JPH0144721B2

JPH0144721B2 -

Info

Publication number: JPH0144721B2
Application number: JP14489579A
Authority: JP
Inventors: Kyoshi Sato; Kazuhiro Inoe; Hiroshi Korenaga; Shunichiro Ooga; Toshihiko Kumada; Shizuo Kadoya
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1979-11-08
Filing date: 1979-11-08
Publication date: 1989-09-29
Also published as: JPS5667301A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗血栓作用を有する新規な硫酸化多糖
体DF−4639（以下略して単にDF−4639ともいう）
に関する。本発明者らは、微生物生産物の中に抗血栓作用
を有するものを探索した結果、分離番号AT−25
菌の培養濾液およびその菌体抽出液が優れた抗血
栓作用を示すことを見出した。その後種々の研究
を重ねた結果、本発明者らは、その活性本体を分
離精製することに成功し、その本体は硫酸化多糖
体を主構成成分とする新規物質であることを確認
し本発明を完成した。従来硫酸化多糖体としては動物由来のヘパリン
がよく知られているが、微生物によつて直接に硫
酸化多糖体が産生される事実は極めて稀であり、
本発明者らが文献調査した限りでは次の報告が見
られるのみである。すなわち、Darbyらの
Clostridium welchiiの夾膜成分としてデルマタ
ン硫酸様高分子の存在に関する報告（Journal of
Bacteriology、103巻、159頁、1970年）または
SteberらのHalococcus morrhuae菌の細胞壁成
分としてグルコース、マンノース、ガラクトース
から成る硫酸化多糖体の報告（Archives of
Microbiology、105巻、173頁、1975年）の２例
に限られる。しかし、これら既報の生産菌および
産生物質は、本発明にかかわるAT−25菌および
DF−4639とは、本文中に記載の如く明らかに異
なるものである。本発明の硫酸化多糖体DF−4639を生産するに
はDF−4639生産菌を培養すればよいが、最も代
表的な方法は、AT−25菌またはその変異株をそ
の菌が成育し得る培地中で培養し、培養液または
菌体から分離精製することである。 AT−25菌は本発明者らが、土壤試料から新た
に分離した菌であり、分類学的に詳細な検討をし
た結果、新菌類であると推定し、暫定的にミクロ
コツカス属（Micrococcus sp.）AT−25と名付
けて微生物工業技術研究所に寄託保存されている
（寄託番号第5255号）。以下、本菌をAT−25菌と
略記することがある。 AT−25菌の菌学的性質は次の通りである。 (a) 形態球状乃至短桿状（培養後期に球状）0.5〜
0.7×0.7〜1.5μｍ多形性あり運動性なし、
胞子形成なし、グラム染色陽性、抗酸性
なし (b) 各培地における生育状態肉汁寒天平板培養点状または円形状に中程度の発育で、光沢
ある山吹茶色を示すが、拡散性はなし。肉汁寒天斜面培養糸状に生育する他は、の平板培養の場合
と同様であつた。肉汁寒天液体培養菌膜形成はなく、全体に濁りおよび沈査あ
り。肉汁ゼラチン穿刺培養（22℃培養）穿刺線に沿つて生育し、かぶ状に液化す
る。リトマスミルク培地リトマスをやゝ赤変する。また長期培養
（14日以上）では凝固も見られる。 (c) 生理学的諸性質硫酸塩の還元陰性、脱窒反応陰性、
MR反応陰性、VP反応陰性、イン
ドールの生成なし、硫化水素の生成な
し、デンプンの加水分解能なし、クエン
酸の利用能なし、無機窒素源の利用能あ
り、水不溶性の色素生成あり、ウレアー
ゼ作用なし、オキシダーゼ作用なし、
カタラーゼ作用あり、生育の範囲 PH6.0
〜8.5（最適７〜８）、温度10〜37℃（最適27〜
30℃）、好気性、OF反応陰性、下記15
種の糖類からの酸およびガスの生成はなし、(1)
Ｌ−アラビノース、(2)Ｄ−キシロース、(3)Ｄ−
グルコース、(4)Ｄ−マンノース、(5)Ｄ−フラク
トース、(6)Ｄ−ガラクトース、(7)麦芽糖、(8)シ
ヨ糖、(9)乳糖、(10)トレハロース、(11)Ｄ−ソルビ
ツト、(12)Ｄ−マンニツト、（13）イノシツト、
