JPH02138965A - クレブシェラ属の菌株の培養物を用いてラムノース含有量の高い単糖類混合物を生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、クレブシェラ属の新規微生物ｋｌｅｂｓｊｅ
ｌ］ａｓｐ、またはその変異株の培養物、およびこの培
養物を用いて、高いラムノース含有量を有する単糖類混
合物を生産する方法に関する。

〔従来技術と解決すべき課題〕

クレブシェラ（ｋｌｅｂｓｊｅｌｌａ）属の微生物の中
には、ある生育条件下で、多糖類、特にエキソポリサツ
カリド（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）を、
生育培地１リツトルあたり十分の数グラムのオーダーで
生産しうるものがあることが知られている。この場合、
ラムノースは、これらエキソポリサツカリドの６６％に
まで達しうる。このことについては、Ｂ、Ａ、Ｂｒｙａ
ｎ。

ＲｏＪ、Ｌｉｎｈａｒｄｔおよびり、Ｄａｎｊｅｌｓの
論文（”Ａｐｐｌｊｅｄａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ
ｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”、ｖｏ］、５１．
Ｎｏ、６゜第１３０４〜１３０８頁（１９８６年６月）
）を参照されたい。しかし、産生されるラムノースの収
率は低く、工業的な応用には結びつかない。

出願人は、クレブシェラ属の新規微生物Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌ］ａ　ｓｐ、の培養物を使用することにより、上記論
文に報告されているよりもずっと高収率で、ラムノース
を生産することが可能であることを、あらたに見出した
。

〔発明の構成〕

よって、本発明の第一の目的は、ラムノースを高収率で
産生ずる能力のある、クレブシェラ属の新規微生物Ｋｌ
ｅｂｓｉｃｌ］ａ　Ｓｐ、の培養物を提供することであ
る。

本発明の第二の目的は、さらに良好な収率でラムノース
を産生ずる能力のある該微生物の選択された変異株の培
養物を提供することである。

本発明の第三の目的は、ラムノースを含む単糖類混合物
を生産する方法を提供することである。

より特定すれは、本発明は、番号ｌ−７１４として１９
８７年１１月１０日付でパスツール研究所（Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ）の国立微生物培養物寄託所（Ｃ
ｏｌ　１ｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅＣｕｌ
ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｒ＋ｊｓｍｅｓ
（Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ）住所：パリ７５７２４　、リュ・デ
ュ・ドクトール・ルー２５番地−２５，ｒｕｅ　ｄｕ　
Ｄｏｃｔｅｕｒ　Ｒｏｕｘ　−７５７２４ＰＡＲＩＳ　
ＣＥＤＥＸ　１５）に寄託された菌株ＢＥＣ４４１の特
徴を有し、同化可能な、炭素源、窒素源および無機物質
源を含む栄養培地中での発酵により、大部分エキソポリ
サツカリドのかたちで、ラムノースを含む多糖類を産生
ずる能力のある新規微生物Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐ
、の培養物に関する。

