NL8302880A

NL8302880A - Carcinostaticum en werkwijze ter verkrijging daarvan.

Info

Publication number: NL8302880A
Application number: NL8302880A
Authority: NL
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1982-08-17
Filing date: 1983-08-16
Publication date: 1984-03-16
Also published as: ES8505823A1; CH659256A5; NO159452C; FR2531863A1; PT77207B; AU556770B2; DE3329255C2; PT77207A; SE8304435D0; KR840005741A; GB2126893B; DE3329255A1; FI79140C; US4547462A; IT8348851A0; GB2126893A; SE456014B; SE8304435L; BE897549A; CA1202585A

Description

[ * " * * I

Carcinostaticum en werkwijze ter verkrijging daarvan. I

De laatste jaren worden patiënten met verschillende I

soorten kanker behandeld door hun immuniteit te verhogen I

om daarmee een carcinostatisch effect te bereiken. I

Gevonden is dat een bepaalde component in het extract I

5 verkregen door extractie met een dialkylsulfoxyde van I

microorganismen behorende tot het genus Fusobacterium I

geïsoleerd uit de mondholte, indirecte carcinostatische I

werking vertoont doordat hij de immuniteit of antitumor I

aktiviteit van de patiënt verhoogt. Bovendien is deze I

10 component zeer weinig toxisch. I

Bedoelde component wordt in het hierna volgende I

aangeduid met TF-500. I

Het carcinostaticum TF-500 of een zout daarvan wordt, I

zoals reeds vermeld, verkregen door extractie van een micro- I

15 organisme behorende tot het genus Fusobacterium met een I

dialkylsulfoxyde en uit het extract TF-500 te isoleren. I

Het microorganisme waaruit TF-500 kan worden verkregen, I

is in principe elk microorganisme behorende tot het genus I

Fusobacterium dat TF-500 kan produceren, maar is bij voorkeur I

20 een Fusobacterium nucleatum en in het bijzonder Fusobacterium I

nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647),en TF-500 produceren- I

de spontane en kunstmatige mutanten daarvan.

Fusobacterium nucleatum TF-031 heeft de volgende I

bacteriologische eigenschappen: I

25 Vorm I

1) vorm van de cellen: staafjes (fig. 1) I

2) polymorfisme van de cellen: afwezig I

3) motiliteit: afwezig I

4) sporen: afwezig I

30 5) Gram-kleuring: Grammegatief I

8 3 Γ Λ * Π *

V 'V .. J -J

J» -2- 6) zuurvastheid: negatief

Groei op 1) TF-a agatplaat en schuine cultuur: uiterlijke vorm: rond 5 grootte: ongeveer 1 mm protuberantie: halfcirkelvormig struktuur: dauwdruppelachtig oppervlak: glad randen: glad 10 kleur: melkachtig-geelachtig-wit transparantie: troebel 2) in TF-a vloeibaar medium: mate van groei: sterk turbiditeit: coagulum 15 precipitaat: geen oppervlaktegroei: geen, geen groei tot een diepte van ongeveer 5 mm gas: geen

Fysiologische eigenschappen 20 1) vorming van H^S: + 2) nitraatreductie: - 3) boterzuurvorming: + 4) indoolvorming: + 5) urease: - 25 6) katalase: - 7) zetmeelhydrolyse: - 8) zuurstofgevoeligheid: anaëroob 9) ammoniakvorming: + 10) kooldioxydevorming: +

30 11) groei bij: pH 5,0 - 8,5, en 30-45°C

12) gasvorming uit sacchariden: L-arabinose (-), D-xylose (-), D-glucose (-), D-mannose (-), D-fructose (-), D-galactose (-) , moutsuiker (-), sucrose (-), trehalose (-), sorbitol (-), mannitol (-), ‘ 35 inositol (-), glycerol (-), zetmeel (-).

83 0 2 t * -3- TF-500 Kan worden verkregen volgens onder staand schema:

Kweken van een Fusobacterium nucleatum ν' filtratie bovenstaande vloeistof v cellen dialkylsulfoxyde onoplosbaar materiaal extract (zuur) hydr of iel—* organisch oplosmiddel precipitatie deproteïnisatie en/of ultrafiltratie

J

carcinostaticum TF-500

Ter toelichting op bovenstaand schema diene het volgende:

Kweken van het mier o organisme

Het kweken van een microorganisme behorende tot het 5 genus Fusobacterium wordt op voor het kweken van anaerobe bacteriën gebruikelijke wijze uitgevoerd. Het cultuurmedium bevat een stikstofbron zoals runder Brain-Heart extract of λ *» .» — ft.

Λ (, ' · . - ’V W "V 'w -4- % verschillende peptonen, een vitaminebron zoals gistextract, een anorganisch zout zoals natriumchloride, een koolstof-bron zoals glucose of lactose, en een reduceermiddel zoals L-cystine, natriumsulfiet of natriumthioglycolaat. Het 5 medium wordt met een waterige natriumhydroxydeoplossing op een pH 5 - 8,5 en bij voorkeur 6,5 - 7,5 ingesteld. Na enten wordt gekweekt onder anaerobe omstandigheden bij 30 - 45°C en bij voorkeur 32 - 37°C gedurende 1-5 dagen en bij voorkeur 1-4 dagen, al dan niet onder roeren. Ge-10 schikte media zijn in onderstaande tabel A aangegeven. Deze worden in het hierna volgende aangeduid met TF cultuurmedium. Het Brain-Heart infuus kan worden vervangen door een andere stikstofbron zoals hartinfuus (runderhartextract), vlees-extract, visextract of maisweekvloeistof. Proteosepepton 15 en fytonpepton kunnen achterwege worden gelaten, en trypticasepepton kan worden vervangen door polypepton.