（14）グリセリン、（15）デンプン (d) その他の諸性質フオスフアターゼ作用なし、アルギニ
ンの分解能なし、塩化ナトリウム7.5％中
では生育するもの10％中では生育せず、ノボ
ビオシンおよびリゾチームに対する最小発育阻
止濃度は共に3.1μｇ／mlグアニンおよびシト
シン含量（GC含量）72.9％菌体内色素（黄
色）産生細胞壁成分にジアミノピメリン酸
（DAP）あり以上の菌学的性質をBergey′s Manual of
Determinative Bacteriology、8th Edition、R.
E.Buchanan and N.E.Gibbons（Williams and
Wilkins Co.、1974）の記載に照すると、本菌は
アルスロバクター（Arthrobacter）に属せしめ
るのが適当である。次に硫酸化多糖体DF−4639を得るための基本
的な方法についてのべる。すなわち、DF−4639
を取得するためには用いた菌の培養液および菌体
内にDF−4639が蓄積すればよいわけで、それに
は用いた菌が生育しうる培地であればすべて使用
可能であり、用いた菌が資化しうる炭素源、窒素
源の他に無機塩やビタミン類を単独に、あるいは
適当な割合に組合せて用いることができる。使用
する菌としてはAT−25が適当である。炭素源と
してはブドウ糖、グリセリンなど、窒素源として
は酵母エキス、肉エキス、ペプトン、大豆粉、コ
ーンステイープリカーや燐酸水素アンモニウム、
硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩が用
いられ、そのほかに無機塩としてマグネシウム、
カリウム、鉄、マンガンなどの金属塩の適当量の
添加が可能である。また、DF−4639は硫酸化多
糖体であるので、硫酸ナトリウムや硫酸アンモニ
ウムの如き硫酸塩類を適当量加えることは極めて
有意義である。次に培養温度や培地のPHは使用し
た菌が生育しうる範囲であればよいが、温度は25
〜37℃、PHは6.5〜8.5の間で培養するのが好まし
い。培養は好気的条件で行うのがよく、例えば振
盪培養法もしくは培養槽内で通気撹拌培養を行な
えばよい。培養時間は24時間以上であればよい
が、50〜200時間が好ましい。培養が終了すれば、培養物を遠心分離機にかけ
て菌体と濾液とに分け、濾液については大略以下
に述べる如く処理する。なお、菌体については、
その量が少い場合は無視し得るが、多量の場合は
後述する方法に従い別に処理する。すなわち、濾液に第４級アンモニウム塩、例え
ばセチルピリジニウムクロライド（CPC）の溶
液を加えて撹拌し、生じる沈でんを高速遠心機に
かけて分離して集める。得られた沈でんに適当な
濃度の電解質溶液、例えば10％エタノール含有の
３モル食塩水を加えて撹拌溶解せしめる。エタノ
ールを新たな沈でんが生じなくなる迄加え、生じ
た沈でんを集め、エタノールそしてアセトンで洗
つた後乾燥すれば、粗粉末が得られる。ここに得
られた粗粉末を再び水に溶解し、稀塩酸を加えて
PHを約1.0とした後低温（約５℃）で遠心分離し
て不溶物を除去する。上清を集め、稀苛性ソーダ
液で中和し、これに第４級アンモニウム塩、例え
ばセチルトリメチルアンモニウムブロマイド
（CTAB）水溶液を加えて生じる沈でんを遠心分
離して集める。得られた沈でんを１モル食塩水中
に加えて核酸等の夾雑物を充分に撹拌可溶化した
後、遠心分離して不溶分を集める。この不溶物を
10％エタノール含有の３モル食塩水に加えて約50
℃に加温しつつ溶解する。この溶液にエタノール
を加えて沈でんさせ、生じた沈でんを集めてエタ
ノール、ついでアセトンで洗つた後、再び水に室
温で撹拌しながら溶解させ、約５℃で遠心分離し
て微量の不溶物を除去する。溶液に新たな沈でん
が生じなくなる迄エタノールを加え、生じた沈で
んを集め、順次エタノール、アセトンおよびエー
テルで洗つた後、約70℃で減圧乾燥すればDF−
4639が白色粉末として得られる。一方、菌体からDF−4639を得るには、菌体の
水懸濁液にトルエンなどを加えて室温に放置して
菌体を自己融解させ、菌体内成分を水に移行させ
る。この懸濁液にエタノール40％になる迄加え、
沈でんする蛋白、核酸等を菌体残渣と共に濾過し
て除き、濾液を濃縮してエタノールを留去する。
これにCPC溶液を加えて生じる沈でんを集め、
以下培養濾液の場合と同様に処理する。以上述べたような方法で得られたDF−4639は、
硫酸化多糖体のナトリウム塩として得られ、以下
述べるような物理化学的諸性質を有する。 (a) 元素分析値、糖および蛋白含量５ロツトの値および平均値を第１表に示し
た。

