KR101443429B1 - 히알루론산의 제조 방법 - Google Patents

히알루론산의 제조 방법 Download PDF

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덴키 가가쿠 고교 가부시기가이샤
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Abstract

본 발명은 히알루론산을 고수율로 간편하게 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 히알루론산을 단시간에 제조하는 방법을 제공하는 것도 목적으로 한다.
본 발명에 따르면, 히알루론산 생산능을 가지는 미생물을 배양하는 공정과, 상기 미생물의 대수증식기 후기에 글루타민 및 아르기닌을 배양액에 첨가하는 공정을 포함하는 히알루론산의 제조법이 제공된다.

Description

히알루론산의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING HYALURONIC ACID}
본 발명은 미생물을 이용한 히알루론산의 제조 방법에 관한 것이다.
히알루론산은 화장품의 보습제 외에도, 안과, 정형외과, 피부과 등에서 의약품으로 이용되고 있다. 히알루론산은 동물 조직, 예를 들면, 닭의 계관, 소의 눈의 유리체 등으로부터의 추출물에 의해 제조할 수 있지만, 협잡물로서 콘드로이틴황산 등이 혼입되거나, 조직 내에 포함되는 히알루로니다아제 등에 의해 저분자량화되기 쉽기 때문에, 히알루론산 생산능을 가지는 미생물을 배양하여, 배양액으로부터 히알루론산을 제조하는 것(발효법)도 행해지고 있다(특허문헌 1). 발효법에 의해 제조되는 히알루론산은 추출법에 비해 일정한 원료, 일정한 방법으로 제조되기 때문에, 제품의 품질이 일정하게 유지되는 점에서 산업상의 이용가치는 크다.
또한, 공업적인 히알루론산의 생산을 목적으로, 발효법을 위한 다양한 배지 성분의 배지를 이용한 발효법이 개발되고 있다(특허문헌 2 내지 4). 특허문헌 2에서는, 히알루론산 생산에 유효한 성분으로서, 생육에 필수로 여겨지는 8 종류의 아미노산을 증량한 배지를 이용한 발효법이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 3에는, 아르기닌 및/또는 글루탐산을 증량한 배지를 이용한 발효법이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 4에는 아르기닌을 증량한 배지를 이용한 발효법이 기재되어 있다.
일본 특허 공고 (평)4-12960호 공보 일본 특허 공개 (평)7-46992호 공보 일본 특허 공개 (소)62-289198호 공보 일본 특허 공개 (소)63-141594호 공보
그러나, 배양법에 적합하다고 여겨지는 종래의 배지의 대부분은 성분수가 많고, 배지 제조도 번잡하거나, 배지로부터의 히알루론산의 분리·정제가 복잡하기도 하는 등, 공업적인 생산 방법으로서는 추가적인 개선이 요망되었다. 또한, 그 밖의 종래 기술의 방법에 대해서도, 공업적인 생산 방법으로서는 추가적인 개선이 요망되었다.
본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것으로서, 히알루론산을 고수율로 간편하게 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 히알루론산을 단시간에 제조하는 방법을 제공하는 것도 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 목적을 해결하기 위해 예의 연구에 힘쓴 결과, 배양의 특정 시기에, 아르기닌과 글루타민을 조합하여 배양액에 첨가함으로써 히알루론산의 생산이 개선됨을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명에 따르면, 히알루론산 생산능을 가지는 미생물을 배양하는 공정과, 그 미생물의 대수증식기 후기에 글루타민 및 아르기닌을 배양액에 첨가하는 공정을 포함하는 히알루론산의 제조법이 제공된다. 이 제조 방법에 따르면, 배양의 특정 시기에 글루타민과 아르기닌을 조합하여 배양액에 첨가함으로써, 히알루론산을 고수율로 단시간에 간편하게 제조할 수 있다.
본 발명의 히알루론산의 제조 방법에 따르면, 히알루론산 생산능을 가지는 미생물의 배양의 특정 시기에 글루타민과 아르기닌을 조합하여 배양액에 첨가함으로써, 히알루론산을 고수율로 단시간에 간편하게 제조할 수 있다.
