１をもつヒアルロン酸ナトリウム約８８〜９２重量％と 、約８〜約１２重量％の水と約４〜約６重量％のナトリウムイオンと０．０１重 量％未満のタンパク質と０．００１％未満の硫酸塩と０．０２重量％未満の核酸 と０．２重量％未満の中性糖とを含むことを特徴とする発熱性及び炎症活性のな いヒアルロン酸ナトリウム組成物。 ４４．請求の範囲４１、４２又は４３に記載のヒアルロン酸ナトリウムと適当な 担体とを含む組成物。 ４５．最小粘度約３．５ｍ３／ｋｇ、最小平均分子量約３．５×１０６ドルトン 、濃度２５℃及び波長４３６ｎｍで測定した比旋光度約１５５°〜１６５°、タ ンパク質含量約１ｍｇ／ｇ未満、波長２５７ｎｍでの吸光度約０．５未満、内毒 素約０．０５ｎｇ／ｍｌ未満、鉄約０．２ｍｇ／ｇ未満、銅約０．２ｍｇ／ｇ未 満であり、生理的緩衝液に溶解した組成物の１％溶液１ｍｌをフクロウザルの存 在する硝子体液のほぼ１／２と置換した場合、このフクロウザルの眼の水性体液 １ｍｍ３当たりの白血球の浸透が約２００未満であることを特徴とする高分子量 ヒアルロン酸ナトリウム組成物。 ４６．平均分子量が３．５×１０６ドルトンより大きいことを特徴とする請求の 範囲４１、４２又は４５に記載のヒアルロン酸ナトリウム組成物。 ４７．平均分子量が４．４×１０６ドルトンより大きいことを特徴とする請求の 範囲４１、４３又は４５に記載のヒアルロン酸ナトリウム組成物。 ４８．ヒアルロン酸を産生する微生物を適当な突然変異誘発物質で処理してその 変異体を産生し、変異体を適当な固体培地で増殖させ、ムコイドコロニーを同定 し、かかるコロニーを回収し、回収コロニーを血液寒天培地で増殖させ、ヘモグ ロビンを溶解しない微生物コロニーを選択するステップを含む溶血活性をもたな いヒアルロン酸を多量に産生する微生物の選択方法。