JPS62257901A

JPS62257901A - ヒアルロン酸の製造法

Info

Publication number: JPS62257901A
Application number: JP10110886A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Morikawa; 森川　清志; Akio Hamai; 浜井　昭夫; Katsuyuki Horie; 克之堀江
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1986-05-02
Filing date: 1986-05-02
Publication date: 1987-11-10
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: JPH0630603B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の技術分野］本発明は、ヒアルロン酸（以下ｒＨＡＪという）の製造
法に関し、更に詳しくは、ＨＡ産生閑を糖質含有培地で
培養し、培養物からＨＡを採取するＨＡの製造法に関す
る。

［従来の技術及びその問題点］ＨＡは、ウシの硝子体、ヒトのＸ　４ｔ’ｒ、関節液、
皮ｊａ、ニワトリのトサカ等、動物の結合組織中に広く
存在する直鎖状の高分子物質で酸性ムコ多糖と称せられ
る物質群の一種である。

ＨＡの水溶液は強い保水性、粘弾性を示し、生体内では
細胞間隙に水を保持したり、細胞内でシェリ一様のマト
リックスを形成し、細胞を保持したり、細胞間物質の移
動を制御したり、更には外からの機械的侵襲や細菌感染
に対する防禦に役立っている。

ＨＡの利用としては、眼科領域（網膜剥離）に関しては
、例えばモダン・ブロブレムズ・イン・オブタルモロジ
ー（Ｍｏｄｅｒｎ　Ｐｒｏｂｌｅｍｓ　１ｎＯｐｈｔｈ
ａｌａ＋ｏｌｏｇｙ　）　、第１２巻、３７０〜３７７
頁（１９７４年）に、整形外科領域（関節炎）に関して
は１例えばアクタ・ベテリナリア・スカンジナビア（Ａ
ｃｔａ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ　５ｃａｎｄｉｎａｖ
ｉａ）　　、第１７巻、３７９〜３９４頁（１９７６年
）に、皮膚科領域（皮膚炎）に関しては、例えばオスペ
ダリ・イタリア・チルギア（Ｏｓｐｅｄａｌｉ　Ｄ’ｉ
ｔａｌｉａｃｈｉｒｕｒｇｉａ　）　、第１９巻、１７
３〜１８８頁（１９６８年）にその使用が報告され、慢
れた治療効果が認められており、ＨＡの医薬品とじての
用途の期待は大きい。

このようなＨＡの原料としては、安価かつ大量に供給で
さるものが好ましく、主にニワトリのトサカ等の動物由
来のものが利用されているが、動物由来のものは生産・
供給が一定せず、生産管理の容易な微生物由来のものが
強く望まれている。

微生物由来のＨＡは古くからよく知られるところであり
、例えばジェ一番ニス・ブリマコンビ−（Ｊ、　Ｓ、　
Ｅｌｒｉｍａｃａｍｂｅ）及びジェー・エム・ウェッへ
−（Ｊ、　Ｍ、　Ｗｅｂｂｅｒ）共著による１９６４年
出１ｉＲ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社、アムステルダム）のム
コポリサッカライド（Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒ
ｉｄｅ）　４３頁には、エアロバクター・エアロゲネス
（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｚｅｎｅｓ　）　、　
　ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）等の連鎖球菌、シュー
ドモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ）で代表される菌類のＨＡ産生能につ
いて記載されている。

連鎖球菌由来のＨＡは、古くはジャーナル・オブ・ゼネ
ラル・マイクロバイオロジ−（Ｊａｕ　ｒｎ♂ｌｏｆ　
　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　）
　　　、　　第　１４￥８　、１３４〜１４２頁（１９
５６年）にＡ群、Ｃ群合わせて数棟についてＨＡ産生量
とＨＡ分解酵素（ヒアルロニダーゼ）産生能を調べた結
果が報告されており、ＨＡ産生量は培地１００４当り１
０〜２０ＢでＨＡ産生と同時にヒアルロニダーゼを産生
ずる株では一度産生じたＨＡが消失することが指摘され
ている。