도 1은 히알루론산 생산 미생물을 배양했을 때의, 배양액 중의 아미노산 농도의 그래프이다.
도 2는 아르기닌을 일괄 첨가한 경우와, 후첨가한 경우의 비교 그래프이다. 좌측 그래프는 균체 농도의 시간 경과를 나타내고, 우측 그래프는 점도(히알루론산 농도의 지표)의 시간 경과를 나타낸다.
〔용어의 설명〕
본 명세서에서의 "대수증식기 후기"란, 미생물이 충분히 증식한 상태로서, 대수증식기의 후반 내지 정지기(정상기)에 걸쳐서를 말한다. 또한, 대수증식기란, 미생물의 배양에 있어서, 미생물이 일정 시간마다 이분되며 증식할 때, 시간에 대하여 세포수의 대수가 직선이 되는 시기를 말한다. 대수증식기의 후기인지 여부는 당업자에게 기지된 임의의 지표·방법을 이용하여 판단할 수 있다. 간편하게는, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 탁도 또는 비증식속도를 지표로 하여 판단할 수도 있다.
본 명세서에서의 "탁도"는 미생물의 증식을 배양액의 탁함 정도(배양액 중의 균체량)로 측정하는, 가장 일반적인 간편하고 신속한 측정법이다. 빛을 배양액에 쬐어, 그의 투과광이 어느 정도 산란 및 흡수에 의해 저지되는지를 측정한다. 히알루론산을 생산하는 미생물은 미립자이기 때문에, 미생물의 양과 배양액의 탁도는 비례 관계에 있다. 탁도는, 예를 들면 이하와 같이 하여 측정된다.
파장 660 nm의 단파장의 빛을 배양액에 입사시키고, 투과광을 분광 광도계에 의해 측정한다. 여기서 입사광과 투과광의 강도를 각각 I0, I, 투과층의 두께를 L, 흡광도를 τ로 하고, 다음 식에 의해 구한 흡광도를 배양액의 탁도(OD)라 정의한다.
Figure 112011013348421-pct00001
또한, 배양 전의 배지 자체가 무시할 수 없을 정도의 탁도를 가지고 있는 경우, 대조 배지의 탁도를 배양액의 탁도로부터 감산할 수도 있다.
본 명세서에서의 대수증식 후기로서는 배양액의 660 nm에서의 탁도가 0.5 이상을 나타내는 시기가 이용된다. 또한, 상기 대수증식기로서는 1.0 이상의 탁도를 나타내는 시기가 바람직하고, 2.0 이상의 탁도를 나타내는 시기가 보다 바람직하고, 3.0 이상의 탁도를 나타내는 시기가 더욱 바람직하다.
본 명세서에서의 "비증식속도"란, 그의 비증식속도가 이하의 식으로 정의되는 값이다.
Figure 112011013348421-pct00002
여기서, 균체의 세대 시간은 히알루론산을 생산하는 미생물이 2배로 증식하는 데 걸리는 시간이다. 히알루론산을 생산하는 미생물은 충분히 증식하면 영양의 고갈, 대사산물의 축적 등에 의해 증식 속도가 저하되고, 비증식속도도 저하되게 된다.
본 명세서에서의 대수증식 후기로서는 비증식속도가 0.5 h-1 이하를 나타내는 시기가 이용된다. 또한, 상기 대수증식기로서는 0.4 h-1 이하의 비증식속도를 나타내는 시기가 바람직하고, 0.3 h-1 이하의 비증식속도를 나타내는 시기가 보다 바람직하고, 0.2 h-1 이하의 비증식속도를 나타내는 시기가 더욱 바람직하고, 0.1 h-1 이하의 비증식속도를 나타내는 시기가 더욱 더 바람직하다. 또한, 당연한 것이기는 하나, 비증식속도는 0 h-1보다 크다.