Wanneer geen agar wordt gebruikt verdient het aanbeveling om het medium te roeren.

Tabel A

20 Bestanddelen, g/1 Cultuurmedia TF-a TF-b TF-c Tf-d TF-e TF-f trypticssspepton 17 17 17 17 17 17 fytonpepton 3 3 1,5- proteosepepton 10 5 5 - 25 Brain-Heartinfuus 35 17,5 - - - - hartinfuus - - 25 20 10 15 gistextract 3 33333 natriumchloride 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 glucose 6 6 6 12 12 12 30 lactose 5 5 5 10 10 10 L-cystine 0,25 0,5 0,5 natriumsulfiet 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 natriumthio- glycolaat 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 83C2C30 -5-

vervolg tabel A

Bestanddelen, g/1 Cultuurmedia TF-a TF-b TF-c TF-d TF-e TF-f agar 0 of 0 of 0 of 0 of 0 of 0 of 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 5 dikaliumwater- stoffosfaat - - 2,5 2,5 2,5 2,5

Verzamelen van de cellen uit de cultuur

De cellen worden verkregen door de bovenstaande vloei-10 stof te verwijderen bijvoorbeeld door centrifugeren of filtreren met behulp van een filtreerhulpmiddel zoals Celite (afkomstig van Johns-Manville, Amerika). De cellen worden gewassen met een fysiologische zoutoplossing en daarna gedroogd bijvoorbeeld door lyofiliseren, of gewassen 15 met een fysiologische zoutoplossing en daarna eventjes met een hydrofiel organisch oplosmiddel zoals ethanol of aceton en vervolgens gedroogd bijvoorbeeld met of aan de lucht. Indien nodig worden de gedroogde cellen verpoederd tot een droog poeder.

20 Extractie

De gedroogde microorganismen worden geëxtraheerd met een dialkylsulfoxyde bijvoorbeeld dimethylsulfoxyde of diethylsulfoxyde, bij voorkeur dimethylsulfoxyde, in een hoeveelheid van 10 - 50 ml per gram gedroogde cellen. De 25 extractie wordt uitgevoerd onder roeren bij een temperatuur tussen kamertemperatuur en 80°C gedurende 30 minuten tot enkele dagen, en bij voorkeur 3-5 uren bij ongeveer 65°C. Onoplosbaar materiaal wordt verwijderd bijvoorbeeld door decanteren, centrifugeren of filtreren. Aan het extract 30 wordt een hydrofiel organisch oplosmiddel toegevoegd zoals een keton bijvoorbeeld aceton, diethylketon of methylethyl-keton, of een alcohol bijvoorbeeld methanol, ethanol of isopropanol, in meer dan vijf keer de volumehoeveelheid van het extract en bij lage temperatuur. Bij voorkeur wordt de

8’ n .* -1 o λ o ü j J

ft * -6- precipitatie met het hydrofiel organisch oplosmiddel uitgevoerd onder zuurreagerende omstandigheden, en wordt bijvoorbeeld aceton samen met chloorwaterstofzuur toegevoegd. Het mengsel wordt dan enkele uren tot enkele dagen bij onge-5 veer 4°C weggezet. Het gevormde neerslag wordt op gebruikelijke wijze afgescheiden.

Het neerslag wordt onderworpen aan deproteïnisatie en/of ultrafiltratie. Wanneer de cellen zijn gewassen met een fysiologische zoutoplossing en daarna gedroogd door 10 lyofiliseren, kan de deproteïnisatie of ultrafiltratie achterwege worden gelaten.

Deproteïnisatie, ultrafiltratie en verzamelen van TF-500

Deproteïnisatie kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd met een proteolytisch enzym door het neerslag op te lossen of 15 te suspenderen in water of een bufferoplossing en een proteolytisch enzym toe te voegen. Geschikte proteolytische enzymen zijn pronase, papaïne, trypsine en chemotrypsine, bij voorkeur pronase en trypsine. De pH wordt vóór of tijdens de behandeling met het enzym ingesteld en gehand-20 haafd op 7 - 8 bijvoorbeeld met natriumhydroxyde, kalium- hydroxyde, natriumcarbonaat, ammoniumcarbonaat of natrium-waterstofcarbonaat. Om putrefactie van het reaktiemengsel tijdens de behandeling met enzym te voorkomen, kan een weinig organisch oplosmiddel zoals chloroform of tolueen 25 worden toegevoegd. De hoeveelheid waarin het enzym wordt gebruikt, bedraagt gewoonlijk ongeveer 1 - 4 gew.% berekend op het droge poeder.

