KR860001213B1 - 제암 및 면역자극 작용을 갖는 물질의 제조방법 - Google Patents

제암 및 면역자극 작용을 갖는 물질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

제암 및 면역자극 작용을 갖는 물질의 제조방법
제1도는 본 발명에 사용되는 퓨조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) TF-031(기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1982. 3. 19, 기탁번호 : 820319-01815호)의 형태를 제시하는 현미경 사진이고,
제2도는 후술하는 바의 실시예 1에서 수득되는 TF-500의 적외선 흡수 스펙트럼이며,
제3도는 전술한 물질의 자외선 흡수 스펙트럼이고,
제4도는 후술하는 바의 실시예 2에서 수득되는 TF-500의 적외선 흡수 스펙트럼이며,
제5도는 전술한 물질의 자외선 흡수 스펙트럼이고,
제6도는 후술하는 바의 실시예 3에서 수득되는 TF-500의 적외선 흡수 스펙트럼이며,
제7도는 전술한 물질의 자외선 흡수 스펙트럼이고,
제8도는 후술하는 바의 실시예 4에서 수득되는 TF-500의 적외선 흡수 스펙트럼이며,
제9도는 전술한 물질의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명은 제암물질을 제조하는 신규의 방법, 상술하면, 퓨조박테리움(Fusobacterium)속의 미생물을 디알킬 설폭사이드로 추출처리하고, 생성된 추출물로 부터 TF-500물질 또는 그의 염을 수득함을 특징으로 하여, 후술하는 바의 특성을 갖는 제암물질 또는 그의 염을 제조하는 신규의 방법에 관한 것이다.
근년에 이르러, 여러가지 유형의 암환자에 대한 환자의 면역 기능을 향상시키고, 이에 수반하여 제암효과를 수득함을 특징으로 하는 약제가 광범위하게 사용되었다.
본 발명의 발명가들은 구강으로 부터 분리시킨 퓨조박테리움 속의 미생물을 디d알킬 설폭사이드로 추출처리하여 수득된 성분의 약물학적 활성을 시험한 결과 추출물로 부터 수득한 특성 성분은 제암활성을 가지며, 숙주 중재 항암 활성 또는 숙주의 면역성을 증가시키거나 면역성을 이용함으로써 간접적 제암활성을 가지며, 독성이 매우 낮음을 발견하고, 이 성분을 제조하는 방법을 연구하였으며, 본 발명을 완결하였다.
본 발명의 목표는 퓨조박테리움 속의 미생물을 디알킬 설폭사이드로 추출 처리하고 생성된 추출물로 부터 제암 물질을 수득함을 특징으로 하는 신규의 공정을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 그외 목표는 후술하는 바에서 명백히 알려질 것이다.
본 발명에 사용하는 미생물로서 퓨조박테리움 속의 TF-500물질-생성 균을 사용할수 있으며, 예를들면, 바람직하게는 퓨조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)에 속하는 균을 사용한다. 특히 퓨조박테리움 뉴클레아툼 TF-031(기타번호 : 820319-01815호, FERM 5077 ; ATCC 31647) 및 미생물학의 일반지식에 있어서 전술한 바의 특성을 가질 것으로 고려되는 균주 즉, 자연 돌연변이체 또는 인공적으로 변형시킨 균주를 사용한다.
퓨조박테리움 뉴클레아툼 TF-031(기타번호 : 820319-01815호)의 세균학적 특성은 후술하는 바와같다 :
Figure kpo00001
Figure kpo00002
전술한 제조과정을 상술하면 다음과 같다.
(Ⅰ) 균의 배양
혐기성 균 배양에 대한 통상적인 방법으로 퓨조박테리움 속의 균을 배양시킨다. 즉, 소의 뇌-심장 추출물, 여러가지의 펩톤 등과 같은 질소원, 이스트 추출물 등과 같은 비타민 원, 염화나트륨 등과 같은 무기염, 포도당, 유당 등과 같은 탄소원, L-시스테인, 아황산나트륨, 나트륨 티오글리콜레이트 등과 같은 환원제를 함유하는 배양매질에 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 5내지 8.5로, 바람직하게는 6.5내지 7.5로 조절하고, 균을 배양매질에 접종한 후, 혐기성 조건하에서, 30°내지 45℃, 바람직하게는 32°내지 37℃로 1내지 5일간, 바람직하게는 1내지 4일간 정지 상태로 배양시키거나 교반 배양시킨다. 특히, 표I(후술하는 바에서는 TF배양 매질로 언급)에 기술된 배양매질을 사용함이 바람직하다. 그러나, 소의 뇌-심장 추출 침액이 질소원으로 반드시 필요한 것은 아니며, 소의 심장 추출물, 우육추출물, 생선 추출물, 옥수수 침액 등을 대신 사용할 수 있다. 여러가지 펩톤중에서, 프로테오즈 펩톤 및 피톤(phytone)펩톤이 반드시 필요한 것은 아니며, 트립티카아제 펩톤대신 폴리펩톤을 사용할 수 있다.
