KR102249438B1 - 히알루론산 생산 균주 및 이를 이용한 히알루론산의 생산방법 - Google Patents

히알루론산 생산 균주 및 이를 이용한 히알루론산의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산 생산 균주 및 이를 이용한 히알루론산의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20) 균주(기탁번호:KCCM12789P) 및 이를 이용한 본 발명에 따른 히알루론산의 생산방법에 따르면, 고분자량의 히알루론산의 생산량을 크게 향상시킬 수 있다. 또한, 이와 같이 생산된 히알루론산(Hyaluronic Acid, HA)은 화장품과 의약품 분야에서 보다 광범위하게 이용할 수 있다.

Description

히알루론산 생산 균주 및 이를 이용한 히알루론산의 생산방법{STRAIN FOR PRODUCING HYALURONIC ACID AND PREPARING METHOD OF HYALURONIC ACID USING THE SAME}
본 발명은 히알루론산 생산 균주 및 이를 이용한 히알루론산의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 히알루론산을 고농도로 생산할 수 있는 신규한 스트렙토코커스 종 균주 및 이를 이용한 히알루론산의 생산 방법에 관한 것이다.
히알루론산 (Hyaluronic acid(HA), Hyaluronan, (C14H20NNaO11)n (n>1000))은 β-(1→4)와 β-(1→3)글리코시드 결합을 교대로 연결하여 D-글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민으로 구성된 이당류의 고분자이다. 히알루론산은 사람의 눈조직(초자체), 혈관벽, 피부, 탯줄, 연결근육, 관절 등에 널리 분포하고 있다. 히알루론산은 물에 녹아 매우 점성을 띠는 액체를 이루며 어느 곳으로부터 유래하였는가에 따라 분자량은 103 내지 107 Da에 이르는 높은 분자량의 다당류이다.
히알루론산은 강력한 수분 함유력을 지니고 있어 화장품의 보습제로서 광범위하게 사용되고 있으며 최근에는 안과, 정형외과, 피부과 등에서 점안제, 관절 주사제, 성형 필러용 원료로서 이용 범위가 확대되고 있다. 히알루론산은 동물 조직, 예를 들면, 닭의 계관, 소의 눈의 유리체 등으로부터의 추출물에 의해 제조할 수 있지만, 협잡물로서 콘드로이틴황산 등이 혼입되거나, 조직 내에 포함되는 히알루로니다아제 등에 의해 저분자량화되기 쉽기 때문에, 히알루론산 생산능을 가지는 미생물을 일정 조건에서 배양하고 정제하여 제조하는 것도 행해지고 있다.
일반적으로 스트렙토코커스 종 균주들은 히알루론산 생성능이 있는 것으로 알려졌는데, 이들 균주는 동물성 유래 트립톤 및 대두 유래 소이펩톤이 함유된 배지에서 최적 배양이 가능한 것으로 알려져 있어, 대부분의 히알루론산 생성능을 갖는 균주는 트립톤과 소이펩톤을 포함하는 배지에서 배양하고 있다.
그러나, 동물성 배지인 트립톤은 광우병 등의 염려로, 대두 유래 소이펩톤은 알러지 유발 및 GMO의 염려로 인해 사용에 제한이 있으며, 트립톤 및 소이펩톤이 함유된 배지에서 배양한다 하여도 히알루론산 생산성이 2~4g/L 정도로 낮기 때문에 산업화하기에는 어려운 문제점이 있다 (한국등록특허 제0250573호 및 미국등록특허 제6090596호).
또한 최근에는 일부 히알루론산의 생산성이 증가된 균주가 보고된 바 있으나 (한국등록특허 제0047007호) 이 특허의 경우에도 역시 고가의 동물성 배지를 사용하고 있어 경제성 면에서 산업화하여 시장을 확대하기에는 어려움이 있는 실정이다.
따라서 고가이면서 사용의 제한성이 있는 동물성 배지와 알러지 유발의 염려가 있는 소이펩톤을 전혀 사용하지 않고도 고농도로 히알루론산을 생산할 수 있는 균주의 확보와, 이를 이용한 경제성 있는 배양과 정제 조건의 개발이 요구되고 있다.
특허문헌 1: 한국등록특허 제10-1443429호 특허문헌 2: 한국등록특허 제10-1746410호
본 발명자들은 상기 종래 기술의 문제점 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 히알루론산 생성능을 갖는 신규한 균주를 이용하여 고분자량의 히알루론산을 최대 수율로 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.