この新規微生物は、下水処理場の汚泥から単離されたし
ので、以下の特徴を有する： 基本立黴隻 一形態：均一な杆菌 直径において大 特定の配列をもたない −移動性− 一グラム陰性 一３％ＫＯＨによる溶解：＋＋＋ −深い寒天中での可視培養：好気／嫌気性−０％ＮａＣ
Ω肉汁中での培養二十＋十−２％ＮａＣｎ肉汁中での培
養：＋十＋−４％ＮａＣｎ肉汁中での培養：＋＋十−６
％ＮａＣｎ肉汁中での培養：＋十 ８％ＮａＣＱ肉汁中ての培養二十 ＝１０％ＮａＣＱ肉汁中での培養： 〔基本培地：ＰＹＧ（ペプトン：ＩＯｇ／（１：イース
ト抽出物：３ｇ／ｌ、；グルコース：１ｇ／ｎ））−１
０℃での培養：＋＋＋ 一２０℃ての培養：＋＋＋ 一４１℃での培養：＋＋＋ ４５℃での培養ニー 〔基本培地：ＢＩＩＩ（脳、心臓浸出液、診断用パスツ
ール（Ｄｊ、ａｇｎｏｓｔｊｃ　Ｐａ５ｔｅｕｒ）））
−普通寒天培地上での急速濃厚培養； 白色で厚く滑らかで広がった直径８〜１０ｎｕｎのコロ
ニ（コロンビア寒天（ＣＯＬＵＭＢＩＡ　ＡＧＡＲ）、
３０℃、空気中、４日間培養） 一原栄養株培養 グルコースからの酸産生：＋＋＋ クルコースからのガス産生： １０℃で：＋＋＋ｄ ３０℃で：＋＋＋ ４１℃でニー ーヴオージｘ’プロスヵウアー（ＶＯＧＥＳ−ＰＲＯ５
ＫＡＵＥＲ）反応：十十十 一硝酸塩還元酵素（ｎｉｔｒａｔｅ　　ｒｅｄｕｃｔａ
ｓｅ）　：　＋＋＋亜硝酸塩還元酵素（ｎｉｔｒｉｔｅ
　　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）　：　＋−チオ硫酸塩還元酵
素（ｔｈｊｏｓｕｌｐｈａｔｅ　　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
）　：−テ１−ラチオネート・レダクターゼ（ｔｅｔｒ
ａｔｈｉｏｎａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ）　：　− 一つレアーゼ二十＋＋ インドール産生： フエごルアラニン・デアミナーゼ（ｐｈｅｎｙ］ａｌａ
ｎｊｒ＋ｅｄｅａｍｉｎａｓｅ）　ニー トリプトファン・デアミナーゼ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ
　　ｄｅａｍｊｎａｓｅ）　： 「アルギニン・ジヒドロラーゼＪ（”ａｌｇｉｎｊｎｅ
　　ｄｊｈｙｄｒ。

１ａｓｅ”）ニ ー「オルニチン・デカルボキシラーゼＪ　（”ｏｒｎｉ
ｔｈｊ　ｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙ、１ａｓｅ”）ニ ー「リジン・デカルボキシラーゼＪ　（”１ｙｓｉｎｅ
　　ｄｅｃａｒｂｏｘｙ−１ａｓｅ”）： γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ｇ］、ｕｔａ
ｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）　：　＋　＋　＋ ｏＮＰｂ−ガラクトシド（ｏＮＰｂ−ｇａｌａｃｔｏｓ
ｉｄｅ）の加水分解ニー＋＋ ｐＮＰｂ−キシロシド（ｐＮＰｂ−ｘｙｌｏｓｊｄｅ）
の加水分解ニーｐＮＰｂ−グルクロネーｈ　（ＰＮＰｂ
−ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）の加水分解ニー 不溶性デンプンの加水分解：＋ ＴｕＥＥＮ　８０の加水分解ニー 卵黄寒天上のリパーゼニー 細胞外ＤＮＡアーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌ、ａｒ　
　ＤＮａｓｅ）　：　−ゲラチナーゼ（ｇｅｌａｔｉｎ
ａｓｅ　（Ｆｒａｚｉｅｒ））　：カゼイナーゼ（ｃａ
ｓｅｊ、ｎａｓｅ）　：ＡＰＩＯ５０ＣＨ（発売元ニア
−・ペー・イ・システム・ニス・アー（ＡＰＩ　Ｓｙｓ
ｔｅｍ　Ｓ、Ａ、）、Ｌａ　Ｂａｌｍｅ−Ｌｅｓ−Ｇｒ
ｒｏｔｅｓ、３８３９０　Ｍｏｎｔａｌｉｅｕ−Ｖｅｒ
ｃｊｅｕ、　Ｆｒａｎｃｅ）での酸性化懸濁培地：　Ｍ
ＴＬ（後記Ｍ６３培地＋ペプトン５ｇ／　Ｑ＋イースト
抽出物０．５ｇ／　Ｑ　） 指示薬：フェノール・レッド 測定　：　１，５．９日 結果は第１図にまとめである。

−Ｍ６３培地（炭素源研究用の無機培地。組成は次のと
おり）： ＫＨ２ＰＯ４：　　　　　　　　３．９ｇ／　ＱＫ２Ｈ
Ｐ０４　：　　　　　　　１１．２ｇ／　Ｑ（ＮＨ４）
２ＳＯ４：　　　　　　２ｇ／　ＱＭｇｓＯ，・７Ｈ２
０：　　　　　０．２ｇ／ｌＦｅＳＯ４・７Ｈ２０：　
　　　　０．０５ｇ／　ＱＤ−グルコース存在下：＋＋
＋ 酢酸存在下：＋＋＋ マロン酸存在下： クエン酸存在下：＋＋＋ ３−ヒドロキシ安息香酸存在下： Ｌ−ヒドロキシプロリン存在下： 空気中３０℃での反応 Ｅ」Ｊｌ【吸 ：反応または培養が陰性（進まない） Ｗ　　：弱 ｄ　　：遅延 十　　二陽性 十十：強陽性 ＋＋＋：陽性の度合いが特に強い 化学的分類様相 極性脂質に関する組成を以下の方法で調べた。