한천을 사용하지 않을 경우에는 교반배양을 수행함이 바람직하다.
[표1]
Figure kpo00003
(Ⅱ) 배양물로 부터 균의 수집
균을 수득하기 위해 전술한 바에서 수득한 배양물로 부터 상청액을 제거한다. 상청액의 제거공정은 원심분리 및 셀라이트(Celite, 상표명 : Johns-Manville, U.S.A.)와 같은 여과 보조제를 사용하는 여과법을 예로 들 수 있는 통상적인 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 수득한 균을 생리적 식염수로 세척한 후, 동결건조와 같은 통상적인 방법으로 건조시키거나, 생리적 식염수로 세척한 후 에탄올, 아세톤 등과 같은 친수성 유기 용매로 단시간내에 세척한 후, 공기 건조등과 같은 통상적인 방법으로 건조시켜, 건조된 균을 수득한다. 필요하면, 건조된 균을 분쇄하여 건조분말을 수득한다.
(Ⅲ) 추출공정
전술한 바에서 수득한 건조 균에 디메틸 설폭사이드, 디 에틸 설폭사이드 등과 같은 디알킬 설폭사이드, 바람직하게는 디메틸 설폭사이드를 건조균 1g 당 10내지 50ml의 비율로 가한다. 추출처리는 실온 내지 80℃에서 30분내지 수일간, 바람직하게는 약 65℃에서 3내지 5시간동안 교반시키면서 수행한다. 다음에 경사, 원심분리, 여과등과 같은 통상적인 공정으로 불용성물질을 제거한다. 또한, 전술한 바에서 수득한 추출물에 아세톤, 디에틸케톤, 메틸 에틸케톤 등과 같은 케톤, 또는 메탄올, 에탄올, 이소프로판을 등과 같은 알코올을 저온에서 추출물의 5배(용적/용적)이상량을 가한다. 바람직하게는 친수성 유기용매를 산성 조건하에서 가하는 바, 예를들면, 아세톤을 염산과 같은 가하여, 생성된 혼합물을 약 4℃에서 수시간 내지 수일간 정지시킨다.
침전을 통상적인 방법으로 분리시킨다. 다음에 수득된 침전을 제단백 처리하거나 초여과 처리하거나 또는 제단백처리 및 초여과 처리한다.
균을 생리적 식염수로 세척한 후 동결건조할 경우에는 제단백처리 또는 초여과 처리를 하지 않고서도 제암물질 TF-500 또는 그의 염을 수득할 수 있다.
(Ⅳ) 제단백, 초여과 및 목적물의 수집
전술한 바에서 수득한 침전을 제단백 처리한후, 초여과 처리하거나, 또는 제단백 처리만을 하거나, 초여과 처리만을 하여 제암물질 TF-500 또는 그의 염을 수득한다.
제단백 처리를 위해 그 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있다. 제단백 처리를 단백분해 효소로 처리하여 수행할 때에는, 수득한 침전을 물 또는 완충액에 용해시키거나 현탁시키고, 생성된 용액 또는 현탁액에 단백분해효소를 가하여 통상적인 방법으로 효소처리를 수행한다.
단백분해 효소에 관한 한, 프로나아제, 파파인, 트립신, 케모트립신 등을 사용할 수 있다. 이들중 프로나아제 및 트립신이 바람직하다. 효소처리를 하기 전 또는 효소처리 동안에 수용액의 pH를 7내지 8로 조절하여 유지시킨다. 이를 위해서는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산암모늄, 중탄산나트륨 등을 사용할 수 있다. 효소처리를 수행하는 동안 반응혼합물의 부패를 방지하기 위해, 소량의 클로로포름, 톨루엔 등과 같은 유기용매를 가함이 바람직하다. 통상적으로 효소처리를 하고자 하는 분말(고체)의 중량을 기준으로 약 1내지 4%가량의 효소를 사용한다.
전술한 바의 효소처처는 통상적으로는 30℃ 내지 40℃에서 1시간 내지 72시간동안, 바람직하게는 24시간 내지 48시간동안 수행한다. 또한 효소처리는 예를들면, 처음에 분말(고체)을 1내지 24시간동안 효소처리한 다음 다시 효소 처리를 하기 위해 약 1내지 2%(중량)의 효소를 가한다.
효소처리를 수행한 후, 필요하면 불용성물질을 원심분리, 여과 등과 같은 방법으로 제거하여 수득된 수용성 분획으로 부터 제암물질 TF-500을 수집한다.