【表】 (b) グルコース、ガラクトース、硫酸基および燐
含量モル比 DF−4639を１規定硫酸中、100℃５時間加水
分解した後炭酸バリウムで中和しDowex50W
（Ｈ型）にかけて得られる流出液を用いて、
Khimらの方法（J.X.Khim and L.P.Zilt、J.
Am.Chem.Soc.、74、2090（1952））を適用して
グルコースとガラクトースを分離定量した。ま
た、硫酸基および燐のモル比はＳおよびＰの含
量（％）から算出した。第２表にグルコースを
1.0モルとした場合の各成分のモル比の１例を
示した。

【表】 (c) アミノ酸およびアミノ糖の含量モル比 DF−4639を３規定塩酸中、100℃16時間加水
分解し、塩酸を留去してアミノ酸分析計にかけ
て定量した結果の１例をグルタミン酸を1.0モ
ルとして第３表に示した。

【表】

【表】 (d) 旋光度〔α〕²⁵ _D−36±1゜（ｃ−1.0、水） (e) 分子量 23000（デキストランを標準物質とするゲル濾
過法における主ピーク） (f) 紫外部吸収２mg／ml水溶液において220〜340nｍに極大
吸収は認められない。 (g) 赤外線吸収スペクトル（KBr錠）図１に示す通り、1240、840（肩）および810
cm^-1に硫酸化多糖特有の吸収を示す。 DF−4639の生物学的諸性質を次に示す。 (a) 試験管内生物活性

【表】

【表】 (b) ラツトにおける線溶誘導活性ラツトを用い、検体投与（静注）前後のユー
グロブリン溶解時間（FLT）を経時的に測定
し、次式により線溶活性増加率（％）として表
現した。線溶活性増加率（％）＝FLT（前値）−FLT（後値
）／ELT（前値）×100

【表】 (c) 急性毒性 LD₅₀1500mg／Kg以上（マウス、静注）以上のごとく、DF−4639は試験管内およびラ
ツトを用いた実験において、ヘパリンと同等もし
くはそれ以上の線溶誘導活性を示すことが確認さ
れた。しかもDF−4639においては、好ましくな
い抗凝固活性がヘパリンに比し著しく弱いという
特徴を有している。さらには赤血球凝集促進作用
も認められず、急性毒性値も1500mg／Kg以上（静
注）を与え、副作用が非常に少なく、抗血栓薬と
して有望である。また、本発明者らは、DF−
4639にはリポプロテインリパ−ゼ活性化作用、抗
がん作用および感染防禦作用などの有用な作用の
あることを動物実験で知見している。次に製造実施例を挙げて説明するが、％は特に
記載があるものを除きＷ／Ｖ％である。実施例１グルコース２％、ヘプトン0.5％、コーンステ
イープリカー0.5％、酵母エキス0.3％、食塩0.5％
および炭酸カルシウム0.3％よりなる液体培地100
mlを含む500mlの振盪フラスコに予め寒天斜面培
地に生育したAT−25菌の１白金耳を接種し、30
℃において３日間振盪培養して種培養液を得た。
次にグリセリン２％、硫安0.5％、燐酸一カリウ
ム0.1％、硫酸ナトリウム0.05％、酵母エキス0.2
％よりなる培地20を30容のジヤーフアーメン
ターに加え、120℃で20分間滅菌したのち、PHを
7.5に調整する。これに種培養液600mlを接種して
温度30℃、通気量毎分10、撹拌毎分250回転の
条件で159時間培養した。得られた培養液を遠心
分離して少量の菌体を除去し、上澄液18に10％
セチルピリジニウムクロライド水溶液500mlを加
え、一昼夜放置した後、沈でん物を遠心分離し
た。この沈でん物を3M食塩−10％（Ｖ／Ｖ）エ
タノール溶液600mlに加え、十分に撹拌して溶解
させた後、エタノール1.6を加えて生じた沈で
んをグラスフイルターを用いて濾別した。この沈
でんをエタノール、次いでアセトンで洗い、乾燥
して粗粉末37.0ｇを得た。この粗粉末を500mlの
水に溶解し、０℃において1N塩酸で約PH1.0とし
て生ずる沈でんを遠心分離して除き、上清を中和
後10％セチルトリメチルアンモニウムプロマイド
水溶液500mlを加え、生じた沈でんを遠心分離し
た。沈でんを1M食塩水で十分に洗つた後、3M食
塩−10％（Ｖ／Ｖ）エタノール溶液150mlを加え、
十分に撹拌して溶解せしめ、エタノール450mlを
加えて一夜放置後、遠心分離して沈でん物を集め
た。この沈でん物をエタノールで洗つた後、再び
水150mlに溶解せしめ、グラスフイルターで濾過
し、少量の残渣を水50mlで洗浄した。濾液および
洗液を合し、撹拌しながらエタノール２中に注
ぎ、白色沈でんを生成せしめた。この沈でんをグ
ラスフイルターを用いて濾別し、エタノール、ア
セトンおよびエーテルで順次洗浄し、55℃で５時
間減圧乾燥し、白色粉末のDF−4639を13.9ｇ得
た。本物質は、本文記載の物性を示すものであ
り、トロンビン活性の50％阻害濃度は0.7μｇ／ml
であつた。実施例２グリセリン２％、可溶性でん粉１％、肉エキス
１％、ペプトン１％および食塩0.2％より成る培
地20を30容のジヤーフアーメンターに加えて
120℃、20分間滅菌し、実施例１と同様にして65
時間培養を行つた。培養終了後、培養液を遠心分
離して、菌体と上清に分けた。上清に10％セチル
ピリジニウムクロライド水溶液150mlを加え、以
下実施例１に従つて分離精製して、DF−4639の
白色粉末を3.2ｇ得た。一方、菌体は1200mlの水
と300mlにトルエン混合液中に懸濁し、時々撹拌
しながら、室温下３日間放置した。トルエンを減
圧下留去後、エタノールを約40％（Ｖ／Ｖ）にな
る迄加え、沈でんして来る蛋白および核酸等を菌
体と共に濾過して除いた。得られた濾液を約１
迄に減圧下濃縮後、10％食塩水30mlおよび10％セ
チルピリジニウムクロライド水溶液100mlを加え
て生じた沈でんを遠心分離した。以下、実施例１
に従つて分離精製し、白色粉末のDF−4639を2.4
ｇ得た。