シリカ上薄層クロマ１〜グラフ法による比較分析抽出に
用いた溶媒：クロロホルム／メタノール１：２１次元ク
ロマ１−グラフ法： 展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水／酢酸６５　
：　２５　：　４−　：０．８ リン脂質の可視化：モリブデン酸アンモニウムアミノ化
脂質の可視化：ニンヒドリン 糖脂質の可視化：α−ナフトール 全脂質の可視化：バニリン／１（２Ｓ０４対照株： ｍｆ　Ｑ　　２９０　：　Ｋ］、ｅｂｓｉｅｌｌａ　Ｔ
ｅｒｒｊ４ｅｎａ　ＣＩＰ　８０．０７得られたクロマ
トクラムを第２図に示す。

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐ、１．７１４株は抗莢膵血
清（ａｎｔｊｃａｐｓｕｌａｒ　５ｅｒａ）　Ｋ　１４
およびＫ　４４に対し試験した場合、ノイフェルト反応
（莢膜膨化）に陽性反応を示す。他の抗莢膜血清、たと
えば、Ｋ１　からに１３、Ｋ１５、Ｋ１７からに４３、
Ｋ４６、Ｋ４７、Ｋ５０、Ｋ５１、Ｋ５４、Ｋ５５、Ｋ
５９からに６２、Ｋ６４からに６７およびに７０からに
７２に対しては反応陰性であり、Ｋ１６、Ｋ４５、Ｋ４
８、Ｋ４９、Ｋ５２、Ｋ５３、Ｋ５６からに５８、Ｋ６
３、Ｋ６８およびに６９血清に対しては、Ｉ、７１４株
は、ノイフエルト反応に弱陽性を示す。よって、１．７
Ｍ株は血清型に１４およびに４４に関係する。

本発明はまた、微生物ｋ］ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐ、Ｉ
’３Ｅｃ　４／１１の変異株培養物に関する。有用な変
異株は、発酵器中であらかじめ培養したものから自然発
生変異株を単離、し、これから単純に選び出すことによ
り、あるいは、ｋｌｅｂｓｊｅｌ］ａ　ｓｐ、ＢＥＣ４
４１の培養物に高エネルギー放射線（たとえば紫外線、
Ｘ線）または化学試薬［たとえばオゾン、亜硝酸、　Ｎ
ＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ′−二１−日ソーＮ−ニトロソグ
アニジン）もしくはＥＭＳ　（エチルメタン・スルホネ
ート）］を作用させて微生物の大部分を殺し、生き残っ
た微生物を培養し、より多くの多糖類を産生ずるものを
選択することにより得ることができる。

本発明はさらに、ラムノース含有量の高い！１１糖類混
合物を得る方法に関する。この方法は、ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌ］ａ　ｓｐ、ＢＥＣ４４１または選択されたその変異
株の培養物を、炭素源、窒素源および適当な無機塩から
なる栄養培地中、約６ないし８のｐＨ１約３０℃ないし
３５℃の温度で、空気を吹き込み攪拌しながら、２ない
し１２日間発酵させ、生じた多糖類を発酵媒体から単離
し、ついでこの多糖類を加水分解し、生した加水分解の
ｐＨを約５ないし９の範囲に調整することによる。

本発明はまた、本発明による培養物を用いて生じたラム
ノースに関する。

炭素源としては、ソルビトール、マンニトール、グルコ
ース、グリセロールおよびその混合物のような物質を用
いることができるが、これに限定されるものではない。

現時点では、ソルビトールが好ましい。化学的に純粋な
炭素源を用いることは必須ではない。たとえば、工業用
品位のソルビトール、就中、マンニト−ルを不純物とし
て含むものの使用が可能である。

