DK165641B - Fremgangsmaade til fremstilling af tf-220, tf-230 og tf-240 forbindelser og de tilsvarende proteinfrie forbindelser - Google Patents

Description

DK 165641 ts i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte forbindelser, der udviser carcinostatiske og immunostimulerende virkninger, og som betegnes TF-220, TF-230 og TF-240, og de tilsvarende pro-5 teinfrie forbindelser som betegnes TF-320, TF-330 og TF-340.

X de senere år har man i udstrakt grad anvendt lægemidler til patienter med forskellige typer cancer, der bevirker 10 en forøgelse af værtsorganismens immunologiske aktivitet, hvorved der opnås en carcinostatisk virkning med hjælp fra den immunologiske funktion. Som antitumormidler i et sådant lægemiddel kendes forbindelser, der opnås fra forskellige bakterieorganismer eller forskellige bakterie-15 kulturer eller polysaccharider, der er opnået fra frugtlegemerne af Basidiomycetes eller dyrkede svampelegemer heraf.

Man har nu undersøgt den farmakologiske virkning af den 20 supernatante væske, der er opnået ved at dyrke Fusobac-terium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) og fjerne organismerne fra kulturen, og har fundet, at en særlig komponent, der fås fra den supernatante væske, udviser en carcinostatisk virkning. Man har fundet, at komponenten 25 har en indirekte carcinostatisk virkning ved at forøge den værtsformidlede antitumorvirkning eller værtens immunitet og at udnytte denne. Komponenten udviser særdeles lav toxicitet, og den kan opnås også ved at behandle selve kulturen.

30

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved det i krav l’s kendetegnende del anførte.

35 Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 3616/80 må det endvidere anses for kendt at fremstille en stofblanding betegnet TF-100 eller fraktioner heraf med carcino- 2

DK 165641 B

statiske og immunostimulerende virkninger ved en fremgangsmåde som er ejendommelig ved at Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) dyrkes i et passende næringssubstrat, hvorefter et hydrofilt organisk 5 opløsningsmiddel sættes til kulturen eller dennes super-natante del. Herefter isoleres det dannede bundfald, og den vandopløselige fraktion af bundfaldet isoleres og underkastes eventuelt efterfølgende dialyse, ultrafiltrering, behandling med ionbytter, udfældning med barium-10 ioner og efterfølgende fjernelse af barium, dialyse og ultrafiltrering eller den vandopløselige fraktion tilsættes et kvaternært ammoniumsalt, bundfaldet isoleres, og der dissocieres, idet de ønskede fraktioner isoleres på det enkelte behandlingstrin.

15

Opfindelsen beskrives nærmere i det følgende.

Som den anvendte bakterie ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 20 . 5077; ATCC 31647) og spontane mutanter eller kunstigt mo dificerede mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber.

De bakteriologiske egenskaber af Fusobacterium nucleatum TF-031 er følgende; 25 (I) Form (1) celleform; tenformede (fig. 1) (2) cellernes polymorphisms: ingen 30 (3) bevægelighed: ingen (4) sporer: ingen (5) gramfarvning: gram-negativ (6) syreresistens: negativ 35 (II) Vækstbetingelser i et dyrkningssubstrat: DK 165641 6 3 (1) TF-a agarplade og skråagardyrkningssubstrat - Ydre form: rund

Størrelse: ca. 1 mm Udvækst: halvkugleformet 5 Struktur: dugdråbeagtig

Overflade: glat Kanter: glat

Farve: mælkeagtig gullighvid Gennemskinnelighed: uigennemsigtig 10 (2) TF-a flydende dyrkningssubstrat Vækst: kraftig

Turbiditet: koagulering Bundfald: intet 15 Overfladevækst: ingen, ingen vækst til en dybde på ca. 5 mm

Gasudvikling: ingen (III) Fysiologiske egenskaber 20 (1) Produktion af hydrogensulfid: + (2) Reduktion af nitrater: - (3) Produktion af smørsyre: + (4) Produktion af indol: + 25 (5) Urease: - (6) Katalase: - (7) Stivelseshydrolyse: - (8) Oxygenkrav: anaerob (9) Produktion af ammoniak: + 30 (10) Produktion af carbondioxid: +

(11) Vækstområde: pH 5,0-8,5, temperatur 30-45 °C

(12) Produktion af gas fra sukkerarter: L-arabinose (-), D-xylose (-), D-glucose (-), D-mannose (-), D-fruc-tose (-), D-galactose (-), maltsukker (-), sucrose 35 (-), trehalose (-), sorbitol (-), mannitol (-), ino sitol (-), glycerol (-), stivelse (-).

4

DK 165641 B

Forbindelserne betegnet TF-220, TF-230, TF-240, TF-320, TF-330 og TF-340 fremstilles på følgende måde: 5 10 15 20 25 30 35 5

UfV IODD4 I IS

i 1 " j 0 o o N (0 ^

N N CS

1 I I

fa fa fa

B B B

Η <H t t t CO (0 „ Ο ή O VO · - T S - a vo ^ fa .c co & _ ,-, Η I ft W ® 2 2 m in i+i a a o* e ,5 * id <w n«v o 3¾ <o m ή '-Tr1 +3¾ 0) ido) k fa <o > tc -h c &h&^ a a a o c c η o) c ό ω a) n +) OS ΦΌ X>

a ft 0) λ f 2 S

r;<0 <D > Ή U XI £3 +3 CO Ό ^ <0 8¾¾ e«j ·—i h c eg® 3c a) cd o a cc •H ΗΉ-HC *+ +1—0)-H — -O — +> -Η _Ή Ή a) a ή c Λί ^ a _ +) 3 λ 3 <d <D *H a a ο co m m u G h -h -h

(d Ό +>0 0)HH

X}C< CD Ή CD CD CD 99

o ft ,¾ +3 © CO CD CO CO

w -d ax h ©· © N *\ CO

a id an h i —7 i £ u λ u oaa ftfe m fa 3 0 0 &< £·

ι+ι H -dtiOON

id H C C C

(D (0 (d SC <d EC

cn > > a > a •H 3 H tH Ή h fa c β+3φ φ Φ id ο id r|

y Zj TS <D

"5 3 -3 hhfikC! -p & £ -η ω ο) φ ω ω ο q ε ft CO CD a) w

a ^ kXJ

c c c ^ c h fa £ ooieoe ooio

g Ή Ή C fa G CO CO

m +3+)+) CO *v CO CD

•©.V ΛΑΙΉΛΉ I “7 I W

h id to to a fa h a & £ a ί a e* cd

O 4-1 <+t fa fa fa C

rH rH * tø A* 3 G C <D C <D 0) coo cd a) co <d co -p fa fa ·©·©· 3 +) ΙΗΉΗΉΗ (0,¾ co to a <d a * a (0 oo u +i a a a a a o fa d fid 2fl

rl fa 3 Ή G

+3 a H H (0 H (0 H fa EE>6> fa H (0 (0 (0

i+l φ CD CD C CD C

o co a a cd a a) μ ©. ό οοεοε σ h c >i a to 1-1 æ o > 6

DK 165641 B

Ovennævnte produktionsmetode beskrives nedenfor: (1) Dyrkning af bakterier 5 Dyrkning af Fusobacterium nucleatum TF-031 udføres på almindelig måde til dyrkning af anaerobe bakterier. Dvs., et dyrkningssubstrat indeholdende en nitrogenkilde som f.eks. oksehjerne-hjerteekstrakter, forskellige peptoner eller lignende; en vitaminkilde som f.eks. gærekstrakt 10 eller lignende; et uorganisk salt som f.eks. natriumchlo-rid eller lignende; en carbonkilde som f.eks. glucose, lactose eller lignende; et reducerende middel som f.eks. L-cystin, natriumsulfit, thioglycolat eller lignende, indstilles til en pH-værdi på 6-8,5, fortrinsvis 6,5-7,5, 15 og bakterierne udsåes på/i dyrkningssubstratet, hvorefter steady-state-dyrkning udføres under anaerobe betingelser ved 30-42 °C, fortrinsvis 32-37 °C i 1-5 dage, fortrinsvis 24-96 timer. Specielt er det ønskeligt at anvende dyrkningssubstraterne beskrevet i tabel 1 (i det efter-20 følgende omtalt som TF-dyrkningssubstrat). Imidlertid er hjerne-hjerte-infusionssubstratet, der er et oksehjerne-hjerte-ekstrakt, ikke altid nødvendigt som nitrogenkilde, og det kan erstattes med et hjerteinfusionssubstrat, der er et oksehjerteekstrakt, kødekstrakt, fiskeekstrakt, 25 majsstøbevæske eller lignende. Blandt de forskellige peptoner, er proteosepepton og phytonpepton ikke altid nødvendige, og trypticasepeptonen kan erstattes med polypep-ton.

30 Dersom agar ikke anvendes, er det en fordel at omrøre kulturen.

35

DK 165641 B

7 U

Q)

rH

rH

ΙΠ iH LO <D C** ta isi i iinooc^NO loooo

E-< η η rH tH

U

0)

H i—I

λ) LO Η ΙΠ ί) t> I w * * *

ta t^ll lOCOOCdOlOOOO

£H Η H HH

H

Q)

H

rH

h in η ίο Φ is I ***·*·

t, fx i i i O CO IS <N O IOOOO

E-ι H OJ HH

0)

r*H

rH

q in in in η Λ ffl > I I X s V. X V x

Qj f, h in i incoiN'ninooooo a b h n m m < E-<

M

Φ

H

H

n in in in η in d)

I X X x x x X

b [-»coin fx icoisvoinooooo

Eh rH H

u 0)

rH

LO in H

,rj s γη h in o) fx I ^ ^ V ^ ^ ta fx o o in icoovoinooooo

Eh rH h co μ c (0 o ύ μ

μ μ Dj C I C TJ

raw 0) _ o ω o μ +? ,, λ o, c μ μ ·η k μ μ Φ3 ο α h w μ ο μ<ο him α) μ g α> ,3-¾ μ o)o)r-x i a a ο μ ra £5 _ 3 ο

Ο Ο) ti (OeidJjSCCh O CgO

α c φ co.« i ομμ6®®μ§>» c -ri μ ^ΗβΟΦμΦΜ^ΜΜμ^μ a c η μοδοκμΑίμοοιημσ) 55η ftflHShlH04»>ih0h w * \ “^ΟφμφΜμροϋμμιο 0) >ι ϋ> ^xj^^fi-offiraHra L £ £ i? Ρ3 *0 >—«* 1¾ &* i3G *τΗ »Χΐ C0 Ϊ22 Ο J t-3 2 Ε"4 ^3 8

DK 165641 B

(2) Indsamling af den supernatante væske fra kulturen (fjernelse af organismerne)

Organismerne fjernes fra den ovennævnte .opnåede kultur 5 for at opnå en supernatant væske. For at fjerne organismerne kan en almindelig metode som centrifugering og filtrering anvendes, idet der bruges en filterhjælp som f.eks. Hyflo-Super-Cel, og specielt foretrækkes en centrifugeringsmetode af driftsmæssige hensyn på grund af 10 mængden af fjernede organismer og udbyttet af den supernatante væske.