수용성 분획으로 부터 TF-500을 수집하는 공정은 pH에 따라 우선, 분별법, 친수성 유기용매로 부터 분별칠전, 이온 교환기를 사용하는 분별법, 중 하나이상의 공정을 수행한 후, 초여과한다(이 처리 공정을 2회 반복할 수 있다.) 특히, 본 발명의 제암물질 TF-500은 전술한 바의 수용성 분획의 pH를 바람직하게는 2.5이하로 조절하고(필요하면, 트리클로로아세트 산을 가할 수 있다.)생성된 침전을 회수하며, 가용성 분획에 에탄올과 같은 친수성 유기 용매를 가하여 농도가 30내지 80%, 바람직하게는 60내지 80%(용적)로 되게하고, 목적물의 분획인 생성된 침전을 수집한 후, 필요하면 다우엑스1타입(상품명 : Dowex 1 type), 암버라이트 IRA-400(상품명 : Amberlite IRA-400), 데아에-세파덱스(상품명 : DEAE-Sephadex), 데아에-셀룰로오즈(상품명 : DEAE-Cellulose)등과 같은 음이온 교환수지로 침전을 처리하여(이 처리공정은 수회 실시할 수도 있다) 비흡착 분획을 수집한 후, 수득한 침전 또는 예를들면, 초여과막 UK-50(명목 분자량: 50,000), 초여과 막 UK-200(명목 분자량 : 200,000)[초여과막 UK-50 및 UK-200은 도요 로시 가부시끼가이샤(Toyo Roshi Kabushiki Kaisha)의 초여과 막에 대한 상품명임]과 같은 것으로 초여과(명목 분자량 : 50,000내지 20,000)하여 수득한 분획의 수용액을 농축 및 탈염시키고, 건조시킴으로써 수득한다. TF-500의 0.2(중량/용적)수용액은 투명하다.
제단백처리 및 차후의 초여과 처리공정 대신 전술한 바의 제단백 처리 또는 초여과 처리만을 수행할 수 있다.
수득된 제암물질 TF-500은 후술하는 바와같은 특성을 가지며, 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 무독한 염으로 전환시킬 수 있다. 특히, 약제학적으로 무독한 산부가염에는 예를들면, 나트륨염, 칼륨 염과 같은 알칼리금속염, 및 마그네슘염, 칼슘 염과 같은 알칼리 토금속염이 포함된다.
제암물질 TF-500의 특성은 후술하는 바와같다 :
(a) 회백-연갈색 분말로
(b) 제암 및 면역자극 작용을 가지고
(c) 물에는 용해되나, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 벤젠, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 디에틸에테르에는 불용성이며,
(d) 명확한 융점은 없고, 약 180℃에서 분해되기 시작하며 195℃이상에서 현저하게 분해되고,
(e) KBr법에 의해 측정된 적외선 흡수 스펙트럼의 경우, 3500-3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000, 970 및 840-800cm-1근처에서 흡수대가 나타나며,
(f) pH 7.0의 수용액에 대한 자외선 흡수 스페트럼에서는 흡수단에서 강한 흡수가 나타나며, 246내지 280mn 근처에서 흡수 피이크가 나타나고,
(g) 몰리쉬반응(Molish reaction), 페놀-황산반응, 안트론-황산반응, 인돌-염산 반응 및 로리-폴린반응(Lowry-Folin's reaction)에는 양성이나 닌히드린 반응에는 음성이며,
(h) 원소분석치가 C : 38내지 47%, H : 5내지 7%, N : 1내지 4%이고,
(i) 페놀 황산법으로 측정한 바의 당함량이 포도당으로서 약 12내지 30%(중량)이며, 로타-폴린법으로 측정한 바의 단백질함량이 소혈청 알부민으로서 약 10%(중량)이하이다.
본 발명의 제암물질 TF-500의 약물학적 작용은 후술하는 바와같다 :
(Ⅰ) 세포 생활력에 대한 TF-물질의 효과(집락 형성 분석)
제이. 에이치. 김(Kim J H)등의 방법을 근거로 하여, [Cancer Res.25,698(1965)], 헬라(Hela) S-3 세포를 10%송아지 혈청을 가한 이글즈(Eagle's) MEM중에서 37℃로 3일내지 5일간 배양시킨 후, 배양물을 회수하고, 0.01%(중량)의 에틸렌디아민 테트라아세트산 및 0.1%(중량)의 트립신을 함유하는 PBS(-)용액(8.0g/ℓ의 염화나트륨, 0.2g/ℓ의 염화칼륨, 1.15g/ℓ의 인산 1수소나트륨 및 0.2g/ℓ의 인산 2수소칼륨을 함유하는 수용액)을 수득된 세포층에 피펫으로 가하여 현탁액을 생성한다. 수득된 세포현탁액에 20%송아지 혈청을 가한 이글즈 MEM을 가하여 희석함으로써 1mℓ당 세포수가 300개가 되도록 한다. 이 세포현탁액 1mℓ를 CO2-배양기중에서 37℃로 24시간동안 배양시키고, 생성된 배양물에 실시예 1에서 수득한 제암물질 TF-500을 농도가 250,500,1000㎍/㎖되도록 가한다. 2회의 실험을 수행하는데 그중 하나는 배양물에 혈청(20% ; 용적/용적)을 가하고, 다른 하나는 혈청을 가하지 않는 경우이다. 24시간동안 처리한 후, 세포를 혈청부재 배양물로 세척하고, 이 세포에 20%송아지 혈청을 가한 배양물을 가한 후, CO2-배양기중에서 6일간 배양시킨다. 배양을 끝낸후, 에탄올로 세포를 고정하고, 김사(Giemsa)염색 액으로 염색하고, 세포의 생존률을 측정하기 위해 집락을 계수한다.