De behandeling met het enzym wordt gewoonlijk uitgevoerd bij 30 - 40°C gedurende 1 - 72 uren en bij voorkeur 30 gedurende 24 - 48 uren. De deproteïnisatie kan ook in stappen worden uitgevoerd bijvoorbeeld door eerst ongeveer 1 - 2 gew.% enzym toe te voegen en na 1 - 24 uren weer ongeveer 1 - 2 gew.% enzym waarna de behandeling wordt voortgezet.

Na afloop wordt eventueel onoplosbaar materiaal verwijderd 35 door bijvoorbeeld centrifugeren of filtreren waarna uit het 83 0 2 3 3 0 * * -7- in water oplosbare gedeelte TF-500 wordt gewonnen.

Het winnen van TF-500 uit het in water oplosbare gedeelte kan worden uitgevoerd door eerst fractionering bij een bepaalde pH, precipitatie met een hydrofiel organisch 5 oplosmiddel en/of fractionering met een ionenuitwisselaar, en daarna door ultrafiltratie (de behandeling kan twee keer worden herhaald). In het bijzonder wordt de pH van het in water oplosbare gedeelte ingesteld op bij voorkeur niet hoger dan 2,5 (indien nodig kan trichloorazijnzuur worden 10 toegevoegd). Het gevormde neerslag wordt verwijderd én aan het oplosbare gedeelte wordt een hydrofiel organisch oplosmiddel zoals ethanol toegevoegd tot een concentratie 30 - 80 vol.% en bij voorkeur 60 - 80 vol.Z, . Het TF-500 bevattende neerslag wordt verzameld en, indien nodig, 15 behandeld met een ionenuitwisselaarhars zoals Dowex 1,

Amberlite IKA-400, DEAE-Sephadex of DEAE-cellulose (deze behandeling kan verschillende keren worden herhaald) om de niet-geadsorbeerde fracties te verzamelen. Tenslotte wordt een waterige oplossing van het verkregen neerslag geconcen-20 treerd en ontzout of worden de verkregen fracties onderworpen aan ultrafiltratie (nominaal moleculair gewicht: 50.000 - 200.000), met behulp van bijvoorbeeld ultrafiltratie-membraan UK-50 (nominaal moleculair gewicht 50.000) of ultrafiltratiemembraan UK-200 ( nominaal moleculair gewicht 25 200.000) (voomoemde membranen zijn afkomstig van Toyo Roshi

Kabushiki Kaisha), waarna het geconcentreerde en ontzoute produkt wordt gedroogd. Een 0,2 gew./vol.%'ige waterige oplossing van het aldus verkregen TF-500 is transparant.

In plaats van een gecombineerde deproteïnisatie en 30 ultrafiltratie kan met een van beide behandelingen afzonderlijk worden volstaan.

Het aldus verkregen carcinostaticum TF-500 kan worden omgezet in een farmaceutisch aanvaardbaar zout, bijvoorbeeld een alkalimetaalzout zoals het natrium- of kaliumzout, of 35 een aardalkalimetaalzout zoals het magnesium- of calciumzout.

83 0 2 GG 0 * * -8-

Het carcinostaticum TF-500 heeft de volgende eigenschappen : a) grijsachtig wit-lichtbruin poeder b) carcinostatische en immunostimulerende werking 5 c) oplosbaar in water maar onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en diethylether

d) geen duidelijk smeltpunt, begin van ontleding bij ongeveer 180°C, en aanmerkelijke ontleding boven 195°C

10 e) absorptiebanden in het IR-spectrum zoals bepaald volgens KBr methode bij 3500 - 3200, 2920, 2850, 1660-1600, « 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000, 970 en 840-800 cm”1 f) het UV-spectrum zoals gemeten aan een waterige 15 oplossing met een pH 7,0 vertoont een sterke absorptie bij de rand en een piek nabij 246-280 nm g) de Molish-reaktie, fenol-zwavelzuurreaktie, anthron -zwavelzuurreaktie, indool-chloorwaterstofzuur-reaktie en Lowry-Folin-reaktie zijn allen positief, maar 20 de ninhydrinreaktie is negatief h) elementair analyse: C: 38-47%; H: 5-7%; N: 1-4% i) het saccharidegehalte zoals bepaald volgens een fenol-zwavelzuurmethode bedraagt ongeveer 12-30 gew.% voor 25 glucoiie, en het protexnegehalte zoals bepaald volgens de

Lowry-Folinmethode ongeveer 10 gew.% of minder voor runder-serumalbumine.

Het carcinostaticum TF-500 heeft de volgende farmacologische eigenschappen: 30 1) invloed op de levensvatbaarheid van cellen (bepaling van kolonievorming)

Volgens de methode van J.H.Kim et al. (Cancer Res. 25, 698 (1965)) werden HeLa S-3 cellen gekweekt in Eagle’s MEM aangevuld met 10% kalfsserum bij 37°C gedurende 3-5 dagen.