(3) Opsamling af carcinostatisk forbindelse TF-220, TF-230, TF-240, TF-320, TF-330 og TF-340 15 (i) (a) På dette tidspunkt indstilles den supernatante væske eller kulturen fortrinsvis til pH 1,5-7, fortrinsvis i nærheden af pH 2 (pH 1,5-2,5). Et hydrofilt organisk opløsningsmiddel sættes til den ovennævnte superna-20 tante væske eller kultur, og det dannede bundfald opsamles. Hydrofile organiske opløsningsmidler omfatter f.eks. alkoholer som ethanol eller methanol, ketoner som f.eks. acetone, idet alkoholerne, specielt ethanol, giver det bedste resultat. Det hydrofile organiske opløsningsmiddel 25 sættes fortrinsvis til på en sådan måde, at koncentrationen af dette bliver 30-80 rumfang-%, specielt 50-80 rumfang-%. Efter tilsætningen af det hydrofile organiske opløsningsmiddel, henstår den fremkomne blanding ved lav temperatur, fortrinsvis ved ca. 5 °C, i flere timer til 30 adskillige dage, for at fuldende dannelsen af bundfaldet.

Det således dannede bundfald fraskilles ved almindelige metoder som f.eks. dekantering, centrifugering eller filtrering.

(b) Til det ovenfor fraskilte bundfald sættes vand sædvanligvis i en mængde på 5-20 gange bundfaldets, og bund- 35 9

DK 165641 B

faldet fraskilles afhængigt af pH. Specielt udføres denne procedure som følger: (b-1) Det under (a) opnåede bundfald tilsættes separat 5 vand sædvanligvis i en mængde på 5-20 gange bundfaldets. Blandingen indstilles til pH 7,5-8. Efter eventuel fjernelse af den uopløselige del, indstilles blandingen til nær pH 6 (5,5-6,5). De fremkomne vanduopløselige og vandopløselige dele skilles fra hinanden ved en almindelig 10 metode som f.eks. centrifugering eller filtrering. Den således opnåede vanduopløselige del (TF-220) har de i tabel 2 angivne egenskaber.

(b-2) Den vandopløselige del fraskilt ovenfor under (b-1) 15 indstilles til nær pH 4 (3,5-4,5). Bundfaldet og den opnåede vandopløselige del skilles fra hinanden ved en almindelig metode som f.eks. centrifugering eller filtrering. Det opnåede bundfald (TF-230) har de i tabel 2 angivne egenskaber.

20 (b-3) Den under (b-1 eller b-2) fraskilte vandopløselige del indstilles til nær pH 2 (1,5-2,5), hvorved der dannes et bundfald. Bundfaldet skilles fra den vandopløselige del ved almindelige metoder som f.eks. centrifugering el-25 ler filtrering. Det fremstillede bundfald (TF-240) har de i tabel 2 angivne egenskaber.

De således opnåede carcinostatiske forbindelser TF-220, TF-230 og TF-240 kan hver flere gange underkastes samme 30 fraktionering afhængig af pH for at renses. De således opnåede carcinostatiske forbindelser kan hver omdannes ved almindelige metoder til farmaceutisk acceptable salte heraf som f.eks. alkalimetalsalte som natriumsalte eller kaliumsalte og jordalkalimetalsalte, som f.eks. magne-35 siumsalte eller calciumsalte.

10

DK 165641 B

(ii) De under (i) opnåede fraktioner, TF-220, TF-230 og TF--240 underkastes hver proteinfjernelsesbehandling ved almindelige metoder, hvorved der opnås TF-320, TF-330 og TF-340. For at fjerne protein kan der anvendes fremgangs-5 måder, der er velkendte inden for fagområdet, og særligt foretrukken er en metode, der nedbryder med proteolytiske enzymer. Dersom det ønskes, at fjernelsen af protein udføres ved en behandling med et proteolytisk enzym, er det tilstrækkeligt, at hver af de under (i) ovennævnte opnå-10 ede fraktioner med carcinostatisk virkning opløses eller opslæmmes i vand eller en puf fer opløsning, at den fremkomne opløsning eller suspension tilsættes et proteinnedbrydende enzym, og at enzymbehandlingen udføres på sædvanlig måde.

15

Som proteolytiske enzymer kan nævnes pronase, papain, trypsin, chymotrypsin og lignende. Pronase og trypsin foretrækkes. Det foretrækkes inden eller under enzymbehandlingen, at den vandige opløsning indstilles til og 20 holdes ved pH 7-8. Til dette formål kan anvendes natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natriumcarbonat, natriumhydro-gencarbonat og lignende. For at forhindre nedbrydning af reaktionsblandingen under enzymbehandlingen er det en fordel at tilsætte en lille mængde af et organisk opløs-25 ningsmiddel som f.eks. chloroform, toluen eller lignende. Enzymet anvendes sædvanligvis i en mængde på ca. 1-2 vægt-% baseret på vægten af pulveret (tørstof), der skal underkastes enzymbehandlingen.

30 Den ovennævnte enzymbehandling udføres sædvanligvis ved 30-40 °C i 1-72 timer, fortrinsvis 24-48 timer. Den kan også udføres ved f.eks. først at tilsætte ca. 1 vægt-% af et enzym til pulveret (tørstof), og underkaste pulveret (tørstoffet) for enzymbehandling i 1-24 timer og herefter 35 yderligere tilsætte ca. 1 vægt-% af enzymet igen for yderligere at enzymbehandle.

11

UK IbOtKf l B

Efter ovennævnte enzymbehandling fjernes uopløselige dele eventuelt ved en behandling som f.eks. centrifugering eller filtrering, hvorefter der fra den således opnåede vandopløselige del opsamles de pågældende fraktioner af 5 de carcinostatiske forbindelser TF-320, TF-330 og TF-340.

På denne måde kan TF-320 fås fra TF-220, TF-330 fra TF-230 og TF-340 fra TF-240. Isoleringen af TF-320, TF-330 og TF-340 kan udføres ved i det mindste én fraktioneringsmetode afhængig af pH, separat udfældning med et hy-10 drofilt organisk opløsningsmiddel, ved fraktionering med en ionbytter eller ved ultrafiltrering. Eventuelt kan én eller flere af disse behandlinger gentages flere gange.

De carcinostatiske forbindelser TF-320, TF-330 og TF-340 fås specielt ved at indstille den ovennævnte vandopløse-15 lige dels pH til fortrinsvis en pH-værdi på ikke over 2,5 (eventuelt kan trichloreddikesyre tilsættes), fjerne det fremkomne bundfald, tilsætte den opløselige del et hydrofilt organisk opløsningsmiddel som f.eks. en alkohol, således at koncentrationen af denne bliver 30-80 rumfang-%, 20 fortrinsvis 60-80 rumfang-%, opsamle det fremkomne bundfald, der er en fraktion af den omhandlede forbindelse, og herefter eventuelt behandle dette bundfald med en €> ® stærk anionbytterharpiks som f.eks. Dowex 1, Amberlite IRA-400 eller lignende (denne behandling kan udføres fle-25 re gange) for at opsamle de uadsorberede fraktioner, eventuelt underkaste fraktionerne ultrafiltrering (f.eks.

Toyo Ultrafilter UK-50 [molekylvægtsafskæring: 50 000] eller Toyo Ultrafilter UK-200 [molekylvægtsafskæring: 20 000]), og herefter underkaste dem f.eks. koncentre-30 ring, afsaltning, tørring eller udfældning fra et hydrofilt organisk opløsningsmiddel eller lignende. De således opnåede carcinostatiske forbindelser TF-320, TF-330 og TF-340 har de i tabel 2 angivne egenskaber.

35 De carcinostatiske forbindelser TF-320, TF-330 og TF-340 kan omdannes til farmaceutisk acceptable salte heraf ved almindelige metoder. Specielt skal f.eks. nævnes alkali-

DK 165641 B

12 metalsalte som f.eks. natriumsalte eller kaliumsalte og jordalkalimetalsalte som f.eks. magnesiumsalte eller calciumsalte som eksempler på farmaceutisk acceptable salte.

5 10 15 20 25 30 35 _13 _ DK 165641 15 o » o c

<D -P v N «3 Ό H G P

O O Φ ID

Λ C Λ O

O) (0 tO

Η A ·> H

H -P O >1 <D OCX! CD E OP s = = Q. -P 0) ,

H -HOP

a g * o o tn to S ΧΪ h μ +>

r-1 v O O O Η *H H 0} O O >i ø C P A Η Φ OP Ρ.Λ H O

0 -P X! -H P Φ ΟΌ _______ , g

tn C

C OB

1 -O O i E

(0 M OO o W -n ρφηρ uo 0) +J CO O -P c tu tH-Htox: «h-ho

c -H o B Οι -H O

•H ri ω O tn G Η Μ P

N C O 10 O OP P CO Λ * PPG Λ ( ^

p μ antog* & P

ω η o go g p oo) dq > mbs-h neoo> 2 O 3 ' > oo c S * ερρφ epfflp •h IxJ^-g §£6* tn X5 O 3 G £* O Pt O -Η -P B O _ Ή M ri H C Η O P g h o >

O O P O G O O

* -HG+MOH -ΗΛ Ο 10 ρωθ)Η3 pwoo

E * (0 O B * oo G

S <0 P P 6 Π (OMPHp to μ to -p ,p to p h, mxivow ή ΦΦ

β Oh O C B H

0 O Ή I C o φ o 3

CGHCQ3 CCOB

cop ε c o p -h 1) H £ 0)5 O Ti 5 ti

Q -P W O Ή Q ·Ρ CO CQ

1 -μ o -pc Ό Ό 3 , c -η μ μ o > X3 o O £5 O > = Ϊ s

CO -KO W H

Ό μ in 3 D tJ)H α P /

O L

£5 t (0 /0 _ _ _

x /-ri O O O O

(0 /+) N CO ^ OJ

c X CS CS CS CO

O / O I I r‘ r' O)/ P tu h fri M/ tu BH Jh_

i* DK 165641 B

Ό 0) Λ Ο) Η = s ,. Η 0) Μ θ- Η a ο ι

•Hk Cn ho G O S CH

D) k 3 ffl C

G D.4J Λ H k k G k Λ (0 ·Η

Ai ffl ϋ Λ >

k E -H

•H EH 010 > ffi k O tf Λ Λ G = M tq ω tt) — 10 G 3 k •μ h o m E ffl (d O) *h cd h to o μ to 3