ＨＡ産生増強のための培養法に関する報告はほとんどな
されておらず、わずかにグルコース添加量について検討
した結果が報告されているにすぎない、即ち、アプライ
ド・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ）　、第１５巻、１４０９〜１４１３
頁（１９６７年）にはＡ群の連鎖球菌を用いてヴイール
・インヒユージョン培地によりグルコース１％までの影
響を、醗酵工学雑誌、第５３巻、６４８〜６５７頁（１
９７５年）にはアウレオバシデューム自プルランス（Ａ
ｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎＳ）を用
いて酵母エキスと各種塩類からなる培地によりグルコー
ス１０％までの影響をそれぞれ検討しており、いずれも
グルコース添加量に応じて産生量が増大すると報告して
いる。

本発明者らは、ＨＡ産生量を増大せしめる添加成分につ
いて鋭意研究を重ねた結果、グルコサミン、ピルビン酸
、アセトインを培地に含有させることによりＨＡ産生量
が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。

［発明の構成］本発明は、ＨＡ産生菌を糖質含有培地で培養し、培養物
からＨＡを採取するＨＡの製造法において、該培地中に
グルコサミン又はその塩、ピルビン酸又はその塩及びア
セトインからなる群から選ばれる少なくとも１種を添加
することを特徴とするＨＡの製造法に関するものである
。

本発明に用いる微生物としては、ＨＡ産生能を有する菌
類であれば如何なるものでもよい、かかるＨＡ産生αＩ
としては、例えば、ストレプトコッカスｊ試に属するス
トレプトコンカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｏｅｐｉｄｅ＋５ｉｃｕｓ　；この
うち、Ｎｏ、６０００１株及びＮｏ、６００１９株は、
それぞれ微工研菌寄第８６７３号及び同第８６７４号と
して通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（以下
「微工研」という）に寄託されている。）、ストレプト
コッカス・エキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｉ
　　；　Ｉ　Ｉ　Ｄ　６７９号として東京大学医科学研
究所に寄託されている。）、ストレプトコッカス・エキ
シミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｕｓｅｑｉｓｉｍｉ
ｌｉｓ；　Ｉ　Ｉ　Ｄ　　６８１として東京大学医科学
研究所に寄託されている。）、ストレプトコッカス・デ
ィスガラクチイエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄ７ｓ
ｇａｌａｃｔｉａｅ；　Ｉ　Ｉ　Ｄ　　６７８号として
東京大学医科学研究所に寄託されている。）、ストレプ
トコッカス゛・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｐｙａｇ、ｅｎｅｓ、’ＩＩＤ　　７１５号として
東京大学医科学研究所に寄託されている。）；シュード
モナス屈に属するシュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　；　Ｉ　Ａ
　Ｍ　　１０９５号として東京大学応用微生物研究所に
寄託されている。）；パスツレラ屈に属するパスツレラ
・ムルトシーダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ａ＋ｕｌｔ
ｏｃｉｄａ　；　Ｎ　Ｉ　ＡＨ１１７９号として鳥林水
産省家畜衛生試験所に寄託されている。）等が挙げられ
る。

前述の微生物のうち、特に安全性の面から取扱い易い、
ランスフィールド（Ｌａｎｃｅ　ｒ　ｉｓ　ｌｄ）の血
清学的分類で０群に屈する連鎖球菌（ストレプトコッカ
ス（Ｓｔｒｅｐヒｏｃｏｃｃｕｓ）属細ｒ：Ｍ）ノヒア
ルロニダーゼ非産生株、例えばストレプトコッカス・ズ
ーエピデミカス６０００１株、同６００１９株、ストレ
プトコッカスＯエキｌＩＤ６７９株を用いることが好ま
しい。

本発明において、培地としては炭素源として砧質を含有
する培地を用いる。該培地には、通常の窒素源及び無機
塩類を適宜添加する。

糖質としては、グルコースが最も好ましいが、デンプン
加水分解物、廃糖蜜、水飴、ショ糖、乳糖、果糖等を用
いてもよい、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、
肉エキス、心臓エキス等の一般的原料を用いることがで
きる。無機塩類としては、ナトリウム、カリウム、カル
シウム等のリン酸塩、炭酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩等
を必要に応じて添加する。

