JPH0236201A - ラムノース含有多糖およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 最近、糖類の性質に対する興味は益々増大しつつある。

糖類は医薬品や植物保護剤の合成の出発物質として次第
に頻繁に使用されている。

Ｌ−ラムノースまたはその誘導体もこれらの分野で、ま
たさらに植物や動物細胞の細胞学および微生物学、遺伝
子工学、香料の製造ならびに免疫学の分野でも、その応
用範囲は拡大を続けている。

ラムノース含有細胞外多糖の製造は既に多くの特許およ
び特許出願に記載されている（ＤＥ３．２２９，７００
　、　ｕｓ　４，３４２，８６６またはＵＳ　４，５２
９．７９７；およびＵＳ　４，４５４，３１６）。これ
らの記載によれば、ラムノースの製造は、アルカリゲネ
ス（Ａｌｃａｌｉ−ｇａｎｅｓ）、タレプシーラ（Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）またはエンテロバクタ−（ＥｎＬｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ）属の細菌を栄養培地中にラムノース含有多糖
が蓄積するまで発酵させることによって行うことができ
る。ついでラムノースはこれらの多糖から酸加水分解し
た後に単離することができる。

本発明は驚くべきことにシュードモナスポイキモビリス
（Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ
）が、同様にラムノースを含有し、それから所望のラム
ノースを容易に単離することができる新規な多糖を合成
することを発見したものである。

すなわち本発明は、 （１）主要構成成分としてＬ−ラムノース、グルコース
、ガラクトース、マンノースおよびグルクロン酸を、■
　（ラムノース）：０．５〜１．８（グルコース）　：
　０．０４〜０．１（ガラクトース）：０．０４〜０．
１６（マンノース）：０．２〜０．６（グルクロン酸）
の比で含有する多糖 （２）シュードモナスポイキモビリス（Ｐｓｅｕｄｏ−
ｍｏｎａｓ　ｐａｕｃｉ＋ｎｏｂｉｌｉｓ）　ＤＳＩＪ
　４４２９を使用することからなるシュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏＩＩＩｏｎａｓ）に属する菌株の培養による
上記（１）の特徴を有する多糖の製造方法 （３）ラムノースの製造のための上記（１）の特徴を有
する多糖の使用 に関する。

本発明を以下に、とくにその好ましい実施態様について
詳細に説明する。本発明はまた特許請求の範囲に明示さ
れる。

シュードモナスボイキモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）　ＤＳＭ　４４２９は、
ブダペスト条約の条件に従って、１９８８年３月８日（
８，３−２９８８）に、ドイツ微生物寄託機関（Ｄｅｕ
ｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｓ）に上述の番号で寄託された。この菌株
は最初、土壌サンプルから単離されたものであり、単離
規準は炭水化物に富む栄養培地上での莢膜または粘質層
の形成である。

シュードモナスポイキモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）　ＤＳＭ　４４２９は以
下の性質を有する。