μ h ji c o E

k o (0 0) A -η o x k g μ td μ o to co w g η ® o k ο) μ μ g n cd G ffl H 3

fet G k O E

kl ffl Φ t n e ω q m id h CQ < E-<--- ffl Ό

G

ffl ffl = = to *0

D

k / Q) / Λ /G (O /0

/H O O

to / μ co ^ C X CO 00 ffl / cd i i tn/ k 1¾ fet &y fei ih b ^_ 15__ UK lbbb*n ts dp H ^

σι Η H

U I I '

0) 2 C" O N

•Η Η H

Ό i-l S---- o) " CO —· H w i> i> in d a in in ^ (0 i-l td 4j ----—--

C

a} g <D -— in ® H dP <* 9

H w i I I

O N m U ^ ^ 00

Ij V ·> pq i o i o o

£ CO H w NlO

* g kin i C ‘in σ> ooho 929 ^ a) ήο i N 9 ο I "

JJ L| JJ (S Ο H 4JNOO

(0 -μ a CO in rH acoinvo to λ; μιιη μ i in ° 4J ctf OOHO) oohh u a to ο o ®o η tB pQvO*· XJiD·.^ m to to oo ο o onoo

w C CSJ όί (N H

0 i-l tw VO M jj 4j VO (N

(M -H (0 (d rl H <0 <0 r-I tH

•P XJ I I = Λ ^ * I

j q. coo coo w m gdico'd* S Q) co m

S o 3OVON

< w μ tu η η H 2HH.

[H XH +} JC £ £ 9 g <d 8J o oh a) δ ο ο ε 0)0 a c ncoi £Cnvo 0 Ό toocog “

β'-' -HMHO m ^ 9 9 S

S-o pdooo ii'SSS05

μ ο ·ρ Cio^fN c in rH

ΉΡ Q) *<d σ» O Q) ·<0 σ< M1 O) CO) Q Λ Μ Η Η ΟΛΝΗ o H g

1 i i . I

to d i ε dig dig 0) 00)0 00)0 00)0 c -HP* ^ PA! Ή -P A! H +> H fl) Ό 4->iHQ)O -P H Q) Φ μ ,¾ <D Ο Ό 0) U A! (!) 0) Ό <D U a; 0) Q) Ό 0) o S >o Λ^ε >o <ο*ε >° g PAJtQO) MAitOO) PAitOO) O *H 5 OhO Ή Ή O P in ΉΉ Ohin

Qj •ΡΟ'ί +JQ)N +> <D Η g jj a)pa+JPN tu p a+> p n α) μ a-p μ <n

oS C o u X φ I c e paj ® i c 0) μ ^ 0) I

y g ctoidCCO dtotdddin ctoidddo

0§ ΦΗΑ301Ο OJ-HAidOco (U-HAidOO

q a q > to a a-π q > to qoih q > to aaN

μ / <i) / λ /c td /0 _ Αί /-Η Ο ο Ο t0 / +> Μ Ο 2 C / Αί Ν « 9 (3) / (0 I I ' ο/ μ tu £ Μ / fa Ε-ι__ JH__£_

___is _ DK 165641 B

cip w ·<φ ^ in

Pi II

dl 2 Η «Η CO

•ri Ό P

ffi---- >

CD

W ^ >i <#>

H w Cv \Q

(0 1 II

C a in in m< (0 p (0 4J---- c <1) s (D -—' t> vi1

H <#> M< M* CO

ω w i ii co co cm

O CO CO CO

* I *

P o o O

CQ I M CO I CM O

a to in o to in cm

C ^ t—{ i—I C *· i-1 CM

o o i oo i h ^ <D ·Η O O * ·ΗΟΟΙ •μ p μ co ro o μ co co ch td μ a co in oh aco m ini to a; p i hhi p i h cm e μ o) ooHg oorHt) p a to o * o toov O to Λ in o - Λ in o *in μ to (tjcocMOO to co m< o co

W c IOVOO UD M< CO

0 p μ h co ro pmrHco CM *H <0 (0 I Η I ID Id I H 01 μ xjoio = Λοιο H a CJIOOCM βιοο

(3) p E Φ vD CO CO EIDOHO

Λ O 3OHC0 3 Ό Η M* O

(0 CO p ti) HD) Ρ © H CJ\ l·* sh μ .g * o μί » (01 A! P O o ΑίΡΟνκ E ©ffiinoo QJflJinoo <D0 acrooiN a c co co

Ό CO CM M< O' C0 CM Mi O

"Θ· *W rH ·Η Η H

p 1) CD s i *w Q) - I i to ό μοοοο μ*οοοο

ΡΟ μ G CM ID CM μ c CM ID CM

m μ cd ho σ' μ ο (Dhoo'M'h CO) D ΰ (Μ Η Η ΡΛ(ΜΗΗ

H E

1 I I

CO CO) CO) Ο) ΟΟΌΟι ΟΌΌΟ) g -Ηοορμ -Ηοορμ η μμ> ο) ου μμ> φ οιο Ρ Αί (0 ϋ ΡΉ» Α! <0 Ο Ρ ·Η ° φ (0 ο ο ο) Ό (0 (Do (D Ό G ΡΡΡ G G in Ρ Ρ Ρ c c ο

Ο μ Φ φ Ο Ο ffi θ' r Ρ (& (DO Ο ISO

a Όοα^μΗ ΌβΜ^μίΜ εμ (dcohew φ β ο η ε to ο a: c >ta οόρ G^a oop

Ai G G O) E · A! Η φ C OlE ·ΑΗ Φ Φ 3 Φ Φ O (0 Φ 3 > Φ Φ O (0 Φ 3 > oa o ΰ x o »o m o___αοχ o ό μ o ρ / φ /

Λ /G (0 /O

X tA O O O

CO / μ CM CO Ml G / a: co co co

Φ / (0 I II

Oy P tu fe fe by fe _ b eh_

17 DK 165641 B

. C •H H

0 C

b O + + + + + 1 -ri >i+> U X ^ 3f «0 0 Φ J u

H

u C 3! O I Ή H+> + + + + + + 0 X Ό «0 C Φ w h .

O

ω

(S

æ c i c

OflO + + + + + + •Η O Ή •μ u μ

~ x λ x μ nj μ (d (0 Ο) Cd) to k < u μ <D

u -------- o u μ to i w μ ^ 0 n to csi

J « β J

w 1 Q + + + + + + op η μ < ο μ

ΐη CX

Φ (0 Λ Φ PU μ 1 c Λ Ο ϋ μ 03 μ •HJ* + + + + + +

Η (0 Ο Φ Σ U

7\~7 μ c \ / ^ ο V .

Ό μ A III

*μ / \ β <0 / \ S h /__\___ Μ / Φ /

Λ /C

(0 /0

ϋ /μοΟΟΟΟΟ Μ/4->ΝΠτ)'Ν00''ί c/a:m<soicooooo Φ / <0 I I I i II

Di/ μ b b b b b b ty_b EH EH EH E·* 1H E-<

18 DK 165641 B

μ *-n H dP g rid ^ O g co Q)

G Ό 4-> -H O

X g +> >i 3 Φ

P X) g O O

P H lO oo ^ Ό Cd 01 3 g - · · 3 C cd «0 Ό P -H o o

H Φ H

o co o o i i o o o XJ fe H r-Cr-i«-)·

Ό +> I O O

C C >i CO N

ri Ή Vc (0 CO (0 (0 C > S O · · o u o •h o o , cd id (DXJJ v| o O v| v| v| μ ogo h O Φ

Ph cd > μ d) X Δ >1 ft μ ^ μ ό dp co o o o

Od)'— m in co id id in p 3 > N N 0)

C ...» C

·σμ<1).·10<0ΐ0<00 ^ Η Η Ό Cd Cd O O O O -r| μ OriO O O ϋ μ cd Δ g μ i i i i λ: CQ Ό 0) I I (0

μ G Φ g W νθ ιο O P

ρ Ή io i in m η η h do μ O Ό O ^ μ ·Η O O · · · · · · fl) w p 3 co cd cd <0 cd cd cd co

CO H CO O · ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ -H

no x: die h 0 I 0)

i-3 O g H CO

Η (0 O O Ό ra co co ti h < a eh-------o Ό ti 1 -H *H iri Ή -iri ·Η Cd æ di > CG O) O) O) O) O) Cl) O *H 0*0 O O o O 0) •H C ~ g g g g g g Ό

μ 10 g ti ti ti ti tie GG ti ti GG

0,9 ςφφφφφφ·φ s-ι h w +j vd μ vd μ in μ o μ o μ m a O Ck G vo CvD C 'O G CO G 00 Gvo

CQ O X CON ION cd N CON Cd N CON CO

xi cojnii x i x i i *1 Λίι <D

(0 O) g CO OD CQ Ø) DO CO ID CO lO CO O μ

H C'tf ti^f cm C^ C ^ Gin P

Uld < ON ON ON ON ON ON ·©· μα -H iri -iri ·Η -Η -Η Ή p ija μ ih μ cm μμ μμ μμ μμ Ό φ>ο a co a co ae ae aco ae 3 H'-'vp μ μ μ μ μ

Ο IN OG OG OG OG OG OG G

•HQ) CO φ CO Φ CQ Φ CO Φ CO Φ CO Q) Φ > P ffi XJ Ό ΧΙΌ ΛΌ XJ Ό XJ Ό ΧΙΌ O) co μ a (οφ to φ (0Φ co φ cd φ <ο φ g ΡΛί Δ χ! Æ Χ3 XJ χ; ·η μ ΦΌ Ό Ρ Ό Ρ ΌΡ ΌΡ ΌΡ ΌΡ Η η a φ φ» φ» φ æ φ» φ» offirid D C0 > > G > G > G > G > G >C 2 Ømt emm^—^mmm ÉMMWBH· ^mmmmmm^^m ^^mmmmmm^m « « O)

G

•H

c

X

o O O O O O P

N CO ’tf N CO "S1 (B

N N N en CO 00 g I I I I I 1 Φ

Iz, fe fc fc, (i, b CQ

Eh E« En E-< EH E-« J----L-C—- * 19

De farmakologiske virkninger af de carcinostatiske forbindelser TF-220, TF-230, TF-240, TF-320, TF-330 og TF-340 er som beskrevet nedenfor. I de følgende farmakologiske forsøg opnåedes forsøgsforbindelsen TF-220 som be-5 skrevet i eksempel 1, TF-230 som beskrevet i eksempel 3, TF-240 som beskrevet i eksempel 5, TF-320 som beskrevet i eksempel 6, TF-330 som beskrevet i eksempel 7 og TF-340 som beskrevet i eksempel 8.