83 02? 3 0 * J» -9-

Aan de cellaag werd een PBS (-) oplossing (een waterige oplossing van 8,0g/liter natriumchloride, 0,2g/liter kaliumchloride, 1,15g/liter dinatriumwaterstoffosfaat en 0,2g/liter kaliumdiwaterstoffosfaat), welke oplossing 5 0,01 gew.% ethyleendiaminetetraazijnzuur en 0,1 gew.% trypsine bevatte, toegevoegd met een pipet onder vorming van een suspensie. De celsuspensie werd verdund met Eagle's MEM aangevuld met 20% kalfsserum zodat de suspensie 300 ttedLen per ml bevatte. Van de celsuspensie werd 1 ml 10 24 uren gekweekt bij 37°C in een C^-incubator. Aan de verkregen cultuur werd het carcinostaticum TF-500 zoals * verkregen in voorbeeld I toegevoegd in concentraties van

respectievelijk 250, 500 en 1000^ug/ml. Er werden twee proeven I

uitgevoerd waarbij in een daarvan serum (20 vol./vol.%) I

15 aan de cultuur werd toegevoegd en in de andere niet. Na 24 I

uren behandelen werden de cellen gewassen met de serumr I

vrije cultuur waarna aan de cellen de cultuur werd toege- I

voegd waaraan 20 vol./vol.% kalfsserum was toegevoegd. I

Hierna werden de cellen 6 dagen gekweekt in een (^“incubator. I

20 Na afloop werden de cellen gefixeerd met ethanol en gekleurd I

met Giemsa-reagens. De opgekomen kolonies werden geteld en de I

levensvatbaarheid van de cellen werd berekend uit de volgende I

betrekking: I

levensvatbaarheid _ aantal kolonies in de behandelde groep

van de cellen ^ } aantal kolonies in de onbehandelde groep I

De resultaten zijn in onderstaande tabel B vermeld. I

8 > vvj r.n η

* .. 3 U

-10-

Tabel B

Concentratie TF-500 Levensvatbaarheid van de cellen, % ^ug/ml - serumvrije Serum-bevattende cultuur cultuur 5 0 100 100 250 103,8 103,2 500 100,2 98,5 1000 55,2 97,1 10 2) Immunostimulerende aktiviteit.

Groepen van elk drie ICR vrouwtjesmuizen (6 weken oud) werden intraperitoneaal geïnjecteerd met respectievelijk 5, 50 en 500^ug/kg TF-500. 24 Uren later werden de muizen intraveneus in de staart geïnjecteerd met 0,2 ml van een 15 koolstofsuspensie die was bereid door mengen van 1 ml

Perikan Drawing Ink 17 Black (afkomstig van Giïnther-Wagner Co.) met 2 ml van een 3 gew.% gelatine bevattende fysiologische zoutoplossing. Respectievelijk 1, 5, 10 en 15 minuten na de injectie werd 0,02 ml bloed uit de oogkas 20 afgenomen met behulp van een hematocriet capillair bekleed met heparine. De bloedmonsters werden onmiddellijk verdund en gehemolyseerd met 1,6 ml van een 0,1 gew.%'ige waterige natriumcarbonaatoplossing. De verkregen suspensies werden gemeten met een colorimeter bij 675 nm, en de fagocytotische 25 index of K-waarde werd bepaald met de vergelijking volgens

Halpern et al.: log Cn - log C K = --- C ” t0 30 waarin Cq = concentratie koolstof in het bloed op tijdstip tg, en C = concentratie koolstof in het bloed op tijdstip t. De resultaten zijn in onderstaande tabel C vermeld.

ρτ f\ λ λ o λ ^ ^ U c. c j ü

-11-Tabel C

Dosis,^ug/kg Gemiddelde K-waarde 5 0,0418 ± 0,0089 50 0,0560 ± 0,0016 5 500 0,0561 ± 0,027 controle 0,0276 ± 0,0020

Voor de vergelijking was aan een controlegroep 0,2 ml fysiologische zoutoplossing toegediend. Het onderzochte 10 TF-500 was bereid volgens voorbeeld I.

3) Antitumoraktiviteit tegen Sarcoma-180 cellen. Sarcoma-180 cellen werden subcutaan getransplanteerd in de oksel van ICR vrouwtjesmuizen (6 weken oud) in een hoeveelheid van 1 x 10' cellen per muis. Op de tiende en 15 twaalfde dag na de transplantatie werden de muizen 1 keer daags intraveneus geïnjecteerd met 0,2 ml van een oplossing van TF-500 in een 5%'ige waterige glucoseoplossing. Een controlegroep kreeg alleen 0,2 ml van een 5%’ige waterige glucoseoplossing intraveneus toegediend. De resultaten zijn 20 in onderstaande tabel D vermeld.

Tabel D

3)

Dosis, Gemiddeld Hemorragische T/C , % mg/kg tumorgewicht ± tumornecrose op dag 14 standaardfout, op dag 14 . - _§_ 25 0,5" 3,4 ± 0,7 5/5 53 1.01) 3,6 ± 0,7 4/5 56 0,52) 4,1 ± 2,4 3/5 63 1.02) 5,0 ± 1,9 3/5 79 controle 6,4 ± 2,7 0/5 100 30--

1) TF-500 uit voorbeeld I

2) TF-500 uit voorbeeld II

gemiddeld tumorgewicht van muizen in 3) T/Ctt). -X 100 gemiddeld tumorgewicht m controlegroep 33 0 ;; ~0 -12- 4) Acute toxiciteit.