표 Ⅱ에 제시된 결과에서 세포의 생존율은 다음의 방정식으로 부터 계산된다.
Figure kpo00004
[표 2]
Figure kpo00005
Figure kpo00006
(Ⅱ) 면역자극 작용
각 군에 대해 3마리의 ICR종 마우스(암컷, 생후 6주)를 사용한다. 5㎍,50㎍ 및 500㎍/kg의 시험화합물을 마우스에 복강내 투여한다.
투여하고 24시간 후, 3%(중량)의 젤라틴을 함유하는 2㎖의 생리적 식염수와 1㎖의 페리칸 드로잉 잉크 17블랙(Perikan Drawing Ink 17 Black, Ganther-Wagner Co., Ltd에서 제조)을 혼합하여 만든 0.2㎖의 탄소현탁액을 마우스 꼬리에 정맥주사하고 1,5,10분 및 15분후에 헤파린으로 피복한 헤마트크리트(hematocrit)모세관을 사용하여 안검으로 부터 0.02㎖의 혈액을 채취하고 즉시 1.6㎖의 0.1%(중량)탄산나트륨 수용액으로 희석 및 용혈시킨다. 이 현탄액을 675nm에서 비색정량하고, 할펜(Halpern)등의 방정식으로 부터 식균지수, 즉 K값을 측정한다.
대조군의 마우스에 0.2㎖의 생리적 식염수를 투여한다.
Figure kpo00007
상기식에서
C0=시간 t0에서 혈액중 탄소농도
C=시간 t에 있어서 혈액중 탄소농도
결과는 표3에 제시되어 있다.
[표 3]
Figure kpo00008
주 : *실시예 1에서 수득한 제암물질을 사용함.
(Ⅲ) 육종-180세포(Sarcoma-180cell)에 대한 항암작용
ICR종 마우스(암컷, 생후 6주)의 겨드랑이에 1마리당 1×107개의 육종 180세포를 피하에 이식한다.
다음에 각각의 시험물질을 5%포도당 수용액에 용해시키고, 생성된 용액 각각에 대해 0.2㎖를 암세포를 이식한지 10일째 및 12일째 된 마우스에 1일에 한번 정맥 주사한다. 대조군에 대해서는 0.2㎖의 5%포도당 수용액을 전술한 바와같은 방법으로 투여한다. 이에 대한 결과는 표 4에 제시되어 있다.
[표 4]
Figure kpo00009
주 : *1 실시예 1에서 수득된 제암물질을 사용함.
*2 실시예 2에서 수득된 제암물질을 사용함.
*3
Figure kpo00010
(Ⅳ) 급성독성
TF-500의 마우스(ICR종, 암컷, 생후 6주, 정맥투여)에 대한 LD50은 10mg/kg이상이다.
전술한 바의 약물학 시험에서 명백한 바와같이, 본 발명의 TF-500물질은 제암제로 유용하며, 다양한 암 질환에 대한 효과를 가질 수 있을 것으로 기대한다.
본 발명의 TF-500물질 또는 약제학적으로 무독한 그의 염은 경구용 제제, 주사제, 현탁제 등과 같은 다양한 제형으로 제형화하여 사용할 수 있다.
이들 물질을 경구용 제제로 사용할 경우, 여러가지 부형제를 함유할 수 있으며, 캅셀제, 정제, 산제, 또는 과립제로 제형화하여 사용할 수 있다.
이들 물질을 경구용 제제로 사용할 경우, 여러가지 부형제를 함유할 수 있으며, 캅셀제, 정제, 산제, 또는 과립제로 제형화할 수 있다. 이들 물질을 주사제로 사용할 경우, 피하주사, 근육주사, 정맥주사로 투여할 수 있으며, 현탁제, 액제, 또는 생리적 식염수에 용해되는 산제, 또는 포도당 또는 국소 마취제를 함유하는 액제로 사용할 수 있다.
본 발명의 TF-500 물질 또는 약제학적으로 무독한 염에 대한 용량은 환자의 상태에 따라 선택할 수 있으나, 일반적으로 성인에 대해 1일 0.001내지 0.1mg/kg의 용량을 1회 또는 수회 투여함과 같이 투여함이 바람직하며, 투여방법에 대해서는 경구투여, 피하, 근육 또는 정맥주사하거나 환부에 주사함이 바람직하다.