前述のように、ＨＡ製造の基本培地としては一般的な細
菌の増殖用培地を用いることができるが、培養物からの
ＨＡの単離・精製を考慮した場合、可能な限り培地中の
蛋白量が少なく、組成が単純でかつＨＡ産生螢の高い培
地が好ましい。

好ましい基本培地としては、例えば、酵母エキス０．５
０％、ペプトン０．７５％、亜硫酸ナトリウム０．０２
％、グルコース１〜３％、ｐＨ７、５からなる培地が挙
げられる。

本発明においては、増強剤としてグルコサミン又はその
塩、ピルビン酸又はその塩及びアセトインからなる群か
ら選ばれる少なくとも１種を添加する。グルコサミンの
塩としては、例えば塩酸塩、酢酸塩、ギ酸塩等が挙げら
れ、ピルビン酸の塩としては、例えばナトリウム、カリ
ウム、リチウム等のアルカリ全屈及びアルカリ土類金属
の塩が挙げられる。

前記増強剤の添加割合は、例えばグルコ−２１〜３％添
加培地を用いた場合、グルコサミン又はその塩では、通
常０．２５〜３．０％、好ましくは０．５〜２．０％で
あり、ピルビン酸又はその塩では、通常０．２５〜３．
０％、好ましくは０．５〜２．０％であり、アセトイン
では、通常０．１２５〜１．０％、好ましくは０．１２
５〜０．５％である。

菌の培養では、通常、予めウマ等の血液加寒天培地にお
いて３０〜３７℃で１晩種培養した菌を適当な液体培地
に２〜３白金白金挿接、時々ｐＨを中性にアルカリ水溶
液で補正しながら８〜１６時間種培養を行う、この培養
液をＨＡ産生培地に対して１〜３％接種し、３０〜３７
°Ｃで培地を中性に保ちながら２０〜４０時間振盪培養
する（生産培養）、ＨＡの産生には通気攪拌による好気
的培養とｐＨ制御が必要である。

培地の中和は、通常、濃アルカリ水溶液、例えば水酸化
ナトリウム水溶液を適時滴下したり、粉末の炭酸カルシ
ウムを３〜５％添加することにより行う。

増強剤は、前記培養時において、生産培養開始時又は開
始後３〜４時間後の菌の増殖が始まった頃に、全量を又
は数回に分けて添加することが好ましいが、種培養時に
添加することにより生産培養時に存在せしめることとし
てもよい。

培養液からＨＡを分離・採取するにあたっては１通常の
多糖類の分離・採取法を利用することができる０例えば
、培養液中の菌体等の不溶物を濾過又は遠心分離により
分別後、この溶液から、例えばエタノール等の溶媒沈殿
剤又は塩化セチルピリジニウム等の沈殿剤を単独で又は
併用することにより精製ＨＡを分取することができる。

以上のようにして得られたものについてウロン酸゛含量
を測定し、又はセルロースアセテート膜を用いる電気泳
動法によってＨＡであることを確認した。

［発明の実施例］以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

実施例１酵母エキス（極東製薬株製；以下回様）０．５０％、ペ
プトン（極東製薬■製；以下同様）０．７５％、亜硫酸
ナトリウム０．０２％。

粉末炭酸カルシウム５％（ｐＨ７、５）にグルコースの
添加割合を１〜３％に変化させた培地についてＨＡ産生
に及ぼすグルコサミン塩酸塩、ピルビン酸ナトリウム、
アセトインの各々の添加割合の影響を検討した。

予め８時間種培養したストレプトコッカス・ズーエピデ
ミカス６００１９株（微工研菌寄第８６７４号）を２％
接種し、３７°Ｃで１７時間振盪培養後、培養液を遠心
分離して得た上清液にエタノールを添加してＨＡを沈殿
させた後、沈殿物のＨＡ量を分析した。結果を表１に示
す。