본 명세서에서의 "스트렙토코커스속 세균"이란, 히알루론산을 생산할 수 있는 스트렙토코커스(Streptococcus)속의 임의의 세균·그의 변이주를 포함하며, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi), 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus), 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스 디스갈락티에(Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 및 이들의 변이주 등을 들 수 있다.
본 명세서에서의 "글루타민", "아르기닌", "히알루론산" 등의 화학물질의 정의에는 특기하지 않는 한, 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위에서 사용 가능한 임의의 염(여기에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 나트륨염, 칼륨염 등의 금속염이나, 염산염, 인산염, 시트르산염 등의 산부가물 등)이나 수화물, 이들의 혼합물도 포함된다.
또한, 본 명세서에서의 각각의 수치 범위에 대해서는 "~"로 표시된 상한치 및 하한치를 각각 포함하는 것으로 한다.
〔실시 형태〕
이하, 본 발명의 실시 형태에 대하여 설명한다.
본 발명의 어느 실시 형태는 히알루론산 생산능을 가지는 미생물을 배양하는 공정과, 그 미생물의 대수증식기 후기에 글루타민 및 아르기닌을 배양액에 첨가하는 공정을 포함하는 히알루론산의 제조법이다. 이 제조 방법에 따르면, 배양 후기에 아르기닌을 글루타민과 함께 가함으로써, 아르기닌이 가지는 고농도에서의 미생물의 생육저해 작용을 억제할 수도 있고, 히알루론산을 고수율, 단시간에 제조할 수 있다. 또한, 본 실시 형태에서는 글루타민 및 아르기닌을 배양 개시 후에 첨가함으로써, 특히 번잡한 제조를 필요로 하는 것과 같은 배지를 준비할 필요 없이, 통상의 배지를 사용할 수 있다. 또한, 불필요한 영양 성분을 가하지 않음으로써, 히알루론산의 분리·정제 공정의 부하를 경감시켜 품질의 유지·생산성을 안정화할 수도 있다.
상기 실시 형태에 이용되는 배양 방법으로서는 통상 이용되는 배양 방법을 사용할 수 있다. 즉, 배지에는, 예를 들면 글루코오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 수크로오스 등의 당 성분으로 이루어지는 탄소원, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 질산마그네슘, 아황산나트륨, 티오황산나트륨, 인산암모늄 등의 무기염류, 폴리펩톤, 카사미노산, 효모 농축액, 옥수수 침지액, 대두 가수분해액 등의 유기 영양원, 필요에 따라 각종 비타민류 등이 바람직하게 이용된다. 배양은, 예를 들면 통기 교반 배양 등의 호기적인 배양법 등, 기지된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 배양 온도는 30 내지 35℃가 바람직하지만, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양액의 pH는 미생물의 생육과 함께 저하되기 때문에, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 등의 pH 조정제를 첨가하여 pH 7.0 내지 9.0으로 조정할 수도 있다.
글루타민 및 아르기닌은 동시에 첨가될 수도 있고, 따로따로 첨가될 수도 있으며, 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위에서 버퍼나 염 등의 다른 성분도 함께 첨가될 수도 있지만, 그 후의 분리·정제 공정 등을 고려하면, 정제를 필요로 하는 성분은 적은 편이 바람직하고, 예를 들면, 글루타민, 아르기닌 이외의 영양 성분 또는 활성 성분은 0.001％이하, 0.0005％ 이하 또는 포함되지 않는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 추가적인 실시 형태는 상기 대수증식기 후기가, 배양액의 660 nm에서의 탁도가 0.5 이상을 나타내는 시기인 상기 제조 방법이다. 탁도가 0.5 이상이 되는 시기에 글루타민 및 아르기닌을 첨가함으로써, 보다 확실하게 히알루론산의 수율이 향상된다. 더욱 바람직하게는, 상기 탁도가 2.0 이상을 나타내는 시기에 글루타민 및 아르기닌을 첨가한다. 미생물이 충분히 증식한 상태인 상기 탁도를 나타내는 시기에 글루타민 및 아르기닌을 첨가함으로써, 더 높은 수율로 히알루론산을 얻을 수 있다. 상기 탁도가 3.0 이상을 나타내는 시기에 글루타민 및 아르기닌을 첨가하는 것이 더욱 바람직하고, 확실하게 수율을 향상시키고 시간을 단축시킬 수 있다.