본 발명은 하기 실시예, 제조 실시예 및 도면에서 보다 상세히 설명된다.
[실시예 1]
(1) 90ℓ 발효기(MSJ-U형, Marubishi Rika Kenyusho에서 제조)에 1,190g의 트립티카아제 펩톤, 1,050g의 심장침액, 210g의 이스트 추출물, 525g의 염화나트륨, 840g의 포도당, 700g의 유당, 7g의 아황산 나트륨, 35g의 나트륨 티오글리콜레이트 및 175g의 인산 1수소칼륨을 함유하는 70ℓ의 TF-f배양매질을 가하고, 배양매질에 4N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 7.5로 조절한다. 배양매질을 118℃로 15분간 멸균시킨다. 배양매질을 냉각시킨후, 250㎖/분의 속도로 질소가스를 1시간동안 통해준다. 이 배양매질에 전술한 바와 같은 조성을 갖는 TF-f배양매질에 퓨조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) TF-021(기탁번호 : 820319-01815호)(FERM-5077,ATCC-31647)을 배양시켜 제조한 900㎖의 푸조박테리움 뉴클레아툼 TF-031(기탁번호 : 820319-01815호)의 전배양 용액(Preculturede Solution)을 접종한다. 이 세포 배양물에 250㎖/분의 속도로 질소가스를 도입시키고 교반시키면서 (90r.p.m.)33℃에서 4일간 배양시킨다.
(2) 이와 같이 하여 수득한 12ℓ부의 배양물을 원심분리(4×103r.p.m.,10분)하여 균을 수집하고, 생리적 식염수로 세척한 후, 탈지하고, 1ℓ의 에탄올로 세척한 후, 다시 1ℓ의 아세톤으로 세척하고 건조시켜 14.2g의 균을 수득한다. 이것을 300ml의 디메틸 설폭사이드에 현탁시키고, 4시간동안 65℃로 가열 및 교반시키면서 추출한다. 다음에 이 현탁액을 흡인 여과하여 여액을 수득한다. 이 여액의 2ℓ 아세톤 및 8㎖의 농염산을 가하여 생성된 혼합물을 2일간 정치시켜, 생성된 침전을 정치 및 숙성시킨다. 이를 원심분리 (4×103r.p.m.,10분)하여 이 침전을 수집한다(748mg).
(3) 이와 같이 하여 수득한 748mg의 침전을 15㎖의 물에 용해시켜 생성된 용액에 탄산 암모늄을 가하여 pH를 7.8내지 8.0으로 조절한다. 이 용액에 30분 간격으로 7.5mg부의 프로나아제 E (상표명 : kaken kagaku; 1,000,000타이로신 단위/g)를 2회 가하고, 수적의 톨루엔을 가한 후, 37℃로 24시간동안 효소 처리한다. 이와같은 처리를 한 혼합물에 염산을 가하여 pH를 1로 조절한 후, 에탄올 농도가 80%(용적)되도록 에탄올을 가한다. 생성된 혼합물을 원심분리 (4×103r.p.m.,10분)하여 침전을 수집한다(288.6mg).
(4) 이와 같이 하여 수득한 288.6mg의 침전을 50㎖의 물에 용해시킨 용액을 초여과 막(Ultrafiltration Membrane) UK-50을 사용하여 초여과함으로써 5㎖로 농축시키고 45㎖의 물을 가한 후, 초여과 막 UK-50을 사용하여 초여과함으로써 다시 5㎖로 농축시킨다. 공격 지름이 0.2㎛인 밀리포아 여과기(상표명 : Millipore Filter, Japen Millipore Limited의 membrane filter에 대한 상표명)로 농축액을 여과한 후, 동결 건조시켜 264mg의 동결건조된 제암물질 TF-500을 수득한다.
이와같이 하여 수득한 제암물질 TF-500은 전술한 바와 같은 특성 및 제2도에 제시된 바의 적외선 흡수 스펙트럼 및 제3도에 제시된 바의 자외선 흡수 스펙트럼을 갖는다.
[실시예 2]
(1) 실시예 1의 (1)항에서 수득된 70ℓ의 배양물로 부터, 하이플로 슈퍼 셀(Hyflo Super cel, Johns Manville, U.S.A.의 상표명)로 균을 수집하고, 미생물과 하이플로 슈퍼셀의 혼합물을 20ℓ의 생리적 식염수로 세척한 후, 탈지하고, 3ℓ의 아세톤순으로 세척하여, 3.2kg의 건조된 전술한 바의 혼합물을 수득한다. 320g부의 혼합물을 400㎖의 디메틸 설폭사이드에 현탁시킨 현탁액을 4시간동안 65℃로 가열 및 교반시키면서 추출한다. 다음에 이 현탁액을 흡인 여과하여 여액을 수집하고, 2.5ℓ의 아세톤 및 10㎖의 농 염산을 가한 후, 생성된 혼합물을 4℃로 2일간 정치시켜 침전을 정치 및 숙성시킨다. 원심분리하여 침전을 수집한다(4×103r.p.m.,10분간) (94mg).