目安どしては、栄養媒体］リットルあたり、５ないし］
　ＯＯｇの炭素源、好ましくは］０ないし５０ｇ／ｌの
炭素源を用いることができる。

窒素源としては、カゼイン・ペプトン（カゼインの酸ま
たは酵素による加水分解で得られる）、とうもろこし浸
出液、イースト抽出物、大豆ペプトン、ジャガイモ細粉
、Ｌ−フェニルアラニン、トレオニン、硫酸アンモニウ
ムおよびこれらの混合物のような物質を用いることがで
きるが、これに限定されるものではない。現時点では、
カゼイン・ペプトン、とうもろこし浸出液およびジャガ
イモ細粉が好ましい。Ｌ−フェニルアラニンも良い結果
を与えるが、比較的高価であるという欠点がある。

目安としては、栄養培地ＩＱあたり窒素源０．５ないし
Ｌｏｇ、好ましくは１ないし５ｇ／　Ｑを用いることが
できる。

栄養培地中の炭素／窒素重量比が重要な条件である。少
なくとも５の比で用いることが有利で、１００もしくは
それ以」二にまで及んでよい。

無機塩類としては、マグネシウム塩、たとえばＭｇＳＯ
４および少なくとも１種のリン酸塩、たとえばＭ２ＨＰ
Ｏ，、（ここでＭはアルカリ金属またはアンモニウムイ
オン）から選ばれるもの、を含むことが必要である。マ
グネシウム塩は、たとえば、０．１ないし０　、３ｇ／
βの割合で、リン酸塩は、たとえば２ないし１５ｇ／ｌ
の割合で含むことができる。

Ｍ２８Ｐ０４とＭ１１２１１ＰＯ，、の混合物を用いる
と有利である。

こうした混合物は、栄養培地のｐｏの調整を可能とし、
さらに緩衝液として働く。

発酵培地の温度は３０ないし３５℃の範囲、好ましくは
３２〜３３℃とすることができる。培地のＰＨは６と８
の間でなげれはならず、中性（ｐＨ７）域が好ましい。

通気条件は、発酵培地」二の酸素分圧が維持されるに充
分なものでなければならない。おおむね、０．３ないし
３ＶＶＭ　（空気体積／培地体積／分）のオーダーの通
気で充分であろう。

発酵媒体を充分に攪拌し続けることも、培地の過度の増
粘を防ぐため必要である。おおむね、３００ないし１．
５０　Ｏｒ　ｐ　ｍの速度での攪拌が適当てあろう。

また、必須ではないものの、栄養培地中に、微生物にと
って無毒の界面活性剤を混合することが有利である。こ
れにより、発酵培地から多糖類を分離するのが容易にな
る。有用な界面活性剤の一例は、”Ｔｗｅｅｎ　８０”
の商標名で市販されている非イオン性界面活性剤（ポリ
オキシエチレンーソルビＩ〜−ル・モノオレエート）で
ある。たとえば、０．５ないし２ｇ／Ω、好ましくは約
１　ｇ／　Ｑのこの薬剤が混合できる。

ビタミン類を供給するため、栄養培地中に少量のイース
ト抽出物（主要な窒素源としてこれが用いられていない
場合）を混合することも有利である。

発酵時間は、おおむね２ないし１２日程度とする。

実施条件および達成しようとする多糖類濃度の目標値に
応じて決まる。

産生された多糖類は、エクソポリサッカリドまたは細胞
に拘束された多糖類のかたちであるが、たとえば、発酵
培地を７０〜１２０℃の熱で約１０分ないし約１時間熱
処理しく細胞に拘束された多糖類分画を抽出するため）
、冷ました状態で遠心分離して澄んだ上澄みを集めるこ
とにより単離する。

この層には、多糖類のほとんど全量が含まれている。所
望ならば、この後、集めた上澄み層にアセＩ−ンまたは
エタノールもしくはプロパツールのような低級アルコー
ルのような非溶媒性有機液体を添加して多糖類を沈澱さ
せ、その後、濾過または遠心分離により沈澱を分離し、
最後にこれを乾燥することも可能である。変法として、
上澄み層を凍結乾燥させることもできる。

Ｋｌｅｂｓｊｅｌｌａ　ｓｐ、　ＢＥＣ４４１（１，７
］４）によって産生される多糖類は、六炭糖の繰り返し
単位からなる。

この六炭糖はラムノース、ガラン１ヘースおよびグルク
ロン酸からなり、それぞれのモル比は３：２：１である
。これはガラン１〜−スの３位で分岐した側鎖を含み、
該側鎖の分岐点には、側鎖の一部であるウロン酸が直接
に結び付いている側鎖はラムノース残基で終わる。