또한, 탁도에 대해서는 배양액의 탁도를 그대로 사용할 수 있지만, 배양 전의 배지 등의 대조 배지의 탁도가 무시할 수 없을 만큼 큰 경우(여기에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 0.01 또는 0.05 이상), 배양액의 탁도로부터 대조 배지의 탁도를 감산한 탁도를 지표로 할 수도 있다. 대조 배지로서는 배양 전의 배지를 이용할 수도 있고, 미생물을 접종하지 않은 배양액을 이용할 수도 있다.
또한, 상기 탁도에 의한 첨가 시기의 정의는 시기 범위를 어느 하나의 지표로 구체적으로 예시한 것으로서, 반드시 상기 조건으로 탁도를 측정하는 공정을 필수로 하는 것은 아니다. 따라서, 당연한 일이지만, 가령 600 nm에서의 탁도를 측정하여 판단한 경우라도, 660 nm에서의 탁도가 상기 실시 형태의 범위에 포함되는 경우에는 상기 실시 형태에 포함되는 것으로 해석된다.
또한, 본 발명의 추가적인 다른 실시 형태는 상기 대수증식기 후기가, 비증식속도가 0.5 h-1 이하를 나타내는 시기인 상기 제조 방법이다. 비증식속도가 0.5 h-1 이하가 되는 시기에 글루타민 및 아르기닌을 첨가함으로써, 보다 확실하게 히알루론산의 수율이 향상된다. 더욱 바람직하게는, 상기 비증식속도가 0.4 h-1 이하를 나타내는 시기에 글루타민 및 아르기닌을 첨가한다. 미생물이 충분히 증식한 상태인 상기 비증식속도를 나타내는 시기에 글루타민 및 아르기닌을 첨가함으로써, 더 높은 수율로 히알루론산을 얻을 수 있다. 상기 탁도가 0.3 h-1 이하를 나타내는 시기에 글루타민 및 아르기닌을 첨가하는 것이 더욱 바람직하고, 확실하게 수율을 향상시키고 시간을 단축시킬 수 있다.
또한, 상기 비증식속도에 의한 첨가 시기의 정의는 시기 범위를 어느 하나의 지표로 구체적으로 예시한 것으로서, 반드시 상기 조건으로 비증식속도를 측정하는 공정을 필수로 하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 추가적인 실시 형태는 상기 히알루론산 생산능을 가지는 미생물이 스트렙토코커스속 세균인 상기 제조법이다. 히알루론산 생산능을 갖고, 일반적으로 이용되고 있는 스트렙토코커스속 세균을 이용함으로써, 간편하면서 확실하게 히알루론산을 공업적으로 제조할 수 있다. 여기서 이용되는 스트렙토코커스속 세균에는 자연계로부터 분리되는 스트렙토코커스속의 세균 및 그의 변이주가 포함된다.
또한, 상기 실시 형태에서의 스트렙토코커스속 세균으로서는, 스트렙토코커스 에퀴, 스트렙토코커스 에퀴 변이주 FM-100(미생물 공업 기술 연구소 기탁번호 제 9027호) 또는 스트렙토코커스 에퀴 변이주 FM-300(미생물 공업 기술 연구소 기탁번호 제 2319호)을 바람직하게 사용할 수 있다. 이들과 같이 고수율로 안정적으로 히알루론산을 생산하는 주를 이용함으로써, 보다 고수율로 안정된 생산성으로 히알루론산을 제조할 수 있다.
또한, 상기 실시 형태에서의 글루타민의 첨가량은 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위 내에서 특별히 제한은 없지만, 과량 첨가하면 효과의 증가가 작아지기 때문에, 0.01 내지 0.3％가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.05％ 이상, 0.1％ 이상, 및/또는 0.2％ 이하이다. 이 농도 범위의 글루타민을 이용함으로써, 보다 확실하게 수득량 향상 및 생산의 안정화 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 상기 상한치 이하의 글루타민을 이용함으로써, 그 후의 분리·정제 공정의 부담을 경감시킬 수 있다.