(2) 이와같이 하여 수득한 94mg의 침전을 50㎖의 물에 용해시킨 용액을 초여과 막 UK-50을 사용하여 초여과함으로써 5㎖로 농축시키고, 45㎖의 물을 가한 후, 초여과 막 UK-50을 사용하여 초여과 함으로써 다시 5㎖로 농축시킨다.
이와 같이 하여 농축시킨 용액을 공격 지름이 0.2㎛인 밀리포아 여과기로 여과한 후, 동결 건조시켜 62.6mg의 동결건조된 제암 물집 TF-500을 수득한다. 이와 같이하여 수득한 제암물질 TF-500은 전술한 바와 같은 특성 및 제4도에 제시된 바의 적외선 흡수 스펙트럼 및 제5도에 제시된 바의 자외선 흡수 스펙트럼을 갖는다.
[실시예 3]
(1) 실시예 1의 (1)항에서 수득된 7.2ℓ부의 배양물을 원심분리(5×103r.p.m.,10분간)하여 균을 수집하고, 동결 건조시킨다. 이와 같이 동결 건조시킨 3.5g부의 균을 100㎖의 생리적 식염수에 현탁시킨 현탁액에 2N수산화나트륨 수용액을 가하여, pH를 8.0으로 조절하고, 3시간동안 교반시킨 후, 24시간동안 정치시킨 후 원심분리(5×103r.p.m.,10분간)하여 상청액을 제거한다. 수득된 침전에 100㎖의 생리적 식염수를 가하고, 2N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 8.0으로 조절한다. 이 혼합물을 2시간동안 교반시킨 후, 원심분리(5×103r.p.m.,10분간)하여 상청액을 제거한다. 수득된 침전에 100㎖의 생리적 식염수를 가한 혼합물에 2N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 8.0으로 조절한다.
이 혼합물을 2시간동안 교반시킨 후, 원심분리(5×103r.p.m.,10분간)하여 상청액을 제거한다. 다음에 수득된 침전을 50㎖부의 에탄올로 3회, 50㎖부의 아세톤으로 1회, 및 50㎖부의 디에틸 에테르를 1회 순서대로 세척하고(이 세척물의 제거공정은 원심분리(5×103r.p.m.,10분간)로 수행한다), 건조시켜 건조된 균을 수득한다. 균을 분쇄하여 분말을 수득한다. 이 분말에 70㎖의 디메틸 설폭사이드를 가한 혼합물을 63 내지 65℃에서 4시간동안 교반시키면서 추출한 후, 흡인 여과하여 여액을 수집한다. 이 여액에 536㎖의 아세톤 및 1㎖의 농염산을 가한 혼합물을 4℃로 24시간동안 정치시켜 침전을 정치 및 숙성시킨다. 원심분리하여 침전을 수집한다(5×103r.p.m.,10분간) (269mg).
(2) 이와 같이 하여 수득한 269mg의 침전에 2.7㎖의 물을 가한 혼합물에 1N수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 8.0으로 조절한 후, 물을 가하여 최종 용적이 4㎖ 되도록 한다. 이 혼합물에 2.7mg의 프로나아제 E (1,000,000타이로신 단위/g)를 가하고, 37℃로 1시간동안 효소 처리한다. 다시 2.7mg의 프로나아제E 및 수직의 톨루엔을 가하여 생성된 혼합물을 37℃로 24시간동안 효소처리한다. 이와 같은 처리를 한 혼합물로 부터 원심분리(5×103r.p.m.,10분)하여 불용물을 제거한 용액에 2N염산을 가하여pH를 1.0으로 조절한 후, 에탄올 농도가 80%(용적)되도록 에탄올을 가한다. 이와 같이 하여 수득한 침전을 원심분리하여 수집한다(5×103r.p.m.,10분간)(78.5mg).
(3) 이와 같이 하여 수득한 78.5mg의 침전에 20㎖의 물을가하고, 1N수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 7로 조절한다. 다음에, 초여과 막 UK-50을 사용하여 초여과함으로써, 생성된 혼합물을 5㎖로 농축시키고, 45㎖의 물을 가한 후, 다시 초여과 막 UK-50을 사용하여 초여과함으로써 5㎖로 농축시킨다. 이와 같이 하여 수득한 농축용액에 45㎖의 물을 가하고, 초여과 막 UK-50을 사용하여 초여과 함으로써 5㎖로 농축시킨다. 공격지름이인 0.2㎛(Toyo Roshi Kabushiki Kaisha TM-4)인 박막 여과기로 이 농축물을 여과한 후, 동결 건조시켜 65mg의 동결건조된 제암물질 TF-500을 수득한다.