細胞の形状　　　　　　　　　　　桿　状幅　（μｍ’
）　　　　　　　　　　　　０．７〜０，８長さ（μＩ
Ｉ＋）　　　　　　　　　　　　　１．２〜１．６運動
性 繊毛 ダラム反応 ３％ＫＯＨによる溶菌 ＋ １個の極用 ＋ 胞子 オキシダーゼ カタラーゼ 生育 嫌気的 ３７／４１℃ ｐＨ５，６ Ｍａｃ−Ｃｏｎｋｅｙ寒天 Ｃ６Ｌｒ１ｍ１ｄｅ寒天 色素 非拡散 拡散 蛍　　光 ビオシアニン 酸の生産 グルコースから（好気的） グルコースから（嫌気的） ＋ 十 ＋／ 十 黄色 ＋ 十 グルコースから気体の生産 酸の生産 フルクトースから キンロースから ラクトースから マルトースから トレハロースから アラビノースから セロビオースから ラムノースから エタノールから グリセロールから ダルントールから ソルビトールから アドニトールから β−ガラクトシダーゼ アルコールデヒドロゲナーゼ リジンデカルボキシラーゼ オルチニンデ力ルポキシラーゼ ＋ インドール ＮＯ３−からＮｏ、−へ 脱窒化 フェニルアラニンデアミナーゼ スクロースからレバン レシチナーゼ ウレアーゼ 加水分解 デンプン ゼラチン カゼイン ＮＡ ツイーン８０ エスクリン チロシン分解 生育プロモーターの要求 基質利用性 アセテート アジペート カプレート シトレート グリフレート レブリネート マレエート ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ マロネート フェニルアセテート Ｌ−アラビノース　　　　　　　　　＋７ルクトース　
　　　　　　　　　　＋グルコース　　　　　　　　　
　　　　＋マンノース　　　　　　　　　　　　＋マル
トース　　　　　　　　　　　　士キシロース　　　　
　　　　　　　　＋マンニトール グルコネート ２−ケトグルコネート Ｎ−アセチルグルコサミン Ｌーセリン この菌株はシュードモナスに典型的なシクロプロパン脂
肪酸のない脂肪酸バタンを示す。

上述の多糖を合成できるなら、菌株ＤＳＭ　４４２９の
代わりに、その変異体および突然変異体も使用すること
ができる。

このような突然変異体はそれ自体公知の方法Ｘ−線のよ
うな放射線により、またたとえばメタンスルホン酸エチ
ルエステル（ＥＭＳ）、Ｎ−メｆルーＮ’ーニトローＮ
ーニトロソークアニジン（ＭＮＮＧ）もしくは２−ヒド
ロキシ−４−メトキシ−ベンゾフェノン（ＭＯＢ）のよ
うな化学的突然変異誘発物質により発生させることがで
きる。

好気的発酵に好ましい炭酸源は同化可能な炭水化物およ
び糖−アルコールたとえばグルコース、スクロース、フ
ルクトース、ラクトースまたはＤ−マンノース、ならび
に炭水化物含有天然生成物たとえば糖蜜、乳清または麦
芽エキスである。好ましい窒素含有栄養物は、アミノ酸
、ペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの分解生成
物たとえばペプトンもしくはトリプトン、また肉エキス
、粉砕種子たとえばトーモロコシ、小麦、エントウ、大
豆もしくは綿の寅の粉砕種子、アルコール製造時の蒸留
残留物、肉粉ｆたは酵母エキス、さらにはアンモニウム
塩およびで、物理的手段によりたとえば紫外線もしくは
硝酸塩である。栄養溶液にはまた添加無機塩としてたと
えばアルカリ金属まＩ；はアルカリ土類金属、鉄、亜鉛
およびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸
塩を含有させることができる。

本発明の多糖化合物の生成は、グルコース、スクロース
および／まＩ；は糖蜜を２０〜１２０ｇ／４好ましくは
３０〜７０ｇ／Ｑの濃度で含有する栄養溶液中でとくに
よく進行する。

発酵は好気的に、すなわち、たとえば振盪フラスコまた
は発酵槽中で振盪または撹拌しながら、適宜空気または
酸素を導入し、浸漬培養によって行われる。この場合通
気速度は圧力ブランケット１．４バールで発酵槽容量Ｈ
あたり１〜２Ｑ、好ましくは１．１〜１．６Ｑとする。

発酵は約２０〜４０°Ｃ１好ましくは約２５〜３０°Ｃ
の温度範囲で実施できる。ｐＨは５〜８．５、好ましく
は６．５〜８の範囲に保持しなければならない。微生物
は上述の条件下に、定常期に達するまで、約２〜７日間
、好ましくは３〜４日間培養する。この方法で、栄養溶
液１ａあたりポリマー３０〜７０９の収量が達成される
。このポリマーは高含量のＬ−ラムノースを有し、さら
に主要な構成成分としてグルコース、ガラクトース、マ
ンノースおよびグルクロン酸を含有する。これらの構成
成分はほぼ次の比率、１（ラムノース）：０．５〜１．
８（グルコース）　：　０．０４〜０．１（ガラクトー
ス）：０．０４〜０．１６（マンノース）：０．２〜０
，６（グルクロン酸）で存在する。とくにこれらの構成
成分はｌ：０．５〜ｌ　　：　０．０５〜０．０７　：
　０．０５〜０．０７　：　０．３〜０．４の比で存在
する。