10 (1) Immunostimulerende virkning

Tre ICR-stamme mus (hunmus 6 uger gamle) anvendtes for hver gruppe. Hver af forsøgsforbindelserne opløstes i en fysiologisk saltopløsning, og 0,2 ml af hver af de frem-15 stillede opløsninger administreredes intraperitonealt til musene. 24 timer efter administreringen injiceredes 0,2 ml af en carbonsuspension fremstillet ved at blande 1 ml Pelikan blæk 17 sort (fremstillet af Giinther-Wagner Co., Ltd.) med 2 ml af en fysiologisk saltopløsning indehol-20 dende 3 vægt-% gelatine intravenøst i musens hale, og 1, 5, 10 og 15 minutter efter injektionen opsamledes 0,02 ml af blodet fra øjenhulen under anvendelse af et hemato-kritkapillær beklædt med heparin, og der fortyndedes straks og hæmolyseredes med 1,6 ml af en 0,1 vægt-% van-25 dig natriumcarbonatopløsning. Denne opløsning underkastedes kolorimetrisk bestemmelse ved 675 nm, og det phago-cytotiske indeks (K-værdi) bestemtes ud fra ligningen beskrevet af Halpern et al.

30 Til musene i kontrolgruppen administreredes 0,2 ml af en fysiologisk saltopløsning.

log CQ - log C

t - *0 35

DK 165641 B

20 hvori CQ = carbonpulverindhold i blodet til tiden tQ, og C =«. carbonpulverindholdet i blodet til tiden t.

Resultaterne er vist i tabel 3-5.

TABEL 3

Forbindelse Dosis Gennemsnits K-værdi (mg/kg) TF-220 1,5 0,1087 + 0,0346 3 0,1292 + 0,0289 TF-230 5 0,1028 + 0,0175 10 0,1194 + 0,0334 TF-240 5 0,1109 + 0,0250 10 0,1127 + 0,0496

Kontrol - 0,0348 0,0037 TABEL 4

Forbindelse Dosis Gennemsnits K-værdi (mg/kg) TF-320 0,1 0,0468 + 0,0123 1 0,0715 + 0,0040 TF-330 0,1 0,0601 + 0,0098 1 0,0965 + 0,0102

Kontrol - 0,0295 + 0,0007 21

DK 165641 B

TABEL 5

Forbindelse Dosis Gennemsnits K-værdi (mg/kg) 5 TF-340* 5 0,1292 + 0,0229 10 0,1001 + 0,0295

Kontrol - 0,0408 + 0,0016 *Bemærkning: Forsøget udførtes på en gruppe bestående af 10 4 mus.

(2) Carcinostatisk virkning (i) Antitumorvirkning over for Ehrlich tumor ascites 15

Ehrlich tumor ascitesceller indsprøjtedes intraperitone-alt i ICR-stamme mus (hunmus, 6 uger gamle) i en mængde 5 på 1 x 10 celler pr. mus. Herefter opløstes hver af forsøgsforbindelserne i fysiologisk saltopløsning, og 0,2 ml 20 af hver af de fremstillede opløsninger administreredes intraperitonealt til musene en gang om dagen i 7 på hinanden følgende dage fra den første dag efter indsprøjtning af tumorcellerne. Til kontrolgruppen administreredes 0,2 ml fysiologisk saltopløsning på samme måde som be-25 skrevet ovenfor.

Resultaterne er angivet i tabel 6 og 7.

Overlevelsesdage for musene.i en gruppe til hvilken, der er administreret 30 forsøgsforbindelse x 100 (%) T/C - -

Overlevelsesdage for mus i kontrolgruppen 35

22 DK 165641 B

—i—i—i—Γ

1—I

g φ

Φ jC H

H Dl 0) H

g Ό C (1) ffl to oo co ω co coco co

rl+)H NS NN NN N

O ra Φ h m in in Min o ίΒΌ H H 0) 0 3 1-1 ^ΉΛ

<D

<« Ό <0 C 0) 0 Di Ό > id co co co oo ω co co

H (DO W. W NN -N

OH (M IN IN O' co in o

jd ho U <D CO

o >

fa OH

0 ^ in co in co co vo o 'N# CO IN IN vO CO 'S* o

B '—-* Η H HH t—l Η H

Λ Λ Λ Λ Λ Λ ra Φ vo co «Η Η φ W > CQ φ < Η Ε-ι k »-ICO co ό vo in vo 0) XV x x x x x

> VON O in IN M

0 ra +1 + 1 +1 + 1 +1+1 +i +> ~

HD) CO H OVCO 03 in CO

CJ (I) XX xx xx x ra Ό o3ov O)co (O'# vo

gw (NCS 03 03 03 03 H

Q) A Λ ΛΑ A A

C Φ C D) Φ <d Ο Ό

X

0)H

X c ~

'nH h IN IN

D>g Φ

SOD) X X O' IN IN IN

w td β H co in XX XX 1 01 H k * v h cd Φ oh h in h in ra +> h 0 C +> p id ra Φ ra

H

Φ

Ό H

C O O O 0

H 03 CO ^ W

Λ 03 03 OJ -P

U I l I C

O fa fa fa 0

fa__Eh Eh ^ X

23 DK 165641 B

H

ε α) Φ £

H

H O) φ H

ε *d c 0) ^ Ό S3 W 0000 0000 0000 00 Η -μ H W 'N'N NN N.

O co φ !> n- in [N in in o jS Ό Ό μ η φ

0 P U fe «Η XI

Φ Ή fl (0 C Φ Φ O) _

Ό > (0 00 00 00 00 CO CO OD

ri d)fl W W W > OH IN N· N* N« N* CO o

Λ HO

μ φοο ο > fe Ο Η O'-" (Μ Ν· Ν' VO C0C0 Ο \dp IN CO IN IN VO rf Ο

Ehv-t HH HH HH H

Λ Λ ΛΑ Λ Λ

CO

φ Ν' Μ ιΗ j φ ω > CQ Φ < Η Εη μ ιοοι ιοσι ιη^# οο Q) Κ V κ «. *» ^ * > Ν'ί OO Ν § +1+1 +1+1 +1+1 +1 -μ Η Ο) ΟΗ 00 VO 00 Ο 00 C(d *·* vs *·*· " Μ·0 σ' co σνσν οο^ νο gw CM CM ΝΙΝΙ CM CM Η φ Λ Λ Λ Λ Λ Λ C Φ C Ό) Φ (0 Ο Ό χ 0)*Η X c ~ \Η μ IN Ν' ϋ>ε α)

g Ό Ο) X Ν' X Ν' IN IN

((3 C

η in χ in χ XX i m η μ •Η (ΰ Φ OH OH Hin co +> μ o c -μ ο (0 co φ

CO

rH

φ ,

Ό H

c ο ο o p H CM CO 'S' ft XI CO co co -μ

^ i i i C

0 fe fe fe p fr, E-< EH E-1 fe (ii) Antitumorvirkning over for Sarcoma-180 celler 24

DK 165641 B

(a) Sarcoma-180 celler transplanteredes intraperitonealt 1 ICR-stamme mus (hunmus, 6 uger gamle) i en mængde på 1 5 5 x 10 celler pr. mus. Derefter opløstes hver af forsøgsforbindelserne i fysiologisk saltopløsning og 0,2 ml af hver af de fremstillede opløsninger administreredes in-traperitonealt til miisene en gang om dagen i 7 på hinanden følgende dage fra den første dag efter transplante-10 ringen af carcinomacellerne. Til kontrolgruppen administreredes 0,2 ml af en fysiologisk saltopløsning på samme måde. Resultaterne er vist i tabel 8.

15 20 25 30 35

25 DK 165641 B

i

r-H

S Φ Φ jG

i—I

i—I D)

Φ -H

e ό G 0) * ό ffi οι ld in in in in tn in H+>H MN. mm MM V.

OWO w in h in o xi Ό Ό U r-i φ 0 3 k ki Ή Λ - m ό fiCl) O) O) Ό > (0 ld in in in in in in Η φ Ό N.M NN MM V.

OH win nico win o Λ ua

M <D CO 0 > k« O H

O'-' IN CO MX) moo O

M# in O CMC 'tfO O

E-ι ___ ri W HH HW H

A Λ Λ Λ ΛΑ to Φ οο μ Η j φ ω > CQ Φ < η _ Ε-ι μ οο ιοοι ηο η

(J) V V V V V S. V

> νθ Ο Η 0\ C^O CN

Μ +1+1 +1+1 +1+1 +1 -μ -ν •Η Ο) 00 Ο WOO Tf Ο 00 β(0 V k **. »k. k

03 iQ lOO CTi ·Ί· HO

gw (SCO WW WOO Η

φ Λ Λ Λ Λ Λ A

G Φ C Ο) Φ <0 Ο Ό * 0)Η χ c ^ Μ Η U ΐ> C" Ο) g Φ g Ό Ο) XX ININ Μ Μ w (0 Ο

Η CD in XX XX I

03 Η k k <.

ri (0 Φ oh Hin Hin to +> u 0 C +> Q (0 03 Φ 03

rH

Φ

Ό H

G O O O 0

H W 00 ^ H

jQ W W W +>

U I I I C

o fn kl kl 0 ki Eh B ki 26

DK 165641 B

(b) Sarcoma-180 celler transplanteredes subcutant i armhulen på ICR-stamme mus (hunmus, 6 uger gamle) i en mæng- 7 de på 1 x 10 celler pr. mus. Herefter opløstes forsøgsforbindelserne 1 fysiologisk saltopløsning eller i en 5% 5 vandig glucoseopløsning, og 0,2 ml af hver af de fremstillede opløsninger administreredes intravenøst eller intramuskulært i musene en gang om dagen i 7 på hinanden følgende dage fra første dag efter indtransplanteringen af carcinomacellerne. Til kontrolgrupperne administrere-10 des 0,2 ml af en 5% vandig glucoseopløsning eller en fysiologisk saltopløsning på samme måde som omtalt ovenfor. Resultaterne er vist i tabel 8-(2).