이와 같이 하여 수득된 제암물질 TF-500은 전술한 바의 특성 및 제6도에 제시된 바의 적외선 흡수 스펙트럼 및 제7도에 제시된 바의 자외선 흡수 스펙트럼을 갖는다.
[실시예 4]
(1) 실시예 1의 (1)항에서 수득된 배양물 10ℓ부를 원심분리하여 (5×103r.p.m.,10분간) 균을 수집한다.
여기에 500㎖의 생리적 식염수를 가한 혼합물을 30분간 교반시킨 후, 원심분리하여(5×103r.p.m.,10분)침전을 수집한다. 이 공정을 2회 반복한다. 이와 같이 하여 수득된 침전에 500㎖의 생리적 식염수를 가한 혼합물을 30분간 교반시킨 후, 1N수산화 나트륨 수용액을 가하여 pH를 8.0으로 조절하여 30분간 교반시킨다. 다음에 이 혼합물을 원심분리하고 (5×103r.p.m.,10)분 탈지한 후, 500㎖의 생리적 식염수를 500㎖부의 생리적 식염수로 1회, 300㎖부의 에탄올로 1회 및 300㎖부의 아세톤의 순으로 세척한 후 (세척물의 제거는 원심분리로써 수행한다(5×103r.p.m.,10분)). 건조시켜 건조된 균을 수득한다. 이와 같이 하여 수득한 균을 분쇄하여 분말을 수득한다.
이 분말에 160㎖의 디메틸 설폭사이드를 가하고, 생성된 혼합물을 63 내지 65℃로 4시간동안 교반시키면서 추출한다. 다음에, 혼합물을 흡인여과하여 여액을 수득하고, 여액의 1.2ℓ의 아세톤 및 4.2㎖의 농염산을 가한 후, 생성된 혼합물을 4℃로 24시간 동안 정치시켜 침전을 정치 및 숙성시킨다. 이를 원심분리하여(5×103r.p.m.,10분) 침전을 수집한다(246mg).
(2) 이와같이 하여 수득된 246mg의 침전에 5㎖의 물을 가하고, 생성된 혼합물에 1N수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 7.8로 조절한다. 이 혼합물에 5mg의 프로나아제E (1,000,000타이로신 단위/g)를 가하고, 37℃로 30분간 효소처리한 후, 1N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 7.8로 조절하고, 다시 5mg의 프로나아제E 및 수적의 톨루엔을 가한다. 생성된 혼합물 37℃로 24시간동안 효소처리한다.
효소처리된 혼합물에 1N 염산을 가하여, pH를 1.0으로 조절하고, 2시간동안 정치시킨 후, 원심분리하여 (5×103r.p.m.,10분) 상청액을 수득한다. 수득한 상청액에 에탄올 농도가 80%(용적)되도록 에탄올을 가한다. 생성된 혼합물을 2시간동안 정치시켜 원심분리함으로써 (5×103r.p.m.,10분) 침전을 수집한다(98mg).
(3) 이와 같이하여 수득한 98mg의 침전에 20㎖의 물을 가하여 생성된 혼합물에 1N수산화나트륨 수용액을 가하여 pH를 7로 조절한다. 다음에 초여과 막 UK-50을 사용하여 초여과함으로써 생성된 혼합물을 5㎖로 농축시키고, 45㎖의 물을 가한 후, 다시 초여과 막 UK-50을 사용하여 초여과함으로써 5㎖로 농축시킨다. 이와 같이하여 수득한 농축용액에 45㎖의 물을 가하고, 초여과 막 UK-50을 사용하여 초여과함으로써 5㎖로 농축시킨다. 수득한 농축물을 공격지름 0.2㎛인 박막 여과기(Toyo Roshi Kabushiki Kaisha TM-4)를 통해 여과한 후, 동결건조시켜 83mg의 동결 건조된 제암물질 TF-500을 수득한다.
이와 같이 하여 수득한 제암물질 TF-500은 전술한 바와 같은 특성 및 제8도에 제시된 바의 적외선 흡수 스펙트럼 및 제8도에 제시된 바의 자외선 흡수 스펙트럼을 갖느다.
[제조실시예 1]
실시예 1에서 수득한 바의 제암물질 TF-500을 함유하는 pH 7.0내지 7.5의 수용액을 바이알에 충진하고, 동결 건조시켜 0.5 또는 1mg단위를 함유하는 동결건조된 제암물질 TF-500제제를 수득한다. 사용시에는 이를 멸균 생리적 식염수, 0.5%리도카인(lidocaine) 용액, 0.5% 포도당 수용액등에 용해시키고, 이와같이 제조된 용액을 주사제로 사용한다.