多糖類の加水分解は、）Ｉ２Ｓｏ、、やＨＣＱのような
強酸によって加水分解し、多糖類を単糖類に転化する。

加水分解物のｐ＋＋を、その後、ＮａＯＨやＫＯＨのよ
］６ うな塩基により調整し、約５ないし９の範囲のｐ＋＋、
好ましくは中性に近いｐ＋（とする。

加水分解は、上澄み層に対し直接に行なってもよいし、
乾燥あるいは凍結乾燥した製品に対し行なってもよい。

加水分解は、たとえば、Ｈ２ＳＯ４を用いて１００℃で
６時間かけて遂行し、処理したものの最終的な酸濃度は
約２Ｎとなる。

典型的な場合には、中和した加水分解物は次の単糖類組
成を有する。

ラムノース　　　　６４〜８０（モル比％）グルコース
　　　　　２〜２２（モル比％）ガラクトース　　　１
２〜２１（モル比％）グルクロン酸　　　　０〜１２　
（重量％）所望ならば、既知の単糖類分離技術によりラ
ムノースを他の単糖類から単離することができる。

目安として述べれば、中和した加水分解物は、脱塩後、
イオン交換カラム上のクロマトグラフにかけて分離し、
使用したイオン交換樹脂に合う緩衝剤で置換することが
できる。適当な樹脂の一例は、ホウ酸緩衝剤と用いたＤ
ｏｗｅｘ　Ｉ　Ｘ　４であるが、他の多くの樹脂も使用
できるであろう。

ラムノース含有量の高い単糖類混合物またはこの混合物
から単離したラムノースは、フラネオールおよびその誘
暮体のような調味料または香味料合成の有用な出発原料
になる。

さらに、本発明の培養物によって産生された多糖類は、
一般的な多糖類の用途を有し、たとえば、安定剤、）彷
濁剤、分散剤または増粘剤、膜形成剤、保水剤、凝固剤
、コロイ１（、潤滑剤として、また、たとえば、粉末状
洗剤、織物、接着剤、紙、塗料および食品に、さらに油
回収に使用できる。

〔発明の具体的開示〕

本発明を例示するため、以下、実施例を掲げるが、本発
明はこれに限定されるものではない。

以下の例のいずれかにおいても、６００ｎｍで光学濃度
Ｏ０］５を有する本発明培養物の接種物は、発酵培地１
リツ１ヘルあたり１０ミリリツ１ヘルの割合で用いた。

矢凄１９ｊｌｌ 以下の組成を有する発酵培地を実験室用発酵器（１０５
５００型発酵器、容量２リットル；発売元：ＢＩＯＬＡ
ＦＩＴＴＥ社、Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ　ｅｎ　Ｌ
ａｙｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）に置いた。

ソルビトール　　　　　　２０ｇ／氾 フェニルアラニン　　　　　Ｉｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７１１ｚＯ０，２ｇ／ｆｆＫ２ＨＰ０．　
　　　　　　　　　９ｇ／　Ｑにｌ１２ＰＯ４３ｇ／　
ｆｌ ＴＶＥＥＮ　８００　　　　　　　　１ｇ／ｌ。

製パン用イースト抽出物　２０ｍｇ／　Ｑ前に記載きた
接種物をこの培地に加え、以下の条件で発酵を遂行した
。

温度　　　　　　　　　　３０℃ 通気　　　　　　　　　　０，５ＶＶＭ攪拌　　　　　
　　　　　４００ないし６００　ｒ　ｐ　ｍ当初ｐｔ＋
　　　　　　　　　　７（調節せず）７日間発酵させた
後、ラムノース含有量は、分光側光により測定して、発
酵培地ＩＱにつき３ｇであった。ソルビトール５０ｇ／
　ｎおよびフェニルア１つ ラニン５ｇ／Ｍを培地に添加した。４日後、ラムノース
含有量は５．５ｇ／　Ｑであった。

実施例２ 実施例１と同じ装置で発酵を遂行したが、以下の発酵培
地を用いた。

ソルビトール　　　　　　２０ｇ／　Ｑフェニルアラニ
ン　　　　２ｇ／α Ｍｇ５Ｏ，・７８２０　　　　　　　０．２ｇ／　ＱＫ
２ＨＰＯ，、９ｇ／　Ｑ ＫＨ，、ＰＯ４３ｇ／　ｎ ＴＷＥＥＮ　８０［Ｆ］　　　　　　　　Ｉｇ＃！イー
スト抽出物　　　　　２０ｍｇ／　Ｑ発酵条件は実施例
１と同じにした。