본 발명은, 상기 언급한 과제 해결을 위하여, 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus)를 UV로 돌연변이 처리를 한 히알루론산 생성능을 갖는 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20) 균주(기탁번호: KCCM12789P)를 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 신규한 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 균주는 평균분자량 200만 Da 내지 400만 Da의 히알루론산을 생성시키는 것을 특징으로 하는 히알루론산 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 균주는 1g/L 내지 5g/L의 히알루론산을 생성시키는 것을 특징으로 하는 히알루론산 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 균주는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus)를 100㎚ 내지 315㎚ 파장의 UV로 돌연변이 처리한 것을 특징으로 하는 히알루론산의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 균주는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus)를 30분 내지 420분 동안 1회 내지 4회 UV를 조사하여 돌연변이 처리한 것을 특징으로 하는 히알루론산의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 균주를 탄소원, 질소원 및 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 탄소원은 포도당, 과당, 엿당, 갈락토스, 글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지에서 본배양하는 것을 특징으로 하는 히알루론산의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 질소원은 효모 추출물, 카제인 펩톤, 카제인 산 분해물, 카제인 효소 분해물, 박토펩톤, 네오펩톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 아미노산은 글루타민, 리신, 시스테인, 아르기닌, 메치오닌, 아스파르트산, 글리신 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 탄소원은 포도당이며, 상기 질소원은 효모 추출물인 것을 특징으로 하는 히알루론산 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 배지는 포도당(Dextrose) 0.2% 내지 4%(w/v), 육류 추출물(Beef Extract) 0.5% 내지 1%(w/v), 폴리펩톤 2% 내지 4%(w/v), 효모 추출물(Yeast Extract) 1% 내지 5%(w/v), 염화나트륨 0.2% 내지 1%(w/v), 인산 수소 나트륨 0.1% 내지 1%(w/v), 인산이 칼륨 0.012% 내지 0.5%(w/v), 황산마그네슘 0.1% 내지 1%(w/v)을 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20) 균주(기탁번호: KCCM12789P) 및 이를 이용한 본 발명에 따른 히알루론산의 생산방법에 따르면, 고분자량의 히알루론산의 생산량을 크게 향상시킬 수 있다. 또한, 이와 같이 생산된 히알루론산(Hyaluronic Acid, HA)은 화장품과 의약품 분야에서 보다 광범위하게 이용할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.
첨부된 도면은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은, 실시예 1의 균주를 배양 시 배양 시간에 따른 O.D.600 값 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는, 실시예 1의 균주를 배양 시 배양 시간에 따른 점도 값 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 실시예 1의 균주를 배양 시 배양 시간에 따른 잔여 글루코오스 농도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는, 실시예 1의 균주를 배양 시 배양 시간에 따른 HA 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 5는, 실시예 1의 균주에 의해 생산된 HA의 통합 결과 그래프이다.
이하, 본 발명에 따른 히알루론산 생산 균주와 이를 이용한 히알루론산의 생산방법에 관하여 상세히 설명하나, 상기 히알루론산 생산 균주와 이를 이용한 히알루론산의 생산방법의 권리범위는 하기 설명에 의해 제한되는 것은 아니다.
또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서는 히알루론산 생성능이 있는 것으로 알려진 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus) 균주에 UV 돌연변이를 유발시키면 히알루론산 생성능이 더욱 증가된 돌연변이 균주를 제작할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 공지된 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus) 균주를 대상으로 하여 임의로 UV 돌연변이를 유발(random mutagenesis)시켰다. 그 결과, 돌연변이된 균주 풀(pool)중에 히알루론산 생성능이 증가된 균주가 존재하는 것을 확인하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(기탁번호: KCCM12789P)에 100㎚ 내지 315㎚ 파장의 UV를 조사 처리한 다음, 돌연변이된 균주들의 히알루론산 생성능을 확인한 결과, 몇몇 균주의 히알루론산 생성능이 급격하게 증가된 것을 확인하고, 이를 한국 미생물 보존센터에 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20)(기탁번호: KCCM12789P)로 기탁하였다. 따라서, 본 발명은 일 관점에서, 히알루론산을 생성능이 있는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20)(기탁번호: KCCM12789P) 균주에 관한 것이다.
상기 균주는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20)(기탁번호: KCCM12789P)를 100㎚ 내지 315㎚ 파장의 UV로 돌연변이 처리한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 100㎚ 내지 280㎚ 파장의 UV를 조사할 수 있고, 더욱 바람직하게는 100㎚ 내지 180㎚ 파장의 UV를 조사하여 돌연변이 처리할 수 있다.