培養は数段階に実施するのが有利である。すなわち１段
または２段以上の種培養菌体を液体栄養培地中で始めに
製造し、ついで実際の生産培地、すなわち本培養に１：
１０の容量比で移植する。４０〜１２０時間の生育後０
．１〜２ｇ／Ｑｘ時の炭水化物とくにグルコース、スク
ロースまたは糖蜜の連続的補給が有利である。

多糖は公知の方法で、たとえば塩酸、硫酸、リン酸また
は酢酸のような酸の水溶液で、有利には１００〜１７０
°Ｃ好ましくは８０〜１２０°Ｃに温度を上昇させて加
水分解される。

加水分解は一般的には３０〜１８０分で終わらせるのが
好ましく、とくに６０分で終わらせるのが好ましい。使
用した酸の性質に応じて、酸を蒸留または中和沈澱によ
って除去し、酸を含まない糖含有溶液を公知方法で分離
することができる。

所望のデオキシ糖はクロマトグラフィー法たとえばイオ
ン交換クロマトグラフィー　または高表面積を有する適
当な物質たとえばゼオライトに吸着させて分離される。

本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。百
分率のデータは、とくに指示のない限り、重量に対する
値である。

実施例　Ｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ　
ＤＳＭ　４４２９の培養を以下の組成を有する栄養溶液
中で実施する。

グルコース コーンステイープ ＮａＮ０　。

Ｋ、ＨＰＯ。

Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ３０ 微量元素溶液 滅菌前のｐＨ 微量元素溶液 ３　　ｇ看 １　　９／（ｔ Ｏ，２ｇ／Ｑ Ｏ，１９／（１ ０，０２５９／Ｑ Ｏ，０２ｙ／Ｑ ０．００４ｇ／（２ ０，０１ｇ／Ｑ ４５　　ｇ／Ｑ ５　　ｇ／Ｑ ２　　ｇ／α ｌ　　ｇ／Ｑ １．５ｇ／Ｑ ２．５ｍ＋２／Ｑ ７．８ ＣａＣＬ　’　２Ｈ２０ クエン酸鉄（Ｉ［［） ｎ５Ｏ４ ＺｎＣｆｆ　ｌ Ｃｕ５Ｏｔ　’　５Ｈ！０ ＮａＪ＋Ｏｒ　・１０Ｈ２０ 四ホウ酸ナトリウム ＣｏＣ＋Ｑ　。

ＮａｚＭｏＯ＊　−２Ｈ２０ モリブデン酸ナトリ ウム 培養液を振盪しながら３０°Ｃで７日間インキュベート
した。２倍容のイソプロパツールを添加して栄養溶液か
らポリマーを沈澱させた。乾燥させたポリマー６ｇは、
Ｌ−ラムノース１．９８ｇ、グルコース２．６ｇ、　グ
ルクロン酸０．９９、マンノース０．３ｇおよびガラク
トース０．２ｇを含有していｊこ　。

実施例　２ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ　
ＤＳＭ　４４２９を以下の栄養溶液中で培養した。

Ｄ−グルコース　　　　　　　４５　　ｇｌｏＤ−マン
ノース　　　　　　　５９／１２ＮａＮＯ３６ｙｌｏ Ｋ！ＨＰＯ１ｌ　　９／Ｑ ＭｇＣＱ、・６Ｈ！Ｏ１，２ｇ／　Ｑ ＮａＳｚＯ，・５Ｈ２０１，５ｇ／　ＱＨ ７，８ 乾燥させたポリマー１５９は、Ｌ−ラムノース４．８ｇ
、グルコース６ｇ、グルクロン酸３．０ｇ、ガラクトー
ス０．５６９およびマンノース０．２６ｉ＋を含有し　
ｔこ　。