８日間発酵させた後、発酵培地ＩＱにつき５．５ｇのラ
ムノースが得られた。

失鳳孤ｌ ンルビ１−−ルとフェニルアラニンの割合をそれぞれ５
０ｇ／　Ｑ、５　ｇ／　Ｑに上げたほかは、実施例２と
同じにした。

７日間発酵させた後、発酵培地ＩＱにつき５．５ｇのラ
ムノースを得ることができた。

去夫■」先 この例では、富うムノース多糖類高産生性変異株の、出
発株ＢＥＣ４４１からの紫外線処理による調製法を記載
する。

ＢＥＣ４４１株培養物を以下の培地上につくった。

ソルビトール　　　　　　Ｌｏｇ／　Ｑフェニルアラニ
ン　　　　Ｉｇ／　０ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ／　Ｒ Ｋ２ＨＰ０４９ｇ／　Ｑ ＫＨ２Ｐ　０４３ｇ／　Ｑ ＴＷＥＥＮ　８０［Ｆ］　　　　　　　　　　　　１ｇ
ＩＱ通気条件下（０，５ＶＶＭ）、３０℃で４日間培養
した後、この培養物５ｍＱを遠心分離しく４００Ｏｒｐ
ｍ、５分間）、得られたケーキを生理的溶液ＳｍＱ中に
取り出した。

こうして得た細胞懸濁液をペトリ皿に移し紫外線ランプ
（Ｐｈｌｉｐｓ社製５１Ｊ）の下、２０ＣＩ１１離して
置いた。

露光を続ける間、手で攪拌した。１分間露光した後、生
き残った細胞（全細胞の約１％）を前記培地２０ｍ　ｆ
ｌに移し、３０℃３時間培養して表現型（ｐ　ＩＴ　ｅ
　ｎ　ｏ　ｌｙｐ　ｅ　）　ｋ顕現させた。

この培養後、べＩ・り朋中以−１・の培地上に細胞を１
Ｖ板培養した。

ソルヒＩ・−ル　　　　　　　５０ｇ／ｆ＋フェニルア
ラニン　　　　５ｇ／　Ｑ Ｔｘ）ｅｅｎ０８０　　　　　　　　１．２；／　ＱＨ
［Ｓ　０４・７１１．、　ＯＯ，２ｇ／　ＱＫ、、　ｔ
ｌＰＯ１９ｇ／　Ｑ Ｋｌ１２Ｐ０，３ｇ／　Ｑ 寒天　　　　　　　　　　１５ｇ／１２３０℃で１週間
培養した後、より多くの多糖類を産生じた変異株コロニ
ーを識別した。識別は、非変異株コロニーよりも大きな
１１コイト領域がコ［に一周辺に存在するかどうかで行
なった。

これらの二Ｊ口ニーは、単離した後、最初の株と同様に
増殖させ、保存した。

実−１１β− この例では、オゾン処理による、出発株ＢＥＣ４４１か
らの富うムノース多糖類高産生性変異株の調製について
記載する。

実施例４記載の液体培地上および条件下で、発酵器中で
、１リッ１−ルの培養物をつくった３、４日間培養した
後、実験室用オゾン発生機を用いてオゾン処理を遂行し
た。この目的のため、発酵器に入る空気は、発酵器に導
入される前にオゾン発生機を経由するようＬ：＝　ｔ、
た。１時間の処理後、通気を再開した。

処理前後の生存細胞数を測定したところ、処理後の生残
りの濃度は約１０％であった。

処理後さらに３時間、細胞を培養し、表現型を顕現させ
た。ついで、細胞をべ１−り皿上でへＴｌ板培養し、高
産生性変異株を採るべく試験した。この試験は、実施例
４にお番プるのと同様に実行した。

矢遣−卸旦 この例では、変異株を用いての富ラムノース多糖類の産
生を例示する。

使用−株− Ｅｌ）１　およびＥＰ２　： 実施例４に記載した紫外線変異誘発によりＢト（：４１
１株から得たもの。

Ｆ、１およびＦ、、２： 発酵器中であらかじめ培養したものから単離した自然変
異株１．富うムノース多糖類高産生性自然変異株コロニ
ーの識別は、非変異株コロニーより大きなムコイ１〜領
域がコロニーの周囲に存在するかどうかで判断した。