또한, 상기 균주는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20)(기탁번호: KCCM12789P)를 30분 내지 420분씩 1회 내지 4회 UV로 조사하여 돌연변이 처리한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 30분 내지 300분씩, 1회 내지 4회, 더욱 바람직하게는 120분 내지 300분씩 1회 내지 4회 UV로 조사하여 돌연변이 처리한 균주를 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20)(기탁번호: KCCM12789P) 균주를 배양하여 수득한 배양액으로부터 히알루론산을 분리하는 것을 포함하는 히알루론산의 생산방법에 관한 것이다.
상기 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20)(기탁번호: KCCM12789P)는, 35℃ 내지 37℃에서 호기성 조건에서 배양할 수 있으며, 배양 시 생성되는 젖산에 의하여 균주의 배양이 억제되는 것을 방지하기 위하여 pH를 6.9 내지 7.2로 유지시키는 것이 바람직하다. 상기 pH 조절은 균주의 배양에 직접적인 영향을 주지 않으면서 pH를 조절할 수 있는 조절제를 특별한 제한 없이 이용할 수 있으며, NaOH 등을 예시할 수 있다.
상기 히알루론산 생성능이 있는 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20)(기탁번호: KCCM12789P)는 배지에서 배양한 후, 배양액으로부터 히알루론산을 분리할 수 있다. 상기 배양액으로부터 히알루론산의 분리는 통상적으로 알려진 바와 같이 단순 여과 방법에 의해 1차적으로 불용의 불순물을 제거한 후 활성탄 등으로 여과하여 기타 불순물 등을 추가로 제거한 다음, 최종적으로 에탄올을 이용하여 결정화하여 제조할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 고분자량의 히알루론산을 고수율로 생산할 수 있는 배지 조성물을 개발하기 위하여 노력하였으며, 그 결과 상기 본 발명의 균주를 탄소원, 질소원 및 아미노산을 포함하는 배지에서 히알루론산 생성능이 크게 증가된다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 탄소원은 포도당, 과당, 엿당, 갈락토스, 글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 이러한 탄소원을 포함하는 배지에서 본배양할 수 있다.
상기 질소원은 효모 추출물, 카제인 펩톤, 카제인 산 분해물, 카제인 효소 분해물, 박토펩톤, 네오펩톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 아미노산은 글루타민, 리신, 시스테인, 아르기닌, 메치오닌, 아스파르트산, 글리신 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
보다 바람직하게는 상기 탄소원은 포도당이며, 상기 질소원은 효모 추출물일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 본 발명의 균주를 글루코오스 포도당(Dextrose), 육류 추출물(Beef Extract), 폴리펩톤, 효모 추출물(Yeast Extract), 염화나트륨, 인산수소나트륨, 인산수소칼륨 및 황산마그네슘을 포함하는 배지에서 히알루론산 생성능이 크게 증가된다는 것을 확인할 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 본 발명의 균주를 글루코오스 포도당(Dextrose), 육류 추출물(Beef Extract), 폴리펩톤, 효모 추출물(Yeast Extract), 염화나트륨, 인산수소나트륨 및 인산수소칼륨을 포함하는 배지에서 전배양한 후, 폴리펩톤, 효모 추출물(Yeast Extract), 염화나트륨, 황산마그네슘 및 결정글루코오스(dextrose)를 포함하는 배지에서 본배양하여 수득한 배양액으로부터 히알루론산을 분리할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 본 발명의 균주를 상기 글루코오스 포도당(Dextrose) 0.2% 내지 4%(w/v), 육류 추출물(Beef Extract) 0.5% 내지 1%(w/v), 폴리펩톤 2% 내지 4%(w/v), 효모 추출물(Yeast Extract) 1% 내지 5%(w/v), 염화나트륨 0.2% 내지 1%(w/v), 인산 수소 나트륨 0.1% 내지 1%(w/v), 인산이 칼륨 0.012% 내지 0.5%(w/v), 황산마그네슘 0.1% 내지 1%(w/v)을 포함하는 배지에서 히알루론산 생성능이 크게 증가된다는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 본 발명의 균주를 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 조건에 따라 배양함으로써 평균분자량 200만 Da 내지 400만 Da의 히알루론산 생성능이 크게 증가된다는 것을 확인할 수 있다. 상기 본 발명의 균주를 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 조건에 따라 배양함으로써 1g/L 내지 5g/L의 히알루론산을 생성시킬 수 있다. 평균 분자량이 200만 Da 내지 400만 Da인 히알루론산은 기존 식품, 화장품 및 의약품 용도로 사용될 수 있으며, 특히 주름 제거 용도의 의료용 필러에 적합하다.