De LD50 voor ICR vrouwtjesmuizen (6 weken oud) bedraagt bij intraveneuze toediening van TF-500 meer dan 10 mg/kg.

Uit het boven beschreven farmacologisch onderzoek 5 blijkt dat TF-500 volgens de uitvinding een bruikbaar carcinostaticum is, en dat verwacht kan worden dat het werkzaam is tegen verschillende soorten kanker.

De uitvinding heeft verder betrekking op farmaceutische preparaten die TF-500 of een niet-toxisch zout daarvan be-10 vatten. De preparaten kunnen in voor orale of rectale toediening of voor injectie geschikte vorm verkeren. Orale preparaten zoals capsules, tabletten, poeders of korrels bevatten behalve TF-500 of een niet-toxisch zout daarvan gebruikelijke excipiëntia. Preparaten voor bijvoorbeeld 15 subcutane, intramusculaire of intraveneuze injectie verkeren in de vorm van een suspensie, oplossing of een poeder dat wordt opgelost in een fysiologische zoutoplossing of een glucose en/of locaal anestheticum bevattende oplossing.

De dosering van TF-500 of een niet-toxisch zout daarvan 20 bedraagt voor volwassenen in het algemeen 0,001 - 0,1 mg/kg bij een of meer keren toedienen per dag.

Ter toelichting op de uitvinding wordt verwezen naar de figuren. Fig. 1 toont een onder de microscoop gemaakte foto van Fusobacteriüm nucleatum TF-031. In fig. 2 is het 25 IR-spectrum en in fig. 3 het UV-spectrum van TF-500 uit voorbeeld I weergegeven, in fig. 4 het IR-spectrum en in fig. 5 het UV-spectrum van TF-500 uit voorbeeld II, in fig. 6 het IR-spectrum en in fig. 7 het UV-spectrum van TF-500 uit voorbeeld III, en in fig. 8 het IR-spectrum en 30 in fig. 9 het UV-spectrum van TF-500 uit voorbeeld IV.

Voorbeeld I

a) In een 90 liter fermentator (MSJ-U type van Marusbishi Rika Kenkyusho) werd 70 liter van een TF-f cultuurmedium gebracht dat 1190g trypticase, 1050g hart-35 infuus, 21Og gistextract, 525g natriumchloride, 840g glucose, δ Vfl o o λ v v ij £ 3 q ij i u -13- 700g lactose, 7g natriumsulfiet, 35g natriumthioglycolaat en 175g dikaliumwaterstoffosfaat bevatte. Het medium werd met een 4N waterige natriumhydroxydeoplossing op een pH 7,5 gebracht en 15 minuten bij 118°C gesteriliseerd. Na afkoelen 5 en 1 uur doorleiden van stikstof met een snelheid van 250 ml/ min. werd het medium geënt met ongeveer 900 ml van een cultuur van Fusobacterium nucleatum TF-031 (FESM-5077, ATCC-31647). De entcultuur was tevoren bereid door kweken in een TF-f medium met dezelfde samenstelling als boven.

10 aangegeven bij 33°C onder roeren (90 omw./min.) gedurende 4 dagen onder doorleiden van stikstof met een snelheid van 250 ml /min.

b) Van de onder a) verkregen cultuur werd 12 liter 3 10 min. gecentrifugeerd bij 4.10 omw./min. .De cellen werden 15 afgescheiden en gewassen met 1 liter van een fysiologische zoutoplossing en daarna ontvet en gewassen met achtereenvolgens 1 liter ethanol en 1 liter aceton, en tenslotte gedroogd waarbij I4,2g cellen werd verkregen. De cellen werden gesuspendeerd in 300 ml dimethylsulfoxyde en 4 uren 20 geëxtraheerd bij 65°C. Na afloop werd de suspensie gefil treerd op een afzuigfilter. Aan het filtraat werden 2 liter aceton en 8 ml geconcentreerd zoutzuur toegevoegd waarna men het mengsel 2 dagen liet staan om te bezinken en het gevormde neerslag te laten verouderen. Het neerslag werd 3 25 verzameld door 10 min. centrifugeren bij 4.10 omw./min.

c) Het verkregen neerslag (748 mg) werd opgelost in 15 ml water en de oplossing werd met ammoniumcarbonaat op een pH 7,8 - 8,0 gebracht. Aan de oplossing werden met een tijdsinterval van 30 min. twee porties van elk g 30 7,5 mg Pronase E (afkomstig van Kaken Kagaku, 1.10 tyrosine eenheden/g) en enkele druppels tolueen toegevoegd. Het mengsel werd 24 uren op 37°C gehouden. Na afloop van de behandeling met het enzym werd de pH met zoutzuur op 1 ingesteld en werd ethanol toegevoegd tot een concentratie van 35 80 vol.%. Het gevormde neerslag werd verzameld door 10 min.