封シ用−商道−ジ１″ｉｔ性 ツルビートル　　　　　　５０ｇ／　ｎカセイン・パブ
１〜ン　　　４．５ｇ／ｌフェニルアラニン　　　　０
．１ＦＸ／ｌイース１−抽出物　　　　　０．０５ｇ／
　ＱＴｂ］ｅｅｎ０８０　　　　　　　　　１１′に／
　ＱＭｇＳＯ４・７＋１，０　　　　　　　０．２ｇ／
　ＱＫ２ＨＰＯ４］、、８ｇ／　Ｑ Ｋｌ（、ＰＯＩｏ、６ｇ／　Ｑ 発酵器中での音道−条オＬ 湿度　　　　　　　　　；３２℃ ｐｆｌ　　　　　　　　　　　　　　ＩＮ　ＮａＯＨに
より７．０に維持 通気 攪拌 ０．５ＶＶＭ ４００ないしｌ　ＯＯＯｒ　ｐ　＋ｉ ラムノースの産生量を毎日追跡し、使用した変異株の各
々につき発酵時間とラムノース産生量の関係をプロア　
ｈ　した。得られた曲線を第２３図に示す。

７Ｈ未満発酵をした後、発酵培地１リットルあたり　１
２ｇまでのラムノースが得られることがわかった・

【図面の簡単な説明】

第１図はＡＰＩ０５０　ＣＨ（発売元：Ａｐｒ　Ｓｙｓ
ｔｅｍ　Ｓ、Ａ、）中での菌株ＢＥＣ４４１による酸性
化を示す図。 第２図は菌株ｌｌＥＣ４４１と対照株を比較したクロマ
１−グラム。 第３図は発酵時間とうＡｓ　／’−ス産産生力関係を丞
す図。 出願人　ビオヨロープ・ニス・アー 代理人　弁理士　松　刀　政　広　（外１名）手続補正
書 平成１年４月２１日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、同化可能な炭素源および窒素源ならびに無機化合物
   を含有する栄養培地中で、発酵によりラムノースに富ん
   だ多糖類を産生する能力ある；Ｉ−７１４号としてパス
   ツール研究所（ＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ）の国
   立微生物培養物寄託所（ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉ
   ｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇ
   ａｎｉｓｍｅ）に寄託された菌株ＢＥＣ４４１の特徴を
   有する微生物Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｐ．並びに菌株Ｂ
   ＥＣ４４１から変異により得られた菌株；の培養物。 ２、ラムノース含有量の高い単糖類混合物を得る方法で
   あって：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｐ．ＢＥＣ４４１また
   は選択されたその変異株の培養物を、炭素源、窒素源お
   よび適当な無機塩類を含有する栄養培地中、約６ないし
   ８のｐＨ、約３０℃ないし３５℃の温度で、通気および
   攪拌をしながら２ないし１２日間発酵させ；生じた多糖
   類を発酵培地から単離し；ついで、これらの多糖類を加
   水分解し；生じた加水分解物のｐＨを約５ないし９の範
   囲に調整する；ことからなる方法。 ３、請求項第２項の方法であって：該炭素源が、ソルビ
   トール、マンニトール、グルコースおよびグリセロール
   から選ばれ、栄養培地中に５ないし１００ｇ／ｌの割合
   で存在する；方法。 ４、請求項第２項の方法であって：該窒素源が、カゼイ
   ン・ペプトン、とうもろこし浸出液、イースト抽出物、
   大豆ペプトン、ジャガイモ粉、Ｌ−フェニルアラニン、
   トレオニンおよび硫酸アンモニウムから選ばれ、栄養培
   地中に０．５ないし１０ｇ／ｌの割合で存在する；方法
   。 ５、請求項第２項の方法であって：栄養培地中の炭素／
   窒素重量比が少なくとも５である；方法。 ６、請求項第２項の方法であって：栄養培地が、さらに
   、マグネシウム塩、リン酸塩およびこれらの混合物から
   選ばれる無機塩類を含有する；方法。 ７、請求項第２項の方法であって：栄養培地が、さらに
   、少量のイースト抽出物を含有する；方法。