이하, 본 발명을 구체적인 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(KZHAT20)의 선별
<1-1> 히알루론산 생산 스트렙토코커스 속 균주 확보
히알루론산(Hyaluronic Acid, HA)을 생산하는 스트렙토코커스 속의 경우 토드휴이트 배지(BD社, 미국)에서 자랄 시, 단일 콜로니 분리를 할 경우 히알루론산을 생산함으로 인하여 보통의 콜로니보다 더 매끈하고 끈적한 느낌의 콜로니를 형성하게 된다. 전국 승마장에서 채집한 샘플을 한 개의 고체 배지 당 약 100개의 콜로니가 자라도록 희석하여 3% 토드휴이트 고체 배지에 도말하고 육안으로 점액성 물질이 생산되는 것으로 확인되는 콜로니를 골라내었다.
분리한 균주의 형태학적 관찰 확인을 위하여 토드휴이트 고체 배지에서 콜로니로 분리하기 위하여 스트리킹하고 37℃ 배양기에서 배양하였다. 콜로니가 형성되면 말디토프(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 기기를 이용하여 균 동정을 진행하였다. 적합 균주 후보를 선별하였다.
이후, 각각의 균주가 생산하는 점성 물질이 HA인지 확인하기 위하여, HA 생산을 확인하였다. HA 생산을 확인할 때는 Carbazole 반응을 이용하였다. Carbazole 반응은 uronic acid를 정량할 수 있는 방법이다. 히알루론산의 구성물질 중 하나가 Glucuronic acid이므로 반응에 의해 자주색으로 변하여 정량할 수 있다. Carbazole 반응은 샘플 200㎕를 0.95% (in H2SO4)의 붕산(Boric Acid) 1㎖에 넣고 잘 섞은 후 10분간 100℃에서 끓인 후, 얼음에 식히고 0.125%(in EtOH) Carbazole을 40㎕ 첨가하여 잘 섞은 후 15분간 100℃에서 끓인 후, 530㎚에서 흡광도를 측정하였다. Carbazole에 사용된 샘플은 균체를 제거한 배양액을 EtOH과의 비율을 1:3으로 제조하여 에탄올 침전을 진행한 후 생긴 HA를 이용하였다.
<1-2> 히알루로니다아제 활성이 없는 비용혈성 돌연변이 균주 확보
상기 실시예 <1-1>에서 선발된 히알루론산을 생산하는 균주를 3% 토드 휴이트 10㎖ 액체 배지에서 19시간 동안 37℃에서 진탕 배양하였다. OD(600㎚)를 1.0으로 맞춘 배양액을 13,500rpm의 회전 속도로 3분 동안 원심분리하여 균체를 회수하고 100mM Tris-maleate buffer (pH 7.0)로 3회 세척하였다. 멸균된 100mM Tris-maleate buffer (pH 7.0)를 이용해 104개/㎖가 되도록 희석한 후, 배양액에 100㎚ 내지 180㎚ 파장의 UV(ultraviolet)처리를 120분 내지 300분씩 수행하여 사멸율 50% 이상의 조건을 결정하였다. 이렇게 돌연변이 유도된 포자를 Blood Agar에 100㎕ 도말하여 37℃에서 배양시켜 적혈구를 파괴시킨 투명환이 없는 비용혈성 콜로니를 선택하였다. 그러나 용혈성이 재발되는 우려를 감안하여 이러한 비용혈성 콜로니에 대한 UV 돌연변이를 각각 1회 내지 4회 수행하여 계대 배양에서 용혈성을 나타내지 않는 콜로니를 선정하였다.
확보된 비용혈성 균주 중에서 히알루로니다아제 효소가 발현되지 않는 콜로니를 선별은 TSHA(TSA+HA)배지를 이용하여 선별하였다. 확보한 비용혈성 균주를 5% BSA(Bovine Serum Albumin)와 0.1% 히알루론산을 첨가한 트립틱 소이 고체배지에서 19시간 동안 37℃에서 배양하고 그 상층에 2M Acetic Acid를 추가하였다. 히알루로니다아제 활성이 없는 콜로니 중 주변에 투명환이 없는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(KZHAT20)를 선별하였다.