Tumorvægt hos mus i en gruppe til Λc hvilken, der er administreret

Tv (%) = 100 x forsøgsforbindelse_

Cv Tumorvægt hos mus i kontrolgruppen 20 25 30 35

27 DK 165641 B

>

o ^ H H Ti CO O

00 O CO ^ O

> w Ή

Eh • in in oo «si n k in m ^ Φ

4«) s ^ ^ v ^ rH

O) O O O O CS H

O) Q) > λ +1 +| +| +l +l o k D) 1 0 W ^ o t> CO o< o E in in vo oo cr> co

3 v V > ^ ^ H

Ε-» H 00 H OS ^ (0 ε ------o 0 p k W I *0

1 ·©. I 0) CO

i^h p g o a h o p mh o <o o «o CO 3 _ •Hk H $?

k <D X O) C

O CO *H

> C -HD) O) D) k Λ Φ oc = -H C = = Φ

CO O -Η Ό *H P

* H H C C C jjj ΦΦΟΜ (0 CO (0

CSAiO*H'©>·© H

w 03 β CO >H Η Λ i ffi *h ίχ a <#> a cg CO >X3fcO ίο o c

CO

iJ k a p g —i------k * g s kp Ή CO Φ O) Ή _ λ c S5 \*H <2 tn ε ό g Ό

[N On in IN

k ^

CO Η Φ K X« X *H

n co D3 1

BM) C H HH H C

O C Η N N N ω

QcdkO O O O V

«(O

a k φ

T) O

φ > ε > ε cs > H HH Hl 00 å k

O

m S s

3 S

’rj Η Φ

C O OP

•H os k <d

Ώ CO p P

k i C H

o tu 0 3 £ H ^ co Φ

- K

(iii) Antitumorvirkning over for Ehrlich faste tumor 28

DK 165641 B

Ehrlich tumorceller transplanteredes subcutant i armhulen på ICR-stamme mus (hunmus, 6 uger gamle) i en mængde på 4 5 x 10^ celler pr. mus. Herefter opløstes hver af forsøgsforbindelserne i en fysiologisk saltopløsning eller 5% vandig glucoseopløsning, og 0,2 ml af hver af de fremstillede opløsninger administreredes intraperitonealt til musene en gang om dagen i 7 på hinanden følgende dage fra 10 den først dag for indtransplanteringen af tumorcellerne.

Til kontrolgrupperne administreredes 0,2 ml af en fysiologisk saltopløsning eller en 5% vandig glucoseopløsning på samme måde som ovenfor. Vægten af hver tumor bestem tes. Vægtbestemmelsen af tumoren udførtes ved at måle ho-15 veddiameteren (a mm) og den mindre diameter (b mm) ved hjælp af en skydelære og erstatte værdierne for a og b med følgende ligning: 2 20 Tumorens vægt = a x b (mg) 2

Resultaterne er angivet i tabel 9.

25 30 35

29 DK 165641 B

t*P

'w' >01NCOCTiCKCTiO nxøyjtcrjcjinioo -v -i > ^ 'tf ri p 0i Di (0¾ Nvoinvo^· D^-rHCNCN'OC^O'-l O)

*,W^*.SS^C

CQNHHOOHH-H

§ +| +| +| +| +i +l +l ra h "©·

OOC^CO^tfO-CIOlH

gcocovooooco Λ 3 **fc****0

En^cacstS'^'i'vo+J

H

(0 ____ I ........ a)

X

CQ

tn rj.

(0 O)

Ό O

w £

D> O

c H - ® ϊ_ι CO ?ϊ Q) l> «Η

t> ri - P

CQ U3 •H O) CJ\ C Ή - 5 •H m ’dm

j s a> SS

ω Ό (0 » Si;

m t£ Q SO

3 ^ W H <D

2 a c H 0 0) _______—1- 0)

u P

d) d)

•μ fQ

_i m 3 s §

§ u s S

φ £ i

«g1 C P

Sil > ‘w 'vot'.F-ot'-r-t'' co rn (J (0 gp*****:* i Λ g C- cq od)

•HCO^DOOOO 'tf -P

01 c hcshm g> •Η -Η r‘ 5 SI & > °® H ti H (0 •P Ό 0 c n d)

01 Q

d) m ·· H * Φ _.

rrj H ·· CO O o P o •ri Od CO •'tf H ^

S3 01 Ol 01 -p *H

Li I I I .C C

o tu fe I* o Ai fe Eh fH E-* ^ jjj i dl

_____ CQ

(iv) Antitumorvirkning over for B-16 melanomceller

DK 165641 B

30 (a) B-16 melanomceller transplanteredes subcutant i armhulen på BDF--stamme mus (hanmus, 7 uger gamle) i en * 6 5 mængde på 1 x 10 celler pr, mus. Herefter opløstes hver af forsøgsforbindelserne i en fysiologisk saltopløsning, og 0,2 ml af hver af de fremstillede opløsninger administreredes intraperitonealt til musene en gang om dagen i 7 på hinanden følgende dage fra den 1. dag efter ind-10 transplanteringen af tumorcellerne. Til kontrolgruppen administreredes 0,2 ml af en fysiologisk saltopløsning på samme måde. Vægten af tumorerne bestemtes på 17. eller 23. dag efter indtransplantering af tumorcel lerne. Bestemmelsesmetoden var som ovenfor (iii). Resultaterne er 15 vist i tabel 10.

TABEL 10

Forbin- Dosis (mg/kg x Gennemsnit- Tv/Cv (%) delse antal admini- lig tumor- 20 streringer vægt (g) TF-220 1,5 x 7 3,92 + 2,29 82 3x7 3,69 + 0,81 77 25 TF-230 5x7 3,21+0,64 67 10 x 7 3,71 + 1,08 77 TF-240 5x7 3,78+1,26 79 10 x 7 4,00 + 1,36 84

Kontrol - 4,76 + 0,68 100

Bemærkninger: Gennemsnitstumorvægtene for TF-220 til TF-240 bestemtes den 17. dag efter indtransplanteringen af tumorcellerne.

35 31

DK 165641 B

(3) Akut toxicitet LDgQ-værdierne for mus (ICR-stamme, hunmus, 6 uger gamle, intravenøs administrering) er vist i tabel 11.

5 TABEL 11

Forbindelse (mg/kg) 10---- TF-220 >200 TF-230 >100 TF-240 >200 , _ TF-340 >200 15 __

Som det fremgår af de ovennævnte farmakologiske forsøg, er forbindelserne TF-220, TF-230, TF-240, TF-320, TF-330 og TF-340 værdifulde som carcinostatiske midler, hvorfor de kan forventes at have virkning over for forskellige

Zv cancer-sygdomme og at udvise bemærkelsesværdige virkninger over for specielt faste cancere. Alle forbindelserne havde udmærkede virkninger.

__ TF-220, TF-230, TF-240, TF-320, TF-330 og TF-340 for- 25 bindeiserne kan anvendes i forskellige farmaceutiske dosisformer som perorale lægemidler, som injektioner eller suppositorier, idet den foretrukne form er som injektion. Dersom de anvendes som perorale lægemidler, kan disse indeholde forskellige hjælpestoffer og foreligge

wpU

som kapsler, tabletter, pulvere eller granuler. Dersom de omhandlede forbindelser anvendes som injektioner, kan disse foretages subcutant, intramuskulært eller intrave- 35

DK 165641 B

32 nøst, og de kan anvendes som en suspension, en opløsning eller et pulver, der opløses i saltvand, eller en opløsning, der ved brugen indeholder glucose eller et lokal-anæstetikum.

5

Dosis af TF-220, TF-230, TF-240, TF-320, TF-330 og TF-340 udvælges afhængigt af patientens tilstand, skønt det sædvanligvis er fordelagtigt at administrere disse i en voksendosis på 0,005 til 50 mg/kg én gang om dagen eller 10 flere gange om dagen afhængig af administreringsmåden, idet de fortrinsvis administreres subcutant, intramusku-lært eller intravenøst eller som injektion i den angrebne del.

15 Opfindelsen forklares nærmere i detaljer nedenfor, idet der henvises til eksemplerne og de medfølgende tegninger, hvor fig. 1 viser et mikroskop-fotografi, der angiver formen 20 af Fusobacterium nucleatum TF-031, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen; fig. 2 viser et infrarødt absorptions-spektrum af den carcinostatiske forbindelse TF-220 fremstillet i eksempel 25 1, der omtales nærmere nedenfor; fig. 3 viser et ultraviolet absorptions-spektrum af forbindelsen; 30 fig. 4 viser et infrarødt absorptions-spektrum af den carcinostatiske forbindelse TF-230 fremstillet i eksempel 3, der omtales nedenfor; fig. 5 viser et ultraviolet absorptions-spektrum af for-35 bindeisen;

DK 165641 B

33 fig. 6 viser et infrarødt absorptions-spektrum af den carcinostatiske forbindelse TF-240 fremstillet i eksempel 5, der omtales nærmere nedenfor; 5 fig. 7 viser et ultraviolet absorptions-spektrum af forbindelsen; fig. 8 viser et infrarødt absorptions-spektrum af den carcinostatiske forbindelse TF-320 fremstillet i eksempel 10 6, der omtales nærmere nedenfor; fig. 9 viser et ultraviolet absorptions-spektrum af forbindelsen; 15 fig. 10 viser et væskechr oma tograf i med høj ydeevne af forbindelsen; fig. 11 viser et infrarødt absorptions-spektrum af den carcinostatiske forbindelse TF-330 fremstillet i eksempel 20 7, der omtales nærmere nedenfor; fig. 12 viser et ultraviolet absorptions-spektrum af forbindelsen; 25 fig. 13 viser et væskechromatografi med høj ydeevne af forbindelsen; fig. 14 viser et infrarødt absorptions-spektrum af den carcinostatiske forbindelse TF-330 (renset) fremstillet i 30 eksempel 7, der omtales nærmere nedenfor; fig. 15 viser et ultraviolet absorptions-spektrum af forbindelsen; 35 fig. 16 viser et infrarødt absorptions-spektrum af den carcinostatiske forbindelse TF-340 fremstillet i eksempel 8, der omtales nærmere nedenfor:

DK 165641 B

34 fig. 17 viser et ultraviolet absorptions-spektrum af forbindelsen; og fig. 18 viser et væskechromatografi med høj ydeevne af 5 forbindelsen.

EKSEMPEL 1 (1) I en 10 liters forgæringsbeholder (fremstillet af 10 Marubishi Rika Kenkyusho) anbragtes 8 liter af et TF-e dyrkningssubstrat indeholdende 17 g trypticase pepton, 10 g hjerteinfusion, 3 g gærekstrakt, 7,5 g natriumchlorid, 12 g glucose, 10 g lactose, 0,1 g natriumsulfit og 0,5 g natrium-thioglycolat, pr. liter destilleret vand. Dyrk-15 ningssubstratet steriliseredes i 30 minutter ved 120 °C.