또한, 상기 실시 형태에서의 아르기닌의 첨가량은 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위 내에서 특별히 제한은 없지만, 과량 첨가하면 효과의 증가가 작아지기 때문에, 0.01 내지 0.2％가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.05％ 이상, 0.1％ 이상, 및/또는 0.1％ 이하이다. 이 농도 범위의 아르기닌을 이용함으로써, 보다 확실하게 수득량 향상 및 생산의 안정화 효과를 올릴 수 있다. 또한, 상기 상한치 이하의 아르기닌을 이용함으로써, 그 후의 분리·정제 공정의 부담을 경감시킬 수 있음과 동시에, 아르기닌에 의한 생육 저해 작용을 더욱 강하게 방지할 수 있다.
또한, 상기 실시 형태에 의해 설명되는 제조 방법 등은 본 발명을 한정하는 것은 아니며, 예시하는 것을 의도하여 개시되어 있는 것이다. 본 발명의 기술적 범위는 특허청구범위의 기재에 의해 정해지는 것으로서, 당업자는 특허청구범위에 기재된 발명의 기술적 범위에서 다양한 설계적 변경이 가능하다.
예를 들면, 상기 제조 방법은 추가적인 다른 공정을 포함하거나, 또는 상기 제조 방법에 계속해서 추가적인 다른 공정·방법이 실시될 수도 있다. 그와 같은 공정·방법으로서는, 예를 들면 활성탄이나 여과 등에 의한 제균 공정, 중화 공정이나 결정화 공정, 크로마토그래피나 원심 분리 등에 의한 엔도톡신, 단백질, 핵산, 금속 등의 불순물 등의 제거·정제 공정 등을 들 수 있다.
<실시예>
이하, 본 발명을 실시예에 의해 추가로 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
처음에, 본 발명에 관한 예비 실험의 개요를 이하에 나타내겠다. 이들 예비 실험예는 후술하는 실시예 1과 유사한 배양 조건을 이용하여, 동일한 예비 실험 내에서는 조건을 갖추어 검토하였다. 또한, 각각의 실험의 그래프 등에 있어서, 히알루론산을 "HA", 글루타민을 "Gln", 아르기닌을 "Arg", 배양 개시시부터 어느 성분을 배지에 가해 두는 것을 "일괄 첨가", 배양 개시 후(특히 대수증식기 후기)에 있는 성분을 배양액에 첨가하는 것을 "후첨가"로 표기하였다. 또한, 일부 실험예 등에서는 히알루론산 생산량을, 히알루론산 농도와 상관 관계가 있는 점도를 지표로서 평가하였다.
〔예비 실험 1〕
종래의 표준적인 조건에서의 히알루론산 생산 미생물의 배양에서의 각종 아미노산의 농도 변화를 조사하였다. 결과 그래프를 도 1에 나타내었다. 각종 아미노산은 배양시간 경과에 따라, 종류에 따라 감소, 일정, 증가 중 어느 하나의 거동을 나타내었지만, 특히 글루타민 및 아르기닌량의 대폭적인 감소가 관찰되어, 표준 배양 조건에서는 이들이 고갈되는 것으로 관찰되었다.
〔예비 실험 2〕
예비 실험 1의 결과에 기초하여, 글루타민 및 아르기닌을 첨가하는 것을 염두에 두고 추가적인 검토를 행하였다. 아르기닌은 그의 균체 내에서의 메카니즘은 불명하지만, 단체로는 히알루론산 수득량 향상에는 기여하지 않고, 생육 저해를 가져오는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 이들 점에 대하여, 아르기닌의 첨가 방법을 개량함으로써 더욱 개선하고자 생각하여 검토를 행하였다.
그 결과, 도 2의 그래프에 나타낸 바와 같이, 아르기닌을 배양시에 일괄 첨가하지 않고 후첨가함으로써, 히알루론산의 농도(그래프 중, 히알루론산 농도는 점도에 의해 평가됨)가 비약적으로 높아지는 것이 발견되었다. 이 아르기닌에 대한 실험 결과는 이하의 표에 정리할 수 있다.