【図面の簡単な説明】

図１は赤外線吸収スペクトルである。

Claims

【特許請求の範囲】１大部分がＤ−グルコースとＤ−ガラクトース
から成る糖質部分にペプチドグリカン部の結合し
た下記の物性を有する硫酸化多糖体DF−4639（下
記の物性はそのナトリウム塩についてのものであ
る）。 (1) 分子量約23000（ゲル濾過法による主ピーク） (2) 元素分析値 C26.20〜26.90％、H3.77〜3.96％ N0.71〜1.18％、S10.7〜11.6％ P0.75〜1.02％ (3) 糖および蛋白質の含量糖含量（％）：56.4（フエノール硫酸法、ガラク
トース標準）蛋白含量（％）：2.0（ローリー・フオリン法、
牛血清アルブミン標準） (4) 比施光度［α］²⁵ _D−36±1゜（1.0％水溶液） (5) 赤外線吸収スペクトルにおける主要吸収帯
（cm^-1；KBr） 1240、840（肩）、800〜820 (6) 溶解性水に易溶、エーテル、ベンゼン、クロロホル
ム、メタノール、エタノール等の有機溶媒には
殆んど不溶。 (7) 呈色反応フエノール−硫酸、アンスロン−硫酸、ビユ
レツト反応およびローリー・フオリン反応は陽
性、また水解液のエルソン・モルガン反応およ
びニンヒドリン反応も陽性、カルバゾール反応
および坂口反応は陰性。 (8) 塩基性、中性、酸性の区別水溶液のPH６〜８（Na塩として３％） (9) 構成糖および硫酸基、燐の含量Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、
SO₃NaおよびＰ（燐）の含有モル比はＤ−グル
コースを10として、それぞれ約10：63：75：７
である。 (10) 構成アミノ酸およびアミノ酸の含量アミノ酸分析機により分析した結果、グルタ
ミン酸、アラニン、グリシン、Ｌ，Ｌ−ジアミ
ノピメリン酸、グルコサミン、ムラミン酸の存
在モル比は、グルタミン酸を１とした場合、そ
れぞれ約１：２：１：１：２：１の割合であ
る。２硫酸化多糖体DF−4639を有効成分とする抗
血栓薬。