Efter afkøling af dyrkningssubstratet, ledtes nitrogengas gennem dette med en hastighed på 100 ml/min. i en time. 1 dyrkningssubstratet udsåedes 1 liter af en fordyrket kultur af Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-20 31647) fremstillet forud ved at dyrke kulturen i et TF-e dyrkningssubstrat, der havde ovennævnte sammensætning. Cellerne dyrkedes 3 dage ved 37 °C under omrøring (30 omrøringer pr. minut), medens der tilførtes nitrogengas med en hastighed på 65 ml/min. Efter dyrkningen sattes til 25 kulturen 160 g Celite og 80 g cellulose-pulver, og blandingen omrørtes og filtreredes under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 7,8 liter af en bakteriefri supernatant væske af kulturen.

30 (2) Til 7,8 liter af ovennævnte supernatante væske sattes 117 ml koncentreret saltsyre for at indstille væskens pH til 2,0, hvorefter 11,7 liter ethanol tilsattes for at danne en 60% vandig ethanol-opløsning, der herefter hen-stod 24 timer ved 4 °C. Herefter fjernedes den superna-35 tante væske ved dekantering, og den tilbageblevne del 3 underkastedes centrifugering (6 x 10 omdrejninger pr. minut i 5 minutter) ved 4 °C for at opsamle bundfaldet.

DK 165641 B

35

Dette bundfald vaskedes med 400 ml af en 60% vandig etha-nolopløsning, der havde en pH-værdi på 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml acetone og 200 ml diethylether i nævnte rækkefølge, og der tørredes ved reduceret tryk, hvorved op-5 nåedes 4,9 g af et pulver.

(3) Det under (2) ovenfor fremstillede pulver opslæmmedes i 49 ml vand. pH af den fremstillede suspension indstilledes til 7,5 til 8,0 ved at tilsætte 1 N vandig natrium-10 hydroxidopløsning, og efter omrøring i 30 min. ved stuetemperatur, tilsattes 1 N saltsyre for at indstille pH af opløsningen til 6,0. Efter omrøring i 2 timer under isafkøling underkastedes blandingen herefter centrifugering 4 (1 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 min.) for at skille 15 bundfaldet fra den supernatante væske. Dette bundfald vaskedes med 5 ml vand, der havde en pH-værdi på 6,0, og bundfaldet skiltes fra vaskevandet ved centrifugering (1 4 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 min.). Bundfaldet vaskedes med 10 ml ethanol og tørredes under reduceret tryk, 20 hvorved der opnåedes 1,8 g af den carcinostatiske forbindelse TF-220.

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-220 havde de i tabel 2 viste egenskaber. Det infrarøde absorptions-25 spektrum og det ultraviolette absorptions-spektrum af forbindelsen er vist i henholdsvis fig. 2 og 3.

EKSEMPEL 2 30 (1) I en 10 liters forgæringsbeholder anbragtes 8 liter af et TF-d dyrkningssubstrat indeholdende 17 g trypti-casepepton, 20 g hjerteinfusion, 3 g gærekstrakt, 7,5 g natriumchlorid, 12 g glucose, 10 g lactose, 0,1 g natriumsulfit og 0,5 g natriumthioglycolat pr. liter de-35 stilleret vand. Dyrkningssubstratet steriliseredes 30 minutter ved 120 °C. Efter afkøling af dyrkningssubstratet led tes nitrogengas gennem dette i 1 time med en hastighed

DK 165641 B

36 på 100 ml/minut. I dyrkningssubstratet udsåedes 1 liter af en fordyrket kultur af Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) forud fremstillet ved at dyrke i et TF-d dyrkningssubstrat med samme sammensætning som 5 ovenfor. Cellerne dyrkedes i 5 dage ved 37 °C under omrøring (30 omdrejninger pr. min.), medens der tilledtes nitrogengas med en hastighed på 65 ml/minut. Efter dyrk et ning tilsattes dyrkningsopløsningen 160 g Celite og 80 g cellulosepulver, og den fremkomne blanding omrørtes og 10 filtreredes under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 7,8 liter af den bakteriefri supernatante væske af kulturen.

(2) Til 7,8 liter af ovennævnte supernatante væske sattes 15 117 ml koncentreret saltsyre for at indstille den super natante væskes pH til 2,0. Herefter sattes 11,7 liter ethanol til den supernatante væske for at opnå en 60% vandig ethanolopløsning, der herefter henstod i 24 timer ved 4 0 C.

20

Den opløste del underkastedes derefter dekantering, og 3 den tilbageblevne del centrifugeredes (6 x 10 omdrejninger pr. minut, 5 minutter) ved 4 °C for at opsamle bundfaldet. Dette bundfald vaskedes med 400 ml af en 60% 25 vandig ethanolopløsning, der havde en pH på 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml acetone og 200 ml diethylether i nævnte rækkefølge, og der tørredes ved reduceret tryk, hvorved der opnåedes 5,07 g pulver.

30 Det således opnåede pulver behandledes som beskrevet i eksempel 1 (3), hvorved der opnåedes 1,9 g af den car-cinostatiske forbindelse TF-220.

Den således fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-35 220 havde de i tabel 2 angivne egenskaber. Det infrarøde absorptionsspektrum og det ultraviolette absorptionsspektrum var meget nær identiske med de, der opnåedes for den

DK 165641 B

37 fremstillede forbindelse i eksempel 1.

EKSEMPEL 3 5 (1) I en 10 liters forgæringsbeholder anbragtes 8 liter af et TF-e dyrkningssubstrat med samme sammensætning som i eksempel 1. Dyrkningssubstratet steriliseredes i 30 minutter ved 120 °C. Efter afkøling af dyrkningssubstratet ledtes nitrogengas gennem dette i 1 time med en hastighed 10 på 100 ml/minut. I dyrkningssubstratet udsåedes 1 liter af en fordyrket kultur af Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647), der var fremstillet forud ved at dyrke bakterien i et TF-e dyrkningssubstrat med samme sammensætning som ovenfor. Cellerne dyrkedes i 2 dage ved 15 ‘37 °C under omrøring (30 omdrejninger pr. minut), medens der tilførtes nitrogengas med en hastighed på 65 ml/- minut. Efter dyrkning af kulturen tilsattes 160 g β

Celite og 80 g cellulosepulver, og den fremkomne blanding omrørtes og filtreredes under reduceret tryk, hvor-20 ved der opnåedes 7,8 liter af en bakteriefri supernatant væske af kulturen.

(2) Til 7,8 liter af den supernatante væske fremstillet ovenfor under (1) sattes 117 ml koncentreret svovlsyre 25 for at indstille pH af væsken til 2,0. Herefter tilsattes 11,7 liter ethanol til den supernatante væske for at danne en 60% vandig ethanolopløsning, der herefter henstod i 24 timer ved 4 °C, indtil bundfaldet var faldet fuldstændig til ro. Den supernatante væske fjernedes herefter ved 30 dekantering, og den tilbageblevne del centrifugeredes (6 x 10 omdrejninger pr. minut, 5 minutter) ved 4 °C for at opsamle bundfaldet. Dette bundfald vaskedes med 400 ml af en 60% vandig ethanolopløsning med en pH-værdi på 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml acetone og 200 ml diethylether i 35 nævnte rækkefølge, og der tørredes ved reduceret tryk til opnåelse af 2,73 g af et pulver.

DK 165641 B

38 (3) Det under (2) fremstillede pulver opslæmmedes i 25 ml vand. Den fremstillede suspensions pH indstilledes til 7,5 til 8,0 ved tilsætning af 1 N vandig natriumhydroxidopløsning, og suspensionen omrørtes ved stuetemperatur i 5 30 minutter, hvorefter 1 N saltsyre tilsattes for at ind stille pH til 6,0. Herefter omrørtes suspensionen under isafkøling, i 2 timer, hvorefter der centrifugeredes (1 x 4 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Bundfaldet vaske-10 des med 5 ml vand med pH 6,0, og bundfaldet fraskiltes 4 vaskevandet ved centrifugering (1 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter). Vaskevandet og den ovennævnte supernatante væske sloges sammen, og den fremkomne opløsning henstod, efter at pH var indstillet til 4,0 ved tilsæt-15 . ning af 1 N saltsyre, ved en temperatur på ikke mere end 5 °C i 12 timer, hvorefter der centrifugeredes (1 x 10^ omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Bundfaldet vaskedes med 15 ml vand med pH på 4,0, og bundfaldet fraskiltes 4 20 vaskevandet ved centrifugering (1 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter), og bundfaldet vaskedes med 10 ml ethanol, hvorefter der tørredes under reduceret tryk til opnåelse af 0,58 g af den carcinostatiske forbindelse TF-230.

25

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-230 havde de i tabel 2 viste egenskaber. Det infrarøde absorptionsspektrum og det ultraviolette absorptionsspektrum er vist i henholdsvis fig. 4 og 5.

30 EKSEMPEL 4 (1) I en 10 liters forgæringsbeholder anbragtes 8 liter af et TF-d dyrkningssubstrat med samme sammensætning som 35 i eksempel 2. Dyrkningsssubstratet steriliseredes 30 minutter ved 120 °C. Efter afkøling af dyrkningssubstratet ledtes nitrogengas gennem dette i 1 time med en hastighed

DK 165641 B

39 på 100 ml/minut. I dyrkningssubstratet udsåedes 1 liter af en fordyrket kultur af Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) forud fremstillet ved at dyrke i et dyrkningssubstrat med samme sammensætning. Cellerne 5 dyrkedes 2 dage ved 37 °C under omrøring (30 omdrejninger pr. minut), idet der tilledtes nitrogengas med en hastighed på 65 ml/minut. Efter dyrkningen tilsattes kulturen é 160 g Celite og 80 g cellulosepulver, og den fremkomne blanding omrørtes og filtreredes under reduceret tryk, 10 hvorved der opnåedes 7,8 liter af en bakteriefri supernatant væske af kulturen.

(2) Til 7,8 liter af den supernatante væske fremstillet ovenfor under (1) sattes 117 ml koncentreret saltsyre for 15 at indstille den supernatante væskes pH til 2,0. Herefter sattes 11,7 liter ethanol til den supernatante væske for at få en 60% vandig ethanolopløsning, der herefter hen-stod ved 4 °C i 24 timer. Den supernatante del fjernedes derefter ved dekantering, og den tilbageblevne del cen- 3 20 trifugeredes (6 x 10 omdrejninger pr. minut, 5 minutter) ved 4 °C for at opsamle bundfaldet. Dette bundfald vaskedes med 400 ml af en 60% vandig ethanolopløsning med pH på 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml acetone og 200 ml diethyl-ether i nævnte rækkefølge, og der tørredes under reduce- 25 ret tryk, hvorved der opnåedes 3,15 g pulver.