実施例　３ １４（２の発酵槽に実施例２の栄養溶液１ＯＩ２を取り
、同じ培地からの２４時時間積培養菌体１％を植菌しｔ
二。

培養液の温度を３０°ｃＳｐＨを７．０の一定に保持し
、培養液は撹拌しながら１．５ΩＶＶｍの空気で通気し
た。４日後に生成したポリマーを酸加水分解によって分
解し、糖含量を定量的ＨＰＬＣで測定した。培養ブロス
１１２中にはＬ−ラムノース２．５９、ガラクトース０
．２ｇ、グルコース２ｇ、グルクロン酸１．４ｇおよび
マンノース０．３ｇを含有しＩこ。

実施例　４ 菌株を実施例３と同様にして培養した。４０時間後にグ
ルコースの連続供給を開始した。供給速度は、貯蔵容器
から２００ｇｚｌのグルコース濃度で０．６ｇ／Ｑ×時
間としＩ；。計７０時間発酵させたのち、ポリマー中の
糖の量を測定した。糖の含量はＬ−ラムノース４　、５
５ｔ　／　＋２、グルコース４９／Ｑ１　グルクロン酸
２．８ｇ／（ｔ１マンノース０．２ｇ／Ｑおよびガラク
トース０．２９／Ｑであった。

実施例　５ ポリマーの他の特性 Ｒｏｔｏｖｉｓｃｏ　ＲＶ　１２粘度計（Ｈａａｋｅ　
ＭｅｓｓＬｅｃｈｎｉｋＧｍｂＨ＆　Ｃｏ、、　７５　
Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、　ＦＲＧ）による粘度測定 ａ）３０℃ １％濃度水溶液 ｒｐａ＋　　　　０．１　０．４　　１　　２　　１６
　６４粘　　度 〔ｍＰａ、ｓ）　４８３７５２８１２５１７４７５１１
６８１３１６４１０５８０．３％濃度水溶液 ｒｐｍ　　　　　Ｏ・１ ０．４　　　１　　　　２　　　１６ ｂ）各種温度で１ 温度 ３０°Ｃ ４０℃ １２０℃ ％濃度水溶液、２回転／分 粘度（ｍＰａ、ｓ） 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）主要構成成分であるＬ−ラムノース、グルコース、
   ガラクトース、マンノースおよびグルクロン酸を、１（
   ラムノース）：０．５〜１．８（グルコース）：０．０
   ４〜０．１（ガラクトース）：０．０４〜０．１６（マ
   ンノース）：０．２〜０．６（グルクロン酸）の比で含
   有する多糖。 ２）主要構成成分を１：０．５〜１．０：０．０５〜０
   ．０７：０．０５〜０．０７：０．３〜０．４の比で含
   有する請求項１の多糖。 ３）シュードモナスポイキモビリス（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍ
   ｏｎａｓｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）ＤＳＭ４４２９ま
   たはその変異体もしくは突然変異体を培養することから
   なるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属す
   る菌株の培養による請求項１の多糖の製造方法。 ４）栄養培地の総重量に対して２〜１２％の濃度のグル
   コース、スクロースおよび／または糖蜜を含有する栄養
   溶液中で微生物を培養する請求項３の製造方法。 ５）培養はｐＨ５〜８．５において行われる請求項３お
   よび４のいずれかの製造方法。 ６）培養は２０〜４０℃の温度において行われる請求項
   ３から５までの１以上の製造方法。 ７）請求項１の多糖を合成するシュードモナスポイキモ
   ビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｕｃｉｍｏｂｉｌ
   ｉｓ）ＤＳＭ４４２９またはその変異体もしくは突然変
   異体。 ８）ラムノースの製造のための請求項１の多糖の使用。