表１実施例２ストレプトコッカス・ズーエピデミカス６００１９株（
微工研菌寄第８６７４号）をウマ血液寒天培ｉｆ！！（
極東製薬■製−以下同様）に接種し、３７℃で１晩培養
した。酵母エキス０．５０％、ペプトン０．７５％、亜
硫酸ナトリウム０．０２％、フェノールレッド０．００
２％（ｐＨ７，５）からなる培地の２倍濃縮液５０−を
５００４容振盪フラスコに仕込み、１２１　’Ｃ！で１
５分間加圧滅菌後、別に同様にして滅菌した５０％グル
コース水溶液及び滅菌水をグルコース終濃度１％、滴量
１００−になるように無菌的に加えた後、前記培養菌を
２白金耳接種し、３７°Ｃで８時間振盪培養した。途中
、指示薬（フェノールレッド）の色調を観察しながら３
Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で絶えず培地のｐＨを中性に
保った。この前培養液（種）を、前記と同様にしてグル
コースが２．５％になるように調製した生産培地５５〇
−を含む２交容振盪フラスコ４木に２％（Ｖ／Ｖ）ずつ
無菌的に接種し、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で絶えず
培地のＰＨを中性に維持しながら３７℃で１７時間＠盪
培養した。途中、３木のフラスコについて、アセトイン
並びに予め水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７、５に調整
して０．４５角メンブランフィルタ−で無菌濾過した、
グルコサミン塩酸塩の濃縮液及びピルビン酸ナトリウム
のｃ線源をそれぞれ培地当りの終濃度が０．５％、１．
０％、０．５％になるように培養開始４時間目及びその
後２〜３時間間隔で２回の計３回に分けて添加した。

培養終了後、各々の培養液に塩化ナトリウム１モル及び
塩化ベンザルコニウム１００ＯＰＰＱＩを添加して殺菌
した後、培養液を濾過した。炉液に１．２倍量の９８％
エタノールを加え、生じた沈殿物を分取し、エタノール
で洗浄後、乾燥した。

乾燥物の収量は、培養液１見当り、アセトイン、グルコ
サミン塩酸塩酸塩、ピルビン酸ナトリウムの添加例及び
増強剤無添加例（対照）でそれぞれ１．６ｇ、２．０ｇ
、２．１ｇ、１．１ｇであり、カルバゾール硫酸法でウ
ロン酸含量を定量し、ＨＡ含量として算出したところ、
それぞれ９９．２％、１０１．０％、１００．２％、１
００．８％であった。また、これらの乾燥物をセルロー
スアセテート膜電気泳動（０，１５Ｍピリジン−ギ酸、
　ｐＨ３、０、０、５ｍＡ／ｃｍの条件で３０分間泳動
；アルシアンブルーで染色）に付したところ、標準ＨＡ
と同位置に単一バンドを示し、これらの物質がＨＡであ
ることを確認した。

実施例３ストレプトコッカス・ズーエピデミカス６０００１株（
微工研菌寄第８６７３号）、同６００１９株（微工研菌
寄第８６７４号）及びストレプトコッカス−エキ（ＩＩ
０６７９号）をそれぞれウマ血液寒天培地に接種し、３
７℃で１晩培養した。これらの菌について実施例２と同
様に種培養を行い、この種を酵母エキス０．５０％、ペ
プトン０．７５％、亜硫酸ナリウム０．０２％、グルコ
ース２．５％、粉末炭酸カルシウム５％（ｐＨ７，５）
からなる生産環ｉ！！！１００−を含む５０〇−容振耐
フラスコに２％（Ｖ／Ｖ）ｆつ無菌的に接種し、３７℃
で２０時間振盪培養した。増強剤は実施例２と同様にｙ
ＪｔＡＬ、アセトイン、グルコサミンＩ１％Ｉ塩、ピル
ビン酸ナトリウムを各々０．５％、培養開始時に添加し
た。培養終了後、培養液を遠心分離して得た上清液に１
．２倍量の９８％エタノールを加え、生じた沈殿物を分
取した。沈殿物のＨＡ含量をカルバゾール硫酸法にて定
量し、培養液当りのＨＡ産生量を算出したところ、表２
のとおりであった。

表２（単位：　ｍｇ／ａ／）［発明の効果］本発明によれば、微生物由来のＨＡを高収率で製造する
ことができる。

Claims

【特許請求の範囲】

ヒアルロン酸産生菌を糖質含有培地で培養し、培養物か
らヒアルロン酸を採取するヒアルロン酸の製造法におい
て、該培地中にグルコサミン又はその塩、ピルビン酸又
はその塩及びアセトインからなる群から選ばれる少なく
とも１種を添加することを特徴とするヒアルロン酸の製
造法。