Figure 112011013348421-pct00003
〔예비 실험 3〕
이상의 실험 결과로부터 얻어진 지견을 기초로, 표준 조건에 대하여 글루타민 및 아르기닌을 후첨가하여 히알루론산 생산 미생물을 배양하는 실험을 행하였다. 이 실험 결과를 이하의 표 2에 나타내었다.
Figure 112011013348421-pct00004
표 2에 나타난 바와 같이, 글루타민과 아르기닌을 조합하여 후첨가함으로써, 히알루론산의 생산량이 크게 상승하는 것이 관찰되었다.
〔비교 실험예 1〕
이하에 나타내는 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 4의 실험을, 실시예 1과 동일한 조건으로 행하여, 히알루론산의 농도, 및 일정 히알루론산의 농도(점도로 평가)에 도달하기까지의 시간을 계측하였다. 결과는 표 3에 나타내었다.
Figure 112011013348421-pct00005
* 표 중의 글루타민량은 배양 중에 첨가한 양을 나타낸다.
〔실시예 1〕
폴리펩톤 1.5％, 효모 농축액 0.5％로 이루어지는 배지 1 리터를 가열 살균한 후, 글루코오스 6％, 인산수소이칼륨 0.1％, 글루타민 0.06％가 되도록 가하여 배양 초기 조건으로 하고, 스트렙토코커스 에퀴 FM-100(미생물 공업 기술 연구소 기탁번호 제9027호)을 접종하고, 공기를 1 vvm으로 통기시키면서 교반 500 회전/분, 온도 33℃, pH 8.0(25％ 수산화나트륨의 자동 적하에 의한 컨트롤)로 배양을 개시하였다. 경시적으로 배양액을 채취하고, 배양액의 660 nm에서의 탁도가 3.6, 비증식속도가 0.34 h-1에 도달한 시점에서 글루타민 0.1％, 아르기닌 0.05％ 상당을 첨가하였다. 히알루론산의 축적에 의한 배양액의 점도 상승이 정지할 때까지 배양을 계속하였다. 배양액의 점도 상승의 정지 후, 배양액을 질산으로 pH 3으로 조정하고, 원심에 의해 균체를 제거하고, 상청을 회수하였다.
배지 중의 히알루론산을 정량하기 위해, 이 상청을 순차적으로 희석하여 배지 중에 포함되는 히알루론산의 농도를 시차 굴절형 검출기를 구비하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 배지 중의 히알루론산은 6.2 g/L의 고수득량이 얻어졌고, 배양 시간으로서 히알루론산 농도가 4.0 g/L에 도달한 시간은 17시간으로 단시간이었다.
〔실시예 2〕
실시예 1과 마찬가지로 배양을 개시하고, 글루타민 0.1％, 아르기닌 0.1％ 상당을 첨가하였다. 배지 중의 히알루론산은 6.0 g/L의 고수득량이 얻어졌고, 배양 시간으로서 히알루론산 농도가 4.0 g/L에 도달한 시간은 17시간으로 단시간이었다.
〔실시예 3〕
실시예 1과 마찬가지로 배양을 개시하고, 글루타민은 실시예 1보다 적은 0.04％, 아르기닌은 0.05％ 상당을 첨가하였다. 첨가 시기는 균체 농도가 OD 5.3, 비증식속도 0.16으로 행하였다. 첨가 글루타민량이 적기 때문에, 배지 중의 히알루론산은 실시예 1, 2보다 적지만 5.2 g/L의 고수득량이 얻어졌고, 배양 시간으로서 히알루론산 농도가 4.0 g/L에 도달한 시간은 18시간으로 단시간이었다.
〔실시예 4〕
실시예 3과 마찬가지로 배양을 개시하고, 실시예 3과 마찬가지로 글루타민과 아르기닌을 첨가하였다. 첨가 시기는 균체 농도가 OD 7.0, 비증식속도 0.05로 행하였다. 배지 중의 히알루론산은 5.0 g/L의 고수득량이 얻어졌고, 배양 시간으로서 히알루론산 농도가 4.0 g/L에 도달한 시간은 18시간의 단시간이었다.