(3) Det under (2) fremstillede pulver behandledes på samme måde som i eksempel 3 (3), hvorved der opnåedes 0,8 g af den carcinostatiske forbindelse TF-230. Den således 30 fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-230 havde de i tabel 2 viste egenskaber. Det infrarøde absorptions-spektrum og det ultraviolette absorptionsspektrum var i det væsentlige identisk med spektrene opnået for den fremstillede forbindelse i eksempel 3.

35

DK 165641 B

40 EKSEMPEL 5 (1) I 25 ml vand opslæmmedes 3,9 g af pulveret fremstillet på samme måde som i eksempel 1 (1) og (2). Ved til- 5 sætning af 1 N vandig natriumhydroxidopløsning indstilledes den fremkomne suspensions pH til 7,5 til 8,0, og efter omrøring af suspensionen ved stuetemperatur i 30 minutter indstilledes pH atter til 6,0 ved tilsætning af 1 N saltsyre. Efter omrøring i 2 timer med isafkøling cen- 4 10 trifugeredes suspensionen (1 x 10 omdrejninger pr. mi nut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernat ante væske. Bundfaldet vaskedes med 5 ml vand med pH på 6,0, og bundfaldet fraskiltes vaskevandet ved centri- 4 fugering (1 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter).

15 Dette vaskevand og den ovennævnte supernatante væske sloges sammen og underkastedes behandlingen under (2) nedenfor. Bundfaldet vaskedes med 10 ml ethanol, og der tørredes under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 1,06 g af den carcinostatiske forbindelse TF-220.

20

Den således fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-220 havde de i tabel 2 viste egenskaber. Det infrarøde absorptionsspektrum og det ultraviolette absorptionsspektrum var i det væsentlige identisk med spektrene opnået 25 for forbindelsen fremstillet i eksempel 1.

(2) Den forenede opløsning bestående af den supernatante væske og vaskevandet opnået under (1) ovenfor, tilsattes 1 N saltsyre for at indstille pH til 4,0, hvorefter blan- 30 dingen henstod i 12 timer ved ikke mere end 5 °C. Dernæst 4

centrifugeredes blandingen (1 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Bundfaldet vaskedes med 5 ml vand med pH

4,0, og bundfaldet og vaskevandet centrifugeredes (1 x 4 35 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter). Vaskevandet sloges sammen med den ovennævnte supernatante væske, og underkastedes behandlingen beskrevet nedenfor under (3).

DK 165641 B

41

Bundfaldet vaskedes med 5 ml ethanol, og der tørredes under- reduceret tryk, hvorved der opnåedes 0,48 g af den carclnostatlske forbindelse TF-230.

5 Den fremstillede carclnostatlske forbindelse TF-230 havde de i tabel 2 viste egenskaber. Det infrarøde absorptionsspektrum og det ultraviolette absorptionsspektrum var i det væsentlige identisk med spektrene opnået for forbindelsen fremstillet i eksempel 3.

10 (3) Til den forenede opløsning bestående af den superna-tante væske og vaskevandet opnået ovenfor under (2) sattes 1 N saltsyre for at indstille pH til 2,0, og blandingen henstod i 2 timer under isafkøling. Blandingen 3 15 centrifugeredes (6 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Bundfaldet vaskedes med 3 ml vand med pH på 2,0, 3 og bundfaldet og vaskevandet centrifugeredes (6 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter). Bundfaldet vaskedes 20 med 5 ml ethanol, og der tørredes under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 0,10 g af den carcinostatiske forbindelse TF-240.

Den således fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-25 240 havde de i tabel 2 viste egenskaber. Det infrarøde absorptionsspektrum og det ultraviolette absorptionsspektrum er vist i henholdsvis fig. 6 og 7.

EKSEMPEL 6 30 (1) I 10 ml vand opslæmmedes 1 g af den carcinostatiske forbindelse TF-220 fremstillet som beskrevet i eksempel 5 (1). Til den fremstillede suspension sattes 1 N vandig natriumhydroxidopløsning under omrøring for at indstille 35 pH til 7,8. Blandingen opvarmedes til 37 °C, og der tilsattes 15 mg "Pronase" E og flere dråber toluen. Under omrøring enzymbehandledes blandingen ved en pH-værdi på

DK 165641 B

42 7,8 til 8,0 ved 37-40 "C i 24 timer. Efter behandlingen centrifugeredes blandingen (4000 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatan-te væske. Til bundfaldet sattes 3 ml vand med pH 8,0, og 5 blandingen centrifugeredes (4000 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra vaskevandet. Vaskevandet og den supernatante væske sloges sammen, og til opløsningen sattes 1 N saltsyre for at indstille pH til 2,0, hvorved der dannedes et bundfald. Blandingen 10 henstod ved 5 "C i 12 timer, og herefter centrifugeredes 4 (1 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Til bundfaldet sattes 3 ml vand med pH 2,0, og blandingen centri- 4 fugeredes (1 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) 15 for at skille bundfaldet fra vaskevandet. Dette vaskevand og ovennævnte supernatante væske sloges sammen, og ethanol sattes til opløsningen til dannelse af en 80% vandig ethanolopløsning. Den vandige ethanolopløsriing omrørtes 2 timer under isafkøling, hvorefter den centrifugeredes 20 (4000 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Bundfaldet vaskedes med 5 ml 80% vandig ethanolopløsning og 5 ml ethanol i nævnte rækkefølge, og herefter tørredes under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 163 mg af den carcinostatiske 25 forbindelse TF-320.

I 5 ml vand opløstes 150 mg af ovennævnte pulver, og den fremstillede opløsning indstilledes til pH på 7,0 ved tilsætning af 1 N vandig natriumhydroxidopløsning. Den 30 fremstillede opløsning hældtes på en søjle pakket med 25 ml Amberlite IRA 400 forud indstillet til OH-typen med 1 N vandig natriumhydroxidopløsning. Herefter ledtes 100 ml vand gennem søjlen. Alle eluaterne sloges sammen, og 1 N saltsyre tilsattes for at indstille pH til 7,0. Opløs-35 ningen koncentreredes under reduceret tryk, og herefter filtreredes der gennem et Millipore filter med en pore-diameter på 0,3 um, hvorefter der frysetørredes til op-

DK 165641 B

43 nåelse af 110 mg af den frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-320.

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-320 havde 5 de i tabel 2 angivne egenskaber, og saccharidindholdet heraf var sædvanligvis ca. 20-60% udtrykt som glucose.

Det infrarøde absorptionsspektrum, det ultraviolette absorptionsspektrum og high performance væskechromatografi af en typisk forbindelse er vist i henholdsvis fig. 8, 9 10 og 10.

(2) I 50 ml vand opløstes 100 mg af den ovennævnte carcinostatiske forbindelse TF-320, og den fremstillede opløsning koncentreredes til en koncentration på 100 gange 15 den oprindelige under anvendelse af "U1trafilter" UK-50.

Dette koncentrat filtreredes gennem et Millipore filter med en porediameter på 0,2 m, og herefter frysetørredes til opnåelse af 72 mg af den rensede, frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-320. Den fremstillede rensede 20 carcinostatiske forbindelse TF-320 havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og saccharidindholdet heraf var sædvanligvis ca. 16 til 30% udtrykt som glucose.

EKSEMPEL 7 25 (1) I 5 ml vand opslæmmedes 0,48 g af den carcinostatiske forbindelse TF-230 fremstillet som beskrevet i eksempel 5 (2) . Til suspensionen sattes 1 N vandig natriumhydroxidopløsning under omrøring for at indstille pH til 7,8.

30 Blandingen opvarmedes til 37 °C, og der tilsattes 5,0 mg "Pronase" E og flere dråber toluen. Under omrystning enzymbehandledes blandingen ved en pH-værdi på 7,8 til 8,0 ved 37-40 °C i 24 timer. Efter behandlingen centrifugeredes blandingen (4000 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) 35 for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Til bundfaldet sattes 3 ml vand med pH på 8,0, og blandingen centrifugeredes (4000 omdrejninger pr. minut, 10 minut-

DK 165641 B

44 ter) for at skille bundfaldet fra vaskevandet. Dette vaskevand og ovennævnte supernatante væske sloges sammen, og til opløsningen sattes 1 N saltsyre for at indstille pH til 2,0, hvorved der dannedes et bundfald. Denne blan-5 ding henstod 12 timer ved 5 °C, hvorefter der centrifuge- 4 redes (1 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Til bundfaldet sattes 3 ml vand med pH på 2,0, og blandingen 4 centrifugeredes (1 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 mi-10 nutter) for at skille bundfaldet fra vaskevandet. Dette vaskevand og den ovennævnte supernatante væske sloges sammen, og til opløsningen sattes ethanol til opnåelse af en 80% vandig ethanolopløsning. Den vandige ethanolopløs-ning omrørtes 2 timer under isafkøling, og herefter cen-15 trifugeredes (4000 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Bundfaldet vaskedes med 5 ml af en 80% vandig ethanolopløsning og 5 ml ethanol i nævnte rækkefølge, og herefter tørredes under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 20 100 mg af den carcinostatiske forbindelse TF-330.

I 5 ml vand opløstes 100 mg af ovennævnte pulver, og den fremstillede opløsnings pH indstilledes til 7,0 ved tilsætning af 1 N vandig natriumhydroxidopløsning. Den frem- 25 stillede opløsning hældtes på en søjle pakket med 15 ml €>

Amberlite IRA 400, der var forud indstillet til OH-typen med 1 N vandig natriumhydroxidopløsning. Herefter ledtes 60 ml vand gennem søjlen. Alle eluaterne sloges sammen, og der indstilledes til en pH-værdi på 7,0 ved tilsætning 30 af 1 N saltsyre. Opløsningen koncentreredes under reduce- €> ret tryk og filtreredes gennem et Millipore filter, der havde en porediameter på 0,3 μΐη, og til slut frysetørredes, hvorved der opnåedes 70 mg af den frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-330.

35

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-330 havde de i tabel 2 viste egenskaber. Det infrarøde absorptions- 45

DK 16S641 B

spektrum, ultraviolette absorptionsspektrum og high performance væskechromatograinmet er vist i henholdsvis fig.

11, 12 og 13.

5 (2) 1 50 ml vand opløstes 70 mg af den ovennævnte car- cinostatiske forbindelse TF-330, og den fremstillede opløsning koncentreredes 100 gange under anvendelse af "Ultrafilter" UK-50. Dette koncentrat filtreredes gennem et Milliporew filter, der havde en porediameter på 0,2 10 wm, og herefter frysetørredes, hvorved opnåedes 49 mg af den rensede, frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-330.