83 0 2 C S 0 <· -14- 3 centrifugeren bij 4.10 omw./min..

d) Het verkregen neerslag (288,6 mg) werd opgelost in 50 ml water en de oplossing werd geconcentreerd tot 5 ml door ultrafiltratie onder gebruikmaking van een ultra-5 filtratiemembraan UK-50. Het concentraat werd verdund met 45 ml water en opnieuw geconcentreerd tot 5 ml door ultrafiltratie onder gebruikmaking van voornoemd membraan. Hierna werd het concentraat gefiltreerd over een Millipore Filter (afkomstig van Japan Millipore Ltd.) met een 10 poriëndiameter van 0,2yum, en daarna gevriesdroogd waarbij 264 mg TF-500 werd verkregen. Het IR-spectrum en UV-spectrum van het carcinostaticum TF-500 met de boven aangegeven eigenschappen, zijn weergegeven in respectievelijk fig. 2 en 3.

15 Voorbeeld II

a) Uit 70 liter van de in voorbeeld Ia> verkregen cultuur werden de cellen verzameld door filtreren over Hyflo Super Cel (afkomstig van Johns-Manville, Amerika).

Het mengsel van cellen en Hyflo Super Cel werd gewassen met 20 20 liter fysiologische zoutoplossing en daarna ontvet en gewassen met achtereenvolgens 3 liter ethanol en 3 liter aceton waarbij 3,2 kg droog mengsel werd verkregen. Daarvan werd 320g gesuspendeerd in 400 ml dimethylsulfoxyde. De suspensie werd 4 uren onder roeren geëxtraheerd bij 65 °C. Na 25 afloop werd de suspensie gefiltreerd op een afzuigfilter en aan het filtraat werden 2,5 liter aceton en 10 ml geconcentreerd zoutzuur toegevoegd. Men liet het mengsel 2 dagen staan bij 4°C om te bezinken en het neerslag te laten verouderen. Het neerslag werd verzameld door 10 min. centri-3 30 fugeren bij 4.10 omw./min..

b) Het verkregen neerslag (94 mg) werd opgelost in 50 ml water en de oplossing werd geconcentreerd tot 5 ml door ultrafiltratie onder gebruikmaking van een ultra-filtratiemembraan UK-50. Het concentraat werd verdund met 35 45 ml water waarna opnieuw werd geconcentreerd tot 5 ml door 8 3 ö £ ? o 0 -15- ultrafiltratie onder gebruikmaking van voornoemd membraan. Hierna werd het concentraat gefiltreerd over een Millipore filter met een poriëndiameter van 0,2^um en daarna gevriesdroogd waarbij 62,6 mg TF-500 werd verkregen. Het 5 IR-spectrum en UV-spectrum van het carcinostaticum TF-500 met de boven aangegeven eigenschappen, zijn weergegeven in respectievelijk fig. 4 en 5.

Voorbeeld III

a) Van de in voorbeeld Ia) verkregen cultuur werd 3 10 7,2 liter 10 min. gecentrifugeerd bij 5.10 omw./min. waarna de cellen werden gevriesdroogd. Van de gevriesdroogde cellen werd 3,5g gesuspendeerd in 100 ml fysiologische zoutoplossing. De suspensie werd met 2N waterige natrium- hydroxydeoplossing op een pH 8,0 gebracht, 3 uren geroerd 3 15 en, na 24 uren staan, 10 min. gecentrifugeerd bij 5.10 omw./min.. Aan het neerslag werd 100 ml fysiologische zoutoplossing toegevoegd waarna de pH van het mengsel met 2N waterige natriumhydroxydeoplossing op een pH 8,0 werd ingesteld. Hierna werd het mengsel 2 uren geroerd en ver-

O

20 volgens 10 minuten gecentrifugeerd bij 5.10 omw./min.. Het neerslag werd gewassen met achtereenvolgens drie porties ethanol van elk 50 ml, 50 ml aceton en 50 ml diethylether en na verwijderen van de wasvloeistoffen door 10 min. centri-fugeren bij 5.10 omw./min. gedroogd. De cellen werden 25 verpoederd en aan het poeder werd 70 ml dimethylsulfoxyde toegevoegd. Het mengsel werd 4 uren onder roeren geëxtraheerd bij 63 - 65°C. Onoplosbaar materiaal werd verwijderd door afzuigfiltreren en aan het filtraat werden 536 ml aceton en 1 ml geconcentreerd zoutzuur toegevoegd. Men liet het 30 mengsel 24 uren staan bij 4°C om te bezinken en het neerslag te laten verouderen. Het neerslag werd verzameld door 10 min.

3 centrifugeren bij 5.10 omw./min..

b) Het verkregen neerslag (269 mg) werd opgenomen in 2,7 ml water. De pH van het mengsel werd met 1N waterige 35 natriumhydroxyde op een pH 8,0 ingesteld waarna water werd 83 0·: ~so Λ W to

«I

-16- toegevoegd tot een eindvolume van 4 ml. Aan het mengsel werd 6 2,7 mg Pronase E (1.10 tyrosine-eenheden/g) toegevoegd waarna het mengsel 1 uur op 37°C werd gehouden. Vervolgens werd weer 2,7 mg Pronase E toegevoegd en ook enkele druppels 5 tolueen waarna de behandeling met het enzym nog 24 uren bij 37°C werd voortgezet. Onoplosbaar materiaal werd verwijderd 3 door 10 min. centrifugeren bij 5.10 omw./min.. De pH van de verkregen oplossing werd met 2N zoutzuur op 1,0 ingesteld waarna ethanol werd toegevoegd tot een concentratie van 10 80 vol.%. Het gevormde neerslag werd verzameld door 10 min.