〔비교예 1〕
실시예 1과 마찬가지로 배양을 개시하고, 글루타민과 아르기닌은 첨가하지 않았다. 배지 중의 히알루론산은 4.1 g/L로 저수득량이고, 배양 시간으로서 히알루론산 농도가 4.0 g/L에 도달한 시간은 23시간으로 장시간이었다.
〔비교예 2〕
실시예 1과 마찬가지로 배양을 개시하고, 아르기닌만을 0.05％ 첨가하였다. 배양 시간으로서 히알루론산 농도가 4.0 g/L에 도달한 시간은 18시간이었지만, 배지 중의 히알루론산은 4.3 g/L로 저수득량이었다.
〔비교예 3〕
실시예 1과 마찬가지로 배양을 개시하고, 글루타민만을 0.1％ 첨가하였다. 배지 중의 히알루론산은 5.3 g/L로 저수득량이었다. 배양 시간으로서 히알루론산 농도가 4.0 g/L에 도달한 시간은 21시간으로 장시간이었다.
〔비교예 4〕
실시예 3과 마찬가지로 배양을 개시하고, 실시예 3과 마찬가지로 글루타민과 아르기닌을 첨가하였다. 첨가 시기는 균체 농도가 OD 0.0001, 비증식속도 1.0으로 행하였다. 배지 중의 히알루론산은 4.0 g/L로 저수득량이었다.
〔비교 실험예 2〕
상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 4와 동일한 방법(글루코오스 농도는 6％)으로 추가적인 비교 실험을 행하였다. 결과를 이하의 표 4에 나타내었다. 이 비교 실험으로부터도, 히알루론산의 생산량(표 중 HA 농도)이 글루타민과 아르기닌을 대수증식기 후기에 배양액에 첨가한 경우에 있어서, 히알루론산의 생산량이 증가하는 것이 확인되었다.
Figure 112011013348421-pct00006
〔정리〕
이상의 실험으로부터, 글루타민 및 아르기닌을 대수증식기 후기에 배양액에 첨가하는 방법으로 히알루론산을 종래 기술에 비하여 고수율이면서 단시간에 제조 가능한 것이 확인되었다.
이상, 본 발명을 실시예에 기초하여 설명하였다. 이 실시예는 어디까지나 예시로서, 다양한 변형예가 가능한 점, 또한 그러한 변형예도 본 발명의 범위에 있음은 당업자에게 이해되는 바이다.
미생물 공업 기술 연구소 FERM-BP-2319 19890302 미생물 공업 기술 연구소 FERM-BP-2396 19890421

Claims (8)

  1. 히알루론산 생산능을 가지는 미생물을 배양하는 공정과, 상기 미생물의 대수증식기 후기에 글루타민 및 아르기닌을 배양액에 첨가하는 공정을 포함하는 히알루론산의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대수증식기 후기가 배양액의 660 nm에서의 탁도가 0.5 이상을 나타내는 시기인 히알루론산의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대수증식기 후기가 배양액의 660 nm에서의 탁도가 2.0 이상을 나타내는 시기인 히알루론산의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 대수증식기 후기가 비증식속도가 0.5 h-1 이하를 나타내는 시기인 히알루론산의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산 생산능을 가지는 미생물이 스트렙토코커스속 세균인 히알루론산의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 스트렙토코커스속 세균이 스트렙토코커스 에퀴, 스트렙토코커스 에퀴 변이주 FM-100(미생물 공업 기술 연구소 기탁번호 제9027호) 또는 스트렙토코커스 에퀴 변이주 FM-300(미생물 공업 기술 연구소 기탁번호 제2319호)인 히알루론산의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루타민의 농도가 0.01 내지 0.3％인 히알루론산의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아르기닌의 농도가 0.01 내지 0.2％인 히알루론산의 제조 방법.
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