Den rensede carcinostatiske forbindelse TF-330 fremstil-15 let på denne måde havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og saccharidindholdet heraf var sædvanligvis ca. 16-30% udtrykt som glucose. Det infrarøde absorptionsspektrum og det ultraviolette absorptionsspektrum af en typisk TF-330 er vist i henholdsvis fig. 14 og 15.

20 EKSEMPEL 8 I 10 ml vand opslæmmedes 0,9 g af den carcinostatiske forbindelse TF-240 fremstillet på samme måde som beskre-25 vet i eksempel 5 (3), og 1 N vandig natriumhydroxid sattes til den fremstillede suspension under omrøring for at indstille pH til 7,8. Efter opvarmning til 37 °C sattes til suspensionen 9 mg "Pronase" E og flere dråber toluen i nævnte rækkefølge. Den fremstillede blanding enzym-30 behandledes under omrystning ved 37 °C til 40 °C ved en pH-værdi på 7,8 til 8,0 i 24 timer. Blandingen centrifugeredes (4000 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Til bundfaldet sattes 3 ml vand med pH på 8,0, og den fremstille-35 de suspension centrifugeredes (4000 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra vaskevandet. Vaskeopløsning og ovennævnte supernatante væske slo- 46 DK 165641 B i ges sammen, og til den forenede opløsning sattes 1 N saltsyre for at indstille pH til 2,0, hvorved der dannedes et bundfald. Den fremkomne opslæmning henstod 12 ti-mer ved 5 °C, hvorefter der centrifugeredes (1 x 10 om-5 drejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Til bundfaldet sattes 5 ml vand, der havde en pH-værdi på 2,0, og den fremstil- 4 lede suspension centrifugeredes (1 x 10 omdrejninger pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra vaske-10 opløsningen. Vaskeopløsningen og ovennævnte supernatante væske sloges sammen, og til opløsningen sattes ethanol til opnåelse af en 80% vandig ethanolopløsning. Den vandige ethanolopløsning omrørtes 2 timer under isafkøling, 4 hvorefter der centrifugeredes (1 x 10 omdrejninger pr.

15 minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Bundfaldet vaskedes med 5 ml 80% vandig ethanolopløsning og 5 ml ethanol i nævnte rækkefølge, og der tørredes under reduceret tryk til opnåelse af 170 mg af den carcinostatiske forbindelse TF-340.

20 I 5 ml vand opløstes 150 mg af dette pulver, og den fremstillede opløsnings pH indstilledes til 7,0 ved tilsætning af 1 N vandig natriumhydroxidopløsning. Opløsningen hældtes på en søjle pakket med 25 ml Amberlite IRA 400 25 forindstillet til OH-typen under anvendelse af 1 N vandig natriumhydroxidopløsning. Herefter ledtes 100 ml vand gennem søjlen, og alle eluaterne sloges sammen og indstilledes til pH på 7,0 ved tilsætning af 1 N saltsyre.

Den opnåede opløsning koncentreredes under reduceret tryk 30 og filtreredes gennem et Millipore filter, der havde en porediameter på 0,3 um, hvorefter der frysetørredes til opnåelse af 110 mg af den frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-340.

35 Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-340 havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og det infrarøde absorptionsspektrum, ultraviolette absorptionsspektrum og high

DK 165641 B

47 performance væskechromatogrammet er vist i henholdsvis fig-w 16, 17 og 18.

EKSEMPEL 9 5 0,9 g af den carcinostatiske forbindelse TF-240 fremstillet som beskrevet i eksempel 5 (3) behandledes som beskrevet i eksempel 8, hvorved der opnåedes 115 mg frysetørret carcinostatisk forbindelse TF-340.

10

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-340 havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og det infrarøde absorptionsspektrum, ultraviolette absorptionsspektrum og high performance væskechromatogram var i det væsentlige iden-15 tisk med resultaterne opnået for forbindelsen fremstillet i eksempel 8.

EKSEMPEL 10 20 0,9 g af den carcinostatiske forbindelse TF-240 fremstil let i eksempel 5 (3) behandledes som beskrevet i eksempel 8, bortset fra at (a) enzymbehandlingen udførtes under anvendelse af 9 mg trypsin (fremstillet af Difco) i stedet for "Pronase" E og (b) efter enzymbehandlingen ind-25 samledes bundfaldet fra den vandopløselige del med en pH på 2,0 under anvendelse af en 60% vandig ethanolopløsning i stedet for en 80% vandig ethanolopløsning. Herved opnåedes 105 mg frysetørret carcinostatisk forbindelse TF-340.

30

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-340 havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og det infrarøde absorptionsspektrum og ultraviolette absorptionsspektrum var i det væsentlige identisk med spektrene opnået for forbin-35 delsen i eksempel 8.

DK 165641 B

48 EKSEMPEL 11

Den carcinostatiske forbindelse TF-240 fremstillet i eksempel 5 (3) underkastedes samme enzymbehandling som i 5 eksempel 8, hvorefter der i stedet for opsamling af bundfaldet fra den vandopløselige del med pH på 2,0 opsamledes bundfald ved tilsætning af 40% trichloreddikesyre til en trichloreddikesyrekoncentration på 10%. Herved dannedes en vandopløselig del, der omdannedes til en 80% van-10 dig ethanolopløsning, hvorefter samme behandlinger som i eksempel 8 udførtes til fremstilling af 99 mg frysetørret carcinostatisk forbindelse TF-340.

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-340 havde 15 de i tabel 2 angivne egenskaber, og det infrarøde absorptionsspektrum, ultraviolette absorptionsspektrum og high performance væskechromatogrammet var i det væsentlige identisk med resultaterne opnået for forbindelsen fremstillet i eksempel 8.

20 PRÆPARATIONSEKSEMPEL 1

En fortyndet vandig natriumhydroxidopløsning sættes til 2 til 3 mg af den carcinostatiske forbindelse TF-220, så-25 ledes at der dannes en opløsning med pH på 7,0 til 7,5.

Den vandopløselige del af den resulterende opløsning fyldes i en ampul og frysetørres. Denne opløses, når den skal bruges, i en steriliseret fysiologisk saltopløsning, en 0,5% lidocaineopløsning, en 5% vandig glucoseopløsning 30 eller lignende, og den resulterende opløsning bruges som en injektion.

PRÆPARATIONSEKSEMPEL 2 35 En fortyndet vandig natriumhydroxidopløsning sættes til 1 mg af den carcinostatiske forbindelse TF-230, således at der dannes en opløsning med pH på 7,0 til 7,5. Denne op-

DK 165641 B

49 løsning anbringes i en ampul og frysetørres. Den opløses, når-den skal bruges, i en steriliseret fysiologisk saltopløsning, en 0,5% lidocaineopløsning, en 5% vandig glu-coseopløsning eller lignende, og den resulterende opløs-5 ning bruges som en injektion.

PRÆPARATIONSEKSEMPEL 3

En fortyndet vandig natriumhydroxidopløsning sættes til 1 / 10 mg af den carcinostatiske forbindelse TF-240, således at der dannes en opløsning med pH på 7,0 til 7,5, og opløsningen anbringes i en ampul og frysetørres. Den opløses, når den skal bruges, i en steriliseret fysiologisk saltopløsning, en 0,5% lidocaineopløsning, en 5% vandig glu-15 coseopløsning eller lignende, og den resulterende opløsning bruges som en injektion.

PRÆPARATIONSEKSEMPEL 4 20 En vandig opløsning med pH på 7,0 til 7,5 indeholdende den carcinostatiske forbindelse TF-320 anbringes i en ampul og frysetørres, således at der dannes frysetørret carcinostatisk TF-320 præparater indeholdende 0,5 eller 1 mg. Dette opløses, når det skal bruges, i en steriliseret 25 fysiologisk saltopløsning, en 0,5% lidocaineopløsning, en 5% vandig glucoseopløsning eller lignende, og den resulterende opløsning bruges som injektion.

PRÆPARATIONSEKSEMPEL 5 30

En vandig opløsning med pH på 7,0 til 7,5 indeholdende den carcinostatiske forbindelse TF-330 fyldes i en ampul og frysetørres, således at der opnås frysetørret carcinostatisk TF-330 præparater med 0,5 eller 1 mg. Dette op-35 løses, når det skal bruges, i en steriliseret fysiologisk saltopløsning, en 0,5% lidocaineopløsning, en 5% vandig glucoseopløsning eller lignende, og den resulterende op-

DK 165641 B

50 løsning bruges som en injektion.

PRiEP ARATIONSEKSEMPEL 6 5 En vandig opløsning med pH på 7,0 til 7,5 indeholdende den carcinostatiske forbindelse TF-340 fyldes i ampul og frysetørres, således at der opnås frysetørret carcinosta-tisk TF-340 præparater indeholdende 0,5 eller 1 mg. Dette opløses, når det skal bruges, i en steriliseret fysiolo-10 gisk saltopløsning, en 0,5% lidocaineopløsning, en 5% vandig glucoseopløsning eller lignende, og den resulterende opløsning bruges som en injektion.

15 20 25 30 35

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af carcinostatiske og 5 immunostimulerende forbindelser betegnet TF-220, TF-230 og TF-240 eller de tilsvarende proteinfrie forbindelser betegnet TF-320, TF-330 og TF-340, kendetegnet ved, at bakterien Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647) eller en mutant heraf med i det væsent-10 lige samme egenskaber dyrkes i et dyrkningssubstrat indeholdende nitrogenkilder, carbonkilder, vitaminkilder, reducerende midler og uorganiske salte, med eller uden agar, under anaerobe betingelser, hvorefter et hydrofilt organisk opløsningsmiddel, eventuelt efter fraskillelse 15 af bakteriecellerne, sættes til substratet eller dettes supernatante væske, og det fremkomne bundfald isoleres og ekstraheres med vand ved pH 7,5 til 8, hvorpå ekstrakten behandles ved trinvis indstilling af pH til 5,5 til 6,5, 3,5 til 4,5 og 1,5 til 2,5, idet de ved hver pH-værdi 20 dannede bundfald fraskilles og yderligere renses og om ønsket underkastes en proteinfjernende behandling.

2. Fremgangmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den proteinfjernende behandling udføres med et 25 proteolytisk enzym.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at enzymbehandlingen er en behandling med pronase eller trypsin. 30

4. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det hydrofile organiske opløsningsmiddel, der tilsættes den supernatante væske, er en alkohol. 35

5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, kendetegnet ved, at dyrkningen udføres ved 32- DK 165641 B 52 37 °C i 1-4 dage i et dyrkningssubstrat med en pH-værdi på 6,5-7,5.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet 5 ved, at pH af den supernatante væske indstilles til 1,5-2,5; at en alkohol tilsættes, således at koncentrationen af denne i den fremstillede opløsning er 50-70 rumfang-%. 10 15 20 25 30 35