<1-3> 선별균주 동정
스트렙토코커스 주에피데미쿠스임을 확인하기 위하여 동정실험으로 Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight(MALDI-TOF)를 이용하여 균주 동정을 하였다. 실험 결과 본 발명의 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 균주는 하기 [표 1]과 같이 스트렙토코커스 속 주에피데미쿠스의 결과를 얻었다.
Position ID Detected Species Score
C1 KZHAT20 Streptococcus_equi_ssp_zooepidemicus 2.383
상기 실시예 <1-2>에서 선별된 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(KZHAT20) 균주를 MALDI-TOF를 이용하여 균주 동정하였다. 균주를 동정할 때 쓰는 MALDI-TOF(Bruker社, 미국)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 동정하였다. 균주를 토드휴이트 고체 배지에 스트리킹하여 얻은 단일 콜로니를 타겟 플레이트에 얇게 펴 발라준 후, Matrix solution 1㎕를 올린 후 색이 하얗게 변할 때까지 상온에서 건조 후에 MALDI-TOF 기기를 사용해서 촬영하였다.
MALDI-TOF 결과는 상기 [표 1]에 나타내었다. 상기 [표 1]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(KZHAT20) 균주는 스트렙토코커스 속 주에피데미쿠스인 것으로 확인되었다.
<실시예 2> 고분자 히알루론산 생산을 위한 기본 배양 조건 시험 및 생산량 비교실험
<2-1> 기본배양조건 시험
-75℃의 냉동기에서 보관된 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 균주 배양액 1vial을 급속 해동시켜서 3% 토드휴이트 고체배지에 도말하여 37℃로 19시간 동안 배양한 후 생육된 단일 콜로니를 3% 토드휴이트 브로스(Todd-Hewitt broth; BD社, 미국) 멸균 액체배지 10㎖에 접종하였다.
37℃, 200rpm에서 진탕 배양한 10㎖를 1차 종균 배양액으로 사용하였다. 24시간 배양 상태에서 무균적으로 1차 종균액을 멸균 액체 배지(포도당 0.2%(w/v), 육류 추출물 1%(w/v), 폴리펩톤 2%(w/v), 효모 추출물 5%(w/v), 염화나트륨 0.2%(w/v), 인산 수소 나트륨 0.1%(w/v), 인산이 칼륨 0.012%(w/v))에 접종하였다. 배양 조건은 37℃, 200rpm으로 19시간 무균적으로 배양함으로써 2차 종균 배양액으로 사용하였다.
이때 종료된 2차 종균 배양액은 7.0±0.5의 pH 상태를 유지하고 있어야 하고, 2차 종균 배양액 50㎖를 본배양 배지에 접종하여 24시간 이상 배양함으로써 돌연변이 균주에 따른 히알루론산의 생산성의 차이와 점도의 차이를 관찰하였다. 이상의 배양공정은 모든 실시예에서 동일하게 적용되었다.
히알루론산을 최적으로 생산하기 위한 본 배양 배지 결정 시험은 5L 발효조에서 1L 배양액 조건으로 실시하였다. 배지 조성은 포도당 4%(w/v), 폴리펩톤 2%(w/v), 효모 추출물 1%(w/v), 염화나트륨 0.2%(w/v), 0.01x 인산완충생리식염수, 배양조건은 pH 7.0, 37℃의 조건을 기본으로 하였다.
본 발명에서 배양액 내에 존재하는 히알루론산 농도는 카바졸 방법으로 확인하였다.
점도 분석은 Rheosense의 microVISC(Rheosense, 미국)을 사용하여 측정하였고 sample 온도는 25℃ 내지 30℃의 조건에서 시료를 분석하여 점도(cP)를 측정하였다.
균체량은 적절한 농도(배양액의 1/10)로 희석된 배양액을 1㎖씩 cuvette에 분주하여 600㎚ 파장에서 Nanodrop Photomemter(Implen社, 독일)로 흡광도를 측정하였다.
<2-2> 히알루론산의 생성능 검증 시험
상기 실시예 2와 같이 배양 시 시간대 별로 배양액을 샘플링하여 배양 시간에 따른 O.D.600, 점도, 잔여 Glucose 농도를 측정하였으며, 히알루론산(HA) 생성능을 확인하였다.
HA 생성능에 대한 결과를 하기 표 2 내지 표 5 및 도 1 내지 도 5에 나타내었다. 보다 구체적으로, 하기 [표 2]는 "배양 시간에 따른 O.D.600 값 변화", [표 3]은 "배양 시간에 따른 점도 변화", [표 4]는 "배양 시간에 따른 잔여 Glucose 농도 변화" 및 [표 5]는 "배양 시간에 따른 HA 생산량"을 나타내었다.