3 centrifugeren bij 5.10 omw./min..

c) Het verkregen neerslag (78,5 mg) werd opgenomen in 20 ml water. Na instellen van de pH op 7 met 1N waterige natriumhydroxydeoplossing werd het mengsel geconcentreerd tot 15 5 ml door ultrafiltratie onder gebruikmaking van een ultra- f iltratiemembraan UK-50. Het concentraat werd met 45 ml water verdund waarna opnieuw werd geconcentreerd tot 5 ml door ultrafiltratie onder gebruikmaking van voomoemd membraan.

1 Na herhaling van deze procedure (verdunnen met 45 ml water en 20 concentreren tot 5 ml) werd het concentraat gefiltreerd over een membraanfliter TM-4 met een poriëndiameter van 0,2^um (afkomstig van Toyo Roshi Kabushiki Kaisha) en daarna gevriesdroogd waarbij 65 mg TF-500 werd verkregen. Het IR-spectrum en UV-spectrum van het carcinostaticum TF-500 25 met de boven aangegeven eigenschappen, zijn weergegeven in respectievelijk fig. 6 en 7.

Voorbeeld IV

a) Van de in voorbeeld Ia) verkregen cultuur werd 3 10 liter 10 min. gecentrifugeerd bij 5.10 omw./min.. Aan de 30 cellen werd 500 ml fysiologische zoutoplossing toegevoegd waarna het mengsel 30 min. werd geroerd en vervolgens 10 min.

3 werd gecentrifugeerd bij 5.10 omw./min.. Deze procedure werd twee keer herhaald. Aan het verkregen neerslag werd 500 ml fysiologische zoutoplossing toegevoegd en het mengsel 35 weird 30 min. geroerd, met 1N waterige natriumhydroxyde- 8302380 3 -17- r /> 4L » oplossing op een pH 8,0 gebracht en nog 30 min. geroerd.

Hierna werd het mengsel 10 min. gecentrifugeerd bij 5.10 omw. /min., en ontvet en gewassen met 500 ml fysiologische . . . . .. 3 zoutoplossing. Na opnieuw 10 mm. centrifugeren bij 5.10 5 omw./min. werd een neerslag verkregen dat werd gewassen met achtereenvolgens 500 ml fysiologische zoutoplossing, 300 ml ethanol en 300 ml aceton en, na verwijderen van de 3 wasvloeistoffen door 10 min. centrifugeren bij 5.10 omw./min., gedroogd. De gedroogde cellen werden verpoederd 10 en het poeder werd 4 uren met 160 ml dimethylsulfoxyde geëxtraheerd bij 63 - 65°C. Na afloop werd het mengsel gefiltreerd op een afzuigfilter waarna aan het filtraat 1,2 liter aceton en 4,2 ml geconcentreerd zoutzuur werden toegevoegd. Men liet het mengsel 24 uren staan bij 4°C 15 om te bezinken en het neerslag te laten verouderen. Het neerslag werd verzameld door 10 min. centrifugeren bij 3 5.10 omw./min..

b) Het verkregen neerslag (246 mg) werd opgenomen in

5 ml water. Na instellen van de pH op 7,8 met een 1N

20 waterige na tr iumhydroxyde op1o s s ing werd 5 mg Pronase E 6 (1.10 tyrosine-eenheden/g) toegevoegd waarna het mengsel 30 minuten op 37°C werd gehouden. Na instellen van de pH op 7,8 met een 1N waterige natriumhydroxydeoplossing werd weer 5 mg Pronase E toegevoegd en ook enkele druppels tolueen.

25 Vervolgens werd de behandeling met het enzym bij 37°C nog 24 uren voortgezet. Na afloop werd de pH met 1N zoutzuur op 1,0 ingesteld waarna men het mengsel 2 uren liet staan.

3

Hierna werd 10 min. gecentrifugeerd bij 5.10 omw./min..

Aan de verkregen bovenstaande vloeistof werd ethanol toege-30 voegd tot een concentratie van 80 vol.%. Na weer 2 uren 3 staan werd het mengsel 10 min. gecentrifugeerd bij 5.10 omw. /min..

c) Het verkregen neerslag (98 mg) werd opgenomen in 20 ml water. Na instellen van de pH op 7 met een 1N waterige 3*5 natriumhydroxydeoplossing werd het mengsel geconcentreerd tot e ^ fi o t -<5 f)

0v j JOU

-18- 5 ml door ultrafiltratie onder gebruikmaking van een ultrafiltratiemembraan UK-50. Het concentraat werd met 45 ml water verdund en opnieuw geconcentreerd tot 5 ml door ultrafiltratie onder gebruikmaking van voomoemd membraan.

5 Deze procedure (verdunnen met 45 ml water en concentreren tot 5 ml) werd herhaald waarna het concentraat werd gefiltreerd over een membraanfilter TM-4 met een poriëndiameter van 0,2^um (afkomstig van Toyo Roshi Kabushiki Kaisha) en daarna gevriesdroogd waarbij 83 mg TF-500 werd verkregen. Het 10 IR-spectrum en ITV-spectrum van het carcinostaticum TF-500 met de boven aangegeven eigenschappen, zijn weergegeven in respectievelijk fig. 8 en 9.