[제조실시예 2]
실시예 2에서 수득한 바의 제암물질 TF-500을 함유하는 pH 7.0내지 7.5의 수용액을 바이알에 충진하고 동결 건조시켜 0.5 또는 1mg단위를 함유하는 동결건조된 제암물질 TF-500제제를 수득한다. 사용시에는 이를 멸균 생리적 식염수, 0.5%리도카인 용액, 0.5% 포도당 수용액등에 용해시키고, 이와같이 제조된 용액을 주사제로 사용한다.
[제조실시예 3]
실시예 1에서 수득한 바의 제암물질 TF-500을 함유하는 pH 7.0내지 7.5의 수용액을 바이알에 충진하고 동결 건조시켜 0.5 또는 1mg단위를 함유하는 동결건조된 제암물질 TF-500제제를 수득한다. 사용시에는 이를 멸균 생리적 식염수, 0.5%리도카인 용액, 0.5% 포도당 수용액등에 용해시키고, 이와같이 제조된 용액을 주사제로 사용한다.
[제조실시예 4]
실시예 4에서 수득한 바의 제암물질 TF-500을 함유하는 pH 7.0내지 7.5의 수용액을 바이알에 충진하고 동결 건조시켜 0.5 또는 1mg단위를 함유하는 동결건조된 제암물질 TF-500제제를 수득한다. 사용시에는 이는 멸균 생리적 식염수, 0.5%리도카인 용액, 0.5% 포도당 수용액등에 용해시키고, 이와같이 제조된 용액을 주사제로 사용한다.

Claims (12)

  1. 퓨조박테리움(Fusobacterium)속의 미생물을 디알킬 설폭사이드로 추출 처리하고 이 추출물로부터
    (a) 회백-연 갈색 불말로
    (b) 제암 및 면역자극 작용을 가지며
    (c) 수용성이나 메탄올, 에탄올, 아세톤, 벤젠, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 디에틸에테르에는 불용성이고, (d) 명확한 융점은 없으며, 약 180℃에서 분해되기 시작하고, 약 195℃에서 현저하게 분해되며, (d) KBr법으로 얻어진 적외선 흡수 스펙트럼에서 3500 내지 3200,2920,2850,1660 내지 1600,1580 내지 1520,1460 내지 1400,1380 내지 1100,1080 내지 1000,970 및 840 및 840cm-1. 근접부에서 흡수대가 있고, (f) pH7.0의 수용액에 대한 자외선 흡수스펙트럼에서는 흡수단에서 강한 흡수가 나타나며, 246내지 280nm근처에서 흡수피이크가 나타나고, (g) 몰리쉬반응(Molish reaction), 페놀-황산 반응, 안트론-황산반응, 인돌-염산 반응 및 로리-폴린 반응(Lowry-Folin's reaction)에는 양성이나, 닌히드린 반응에는 음성이며, (h) 원소분석치가 C : 38내지 47%, H : 5 내지 7%, N : 1내지 4%이고, (i) 페놀황산법으로 측정한 바의 당함량이 포도당으로서 약 12내지 30% (중량)이며, 로리-폴린법으로 측정한 바의 단백질 함량이 소혈청 알부민으로서 약 10%(중량)이하인 물질을 수집함을 특징으로 하여, 전술한 바의 특성을 갖는 제암물질 TF-500 또는 그의 염을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 퓨조박테리움 속의 미생물을 디알킬 서록사이드로 추출 처리하고, 생성된 추출물에 친수성 유기용매를 가하여, 생성된 침전을 제단백 처리한 후, 초여과 처리하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 디알킬 설폭사이드가 디메틸 설폭사이드인 방법.
  4. 제2항 또는 3항에 있어서, 친수성 유기용매가 아세톤인 방법.
  5. 제2항 내지 4항중 어느 하나에 있어서, 제단백 처리를 단백분해 효소로 효소처리하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단백분해 효소가 프로나아제(pronase)인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 퓨조박테리움 속의 미생물을 디알킬 설폭사이드로 추출 처리하고, 생성된 추출물에 친수성 유기 용매를 가하여 수득한 침전을 초여과하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 디알킬설폭사이드가 디메틸 설폭사이드인 방법.
  9. 제7항 또는 8항에 있어서, 친수성 유기용매가 아세톤인 방법.
  10. 제2항 내지 9항중 어느하나에 있어서, 초여과 처리를 명목 분자량이 50,000 내지 200,000인 초여기로 수행하는 방법.
  11. 제1항 내지 10항중 어느 하나에 있어서, 퓨조박테리움 속의 미생물이 퓨조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 퓨조박테리움 뉴클레아튬의 미생물을 디알킬 설폭사이드로 추출 처리하고, 산성 조건하에서 생성된 추출물에 친수성 유기용매를 추출물의 5배이상(용적/용적)가하여 생성된 침전을 프로나아제로 제단백 처리하고, 알코올 농도가 30내지 80%(용적)되도록 알코올을 가하여 생성된 침전을 수집하고 초여과한 후, 박막 여과기로 여과한 다음, 여액을 동결 건조시켜 제암물질을 수득하는 방법.
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