Time(h) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
KZHAT20 0.67 0.137 0.708 3.30 6.26 6.46 5.92 6.16 5.62 5.94 5.57 5.35 5.15
Time(h) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
KZHAT20
(cP)		 0.72 1.43 2.41 6.02 20.11 44.28 54.89 64.21 71.17 73.55 71.45 70.51 72.32
Time(h) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
KZHAT20
(g/L)		 28.42 21.64 12.36 9.03 1.55 1.74 36.93 53.94 51.39 49.53 48.55 46.39 31.74
Time(h) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
KZHAT20
(g/L)		 0.85 1.08 1.75 2.17 0.11 0.02 1.01 1.26 1.74 1.68 2.24 2.64 4.89
상기 표 2 내지 표 5 및 도 1 내지 도 5의 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 신규한 균주의 HA 생산성이 우수하고, 보다 높은 점도와 분자량을 갖는 HA이 생산되었다.
<2-3> 히알루론산의 추출 및 정제
상기 실시예 2와 같이 배양 후 추출 및 정제를 진행하였다.
배양액을 60℃에 1시간 반응 후 원심분리 용기에 나누어 담고 10,000rpm, 1시간 원심 분리하여 균체를 제거하였다. 균체가 제거된 배양액에 3배 부피의 에탄올을 넣어 stirrer에 overnight하여 히알루론산 원료를 추출한 후 100% 에탄올에 넣어 탈수하였다. 에탄올에서 건져낸 덩어리를 잘게 찢어 진공 오븐에서 48시간 건조하여, 히알루론산을 1차 추출을 진행하였다.
2차 정제를 진행하기 위해 건조체를 1g/1L 0.5M NaCl 용액 비율로 용해하였다. 건조체 용해액에 활성탄을 10g/1L 비율로 첨가하여 3시간 반응시켰다. 활성탄 처리 용액을 centrifuge 7,000rpm으로 1시간 동안 원심 분리하였다. 원심분리 한 것을 0.22㎛ filter를 통과시켜 여과하여 여과액만 모아주었다. 여과액에 3배 부피의 에탄올을 넣어 stirrer에 overnight하여 히알루론산 원료를 추출하였다. 100% 에탄올 상에서 경화시킨 후 48시간 동안 진공 건조하였다.
히알루론산 생성능이 반복적으로 3g/L 내지 5g/L로 확인된 실시예 1의 균주를 최종 선정하여 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus, KZHAT20)로 명명하고, 2020년 9월 17일자로 한국 미생물 보존센터(국외)에 기탁하였다(기탁번호:KCCM12789P).
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[수탁정보]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12789P
수탁일자 : 20200917

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus)를 100㎚ 내지 315㎚ 파장의 UV로 30분 내지 420분 동안 1회 내지 4회 조사하여 돌연변이 처리를 한 히알루론산 생성능을 갖는 신규한 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus) KZHAT20 균주(기탁번호:KCCM12789P)를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산방법에 있어서,
    상기 배지는, -75℃의 냉동기에서 보관된 상기 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 균주 배양액 1vial을 급속 해동시켜서 3% 토드휴이트 고체배지에 도말하여 37℃로 19시간 동안 배양한 후 생육된 단일 콜로니를 3% 멸균 액체배지 10㎖에 접종하였고, 37℃, 200rpm에서 진탕 배양한 10㎖를 1차 종균 배양액으로 사용하였으며, 24시간 배양 상태에서 무균적으로 1차 종균액을 포도당 0.2%(w/v), 육류 추출물 1%(w/v), 폴리펩톤 2%(w/v), 효모 추출물 5%(w/v), 염화나트륨 0.2%(w/v), 인산 수소 나트륨 0.1%(w/v) 및 인산이 칼륨 0.012%(w/v)으로 구성된 멸균 액체 배지에 접종하되, 배양 조건은 37℃, 200rpm으로 19시간 무균적으로 배양함으로써 2차 종균 배양액으로 사용한 것이며,
    상기 균주를 탄소원, 질소원 및 아미노산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 생산방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 균주는 평균분자량 200만 내지 400만 Da의 히알루론산을 생성시키는 것을 특징으로 하는 히알루론산 생산방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 균주는 1g/L 내지 5g/L의 히알루론산을 생성시키는 것을 특징으로 하는 히알루론산 생산방법.
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