Preparaatvoorbeelden Voorbeeld V

15 Een waterige oplossing van TF-500 uit voorbeeld I, II, III of IV met een pH 7,0 - 7,5 wordt in een flesje gebracht en gevriesdroogd tot een poeder van 0,5 of 1 mg eenheid. Voor gebruik voor injectie wordt het poeder opgelost in een steriele fysiologische zoutoplossing, 0,5%’ige lidocaïne-20 oplossing of 0,5%'ige waterige glucose oplossing.

fi % r. - · 3 0 'V ω '*-j „„ \j O v

Claims

1. Carcinostaticum, met het kenmerk, dat het carcinostaticum, aangeduid met TF-500„ de volgende eigenschappen heeft: 5 a) grijsachtig wit-lichtbruin poeder, b) carcinostatische en immunostimulerende werking, c) oplosbaar in water, onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en diethylether, 10 d) geen duidelijk smeltpunt, begin van ontleding bij ongeveer 180°C en aanmerkelijke ontleding boven 195°C, e) IR-spectrum zoals bepaald volgens de KBr-methode: absorptiebanden nabij 3500 - 3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580 - 1520, 1460 - 1400, 1380 - 1360, 1120 - 1100, 1080 - 15 1000, 970 en 840 - 800 cm'1, f) UV-spectrum zoals gemeten aan een waterige oplossing met een pH 7,0: sterke absorptie bij de rand en een piek nabij 246 - 280 nm, g) Molisch-reaktie, fenol-zwavelzuurreaktie, anthron - 20 zwavelzuurreaktie, indool-chloorwaterstofzuurreaktie en Lowry-Folin-reaktie allen positief, ninhydrinreaktie negatief, h) elementair analyse: C: 38 - 47%,* H: 5 - 7%j N: 1 - 4%, en i) saccharidegehalte zoals bepaald volgens een fenol- 25 zwavelzuurmethode: ongeveer 12-30 gew.% berekend voor glucose, protexnegehalte zoals bepaald volgens de Lowry-Folin-methode: ongeveer 10 gew,% of minder berekend voor runder-serumalbumine, alsmede de zouten van TF-500.

2. Carcinostaticum, met het kenmerk dat, het carcino staticum, aangeduid met TF-500, extraheerbaar is uit micro-organismen behorende tot het genus Fusobacterium met een dialkylsulfoxyde, alsmede de zouten van TF-500.

3. Werkwijze ter verkrijging van een carcinostaticum, 35 met het kenmerk dat, het carcinostaticum, aangeduid met CO -.. .j 3 V -20- TF-500 en met de in conclusie 1 aangegeven eigenschappen, wordt geëxtraheerd uit een microorganisme behorende tot het genus Fusobacterium met een dialkylsulfoxyde, aan het extract een hydrofiel organisch oplosmiddel wordt toege-' 5 voegd, en dat het gevormde neerslag wordt onderworpen aan deproteïnisatie en/of ultrafiltratie.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk dat, als dialkylsulfoxyde dimethylsulfoxyde wordt gebruikt.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk dat, 10 als hydrofiel organisch oplosmiddel aceton wordt gebruikt.

6. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk dat, de deproteïnisatie wordt uitgevoerd met een proteolytisch enzym.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk dat, 15 als proteolytisch enzym een pronase wordt gebruikt.

8. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk dat, de ultrafiltratie wordt uitgevoerd net behulp van een ultrafilter met een scheidingsvermogen op een nominaal moleculair gewicht van 50.000 - 200.000.

9. Carcinostaticum volgens conclusie 2 en werkwijze volgens conclusies 3-8, met het kenmerk dat, het carcinostaticum wordt geëxtraheerd uit een micro-organisme behorende tot Fusobacterium nucleatum.

10. Werkwijze volgens conclusies 3-9, met het kenmerk 25 dat, een microorganisme behorende tot Fusobacterium nucleatum wordt geëxtraheerd met een dialkylsulfoxyde, aan het extract een hydrofiel organisch oplosmiddel wordt toegevoegd in meer dan vijf keer de volumehoeveelheid van het extract om een neerslag te vormen onder zuurreagerende 30 omstandigheden, het gevormde neerslag wordt onderworpen aan deproteïnisatie met een pronase, aan de behandelde vloeistof een alcohol wordt toegevoegd tot een concentratie van 30 - 80 vol.%, het gevormde neerslag wordt verzameld en wordt onderworpen aan ultrafiltratie en daarna wordt 35 gefiltreerd over een membraanfilter, en dat het filtraat 85 32 3 3 0 «r τ- -21- wordt gevriesdroogd.

11. Farmaceutisch preparaat met carcinostatische en immunostimulerende werking, met het kenmerk dat, het preparaat als werkzaam bestanddeel bevat carcinostaticum

5 TF-500 volgens conclusie 1 of 2, of verkregen met de werkwijze volgens conclusies 3 - 9, of een niet-toxisch zout daarvan.

12. Carcinostaticum en werkwijzen ter verkrijging daarvan zoals beschreven in de beschrijving en voorbeelden.

83. H "3 0